CZ2018671A3 - Expandované deriváty naftalimidu pro aplikace v molekulární biologii - Google Patents

Expandované deriváty naftalimidu pro aplikace v molekulární biologii Download PDF

Info

Publication number
CZ2018671A3
CZ2018671A3 CZ2018-671A CZ2018671A CZ2018671A3 CZ 2018671 A3 CZ2018671 A3 CZ 2018671A3 CZ 2018671 A CZ2018671 A CZ 2018671A CZ 2018671 A3 CZ2018671 A3 CZ 2018671A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
general formula
naphthalimide derivatives
fused
naphthalimide
group
Prior art date
Application number
CZ2018-671A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308568B6 (cs
Inventor
Martin HavlĂ­k
Tomáš BŘÍZA
Robert KAPLÁNEK
Veronika TALIANOVÁ
Jarmila KRÁLOVÁ
Pavel Martásek
Vladimír KRÁL
Original Assignee
Univerzita Karlova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Karlova filed Critical Univerzita Karlova
Priority to CZ2018-671A priority Critical patent/CZ308568B6/cs
Priority to EP19817943.4A priority patent/EP3891153B1/en
Priority to PCT/CZ2019/050060 priority patent/WO2020114531A1/en
Publication of CZ2018671A3 publication Critical patent/CZ2018671A3/cs
Publication of CZ308568B6 publication Critical patent/CZ308568B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/06—Peri-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • C09B57/08—Naphthalimide dyes; Phthalimide dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

Řešením jsou π-expandované deriváty naftalimidu s furanovým nebo pyranonovým kruhem obecného vzorceaž, nesoucí vhodné funkční skupiny, a jejich použití pro přípravu prostředku k selektivnímu značení buněčných organel ve fluorescenční mikroskopii a jako fluorescenční sondy pro aplikace v molekulární biologii.

Description

π-Expandované deriváty naftalimidu pro aplikace v molekulární biologii
Oblast techniky
Vynález se týká použití sloučenin založených na π-expandovaných derivátech naftalimidu s furanovým nebo pyranonovým kruhem obecného vzorce I-IV, nesoucí vhodné funkční skupiny. Tyto sloučeniny lze využít v oblasti selektivní intracelulární lokalizace.
Dosavadní stav techniky
Spektroskopické metody založené na použití fluorescenčních sond jsou jednou z nej výkonnějších a nej důležitějších analytických technik. Tyto metody vynikají především jednoduchým instrumentálním uspořádáním, nízkou cenou, vysokou citlivostí a jejich poměrně snadnou použitelností pro in vitro a in vivo aplikace. [H. Kobayashi, M. Ogawa, R. Alford, P. L. Choyke and Y. Urano, New Strategies for Fluorescent Probe Design in Medical Diagnostic Imaging. Chern Rev, 2010, 110, 2620-2640] Použití fluorescenčních sondy se významně podílí na studiu, porozumění a vysvětlení řady biochemických a biologických jevů a procesů. Kromě toho jsou vhodně konstruované fluorescenční sondy a biologické molekuly značené fluoroforem klíčovou částí molekulárních zobrazovacích technik používaných v moderních diagnostických metodách [H. Kobayashi, M. Ogawa, R. Alford, P. L. Choyke and Y. Urano, New Strategies for Fluorescent Probe Design in Medical Diagnostic Imaging. Chern Rev, 2010, 110, 2620-2640] a opticky řízených chirurgických operacích. [G. A. Sonn, A. S. Behesnilian, Z. K. Jiang, K. A. Zettlitz, E. J. Lepin, L. A. Bentolila, S. M. Knowles, D. Lawrence, A. M. Wu and R. E. Reiter, Fluorescent Image-Guided Surgery with an Anti-Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) Diabody Enables Targeted Resection of Mouse Prostate Cancer Xenografts in Real Time. Clin Cancer Res, 2016, 22, 1403-1412] Příprava a studium nových fluorescenčních motivů a vývoj nových fluorescenčních sond jsou proto jedním z nej důležitějších témat analytické a bioanalytické chemie.
Existuje celá řada fluoro fórů běžně používaných v biochemické a biologické oblasti. Deriváty naftalimidu jsou díky svým vynikajícím fotofyzikálním vlastnostem jedním z nejvíce studovaných fluorescenčních sond. Naftalimidové deriváty vykazují širokou škálu vhodných fluorescenčních vlastností, jako je vysoká fotostabilita, vysoký kvantový výtěžek fluorescence, velké posuny Stokesova pásu, fotochemická stabilita a snadná modifikace struktury. Naftalimidové deriváty se tak často využívají při konstrukci fluorescenčních senzorů [R. M. Duke, E. B. Veale, F. M. Pfeffer,
- 1 CZ 2018 - 671 A3
P. E. Kruger and T. Gunnlaugsson, Colorimetric and fluorescent anion sensors: an overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chem Soc Rev, 2010, 39, 3936-3953] a činidel k zobrazování buněčných částí. [S. Banerjee, E. B. Veale, C. M. Phelan, S. A. Murphy, G. M. Tocci, L. J. Gillespie, D. O. Frimannsson, J. M. Kelly and T. Gunnlaugsson, Recent advances in the development of 1,8-naphthalimide based DNA targeting binders, anticancer and fluorescent cellular imaging agents. Chem Soc Rev, 2013, 42, 1601-1618]. Dalšími často používanými a dlouhodobě studovanými fluorofory jsou kumarinové deriváty. Spolu s poměrně snadnou syntézou a substituční variabilitou se kumariny používají jako fluorofory v oblasti fluorescenčních chemosenzorů [K. Zamojc, M. Zdrowowicz, D. Jacewicz, D. Wyrzykowski and L. Chmurzynski, Fluorescent and Luminescent Probes for Monitoring Hydroxyl Radical under Biological Conditions. Crit Rev Anal Chem, 2016, 46, 160-169] či fluorescenční barviva pro značení biomolekul nebo buněčné zobrazování. [Q. Zheng and L. D. Lavis, Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Curr Opin Chem Biol, 2017, 39, 32-38; M. Tasior, D. Kim, S. Singha, M. Krzeszewski, K. H. Ahn and D. T. Gryko, piExpanded coumarins: synthesis, optical properties and applications. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 1421-1446]. Jiný typ používaných fluoroforů je založen na benzofuranovém skeletu. Podobně jako kumariny a naftalimidy mají benzo- a naftofurany vhodné fyzikálně-chemické vlastnosti. Tyto fluorofory se používají pro konstrukci solvatochromických barviv [M. Koh, W. S. Kim and M. Lee, Exploration of a New Solvatochromic Dye Bearing the Excited-State Intramolecular Proton Transfer Functionality. Bull. Korean Chem. Soc., 2016, 37, 556-560] nebo fluorescenčních barviv pro biologické aplikace. [O. lamshanova, P. Mariot, V. Lehen’kyi and N. Prevarskaya, Comparison of fluorescence probes for intracellular sodium imaging in prostate cancer cell lines. Eur Biophys J, 2016, 45, 765-777; K. Nagy, E. Orban, S. Bosze and P. Kele, Clickable long-wave mega-stokes fluorophores for orthogonal chemoselective labeling of cells. Chem Asian J, 2010, 5, 773-777; G. Galvani, K. H. Vardhan Reddy, C. Beauvineau, N. Ghermani, F. Mahuteau-Betzer, M. Alami and S. Messaoudi, Conversion of 3-Bromo-2Hcoumarins to 3-(Benzofuran-2-yl)-2H-coumarins under Palladium Catalysis: Synthesis and Photophysical Properties Study. Org. Lett., 2017, 19, 910-913].
