CZ2016682A3 - 2-β-Anilidovinyl-N-alkyl-heteroaromatická dimethiniová sůl a její použití jako duální proba pro mitochondriální a lysozomální vizualizaci - Google Patents
2-β-Anilidovinyl-N-alkyl-heteroaromatická dimethiniová sůl a její použití jako duální proba pro mitochondriální a lysozomální vizualizaci Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2016682A3 CZ2016682A3 CZ2016-682A CZ2016682A CZ2016682A3 CZ 2016682 A3 CZ2016682 A3 CZ 2016682A3 CZ 2016682 A CZ2016682 A CZ 2016682A CZ 2016682 A3 CZ2016682 A3 CZ 2016682A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fluorescence
- alkyl
- lysosomes
- cells
- salt
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
- C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D277/84—Naphthothiazoles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
- C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D277/62—Benzothiazoles
- C07D277/64—Benzothiazoles with only hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals attached in position 2
- C07D277/66—Benzothiazoles with only hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals attached in position 2 with aromatic rings or ring systems directly attached in position 2
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
- G01N33/5079—Mitochondria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/16—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing hetero atoms
- C09B23/162—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing hetero atoms only nitrogen atoms
- C09B23/166—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing hetero atoms only nitrogen atoms containing two or more nitrogen atoms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
2-βAnilidovinyl-N-alkyl-heteroaromatická dimethiniová sůl obecného vzorce I a II. Tyto sloučeniny mohou být využity jako duální proby pro zobrazování jak mitochondrií, tak lysozomů zároveň.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká použití systémů založených na 2-3-anilidovinyl-N-alkyl-heteroaromatických solích (dimethiniových solích) obecného vzorce I a II. Tyto systémy lze využít v oblasti selektivní intracelulární lokalizace. Pomocí těchto systémů lze selektivně vizualizovat jak mitochondrie, tak lysozomy zároveň.
Dosavadní stav techniky
Intracelulární fluorescenční proby pro vizualizaci buněčných organel pomocí fluorescenční mikroskopie jsou považovány za velmi silný nástroj při získávání informací o vlastnostech a chování komplexních biologických systémů na buněčné úrovni (Stephens, D. J.; Allan, V. J. (2003) Light microscopy techniques for life cell imagíng. Science 300, 82-86.; Chalfie, M.; Tu, Y.; Euskirchen, G.; Ward, W. W.; Prasher D. C. (1994) Green fluorescent protein as a markér for gene expression. Science 263, 802-805). Existují dvě hlavní skupiny prob. První skupina zahrnuje malé molekuly - chemické struktury s požadovanými vlastnostmi (Stephens, D. J.; Allan, V. J. (2003) Light microscopy techniques for life cell imaging. Science 300, 82-86), ta druhá je založena na využití specificky cílených fluorescenčních proteinů (Chalfie, M.; Tu, Y.; Euskirchen, G.; Ward, W. W.; Prasher D. C. (1994) Green fluorescent protein as a markér for gene expression. Science 263, 802-805). Druhá skupina má bohužel jistá omezení, jako je například nižší intenzita fluorescence, nízká fotostabilita, častá cytotoxicita, fototoxicita a neselektivní lokalizace v jádře. Pozornost současného výzkumu se soustředí především na první skupinu látek, tedy jednoduché chemické struktury využitelné ve fluorescenční mikroskopii pro zobrazování v živých buňkách in vitro anebo i celých organismech in vivo. Tato oblast zažívá v posledních letech nebývalý rozmach (Ueno, T.; Nagano, T. (2011) Fluorescent probesfor sensing and imaging. Nat. Methods 8, 642-645.; Spenst, P.; Wírthner, F. (2015) A perylene bisimide cyclophane as a Turn-On and Turn-Off fluorescence probe. Angew. Chem. 127, 1030310306).
Jednou z velice zajímavých, slibných a dosud téměř neprozkoumaných oblastí je vývoj a využití fluorescenčních prob nazývaných „duální proby. Mezi tyto látky se řadí zatím pouze několik málo struktur vykazujících duální charakter. Jedná se v podstatě o to, že daná látka vykazuje dvě rozdílná fluorescenčně emisní maxima (separované excitované elektronové stavy) v různých prostředích (Brancato, G.; Signore, G.; Neyroz, P.; Polli, D.; Cerullo, G.; Abbandonato, G.; Nucara, L.; Barone, V.; Beltram, F.; Bizzarri, R. (2015) Duál fluorescence through Kasha's rule breaking: an unconventional photomechanism for
intracellular probe design. J. Phys. Chem. B 119, 6144-6154). Jedním z prvních fluorescenčních barviv vykazujících duální charakter byl azulenový derivát (Eber, G.; Griineis, F.; Schneider, S.; Dórr, F. (1974) Duál fluorescence emission of azulene derivatives in solution. Chem. Phys. Lett. 29, 397-404), jehož syntéza a vlastnosti byly popsány již v roce 1974. Později byly objeveny další látky s těmito vlastnostmi jako například pyryliové sole (Nikolov, P.; Metzov, S. (2000) Peculiarities in the photophysical properties of some 6-styryl-2,4-disubstituted pyrylium salts. J. Photochem. Photobiol. A 135, 13-25), antraceny (Muralidharan, S.; Yates, K. (1992) Bichromophoric anthracene derivatives with duál absorptive and emissive states. Chem. Phys. Lett. 192, 571-575), naftalimidové deriváty (Nandhikonda, P.; Heagy, M. D. (2010) Duál fluorescent N-aryl2,3- naphthalimides: applications in ratiometric DNA detection and white organic light-emitting devices. Org. Lett. 12, 4796-4799) a kumariny (Brancato, G.; Signore, G.; Neyroz, P.; Polli, D.; Cerullo, G.; Abbandonato, G.; Nucara, L.; Barone, V.; Beltram, F.; Bizzarri, R. (2015) Duál fluorescence through Kasha's rule breaking: an unconventional photomechanism for intracellular probe design. J. Phys. Chem. B 119, 6144-6154).
