CZ2015670A3 - Purification process of betulin and lupeol and betulin and lupeol prepared thereby - Google Patents
Purification process of betulin and lupeol and betulin and lupeol prepared thereby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2015670A3 CZ2015670A3 CZ2015-670A CZ2015670A CZ2015670A3 CZ 2015670 A3 CZ2015670 A3 CZ 2015670A3 CZ 2015670 A CZ2015670 A CZ 2015670A CZ 2015670 A3 CZ2015670 A3 CZ 2015670A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- betulin
- lupeol
- solution
- ethanol
- filtered
- Prior art date
Links
Abstract
Předkládané řešení se týká způsobu purifikace betulinu a lupeolu z extraktu směsi triterpenů březové kůry, který obsahuje následující kroky: a) extrakt směsi triterpenů březové kůry se rozpustí v acetonu, s výhodou za varu; b) vzniklý roztok se za horka přefiltruje, filtrát se naředí destilovanou vodou, vzniklá suspenze se zfiltruje, promyje destilovanou vodou a vysuší; c) sraženina vzniklá v kroku b) se rozpustí v ethanolu za varu, k roztoku se přidá horký roztok CaCl.sub.2.n.v ethanolu a k takto vzniklému čirému roztoku se pomalu přidává horký ethanolový roztok NaOH, za postupného vzniku nerozpustného Ca(OH).sub.2.n., který se odfiltruje, přičemž filtrát se ponechá krystalizovat, vzniklá krystalická sraženina se zfiltruje, promyje ethanolem a vodou a vysuší; d) krystalická sraženina vzniklá v kroku c) se rozpustí v chloroformu, s výhodou za varu, a vzniklý roztok se vysráží petroléterem a/nebo benzinem a/nebo čistým nízkým uhlovodíkem, vybraným ze skupiny obsahující (C5 až C8) uhlovodíky, s výhodou pentan, hexan, cyklohexan, heptan, přičemž vzniklá sraženina betulinu se zfiltruje, promyje petroléterem a/nebo benzinem a/nebo čistým nízkým uhlovodíkem, vybranými ze skupiny obsahující (C5 až C8) uhlovodíky, s výhodou pentan, hexan, cyklohexan, heptan, a vysuší, přičemž proces vaření, filtrace a sušení je s výhodou alespoň ještě jednou zopakován; získaný filtrát obsahující lupeol se odpaří; e) sraženina nebo filtrát z kroku d) se rozpustí v minimálním množství chloroformu za laboratorní teploty, vzniklý roztok se selektivně přefiltruje přes silikagel v chloroformu a bezbarvý filtrát se odpaří dosucha. Předkládané řešení se dále týká betulinu a lupeolu připravitelných tímto způsobem.The present invention relates to a process for purifying betulin and lupeol from an extract of a birch bark triterpene mixture comprising the steps of: a) dissolving the birch bark triterpene mixture in acetone, preferably at boiling; b) filtering the resulting solution, diluting the filtrate with distilled water, filtering the suspension, washing with distilled water and drying; c) the precipitate formed in step b) is dissolved in ethanol at boiling, a hot solution of CaCl.sub.2 in ethanol is added to the solution and hot ethanolic NaOH solution is added slowly to the resulting clear solution, with the formation of insoluble Ca (OH). which is filtered off, the filtrate is left to crystallize, the resulting crystalline precipitate is filtered, washed with ethanol and water and dried; d) dissolving the crystalline precipitate formed in step c) in chloroform, preferably at boiling point, and precipitating the resulting solution with petroleum ether and / or petrol and / or a pure low hydrocarbon selected from the group consisting of (C5 to C8) hydrocarbons, preferably pentane , hexane, cyclohexane, heptane, wherein the betulin precipitate formed is filtered, washed with petroleum ether and / or gasoline and / or pure low hydrocarbon selected from the group consisting of (C5 to C8) hydrocarbons, preferably pentane, hexane, cyclohexane, heptane, and dried wherein the cooking, filtration and drying process is preferably repeated at least once again; the lupeol-containing filtrate obtained is evaporated; e) dissolving the precipitate or filtrate from step d) in a minimum amount of chloroform at room temperature, filtering the resulting solution selectively through silica gel in chloroform and evaporating the colorless filtrate to dryness. The present invention further relates to betulin and lupeol obtainable by this method.