Ve vývoji nových fluoroforů pro konstrukci fluorescenčních sond se používají dva možné způsoby jejich konstrukce. První způsob zahrnuje přípravu látek se dvěma nebo více fluorofory v jedné molekule (hybridní molekuly, kde je každý fluorofor kovalentně nebo přes vhodnou spojku připojen k jinému). Druhou možností je příprava fluoroforů přikondenzováním jiného fluoroforů
-2CZ 2018 - 671 A3 nebo další (hetero) aromatické části. Tyto prokonjugované fluorofory jsou označovány jako πexpandované fluorofory a jde tak o přípravu nového fluoroforového jádra.
Některé naftalimidy s přikondenzovaným pyranonovým kruhem byly popsány jako sloučeniny pro barvení polyesterových vláken [Η. M. Deger, R. Erckel and H. Fruehbeis, Benzo[de]pyrano[3,2-g]isoquinoline derivatives useful as dyestuffs. Patent EP65743B1, 1982]. V tomto patentu je zmíněna příprava jednoho regioizomeru naftalimidu s kondenzovaným pyranonem Knoevenagelovou kondenzací 3 -hydroxy-4-formyl-jV-methylnaftalimidu s diethylmalonátem nebo 2-(heteroaryl)acetonitrilem, která poskytla sloučeniny s ethoxykarbonylovou nebo (hetero)aromatickou substitucí na pyranonovém kruhu.
Naftalimidy s přikondenzovaným furanovým kruhem byly již publikovány jako interkalující DNA a protinádorová činidla [C. Bailly, C. Carrasco, A. Joubert, C. Bal, N. Wattez, Μ. P. Hildebrand, A. Lansiaux, P. Colson, C. Houssier, M. Cacho, A. Ramos and M. F. Brana, Chromophore-Modified Bisnaphthalimides: DNA Recognition, Topoisomerase Inhibition, and Cytotoxic Properties of Two Mono- and Bisfuronaphthalimides. Biochemistry, 2003, 42, 41364150; M. F. Brana, M. Cacho, M. A. Garcia, B. de Pascual-Teresa, A. Ramos, Μ. T. Dominguez, J. M. Pozuelo, C. Abradelo, M. F. Rey-Stolle, M. Yuste, M. Banez-Coronel and J. C. Lacal, New Analogues of Amonafide and Elinafide, Containing Aromatic Heterocycles: Synthesis, Antitumor Activity, Molecular Modeling, and DNA Binding Properties. J. Med. Chem., 2004, 47, 1391-1399; Z. F. Tao, X. Qian, J. Tang, Synthesis of Furonaphthalimides as Novel DNA Intercalators. Dyes Pigments, 1996, 30, 247-252; M. Fernandez Brana, A. Ramos Gonzalez, M. Cacho Izquierdo, S. Rajamaki, N. Acero de Mesa, J. M. Pozuelo Gonzalez, D. Munoz-Mingarro Martinez, Preparation of 1,8-naphthalimide derivatives for therapeutic use as antiproliferative/anticancer agents, Patent ES2191532B1, 2003; A. D. Patten, G. J. Pacofsky, S. P. Seitz, E. A. Akamike, R. J. Chemey, R. F. Kaltenbach, M. J. Orwat, Preparation of bis-imide polycyclic and heterocyclic chromophores as tumoricidals. WO9500490A1, 1995 (uděleno uděleno na Taiwanu a JARu); X. Qian, H. Yin, Y. Xu, M. Xiao, J. Li, L.Lin, J. Ding, Preparation of naphthalimide derivatives for inhibiting growth of tumor cell and mutant cell. CN100465177C, 2007], fotosenzitizátory [X. H. Qian, J. Tang, J. D. Zhang and Y. L. Zhang, Synthesis of Furonaphthalimides with Potential Photosensitizing Biological Activity. Dyes Pigments, 1994, 25, 109-114], látky pro studium fluorescenčních vlastností [X. Qian, Y. Zhang, K. Chen, Z. Tao, Y. Shen, A study on the relationship between Stoke’s shift and low frequency half-value component of fluorescent compounds. Dyes Pigments, 1996, 32, 229-235] nebo
-3CZ 2018 - 671 A3 chemiluminiscenční sonda pro singletový kyslík [W. Adam, X. H. Qian and C. R. Sahamoller, Synthesis and Photooxygenation of 2,3,6-Trimethylftiro[2,3-b][l]naphtho[4a,7a-e,f)pyrida-5,7dione, A Potential Chemiluminescent Probe for Singlet Oxygen. Tetrahedron, 1993, 49, 417422]. Všechny výše uvedené publikace a patenty popisují syntézu a deriváty bez jakýchkoliv skupin na furanovém kruhu vhodných pro další syntetickou modifikaci (připravené deriváty neměly furanový kruh substituovaný nebo nesly methylové skupiny).
Připravili jsme dva regioizomery naftalimidu s přikondenzovaným pyranonovým kruhem obsahující ethoxykarbonylovou skupinu reakcí naftalimid-o-hydroxykarbaldehydů s ethylmalonátem v přítomnosti piperidinu, dále dva regioizomery naftalimidů s kondenzovaným furanovým motivem Rap-Stoermerovou reakcí naftalimid-o-hydroxykarbaldehydů s ethylbromacetátem za přítomnosti báze. Oba syntetické postupy vedou k derivátům nesoucím ethoxykarbonylovou skoupinu na přikondenzovaném kruhu, která je vhodná pro další syntetické modifikace.