Rovnováha mezi jednotlivými fluorescenčními maximy fluoroforu silně závisí na jeho okolním prostředí (chemické struktury), jako je například použité rozpouštědlo, teplota, pH, viskozita, polarita, tvorba vodíkových vazeb, nábojová hustota a strukturní motiv cílového vazebného místa. (Spenst, P.; Wírthner, F. (2015) A perylene bisimide cyclophane as a Turn-On and Turn-Off fluorescence probe. Angew. Chem. 127,10303-10306; Lippert, E.; Líider, W.; Moll, F.; Nagele, W.; Boos, H.; Prigge, H.; Seibold-Blankenstein, I. (1961) Umwandlung von elektronenanregungsenergie. Angew. Chem. 73, 695-706. Bilokin' M. D.; Shvadchak, V. V.; Yushchenko, D. A.; Duportail, G.; Měly, Y.; Pivovarenko, V. G. (2009) Dual-fluorescence probe of environment basicity (hydrogen bond accepting ability) displaying no sensitivity to polarity J Fluoresc 19, 545553; Motyka, K.; Vaňková, B.; Hlaváč, J.; Šoural M.; Funk, P. (2011) Purine scaffold effect on fluorescence properties of purine-hydroxyquinolinone bisheterocycles. J Fluoresc 21, 2207-2212; Richter, C.; Schneider, C.; Quick, Μ. T.; Volz, P.; Mahrwald, R.; Hughes, J.; Dick, B.; Alexiev, U., Ernsting, N. P. (2015) Dual-fluorescence pH probe for bio-labelling. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 30590-30597; Reers, M.; Smiley, S. T.; Mottola-Hartshorn, C.; Chen, A.; Lin, M.; Chen, L. B. (1995). Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods Enzymol. 260, 406-417; Okamoto, A.; Tainaka, K.; Nishiza, K.; Saito I. (2005) Monitoring DNA structures by duál fluorescence of pyrene derivatives J. Am. Chem. Soc. 127, 13128-1312; Sun, X.; Liu, P.; Wu L.; Liu B. (2015) Graphene-quantum-dots-based ratiometric fluorescent probe for visual detection of copper ion. Analyst 140, 6742-6247; Haidekker, M. A.; Theodorakis, E. A. (2010) Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4,11.
Aplikace již známých duálních prob zahrnuje například značení proteinů (Richter, C.; Schneider, C.; Quick, Μ. T.; Volz, P.; Mahrwald, R.; Hughes, J.; Dick, B.; Alexiev, U., Ernsting, N. P. (2015) Dual-fluorescence pH probe for bio-labelling. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 30590-30597), biokonjugáty (Zhang, Z.; Kao, J.; D'Avignon, A.; Achilefu, S. (2010) Understanding dichromic fluorescence manifested in certain ICG analogs. Pure Appl Chem. 307-311), měření membránového potenciálu pomocí 3-hydroxyflavinových prob PPZ8 a F8N1S) (Shynkar, V. V.; Klymchenko, A. S.; Duportail, G.; Demchenko, A. P.; Mely, Y. (2005) Two-color fluorescent probesfor imaging the dipóle potential ofcell plasma membranes. Bioch. Biophys. Acta 1712, 1282 • · · , : ·· · • · · ; : · · · . ............... ·..·
136)., měření mitochondriálního membránového potenciálu probou JC-1 (Reers, M.; Smiley, S. T.; Mottola-Hartshorn, C.; Chen, A.; Lin, M.; Chen, L. B. (1995). Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods Enzymol. 260, 406-417) a MitoCaptureTR (Plásek, J.; Sigler, K. (1996) Slow fluorescent indicators of membrane potential: a survey of different approaches to probe response analysis. J Photochem Photobiol B. 33, 101-124), pH stanovení za použití benzo[c]xanthenového barviva SNAFL-1 (Brook, P. F.; Lawry, J.; Cooke, I. D.; Barratt, C. L. (1996) Measurement of intracellular pH in human spermatozoa by flow cytometry with the benzo[c]xanthene dye SNAFL-1: a novel, single excitation, duál emission, molecular probe. Mol Hum Reprod. 2, 18-25), 5- a 6-karboxynaftofluoresceinu v polyakrylamidovém gelu (Song, A.; Parus,
S.; Kopelman, R. (1997) High-performance fiber-optic pH microsensors for practical physiological measurements using a dual-emission sensitive dye. Anal. Chem. 69, 863-867), akridinové oranže (Millot, C.; Millot, J. M.; Morjani, H.; Desplaces, A.; Manfait, M. (1997) Characterization of acidic vesicles in multidrugresistant and sensitive cancer ceils by acridine orange staining and confocal microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 45, 1255-1264), xanto-BODIPY připojeného ke glykolované karboxylové kyselině (Han, J.; Loudet, A.; Barhoumi, R.; Burghardt, R. C.; Burgess, K. (2009) A ratiometric pH reportér for imaging protein-dye conjugates in living ceils. J Am Chem Soc. 131, 1642-1643) a IA-SNARF (Richter, C.; Schneider, C.; Quick, Μ. T.; Volz, P.; Mahrwald, R.; Hughes, J.; Dick, B.; Alexiev, U., Ernsting, N. P. (2015) Dual-fluorescence pH probe for bio-labelling. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 30590-30597). Dále lze zmínit monitorování intracelulární viskozity pomocí prob založených na antracenu a anilinu (Liu, T.; Liu, X.; Spring, D. R.; Qian, X.; Cui, J.; Xu, Z. (2014) Quantitatively mapping cellular viscosíty with detailed organelle information via a designed PET fluorescent probe. Sci Rep. 4, 5418) a stanovení glutationu a cysteinu/homocysteinu (Yang, X.-F.; Huang, Q.; Zhong, Y.; Li, Z.; Li, H.; Lowry, M.; Escobedo, J. O.; Strongin, R. M. (2014) A duál emission fluorescent probe enables simultaneous detection of glutathione and cysteine/homocysteine. Chem Sci 5, 21772183). Duální proby jsou využívány také pro stanovení koncentrací bioanalytů přímo v živých buňkách: např. Zn2+ pomocí fluoresceinu/naftofluoresceinu (Chang, C. J.; Jaworski, J.; Nolan, E. M.; Sheng, M.; Lippard, S. J. (2004) A tautomeric zinc sensor for ratiometric fluorescence imaging: application to nitric oxideinduced release of intracellular zinc. Proč Nati Acad Sci USA. 101, 1129-1134) a 4-metyl-2-(2-pyridyl)-5-(2thiofenyl)thíazolu) (Zheng, Μ. H.; Hu, X.; Yang Μ. Y.; Jin, J. Y. (2015) Ratiometically fluorescent sensing of Zn(ll) based on dual-emission of 2-pyridylthiazole derivatives. J Fluoresc 25, 1831-1834), Cu2+ (Lys-Cu založeném na 1,8-naftalimidu a rhodaminu B) (Ren, M.; Deng, B.; Wang, J.-Y.; Liu, Z.-R.; Lin, W. (2015) A dual-emission fluorescence-enhanced probe for imaging copper(ll) ions in lysosomes. J. Mater. Chem. B 3, 67466752), Cd2+ (pomocí BODIPY proby), (Peng, X.; Du, J.; Fan, J.; Wang, J.; Wu, Y.; Zhao, J.; Sun, S.; Xu, T. (2007) A selective fluorescent sensor for imaging Cd2+ in living ceils. J. Am. Chem. Soc. 129, 1500-1501), Pb2+/Fe2+/Zn2+ (benzimidazolové rutheniové komplexy) (Kumar, A.; Singh, A. K.; Gupta, T. (2013) A stimuliresponsive smart probe for selective monitoring of multiple-cations via differential analyses. Analyst 138, 3356-3359) a Hg2+/Fe3+ (rhodaminové-azacrown etherové konjugáty) (Zhang, X.; Shiraishi, Y.; Hirai, T.
(2008) Fe(lll)- and Hg(ll)-selective duál channel fluorescence of a rhodamine-azacrown ether conjugate. Tetrahedron Lett 49, 4178-4181).
Mezi slibné aplikace duálních fluorescenčních prob patří intracelulární vizualizace dvou rozdílných buněčných organel jednou strukturou, kdy každá z organel je detekována při jiné vlnové délce. V současné době je situace taková, že jedna proba selektivně vizualizuje (barví) jednu organelu. Takovýto typ duálních prob byl popsán zatím v jediném případě, publikovaném v roce 2011 Loudetem et al. (Loudet, A.; Ueno, Y.; Wu, L; Jose, J.; Barhoumi, R.; Burghardt, R.; Burgess, K. (2011) Organelle-selective energy transfer: a fluorescent indicator of intracellular environment. Bioorg Med Chem Lett. 21, 1849-1851). Jedná se o konjugát kationického cyaninového barviva s BODIPY pro vizualizaci lysozomů (zelená fluorescence) a mitochondrií (červená fluorescence). Další práce popisující duální lokalizaci malé organické proby je z roku 2015 od Brancata et al. (Brancato, G.; Signore, G.; Neyroz, P.; Polli, D.; Cerullo, G.; Abbandonato, G.; Nucara, L.; Barone, V.; Beltram, F.; Bizzarri, R. (2015) Duál fluorescence through Kasha’s rule breaking: an unconventional photomechanism for intracellular probe design. J. Phys. Chem. B 119, 6144-6154), kde popisují, že látka 3-(benzo[d]thiazol-2-yl)-6,7-dimethoxy-2H-chromen-2one-4-karbonitril vykazuje duální emisi, ale autoři neuvádějí, v jakých buněčných organelách se látka nachází, což snižuje výpovědní hodnotu dané práce.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou dimethiniové sole založené na 2-B~anilidovinyl-N-alkylheteroaromátech obecné struktury I a II. Tyto látky lze využít v oblasti selektivní intracelulární lokalizace jako duální proby pro specifickou vizualizaci lysozomů a mitochondrií. Pomocí těchto fluorescenčních prob lze selektivně detekovat lysozomy jako organely se zelenou (respektive tyrkysovou) fluorescencí a mitochondrie jako organely s červenou fluorescencí. Barvení mitochondrií je možné kombinovat se značením dalších buněčných organel, jako je např. endoplazmatické retikulum anebo Golgiho komplex. Tyto proby jsou snadno připravitelné, kompatibilní s živými systémy, selektivní a mají požadované vlastnosti pro to, aby našly uplatnění ve fluorescenční mikroskopii pro biologické studie jako duální proby.