π-Expandované deriváty naftalimidu s funkčními skupinami a jejich aplikace jako fluorescenční próby jsou předmětem tohoto patentu.
Podstata vynálezu
Tyto fluorescenční sondy mají dvě funkční skupiny a skupiny vhodné pro další modifikaci: jeden na imidovém dusíku (Rl) a druhý na kumarinovém nebo furanovém kondenzovaném kruhu (R2). Vhodné skupiny v těchto polohách mohou sloužit jako cílící skupiny pro specifickou a selektivní subcelulámí lokalizaci, reaktivní místo pro připojení k biomolekulám nebo jako modulátor rozpustnosti a lipofility.
Připravili jsme fluorescenční sondy pro lysosomální zobrazování nesoucí alkylovou skupinu na imidovém dusíku pro rychlý transport do buněk a s A-(2-(dimethylamino) ethyl) amidové skupinou pro lysosomální zaměřování na pyranonovém nebo furanovém kruhu.
Předmětem vynálezu jsou naftalimidové deriváty s kondenzovanou pyranonovou skupinou obecného vzorce I,
-4CZ 2018 - 671 A3
vzorec I dále jsou předmětem vynálezu naftalimidové deriváty s kondenzovanou pyranonovou skupinou 5 obecného vzorce II, o
.Λ R2 o Y vzorec II ίο dále jsou předmětem vynálezu naftalimidové deriváty s kondenzovanou furanovou skupinou obecného vzorce III,
W
O N
I vzorec III dále jsou předmětem vynálezu naftalimidové deriváty s kondenzovanou furanovou skupinou obecného vzorce IV,
R2 cH
Tť
O' N O vzorec IV kde R1 je H, alkyl Cl až C12, allyl, propargyl, benzyl, glykolový řetězec s počtem 1 až 8 glykolových (-OCH2CH2-) opakujících se jednotek končící O-alkyl substituentem Cl až C12 nebo -OH skupinou,
R2 je COOR1, CON(R1)2, kde oba substituenty R1 mohou být stejné nebo rozdílné, CONH(CH2)xN(R1)2, kde x je 2 až 6 a kde oba substituenty R1 mohou být stejné nebo rozdílné, CONH(CH2)xNY, kde x má výše uvedený význam a Y je -CH2-A-CH2CH2-, kde A je CH2, CH2CH2, CH2O, CH2S, CH2SO, CH2SO2, CH2NH, CH2NRI,
CZ 2018 - 671 A3 kde RI má výše uvedený význam.
Látky obecného vzorce I-IV mají fluorescenční vlastnosti; substituenty RI a R2 jsou funkční skupiny zajišťující selektivní lokalizaci do buněčných organel, napomáhají rozpustnosti a 5 ovlivňují lipofilitu, proto je možná jejich značná variabilita. Látky obecného vzorce I-IV lze tak využít v oblasti selektivní intracelulámí lokalizace jako fluorescenční próby pro selektivní značení buněčných organel. Tyto látky jsou relativně snadno připravitelné, mají nízkou toxicitu a vykazují požadované vlastnosti pro to, aby našly uplatnění ve fluorescenční mikroskopii pro biologické studie jako fluorescenční próby.
Příprava a vlastnosti naftalimidových derivátů s kondenzovanou pyranonovou nebo furanovou skupinou jsou doloženy následujícími příklady, aniž by jimi byly jakkoliv omezeny.
- 6 CZ 2018 - 671 A3
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje fluorescenční spektra látek 2 (LysoSer 2), 4 (LysoSer 4), 6 (LysoSer 6), 8 (LysoSer 8) a 10 (LysoSer 10) ve čtyřech různých solventech (PBS pufr, ethanol, methanol, DMSO).
Obrázek 2 znázorňuje fluorescenční spektra látek 2, 4, 6 a 8 (LysoSer 16) ve čtyřech různých solventech (PBS pufr, ethanol, methanol, DMSO).
Obrázek 3 znázorňuje srovnání lokalizace látek 2-8 (ΙμΜ) a srovnání se specifickou lysosomální probou LysoTracker Green DND-26. (A) Obrázek stejné části buněk ukazující fázový kontrast (vlevo) a celulámí fluorescenci (vpravo). (B) Lysosomální lokalizace látek 2-8. Látky byly inkubovány s komerční próbou pro specifické barvení lysosomů LysoTracker Green DND-26 (LT-G) na třech buněčných liniích (HF-P4, BLM, a A-2058). Snímky byly zachyceny pomocí konfokálního mikroskopu Leica TCS SP8 WLL SMD-FLIM s použitím čočky HC PL APO CS2 63x / 1.2W.
Obrázek 4 znázorňuje fluorescenci a intracelulámí lokalizaci látky 10 (50 nM (nahoře), 100 (uprostřed) a 200 nM (dole)) a srovnání se specifickou lysosomální probou LysoTracker Green DND-26. (A) Obrázek stejné části buněk ukazující fázový kontrast (vlevo) a celulámí fluorescenci (vpravo). (B) Lysosomální lokalizace látky 10. Látka byla inkubována s komerční próbou pro specifické barvení lysosomů LysoTracker Green DND-26 (LT-G) na třech buněčných liniích (HF-P4, BLM, a A-2058). Snímky byly zachyceny pomocí konfokálního mikroskopu Leica TCS SP8 WLL SMD-FLIM s použitím čočky HC PL APO CS2 63x / 1.2W.
Obrázek 5 znázorňuje fluorescenci a intracelulámí lokalizaci látky 12 (200 nM) se specifickou lysosomální probou LysoTracker Green DND-26. (A) Obrázek stejné části buněk ukazující fázový kontrast (vlevo) a celulámí fluorescenci (vpravo). (B) Lysosomální lokalizace látky 12. Látka byla inkubována s komerční próbou pro specifické barvení lysosomů LysoTracker Green DND-26 (LT-G) na třech buněčných liniích (HF-P4, BLM, a A-2058). Snímky byly zachyceny pomocí konfokálního mikroskopu Leica TCS SP8 WLL SMD-FLIM s použitím čočky HC PL APO CS2 63x/ 1.2W.
-7 CZ 2018 - 671 A3
Obrázek 6 znázorňuje cytotoxicitu látek 2 (LysoSer 13), 4 (LysoSer 14), 6 (LysoSer 15) a 8 (LysoSer 16) na třech buněčných liniích.