Předmětem vynálezu je 2-3-anilidovinyl-N-alkyl-heteroaromatická dimethiniová sůl a její použití jako duální proba pro mitochondriální a lysozomální vizualizaci, obecného vzorce I
R
kde R je H, F, Cl, Br, I, OH, S, alkyl Cl až C12, glykolové řetězce s počtem 1 až 8 glykolových (OCH2CH2-) opakujících se jednotek končících O-alkyl substituentem Cl až C12 nebo -OH skupinou, alkyl Cl až C8 sulfonové kyseliny nebo jejich odpovídající lithné nebo sodné, nebo draselné, nebo česné, nebo rubidné soli, allyl, propargyl, benzyl, nebo jejich kombinace;
kde Y je alkyl Cl až C18;
kde X je acetát, bromid, fluorid, fosfát, hexafluorfosfát, hydrogensulfát, chlorid, chloristan, jodid, mravenčan, nitrát, sulfát, tetrafluorborát;
a obecného vzorce II
HO kde R, Y a X mají výše uvedený význam.
Fluorescenční vlastnosti těchto prob jsou určovány aromatickým systémem, substituenty R, Y neovlivňují fluorescenci, proto je možná jejich poměrně značná variabilita. Bylo zjištěno, že dimethiniové soli je možné inkubovat do koncentrace 500nM s buněčnými liniemi, s výhodou s buněčnými liniemi U-2 OS, HeLa, MCF-7, HaCaT, HEK 293T a 4T1. Pro dosažení co nejúčinnější vizualizace mitochondrií a lysozomů a minimálního nespecifického barvení se ukázala 100-200nM koncentrace dimethiniových solí. Přípravy prob založených na 2^-anilidovinyl-N-alkylheteroaromátech jako duálních prob pro zobrazování lysozomů a mitochondrií jsou doloženy následujícími příklady.
::-: ·: ·· .: .·· : : . · : » · : :··.
............
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1.:Lokalizace látky 1 v mitochondriích a lysozomech buněk odvozených z karcinomu děložního čípku (HeLa). Panel mikroskopických snímků: A, E) průchozí světlo; B, F) látka 1 v mitochondriích HeLa buněk (červená emise fluorescence); C, G) látka 1 v lysozomech buněk HeLa (tyrkysová emise fluorescence); D, H) překryv snímků.
Obr. 2.:Lokalizace látky 2 v mitochondriích a lysozomech buněk odvozených z karcinomu děložního čípku (HeLa). Panel mikroskopických snímků: A) průchozí světlo; B) látka 2 v mitochondriích HeLa buněk (červená emise fluorescence), C) látka 2 v lysozomech buněk HeLa (tyrkysová emise fluorescence), D) překryv snímků.
Obr. 3.:Lokalizace látky 1 v mitochondriích a lysozomech buněk odvozených z osteosarkomu (U2 OS). Panel mikroskopických snímků: A) procházející světlo; B) látka 1 v mitochondriích U2 OS buněk (červená emise fluorescence), C) látka 1 v lysozomech buněk U-2 OS (tyrkysová emise fluorescence), D) překryv snímků.
Obr. 4.:Kolokalizace dvou mitochondriálních sond v mitochondriích. Lokalizace látky 1 v mitochondriích (B) a lysozomech (C) buněk odvozených z karcinomu děložního čípku (HeLa, snímek A v procházejícím světle), mitochondriální sonda MitoTracker GreenFM v mitochondriích (D) a překryv snímků (E).
Obr. 5.:Kolokalizace látky 1 a lysozomální sondy LysoTracker® Blue v lysosomech. Lokalizace látky 1 v lysozomech (1), lokalizace lysozomální sondy LysoTracker® Blue (LT-B) v lysozomech a překryv snímků. Panel mikroskopických snímků buněk 4T1.
Obr 6.: Lokalizace látky 2 a lysozomální sondy LysoTracker® Bluev lysosomech. Lokalizace látky 2 v lysozomech (2), lokalizace lysozomální sondy LysoTracker® Blue (LT-B) v lysozomech a překryv snímků. Panel mikroskopických snímků buněk 4T1.
Obr. 7.:Barvení mitochondrií, lysozomů a jader živých buněk. Lokalizace látky 1 v mitochondriích (B) a lysozomech (C) buněk odvozených z osteosarkomu (U-2 OS), snímek (A) v procházejícím světle, překryv snímků B a C (D) a překryv snímku D a barvením jader buněk U-2 OS pomocí DAPI (E).
Obr. 8.:Složení Dulbeccem modifikovaného Eaglova media s obsahem glukózy.