Obrázek 7 znázorňuje photobleaching látky 10 (LysoSer 10) a LysoTracker Green DND-2
-8CZ 2018 - 671 A3
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 1 s kondenzovanou pyranonovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec I.
2-Hexyl-5-hydroxy-l,3-dioxo-2,3-dihydro-Lř/-benzo[Je]isochinolin-6-karbaldehyd (650 25 mg, 2,0 mmol) byl smíšen s diethyl malonátem (0,4 mL, 420 mg, 2,6 mmol) a piperidinem (5 kapek) v ethanolu (15 mL). Reakční směs byla míchána za refluxu přes noc a poté odpařena do sucha. Produkt byl čištěn pomocí flash chromatografie (dichlormethan/methanol 97:3). Bylo ÍJCJf získáno 620 mg (74%) látky 1. Ή NMR (500 MHz, CDC13): 9,28 (IH, 'W* d’ °’8’ H20)’ 8’67 (1H’ dd’ 7’3’ L0, H10), 8,64 (IH, dd, 8,5, 1,0, H8),
O^Ň^O i.. 8,52 (IH, d, 0,8, H4), 8,00 (IH, dd, 8,5, 7,3, H9), 4,50 (2H, q, 7,1, H24),
4,18 (2H, ~t, 7,7, H14), 1,73 (2H, ~kv, 7,7, H15), 1,47 (3H, t, 7,1, H25),
1,43 (2H, m, H16), 1,38-1,29 (4H, m, H17 and H18), 0,89 (3H, ~t, 7,2,
H19). 13C NMR (126 MHz, CDCI3): 163,40 (C12), 163,10 (C23), 162,58 (C2), 155,66 (C22), 155,34 (C5), 142,79 (C20), 130,83 (CIO), 129,80 (C9), 128,74 (C7), 128,19 (C3), 127,43 (C8), 125,23 (C13), 123,83 (Cil), 121,07 (C4), 120,61 (C21), 116,46 (C6), 62,79 (C24), 41,15 (C14), 31,64 (C17), 28,14 (C15), 26,90 (C16), 22,69 (C18), 14,41 (C25), 20 14,17 (C19). HRMS (ESC): pro Cz^NiOeNai [M + Na]+ 444,14176; nalezeno
444,14185.
H
Příklad 2. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 2 s kondenzovanou pyranonovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec I.
Látka 1 (100 mg, 0,24 mmol) byla smíšena s 2M vodným roztokem hydroxidu sodného (5 mL) v ethanolu (5 mL) a reakční směs byla míchána za refluxu po dobu 2h. Poté byla směs okyselena kyselinou octovou do slabě kyselého pH. Vzniklý solid byl odfiltrován, promyt vodou a usušen za vakua. Bylo získáno 90 mg (96%) odpovídající kyseliny; ta byla použita do dalšího reakčního kroku bez dalšího čištění. Kyselina (85 mg, 0,22 mmol) byla reagována s oxalylchloridem (3 mL; 2M v dichlormethanu) s N,Ndimethylformamidem (2 kapky) jako katalyzátorem v dichlormethanu (5 mL) při laboratorní teplotě po dobu 2h. Pak byla reakční směs odpařena do sucha a bylo získáno 89 mg (100%) odpovídajícího chloridu kyseliny.
Chlorid kyseliny (89 mg, 0,22 mmol) byl reagován s N,N-9CZ 2018 - 671 A3 dimethylethylendiaminem (25 mg, 0,28 mmol) a triethylaminem (36 mg, 0,36 mmol) v dichlormethanu (5 mL) při laboratorní teplotě přes noc. Reakční směs byla odpařena do sucha. Produkt byl čištěn pomocí flash chromatografie (dichlormethan/methanol 9:1). Bylo získáno 88 mg (88%, 84% celkový výtěžek) látky 2 (LysoSer 13). NMR (500 MHz, CDCh): 9,61 (IH, s, H20), 9,19 (IH, br t, 5,9, NH), 8,73 (IH, dd, 8,4, 1,0, H8), 8,67 (IH, dd, 7,4, 1,0, H10), 8,51 (IH, d, 0,6, H4), 8,00 (IH, dd, 8,4, 7,4, H9), 4,17 (2H, ~t, 7,7, H14), 4,02 (2H, br q, 5,9, H24), 3,30 (2H, br s, H25), 2,89 (6H, br s, H26), 1,73 (2H, ~kv, 7,6, H15), 1,43 (2H, ~kv, 7,5, H16), 1,39-1,29 (4H, m, H17 and H18), 0,90 (3H, t, 7,1, H19). 13C APT NMR (126 MHz, CDCh): 163,33 (C12), 162,51 (C2 or C23), 162,45 (C2 or C23), 160,22 (C22), 154,46 (C5), 142,68 (C20), 131,06 (CIO), 129,91 (C9), 128,82 (C7), 128,14 (C3), 127,93 (C8), 125,35 (C13), 123,71 (Cil), 120,75 (C4), 120,33 (C21), 117,28 (C6), 56,89 (C25), 43,88 (C26), 41,16 (C14), 35,51 (br, C24), 31,64 (C17), 28,13 (C15), 26,90 (C16), 22,70 (C18), 14,18 (C19). HRMS (ESI+): pro C26H30N3O5 [M + H]+ 464,21800; nalezeno 464,21829.
Příklad 3. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 3 s kondenzovanou pyranonovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec II.
2-Hexyl-6-hydroxy-l,3-dioxo-2,3-dihydro-l//-benzo[de]isochinolin-5-karbaldehyd (650 mg, 2,0 mmol) byl smíšen s diethyl malonátem (0,4 mL, 420 mg, 2,6 mmol) apiperidinem (5 kapek) v ethanolu (15 mL). Reakční směs byla míchána za refluxu přes noc a poté odpařena do sucha. Produkt byl čištěn pomocí flash chromatografie (dichlormethan/methanol 97:3). Bylo získáno 590 mg (70%) látky 3. Ή NMR (500 MHz, CDCh): 8,87 (IH, dd, 8,4, 1,2, H8), 8,77 (IH, dd, 7,4, 1,2, H10), 8,76 (IH, s, H20), 8,71 (IH, s, H4), 7,94 (IH, dd, 8,4, 7,4, H9), 4,47 (2H, q, 7,2, H24), 4,17 (2H, ~t, 7,7, H14), 1,73 (2H, m, H15), 1,45 (3H, t, 7,2, H25),
1,45-1,30 (6H, m, H16, H17 and H18), 0,89 (3H, ~t, 7,1, H19). 13C NMR (126 MHz, CDCh): 163,56 (C12), 162,90 (C2), 162,54 (C23), 156,44 (C6), 155,35 (C22), 148,78 (C20), 134,18 (CIO), 130,89 (C4), 130,45 (C13), 129,12 (C8), 128,57 (C9), 123,26 (Cil), 121,31 (C7), 119,87 (C3), 119,08 (C21), 114,26 (C5), 62,55 (C24), 40,92 (C14), 31,66 (C17), 28,18 (C15), 26,91 (C16), 22,70 (C18), 14,38 (C25), 14,18 (C19). HRMS (ESI): pro C24H23NiO6Nai [M + Na]+ 444,14176; nalezeno 444,14184.
- 10 CZ 2018 - 671 A3
Příklad 4. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 4 s kondenzovanou pyranonovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec II.
Látka 3 (130 mg, 0,30 mmol) byla smíšena s 2M vodným roztokem hydroxidu sodného (5 5 mL) v ethanolu (5 mL) a reakční směs byla míchána za refluxu po fi a j? dobu 2h. Poté byla směs okyselena kyselinou octovou do slabě b kyselého pH. Vzniklý solid byl odfiltrován, promyt vodou a usušen ’ίΐΊΤ “ I” Za va^ua’ Byl° získáno 115 mg (95%) odpovídající kyseliny; ta byla ’SAp 4 použita do dalšího reakčního kroku bez dalšího čištění. Kyselina o^n^o 1» 10 (11θ mg, θ,28 mmol) byla reagována s oxalylchloridem (3 mL; 2M v dichlormethanu) s V,V-dimethylformamidem (2 kapky) jako 1β katalyzátorem v dichlormethanu (5 mL) při laboratorní teplotě po dobu 2h. Pak byla reakční směs odpařena do sucha a bylo získáno 115 mg (100%) odpovídajícího chloridu kyseliny. Chlorid kyseliny (115 mg, 0,28 mmol) byl reagován s V,7V-dimethylethylendiaminem (27 mg, 0,31 mmol) a triethylaminem (40 mg, 0,40 mmol) v dichlormethanu (5 mL) při laboratorní teplotě přes noc. Reakční směs byla odpařena do sucha. Produkt byl čištěn pomocí flash chromatografie (dichlormethan/methanol 9:1). Bylo získáno 110 mg (85%, 81% celkový výtěžek) látky 4 (LysoSer 14). Ή NMR (500 MHz, CDCh): 9,11 (IH, d, 0,4, H20), 8,93 (IH, brt, 5,3, NH), 8,84 (IH, dd, 8,4, 1,2, H8), 8,77 (IH, dd, 0,4, 0,3, H4), 8,76 (IH, dd, 7,4, 1,2, H10), 7,94 (IH, ddd, 8,4, 7,4, 0,3, H9), 4,18 (2H, ~t, 7,7, H14), 3,69 (2H, q, 5,9, H24), 2,72 (2H, br t, 6,5, H25), 2,44 (6H, s, H26), 1,73 (2H, ~kv, 7,6, H15), 1,43 (2H, ~kv, 7,5, H16), 1,38-1,27 (2H, m, H17 and H18), 0,89 (3H, t, 7,2, H19). 13C NMR (126 MHz, CDCh): 163,52 (C12), 162,83 (C2), 161,18 (C23), 160,06 (C22), 155,28 (C6), 148,38 (C20), 133,99 (CIO), 131,14 (C4), 130,26 (C13), 128,77 (C8), 128,62 (C9), 123,31 (Cil), 121,21 (C7), 120,24 (C3), 119,65 (C21), 115,18 (C5), 57,75 (C25), 45,15 (C26), 40,94 (C14), 37,51 (C24), 31,66 (C17), 28,17 (C15), 26,90 (C16), 22,69 (Cl8), 14,18 (C19). HRMS (ESI): pro C26H30N3O5 [M + H] 464,21800; nalezeno 464,21837
Příklad 5. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 5 s kondenzovanou furanovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec III.
- 11 CZ 2018 - 671 A3
2-Hexyl-5-hydroxy-l,3-dioxo-2,3-dihydro-l//-benzo[<7e]isochinolin-6-karbaldehyd (650 q mg, 2,0 mmol) byl smíšen s ethyl bromacetátem (0,3 mL, 453 mg, 2,7 mmol) a uhličitanem draselným (830 mg, 6,0 mmol) v acetonitrilu (15 „ r / mL). Reakční směs byla míchána za refluxu 2 dny a poté odpařena do 5 sucha. Produkt byl čištěn pomocí flash chromatografie (dichlormethan).
Bylo získáno 450 mg (57%) látky 5. Ή NMR (500 MHz, CDCh): 8,83 », (1H’ ď Ú0, H4), 8,65 (IH, dd, 7,4, 1,2, H10), 8,49 (IH, dd, 8,2, 1,2, H8), 8’07 <1H’ d’ Ř°’ H2°)’ 7’90 <1H’ dd’ 8’2’ 7’L H9), 4,53 (2H, q, 7,1, H23), “ 4,20 (2H, ~t, 7,7, H14), 1,75 (2H, ~kv, 7,6, H15), 1,49 (3H, t, 7,1, H24),
1,44 (2H, ~kv, 7,5, H16), 1,36 (2H, m, H17), 1,35 (2H, m, H18), 0,90 (3H, t, 7,1, H19). 13C NMR (126 MHz, CDCh): 164,10 (C12), 163,88 (C2), 158,88 (C22), 153,43 (C5), 148,82 (C21), 130,06 (CIO), 129,34 (C8), 128,14 (C9), 128,07 (C6), 126,71 (C7), 125,71 (C13), 123,83 (Cil), 122,92 (C3), 117,97 (C4), 112,27 (C20), 62,30 (C23), 41,00 (C14), 31,70 (C17), 28,22 (C15), 26,96 (C16), 22,72 (C18), 14,49 (C24), 14,20 (C19). HRMS (ESI): pro C23H24N1O5 [M + H]+ 394,16490; nalezeno 394,16513.
Příklad 6. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 6 s kondenzovanou furanovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec III.