• · · • · · ·
Příklady provedení
Příklad 1
Příprava a charakterizace látky 1 spadající pod obecný vzorec I.
Látka 1; Kvarterní heteroaromatická sůl, W-propyl-2-metyl naftothiazolium jodid (410 mg, 1,11 mmol) a /V,/V-difenylformamidin (220 mg, 1,12 mmol) byly smíchány a taveny při 160 °C. Produkt byl získán jako hydrojodid, výtěžek 403 mg, 77 %. Charakterizace látky pomocí NMR je následující:
3H NMR (500 MHz, DMSO) δ: 11.39 (s, 1H), 8.74 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 8.13 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 9.05Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.78 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.46 (m, 4H), 7.21 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 6.42 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.47 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.87 (sextet, J = 7.1 Hz, 2H), 1.04 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, DMSO) δ: 168.4, 149.2, 139.4,
139.2, 130.9, 130.3, 130.1, 129.6, 129.3, 127.7, 126.5, 125.5, 123.6, 121.9, 117.5, 113.7, 90.3, 49.0,
21.5.11.2. ; HRMS: vypočítáno pro C22H21N2S = 345.1420, nalezeno: 345.1427.
Struktura látky 1, dimethiniové sole 1(E)- 2-(2-(phenylamino)vinyl)-3-propylnaphtho[2,l-d]thiazol-3 ium jodid
Fluorescenční maxima látky 1 dokládá tabulka 1.
Tabulka 1. Fluorescenční excitační a fluorescenční emisní maxima látky 1 v prostředí methanolu (MeOH) a lmM fosfátového pufru (PBS, pH 7,34).
| Látka | Prostředí | —Ϊ gt“ Aexmax [nm] | --------λ [B1 Aemmax [nm] |
| 1 | MeOH | 450 | 481 |
| PBS | 448 | 486 a 626 |
[θ] Aexmax-vlnová délka maxima fluorescence excitačního spektra [b] Aemmax- vlnová délka maxima fluorescence emisního spektra
Příklad 2
Příprava a charakterizace látky 2 spadající pod obecný vzorec II.
Látka 2; Kvarterní heteroaromatická sůl, N-propyl-2-metyl naftothiazolium jodid (372 mg, 1,11 mmol) a /V,A/-difenylformamidin (220 mg, 1,12 mmol) byly smíchány a taveny při 160 °C. Produkt byl získán jako hydrojodid, výtěžek 341 mg, 70 %. Charakterizace látky pomocí NMR je následující:
XH NMR (500 MHz, DMSO) δ 11.30 (s, 1H), 10.27 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 12H), 7.43 (d, j = 4.0 Hz, 4H), 7.26 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.19 (m, 1H), 6.99 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 12.2 Hz,
1H), 4.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.80 (sextet, J = 7.2 Hz, 2H), 1.00 (t, J = 7.3 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz,
DMSO) δ 169.75, 158.29, 148.79, 142.04, 139.02, 129.72, 124.83, 123.89, 117.16, 114.99, 114.59,
100.83, 89.95, 48.19, 20.63, 10.95.; HRMS: vypočítáno pro C18Hi9N2OS = 311.1213, nalezeno:
311.1218.
Struktura látky 2, dimethiniové sole 2, (E)-5-hydroxy-2-(2-(phenylamino)vinyl)-3 propylbenzo[cf]thiazol-3-ium jodid
Fluorescenční maxima látky 2 dokládá tabulka 2.
Tabulka 2. Fluorescenční excitační a fluorescenční emisní maxima látky 2 v prostředí methanolu (MeOH) a lmM fosfátového pufru (PBS, pH 7,34).
| Látka | Prostředí | Ϊ----láT“ Aexmax [nm] | ------λ 'kmmax [nm] |
| 2 | MeOH | 426 | 484 |
| PBS | 425 | 474 a 498 |
[a] Áexrnax - vlnová délka maxima fluorescence excitačního spektra [b] Áemmax-vlnová délka maxima fluorescence emisního spektra ··· · · · · · ·· ···· ··· ··· ··· ··
Příklad 3
Selektivní lokalizace látek 1 a 2 v lysozomech (tyrkysová emise fluorescence) a v mitochondriích (červená emise fluorescence)
Příprava zásobního roztoku
Vzhledem k nízké rozpustnosti látek 1 a 2 ve vodě byly sloučeniny rozpuštěny v dimetylsulfoxidu, dimetylformamidu, methanolu a ethanolu. Koncentrace zásobních roztoků, které byly uchovávány ve tmě při -20 °C, byla lOmM. Před použitím byly roztoky za nepřístupu světla temperovány na laboratorní teplotu (cca 23 °C) a řádně promíchány.
Příprava buněk pro značení mitochondrií
Buňky linie HeLa byly kultivovány v DMEM médiu (Dulbeccem modifikované Eaglovo medium s vysokým obsahem glukózy - složení viz obrázek 8 - D5671, Sigma USA) doplněném o 10% fetální bovinní sérum (FBS, Thermo Scientific, USA). Buňky byly udržovány v logaritmické fázi růstu a kultivovány za standardních podmínek (37 °C, 5% CO2, 95% vlhkosti). Pro mikroskopické experimenty bylo inokulováno 100 000 buněk na kultivační misky se skleněným dnem (průměr 35 mm, MatTek, USA). Buňky byly inkubovány za standardních podmínek po dobu 16 h.