Látka 5 (118 mg, 0,3 mmol) byla smíšena s 7V,7V-dimethylethylendiaminem (1 mL) v ethanolu (10 mL). Reakční směs byla míchána za refluxu přes noc a poté odpařena do sucha. Produkt byl čištěn pomocí flash chromatografie (dichlormethan/methanol 9:1). Bylo získáno 112 mg (86%) látky 6 (LysoSer 15). Ή NMR (500 MHz, CD3SOCD3): 8,86 (IH, dd, 8,2, 1,2, H8), 8,85 (IH, br t, 5,8, NH), 8,67 (IH, d, 1,0, H4), 8,53 (IH, dd, 7,4, 1,2, H10), 8,39 (IH, d, 1,0, H20), 8,00 (IH, ddd, 8,2, 7,4, 0,3, H9), 4,06 (IH, ~t, 7,5, H14), 3,45 (2H, td, 6,7, 5,8, H23), 2,47 (2H, covered, H24), 2,24 (6H, s, H25), 1,65 (IH, ~kv, 7,4, H15), 1,36 (2H, m, H16), 1,35-1,26 (4H, m, H17 and H18), 0,87 (3H, ~t, 7,1, H19). 13C NMR (126 MHz, CD3SOCD3): 163,30 (C12), 163,12 (C2), 157,37 (C22), 152,23 (C21), 151,45 (C5), 130,26 (C8), 129,37 (CIO), 128,56 (C6), 128,08 (C9), 126,13 (C7), 124,78 (C13), 122,81 (Cil), 121,14 (C3), 116,58 (C4), 109,13 (C20), 57,84 (C24), 45,07 (C25), 39,94 (C14), 36,86 (C23), 30,93 (C17), 27,39 (C15), 26,17 (C16), 21,94 (C18), 13,89 (C19). HRMS (ESL): pro C25H30N3O4 [M + H]+ 436,22308; nalezeno 436,22327.
- 12 CZ 2018 - 671 A3
Příklad 7. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 7 s kondenzovanou furanovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec IV.
2-hexyl-6-hydroxy-l,3-dioxo-2,3-dihydro-l/7-benzo[de]isochinolin-5-karbaldehyd (650 mg, 2,0 mmol) byl smíšen s ethyl bromacetátem (0,3 mL, 453 mg, 2,7 mmol) a uhličitanem draselným (830 mg, 6,0 mmol) v acetonitrilu (15 mL). Reakční směs byla míchána za refluxu 2 dny a poté odpařena do sucha. Produkt byl čištěn pomocí flash chromatografie (dichlormethan). Bylo získáno 320 mg (41%) látky 7. Ή NMR (500 MHz, CDC13): 8,87 (IH, s, H4), 8,76 (IH, dd, 8,2, 1,2, H8), 8,66 (IH, dd, 7,4, 1,2, H10), 7,89 (IH, ddd, 8,2, 7,4, 0,3 to H4, H9), 7,78 (IH, s, H20), 4,50 (2H, q, 7,1, H23), 4,18 (2H, ~t, 7,7, H14), 1,74 (2H, ~kv, 7,7, H15), 1,47 (3H, t, 7,1,
H24), 1,44 (2H, ~kv, 7,4, H16), 1,38-1,29 (4H, m, H17 and H18), 0,89 (3H, ~t, 7,2, H19). 13C NMR (126 MHz, CDCh): 164,18 (C12), 163,95 (C2), 158,89 (C22), 154,59 (C6), 15 147,25 (C21), 131,08 (CIO), 127,82 (C9), 127,78 (C13), 127,47 (C4), 126,99 (C8), 123,86 (C5), 123,51 (Cil), 119,92 (C3), 119,54 (C7), 115,21 (C20), 62,07 (C23), 40,86 (C14), 31,70 (C17), 28,22 (C15), 26,95 (C16), 22,71 (C18), 14,49 (C19), 14,19 (C24). HRMS (ESI): pro C23H24N1O5 [M + H]+ 394,16490; nalezeno 394,16459.
Příklad 8. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 8 s kondenzovanou furanovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec IV.
Látka 7 (118 mg, 0,3 mmol) byla smíšena s MV-dimcthylethylcndiaminem (1 mL) v
ethanolu (10 mL). Reakční směs byla míchána za refluxu přes noc a poté odpařena do sucha. Produkt byl čištěn pomocí flash chromatografie (dichlormethan/methanol 9:1). Bylo získáno 108 mg (83%) látky 8 (LysoSer 16). Ή NMR (500 MHz, CD3SOCD3): 8,88 (IH, br t, 5,7, NH), 8,86 (IH, s, H4), 8,77 (IH, dd, 8,2, 1,2, H8), 8,53 (IH, dd, 7,4, 1,2, H10), 8,02 (IH, dd, 8,2, 7,4, H9), 7,86 (IH, s, H20), 4,04 (2H, ~t, 7,5, H14), 3,46 (2H, td, 6,7, 5,7, H23), 2,52 (2H, t, 6,7, H24), 2,25 (6H, s, H25), 1,63 (2H, ~kv, 7,4, H15), 1,35 (2H, m, H16),
1,36-1,25 (4H, m, H17 and H18), 0,86 (3H, ~t, 7,1, H19). 13C NMR (126 MHz,
CD3SOCD3): 163,35 (C2), 163,10 (C12), 157,40 (C), 152,50 (C6), 150,26 (C21), 130,03 (CIO), 127,97 (C9), 127,31 (C4), 126,45 (C13), 126,35 (C8), 124,11 (C5), 122,79 (Cil), 118,76 (C3), 118,63 (C7), 111,08 (C20), 58,01
- 13 CZ 2018 - 671 A3 (C24), 45,09 (C25), 39,80 (C14), 36,82 (C23), 30,94 (C17), 27,41 (C15), 26,17 (C16), 21,96 (C18), 13,89 (C19). HRMS (ESI ): pro C25H30N3O4 [M + H]+ 436,22308; nalezeno 436,22343.
Příklad 9. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 9 s kondenzovanou furanovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec III.
Látka 9 byla připravena postupem uvedeným v příkladu 5, s tím, že jako výchozí látka byl použit 2-methyl-5-hydroxy-l,3-dioxo-2,3-dihydro-l/7-benzo[ófe]isochinolin-6-karbaldehyd (510 mg, 2,0 mmol). Bylo získáno 330 mg (51%) látky 9.
Příklad 10. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 10 s kondenzovanou furanovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec III.
Látka 10 byla připravena postupem uvedeným v příkladu 6, s tím, že jako výchozí látka byla použita látka 9 (65 mg, 0,2mmol). Bylo získáno 65 mg (88%) látky 10.
Příklad 11. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu lis kondenzovanou furanovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec IV.