Buňky odvozené od linie osteosarkomu (U-2 OS) byly kultivovány v DMEM médiu (Dulbeccem modifikované Eaglovo medium s obsahem glukózy - složení viz obrázek 8 - D5546, Sigma USA) doplněném o 10% fetální bovinní sérum (FBS, Thermo Scientific, USA). Buňky byly udržovány v logaritmické fázi růstu a kultivovány za standardních podmínek (37 °C, 5% CO2, 95% vlhkosti). Pro mikroskopické experimenty bylo inokulováno 100 000 buněk na kultivační misky se skleněným dnem (průměr 35 mm, MatTek, USA). Buňky byly inkubovány za standardních podmínek po dobu 24 h
Buňky odvozené od buněčné linie 4T1 byly kultivovány v DMEM médiu (Dulbeccem modifikované Eaglovo medium s vysokým obsahem glukózy - složení viz obrázek 8 - D5796, Sigma USA) doplněném o 10% fetální bovinní sérum (FBS, Thermo Scientific, USA). Buňky byly udržovány v logaritmické fázi růstu a kultivovány za standardních podmínek (37 °C, 5% CO2, 95% vlhkosti). Pro mikroskopické experimenty bylo inokulováno 100 000 buněk na kultivační misky se skleněným dnem (průměr 35 mm, MatTek, USA). Buňky byly inkubovány za standardních podmínek po dobu 16 h.
Barvení mitochondrií a lysozomů v živých buňkách pomocí látek 1 a 2
Dvě sady připravených Hela buněk a buněk linie U-2 OS podle popisu výše byly dvakrát omyty předehřátým (37 °C) fosfátovým pufrem (PBS; pH 7,4) a 10 min. inkubovány s dimethiniovou solí 1 « « ·· · · · ···« ·· ·· ····· • · · · · · · · ·· ···· ··· ··· ··· ·· nebo 2 ze zásobního roztoku dimethylsulfoxidu, o koncentraci 200 nM v kompletním kultivačním médiu. Po barvení byly buňky dvakrát omyty fosfátovým pufrem a inkubovány v čerstvém kompletním médiu bez fenolové červeně.
Fluorescenční mikroskopie
Buňky byly po inkubaci s dimethiniovou solí 1 nebo 2 omyty fosfátovým pufrem a pozorovány pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu CellAR (Olympus, Japonsko) za použití 60x (numerická apertura 1,4), a lOOx imersního objektivu (Olympus, Japonsko). V závislosti na spektroskopických vlastnostech testované látky byl použit fluorescenční filtr TRITC, Texas Red, RFP (pro mitochondrie) a FITC, CFP (pro lysozomy). Lokalizace dimethiniových solí v živých buňkách odvozených z buněčné linie HeLa a U-2 OS byla studována v reálném čase. Snímky z mikroskopu jsou zobrazeny na obrázcích 1, 2 a 3. Snímky z fluorescenčního mikroskopu ukazují lokalizaci látky 1 a 2 v mitochondriích a lysozomech buněk odvozených z karcinomu děložního čípku (HeLa) a buněk linie U-2 OS. Snímky dokládají červenou emisní fluorescenci mitochondrií a tyrkysovou emisní fluorescenci lysozomů po použití látky 1 nebo látky 2.
Příklad 4
Kolokalizace látky 1 a mitochondriální sondy MitoTracker Green™ v mitochondriích
Buňky linie HeLa byly připraveny podle příkladu 3 a barveny roztokem dimethiniové sole 1, jak je popsáno v příkladu 3 ve formě zásobního roztoku s dimethylformamidem, o koncentraci v kultivačním médiu 150 nM. Po barvení byly buňky dvakrát omyty fosfátovým pufrem a barveny 120nM roztokem mitochondriální sondy MitoTracker Green™ (Thermo Scientific, USA) rozpuštěné v kompletním kultivačním médiu. Inkubace buněk probíhala za standardních kultivačních podmínek (37 °C, 5 % CO2, 95 % vlhkost) po dobu 10 min. Buňky byly dvakrát omyty fosfátovým pufrem a inkubovány s čerstvým kompletním médiem bez fenolové červeně a mikroskopovány.
Fluorescenční mikroskopie
HeLa buňky byly po inkubaci s dimethiniovou solí 1 a následném obarvení mitochondriální sondou MitoTracker Green™ podle postupu výše omyty fosfátovým pufrem a pozorovány pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu CellAR (Olympus, Japonsko) za použití 60x (numerická apertura 1,4), a lOOx imersního objektivu (Olympus, Japonsko). V závislosti na spektroskopických vlastnostech testované látky byl použit fluorescenční filtr TRITC, Texas Red, RFP (pro mitochondrie) a FITC, CFP (pro lysozomy). Lokalizace dimethiniových solí v živých buňkách odvozených z buněčné linie HeLa byla studována v reálném čase. Snímky z mikroskopu jsou zobrazeny na obrázku 4. Snímky z fluorescenčního mikroskopu ukazují kolokalizaci látky 1 v mitochondriích a lysozomech buněk
• · • · · ··· ··· ·· odvozených z karcinomu děložního čípku (HeLa) spolu s komerční mitochondriální sondou MitoTracker Green™. Snímky dokládají červenou emisní fluorescenci mitochondrií, tyrkysovou emisní fluorescenci lysozomů po použití látky 1 a zelenou emisní flourescenci mitochondriální sondy MitoTracker Green™. Po překryvu snímků je patrný i překryv lokalizace látky 1 a mitochondriální sondy.