Látka 11 byla připravena postupem uvedeným v příkladu 7, s tím, že jako výchozí látka byl použit 2-methyl-6-hydroxy-l,3-dioxo-2,3-dihydro-l/7-benzo[de]isochinolin-5-karbaldehyd (510 mg, 2 mmol). Bylo získáno 300 mg (46%) látky 11.
Příklad 12. Příprava π-expandovaného naftalimidového derivátu 12 s kondenzovanou furanovou skupinou, spadajícího pod obecný vzorec IV.
Látka 12 byla připravena postupem uvedeným v příkladu 8, s tím, že jako výchozí látka byla použita látka 11 (65 mg, 0,2 mmol). Bylo získáno 60 mg (82%) látky 11.
- 14CZ 2018 - 671 A3
Příklad 13. Spektrální vlastnosti látek 2, 4, 6, 8 a 10 spadajících pod obecný vzorec I-IV
Spektrální charakteristiky připravených látek 2, 4, 6, 8 a 10 byly získány za použití UV / VIS a fluorescenčních studií. Látky byly měřeny ve čtyřech různých rozpouštědlech 5 (DMSO, methanol, ethanol a fosfátový pufr). Látky byly rozpuštěny v DMSO a zásobní roztok byl zředěn na konečnou koncentraci 1 μΜ nebo 0,1 μΜ. Naměřené spektra a výsledné hodnoty absorpčního maxima a emisí jsou shrnuty v Tabulce 1 a na Obrázku 1 a 2. Všechny připravené látky mají absorpční maximum v oblasti ultrafialového záření 350400 nm a maximální emise v oblasti od 400 do 450 nm. Látky 6 (LysoSer 6), 8 (LysoSer io 8) a 10 (Lysoser 10) s furanovým motivem vykazovaly vyšší fluorescenční intenzity než látky 2 (LysoSer 2) a 4 (LysoSer 4) s kumarinovým motivem.
Tabulka 1. Absorbční a emisní maxima látek 2, 4, 6, 8 a 10 v různých solventech
Látka Solvent Absorbční maximum (nm) Emisní maximum (nm)
2 DMSO 379 440
EtOH 388 448
MeOH 387 442
PBS 389 448
4 DMSO 368 432
EtOH 319 434
MeOH 317 435
PBS 320 437
6 DMSO 373 424
EtOH 376 422
MeOH 373 421
PBS 373 429
8 DMSO 368 416
EtOH 341 415
MeOH 341 416
PBS 360 428
- 15 CZ 2018 - 671 A3
10 DMSO 377 435
EtOH 365 410
MeOH 372 420
PBS 377 431
Příklad 14. Intracelulámí studie látek 2, 4, 6, 8,10 a 12 spadajících pod obecný vzorec I-IV
Intracelulámí lokalizace látek 2, 4, 6, 8, 10 a 12 v živých buňkách byla studována na konfokálním mikroskopu Leica TCS SP8 WLL SMD-FLIM (vybavený impulsním laserem o délce 405 nm) při 37 ° C za použití čočky HC PL APO CS2 63x / 1,2 W. Schopnost účinnosti látek 2, 4, 6, 8, 10 a 12 vstoupit a eventuálně zabarvit specifické intracelulámí kompartmenty (lysosomy) byla testována s použitím tří různých buněčných linií (lidské fibroblastové buňky HFP4 a dvě melanomové buněčné linie A-2058 a BLM). Jako ko-lokalizační látka byl použit komerčně dostupný LysoTracker Green DND-26. Buňky byly současně barveny látkami 2, 4, 6, 8 (1 μΜ), 10 (200 nM, 100 nM a 50 nM) a 12 (200nM) a LysoTracker Green DND-26 (200 nM) po dobu 30 minut za růstových podmínek a snímky byly zachyceny konfokálním mikroskopem. Měření potvrdily, že látky 2, 4, 6, 8, 10 a 12 zabarvují lysozomální kompartment podobně jako LysoTracker Green DND-26 (Obrázek 3-5). Látky 2, 4, 6, 8, 10 a 12 poskytly modrou intenzivní fluorescenci. Podle pořízených snímků lze usoudit, že nejvyšší intenzita fluorescence (při zachování selektivity) byla dosažena pomocí látek 6 (LysoSer 6), 8 (LysoSer 8), 10 (LysoSer 10) a 12 (LysoSer 10) s furanovým motivem.
Příklad 15. Cytotoxicita látek 2, 4, 6 a 8 spadajících pod obecný vzorec I-IV
Pro test cytotoxicity látek 2, 4, 6 a 8 byl použit kolorimetrický test buněčné metabolické aktivity. Buňky (HF-P4, BLM a A-2058) kultivovány za standardních podmínek v kultivačním médiu (DMEM s 10% FBS). Po 24 hodinách kultivace byly buňky umístěny na 96-jamkové destičky při hustotě 5000 buněk na jamku. Buňky byly uchovávány za standardních podmínek kultury dalších 24 hodin. Po uplynutí této doby bylo médium odstraněno a bylo přidáno médium testovanými sloučeninami a kultivováno po dobu 48 hodin. Poté se médium vyměnilo tetrazoliovým barvivém MTT a inkubovalo se 2 hodiny (37°C). Po dvouhodinové inkubaci bylo žluté tetrazolové barvivo odstraněno a byl přidán DMSO, který se redukoval na fialový formazan v živých buňkách. Toto
- 16CZ 2018 - 671 A3 bylo následováno zkouškou s čtečkou NanoQuant mikrotitrační destičky od firmy Tecan. Absorbance převedeného barviva byla měřena při vlnové délce 570 nm s referencí 630 nm.
Na základě testů proliferace MTT a cytotoxicity byla stanovena hodnota IC50 (koncentrace inhibující růst buněk). Měření cytotoxicity látek 2, 4, 6 a 8 v různých koncentracích (0-10 μΜ) ukázaly, že látky nevykazují téměř žádnou toxicitu nebo nízkou toxicitu (Obrázek 6). Tyto koncentrace jsou o jeden až dva řády vyšší než koncentrace používané pro měření jejich intracelulámí lokalizace.
Průmyslová využitelnost
Naftalimidové deriváty s kondenzovanou pyranonovou nebo furanovou skupinou jsou využitelné jako prostředek pro fluorescenční mikroskopii. Jejich využití spočívá v tom, že je lze použít jako fluorescenční próby pro selektivní značení buněčných organel.

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Naftalimidové deriváty s kondenzovanou pyranonovou skupinou obecného vzorce I, vzorec I kde Rl je H, alkyl Cl až C12, allyl, propargyl, benzyl, glykolový řetězec s počtem 1 až 8 ethylenglykolových (-OCH2CH2-) opakujících se jednotek končící O-alkyl substituentem Cl až C12 nebo -OH skupinou,
    R2 je COOR1, CON(R1)2, kde oba substituenty Rl mohou být stejné nebo rozdílné, CONH(CH2)xN(R1)2, kde x je 2 až 6 a kde oba substituenty Rl mohou být stejné nebo rozdílné, CONH(CH2)xNY, kde x má výše uvedený význam a Y je -CH2-A-CH2CH2-, kde A je CH2, CH2CH2, CH2O, CH2S, CH2SO, CH2SO2, CH2NH, CH2NRI, kde Rl má výše uvedený význam.
  2. 2. Naftalimidové deriváty s kondenzovanou pyranonovou skupinou obecného vzorce II,
    A. R2 o
    ONO vzorec II
    - 17CZ 2018 - 671 A3 kde Rl a R2 mají výše uvedený význam.
  3. 3. Naftalimidové deriváty s kondenzovanou furanovou skupinou obecného vzorce III,
    - 18 CZ 2018 - 671 A3
    R2 χ δ
    7'ť Ο Ν νΟ
    I R1 vzorec III kde Rl a R2 mají výše uvedený význam.
  4. 4. Naftalimidové deriváty s kondenzovanou furanovou skupinou obecného vzorce IV,
    Tť O N O vzorec IV kde Rl a R2 mají výše uvedený význam.
  5. 5. Použití naftalimidových derivátů obecného vzorce I-IV, podle nároku 1-4 pro přípravu prostředku k selektivnímu značení buněčných organel ve fluorescenční mikroskopii.
  6. 6. Použití naftalimidových derivátů obecného vzorce I-IV, podle nároku 1-4 jako fluorescenčních prób pro aplikace v molekulární biologii.
CZ2018-671A 2018-12-03 2018-12-03 Naftalimidofurany pro aplikace v molekulární biologii CZ308568B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018-671A CZ308568B6 (cs) 2018-12-03 2018-12-03 Naftalimidofurany pro aplikace v molekulární biologii
EP19817943.4A EP3891153B1 (en) 2018-12-03 2019-12-03 Naphthalimidofurans for applications in molecular biology
PCT/CZ2019/050060 WO2020114531A1 (en) 2018-12-03 2019-12-03 Naphthalimidofurans for applications in molecular biology

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018-671A CZ308568B6 (cs) 2018-12-03 2018-12-03 Naftalimidofurany pro aplikace v molekulární biologii

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2018671A3 true CZ2018671A3 (cs) 2020-06-10
CZ308568B6 CZ308568B6 (cs) 2020-12-09

Family

ID=68847906

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2018-671A CZ308568B6 (cs) 2018-12-03 2018-12-03 Naftalimidofurany pro aplikace v molekulární biologii

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3891153B1 (cs)
CZ (1) CZ308568B6 (cs)
WO (1) WO2020114531A1 (cs)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3120402A1 (de) * 1981-05-22 1982-12-16 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Neue cumarinverbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als farbstoffe
US5416089A (en) 1993-06-24 1995-05-16 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Polycyclic and heterocyclic chromophores for bis-imide tumoricidals
ES2191532B1 (es) 2001-05-28 2005-02-16 Fundacion Universitaria San Pablo - Ceu Derivados de naftalimidas heterociclicas como agentes antiproliferativos.
CN100465177C (zh) 2006-08-16 2009-03-04 华东理工大学 氧、氮杂环并萘酰亚胺类化合物及其生物应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3891153B1 (en) 2024-01-31
EP3891153A1 (en) 2021-10-13
CZ308568B6 (cs) 2020-12-09
WO2020114531A1 (en) 2020-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. A ratiometric fluorescent probe for formaldehyde in aqueous solution, serum and air using aza-cope reaction
Gao et al. A fluorescent dye with large Stokes shift and high stability: synthesis and application to live cell imaging
Zhang et al. Near-infrared fluorescent probes based on piperazine-functionalized BODIPY dyes for sensitive detection of lysosomal pH
Zhang et al. A ratiometric lysosomal pH probe based on the coumarin–rhodamine FRET system
CN113444046B (zh) 一种荧光探针及其制备方法和用途
Wang et al. A six-membered-ring incorporated Si-rhodamine for imaging of copper (ii) in lysosomes
Khan et al. Synthesis and photophysical investigation of (BTHN) Schiff base as off-on Cd2+ fluorescent chemosensor and its live cell imaging
Kim et al. Far-red/near-infrared emitting, two-photon absorbing, and bio-stable amino-Si-pyronin dyes
Wang et al. A novel p-aminophenylthio-and cyano-substituted BODIPY as a fluorescence turn-on probe for distinguishing cysteine and homocysteine from glutathione
Li et al. A ratiometric near-infrared fluorescence strategy based on spiropyran in situ switching for tracking dynamic changes of live-cell lysosomal pH
Tian et al. Synthesis and characterization of new rhodamine dyes with large Stokes shift
CN109574880B (zh) 一种荧光探针及其制备方法和用途
Wan et al. A ratiometric near-infrared fluorescent probe based on a novel reactive cyanine platform for mitochondrial pH detection
Wang et al. Rational design of novel near-infrared fluorescent DCM derivatives and their application in bioimaging
CN107098923A (zh) 一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料及其制备方法与用途
Tao et al. Linear tetraphenylethene-appended bis-imidazolium salts for sensing of ATP
Gong et al. A near-infrared fluorescent probe based on a novel rectilinearly π-extended rhodamine derivative and its applications
CN108504130B (zh) 一种花菁类荧光染料及其合成方法
Zhu et al. Near-infrared cyanine-based sensor for Fe 3+ with high sensitivity: its intracellular imaging application in colorectal cancer cells
Zhang et al. A series of novel NIR fluorescent dyes: Synthesis, theoretical calculations and fluorescence imaging applications in living cells
Havlík et al. Versatile fluorophores for bioimaging applications: π-expanded naphthalimide derivatives with skeletal and appendage diversity
CN114773875A (zh) 一类氮杂吲哚-方酸菁染料，其合成方法及应用
CN108864058A (zh) 一类氧杂蒽酮类荧光染料及应用
Qiu et al. Amino-substituted C-coumarins: Synthesis, spectral characterizations and their applications in cell imaging
US20040054195A1 (en) Xanthene derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20241203