Příklad 5
Kolokalizace látky 1 a lysozomální sondy LysoTracker® Blue DND-22 v lysosomech
4T1 buňky byly připraveny podle příkladu 3 a barveny roztokem dimethiniové sole 1, jak je popsáno v příkladu 3 ve formě zásobního roztoku s methanolem, o koncentraci v kultivačním médiu 300 nM po dobu 30 min. Po barvení byly buňky dvakrát omyty fosfátovým pufrem a barveny po dobu 30 min. 500nM roztokem sondy pro lysozomy LysoTracker® Blue DND-22 (Thermo Scientific, USA) rozpuštěné v kompletním médiu; buňky byly inkubovány za standardních kultivačních podmínek (37 °C, 5 % CO2, 95 % vlhkost). Poté byly buňky omyty fosfátovým pufrem a inkubovány v čerstvém kompletním kultivačním médiu bez fenolové červeně a mikroskopovány.
Fluorescenční mikroskopie
4T1 buňky byly po inkubaci s dimethiniovou solí 1 a následném obarvení lysozomální sondou LysoTracker® Blue podle postupu výše_omyty fosfátovým pufrem a pozorovány pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu CellAR (Olympus, Japonsko) za použití 60x (numerická apertura 1,4), a lOOx imersního objektivu (Olympus, Japonsko). V závislosti na spektroskopických vlastnostech testované látky byl použit fluorescenční filtr FITC, CFP (pro lysozomy). Lokalizace dimethiniových solí v živých buňkách odvozených do buněčné linie 4T1 byla studována v reálném čase. Snímky z mikroskopu jsou zobrazeny na obrázku 6. Snímky z fluorescenčního mikroskopu ukazují kolokalizaci látky 1 v lysozomech buněk odvozených z buněčné linie 4T1 spolu s komerční lysozomální sondou LysoTracker® Blue. Snímky dokládají tyrkysovou emisní fluorescenci lysozomů po použití látky 1 a modrou emisní flourescenci lysozomální sondy LysoTracker® Blue. Po překryvu snímků je patrný i překryv lokalizace látky 1 a lysozomální sondy.
Příklad 6 • · · · ·· · • ·· ·· ··· • · · ·· ·« • · · · · · · • · · ·· · ··· ··· ··· ··· ··
Barvení mitochondrií, lysozomů a jader živých buněk pomocí látky 1 a jaderné sondy DAPI
U2-OS buňky byly připraveny podle příkladu 3 a barveny roztokem dimethiniové sole 1, jak je popsáno v příkladu 3 ve formě zásobního roztoku s ethanolem, o koncentraci v kultivačním médiu 100 nM. Po obarvení byly buňky dvakrát omyty fosfátovým pufrem a barveny 5 min. roztokem jaderné sondy 4,6'-diamidino-2-fenylindolu (DAPI, 5 pg/ml) v kompletním médiu. Buňky byly inkubovány za standardních kultivačních podmínek (37 °C, 5 % CO2, 95 % vlhkost). Poté byly buňky omyty fosfátovým pufrem a inkubovány v čerstvém kompletním kultivačním médiu bez fenolové červeně a mikroskopovány.
Fluorescenční mikroskopie
U2-0S buňky byly po inkubaci s dimethiniovou solí 1 a následném obarvení jadernou sondou DAPI podle postupu výše omyty fosfátovým pufrem a pozorovány pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu CellAR (Olympus, Japonsko) za použití 60x (numerická apertura 1,4), a lOOx imersního objektivu (Olympus, Japonsko). V závislosti na spektroskopických vlastnostech testované látky byl použit fluorescenční filtr TRITC, Texas Red, RFP (pro mitochondrie) a FITC, CFP (pro lysozomy). Lokalizace dimethiniových solí v živých buňkách odvozených z buněčné linie U-2 OS byla studována v reálném čase. Snímky z mikroskopu jsou zobrazeny na obrázku 7. Snímky z fluorescenčního mikroskopu ukazují kolokalizaci látky 1 v mitochondriích a lysozomech buněk odvozených z buněčné linie U-2 OS spolu s komerční jadernou sondou DAPI. Snímky dokládají červenou emisní fluorescenci mitochondrií, tyrkysovou emisní fluorescenci lysozomů po použití látky 1 a modrou emisní flourescenci jaderné sondy DAPI. Po překryvu snímků jsou jasně viditelné jednotlivé organely.
Průmyslová využitelnost
2-3-Aiilidovinyl-N-alkyl-heteroaromatické sole jsou využitelné jako prostředek pro fluorescenční mikroskopii. Jejich využití spočívá především v tom, že je lze použít jako duální proby pro selektivní značení jak lysozomů, tak i mitochondrií buněk, přičemž lysozomy jsou těmito látkami zbarvovány zeleně (respektive tyrkysové) a mitochondrie červeně.
Claims (2)
1.
2-3-^nilidovinyl-N-alkyl-heteroaromatická dimethiniová sůl obecného vzorce I kde R je H, F, Cl, Br, I, OH, S, alkyl Cl až C12, glykolové řetězce s počtem 1 až 8 glykolových (OCH2CH2-) opakujících se jednotek končící O-alkyl substituentem Cl až C12 nebo -OH skupinou, alkyl Cl až C8 sulfonové kyseliny nebo odpovídající jejich lithné nebo sodné, nebo draselné, nebo česné, nebo rubidné soli, allyl, propargyl, benzyl, nebo jejich kombinace;
kde Y je alkyl Cl až C18;
kde X je acetát, bromid, fluorid, fosfát, hexafluorfosfát, hydrogensulfát, chlorid, chloristan, jodid, mravenčan, nitrát, sulfát, tetrafluorborát.
2. Použití 2^-anilidovinyl-N-alkyl-heteroaromatické dimethiniové soli obecného vzorce I nebo II podle nároku 1 jako duální proby pro vizualizaci lysozomů a mitochondrií vedle sebe ve fluorescenční mikroskopii.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-682A CZ307768B6 (cs) | 2016-11-02 | 2016-11-02 | 2-β-Anilidovinyl-N-alkylheteroaromatická dimethiniová sůl a její použití jako duální proba pro mitochondriální a lysozomální vizualizaci |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-682A CZ307768B6 (cs) | 2016-11-02 | 2016-11-02 | 2-β-Anilidovinyl-N-alkylheteroaromatická dimethiniová sůl a její použití jako duální proba pro mitochondriální a lysozomální vizualizaci |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2016682A3 true CZ2016682A3 (cs) | 2018-05-09 |
| CZ307768B6 CZ307768B6 (cs) | 2019-04-24 |
Family
ID=62068377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2016-682A CZ307768B6 (cs) | 2016-11-02 | 2016-11-02 | 2-β-Anilidovinyl-N-alkylheteroaromatická dimethiniová sůl a její použití jako duální proba pro mitochondriální a lysozomální vizualizaci |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307768B6 (cs) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE471515A (cs) * | 1940-12-04 | |||
| US5183813A (en) * | 1992-02-19 | 1993-02-02 | Sterling Winthrop Inc. | Antiarrhythmic agents |
-
2016
- 2016-11-02 CZ CZ2016-682A patent/CZ307768B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ307768B6 (cs) | 2019-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | A coumarin–indole-based near-infrared ratiometric pH probe for intracellular fluorescence imaging | |
| Ge et al. | A simple pH fluorescent probe based on new fluorophore indolizine for imaging of living cells | |
| Guy et al. | Convergent preparation and photophysical characterization of dimaleimide dansyl fluorogens: elucidation of the maleimide fluorescence quenching mechanism | |
| Wu et al. | Dual-modal colorimetric/fluorescence molecular probe for ratiometric sensing of pH and its application | |
| Niu et al. | Ratiometric emission fluorescent pH probe for imaging of living cells in extreme acidity | |
| Ge et al. | A simple fluorescent probe for monitoring pH in cellsbased on new fluorophorepyrido [1, 2-a] benzimidazole | |
| Mao et al. | Highly sensitive quinoline-based two-photon fluorescent probe for monitoring intracellular free zinc ions | |
| WO2015153813A1 (en) | Azetidine-substituted fluorescent compounds | |
| Li et al. | An effective “turn-on” rodamine-based fluorescent chemosensor for Cu (II) in living cells | |
| Hou et al. | Sensitive detection and imaging of endogenous peroxynitrite using a benzo [d] thiazole derived cyanine probe | |
| Cui et al. | A novel polarity-sensitive fluorescent probe for lighting up lipid droplets and its application in discriminating dead and living zebrafish | |
| Tantipanjaporn et al. | Quinolinium-based viscosity probes for lysosome imaging and tracing lysosomal viscosity changes in living cells | |
| Dai et al. | A quick response fluorescent probe based on coumarin and quinone for glutathione and its application in living cells | |
| CA3004831A1 (en) | Fluorochromes for organelle tracing and multi-color imaging | |
| Sabouri et al. | Construction of a Highly Sensitive Thiol‐Reactive AIEgen‐Peptide Conjugate for Monitoring Protein Unfolding and Aggregation in Cells | |
| He et al. | Multifunctional fluorescent nanoprobe for sequential detections of Hg2+ ions and biothiols in live cells | |
| Liu et al. | A squaraine-based red emission off–on chemosensor for biothiols and its application in living cells imaging | |
| CN111004246B (zh) | 监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用 | |
| Jin et al. | Novel near-infrared pH-sensitive cyanine-based fluorescent probes for intracellular pH monitoring | |
| Pei et al. | TICT-based microenvironment-sensitive probe with turn-on red emission for human serum albumin detection and for targeting lipid droplet imaging | |
| Li et al. | A lysosomal probe for monitoring of pH in living cells and ovarian tumour | |
| Niu et al. | A novel pH fluorescent probe based on indocyanine for imaging of living cells | |
| CN105062467B (zh) | 一种转子型的双红线粒体荧光探针及其应用 | |
| Tian et al. | A series of water-soluble pyridinium derivatives with two-photon absorption in the near infrared region for mitochondria targeting under stimulated emission depletion (STED) nanoscopy | |
| Chen et al. | Two novel two-photon excited fluorescent pH probes based on the A-π-D-π-A system for intracellular pH mapping |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20191102 |