Description
Způsob purifíkace betulinu a lupeolu, betulin a lupeol připravitelné tímto způsobemMethod for purifying betulin and lupeol, betulin and lupeol preparable in this way
Oblast technikyField of technology
Předkládaný vynález se týká způsobu purifíkace betulinu a lupeolu z extraktu březové kůry, betulinu a lupeolu připravitelných tímto způsobem.The present invention relates to a process for the purification of betulin and lupeol from birch bark, betulin and lupeol extract obtainable by this process.
Dosavadní stav technikyPrior art
Betulin (strukturní vzorec I) a lupeol (strukturní vzorec II) jsou pentacyklické triterpeny lupanového typu. Jedná se o lipofilní přírodní látky rostlinného původu, prakticky nerozpustné ve vodě.Betulin (structural formula I) and lupeol (structural formula II) are pentacyclic triterpenes of the lupane type. These are lipophilic natural substances of plant origin, practically insoluble in water.
Bohatým zdrojem lupeolu a zvláště betulinu je vnější kůra některých druhů bříz, např. druhu Betula pendula (syn. B. alba), široce rozšířeného ve střední Evropě. Břízy produkují i jiné triterpenoidy, např. kyselinu betulinovou, kyselinu oleanovou, erythrodiol, betulon apod., obvykle ale v podstatně menším množství a v závislosti na botanickém druhu. Samotná kůra, zdaleka nejbohatší zdroj triterpenů z celé břízy, je pak masivním odpadem dřevařského a zvláště papírenského průmyslu a většinou je využívána jen jako palivo pro výrobu tepla resp. kombinovanou výrobu tepla a elektřiny.A rich source of lupeol and especially betulin is the outer bark of some species of birch, such as Betula pendula (syn. B. alba), widespread in Central Europe. Birches also produce other triterpenoids, such as betulinic acid, oleanic acid, erythrodiol, betulon, etc., but usually in significantly smaller amounts and depending on the botanical species. The bark itself, by far the richest source of triterpenes from the whole birch, is then a massive waste of the wood and especially paper industry and is mostly used only as a fuel for heat production or. combined heat and power.
Betulin vykazuje velmi širokou škálu biologických a medicínských účinků. Popsány byly účinky antimykotické, antibakteriální, protizánětlivé, antivirové, anti-HIV, hepatoprotektivní a především antiproliferativní a protinádorové. Navíc bylo prokázáno, že betulin velmi příznivě ovlivňuje léčbu atherosklerózy a obezity způsobené nevhodnou výživou a zvyšuje citlivost buněk na insulin u diabetů II typu. Betulin je tak mimořádně perspektivní léčivo v mnohých oblastech humánní medicíny, přičemž je klasifikován jako prakticky netoxický. Betulin je také v mnohem větších množstvích dosud zpracováván do kosmetických výrobků a jako součást doplňků výživy.Betulin has a very wide range of biological and medical effects. Antifungal, antibacterial, anti-inflammatory, antiviral, anti-HIV, hepatoprotective and especially antiproliferative and antitumor effects have been described. In addition, betulin has been shown to have a very beneficial effect on the treatment of atherosclerosis and obesity due to malnutrition and to increase the sensitivity of cells to insulin in type II diabetes. Betulin is thus an extremely promising drug in many areas of human medicine, and is classified as virtually non-toxic. Betulin is also still processed in much larger quantities into cosmetic products and as part of nutritional supplements.
Lupeol byl doposud zkoumán o něco méně než betulin. Hlavními příčinou mohou být jeho podstatně vyšší cena, než je u betulinu, a patrně také ještě menší rozpustnost ve vodě a v polárních organických rozpouštědlech. Lze však předpokládat, že díky své vysoké strukturní podobnosti (chybí jen OH-skupina na 28. uhlíku) bude vykazovat prakticky stejné biologické účinky jako betulin a bude tedy mít v budoucnu i podobné využití (M. Saleem, Cancer Lett, 2008, 285, 109-115; S. Ciurlea et al., J Agroalimentary Processes and Technologies, 2010, 16(4), 427).Lupeol has so far been studied slightly less than betulin. The main reasons may be its significantly higher price than betulin, and probably also even lower solubility in water and polar organic solvents. However, it can be assumed that due to its high structural similarity (only the OH group on the 28th carbon is missing) it will have practically the same biological effects as betulin and will therefore have similar uses in the future (M. Saleem, Cancer Lett, 2008, 285, 109-115; S. Ciurlea et al., J Agroalimentary Processes and Technologies, 2010, 16 (4), 427).
Betulin se zdaleka nejčastěji izoluje z kůry bříz. Aby se extrahovatelné látky získaly z přírodních materiálů efektivně, je obvykle nutné surovinu dostatečně rozmělnit. V průmyslovém měřítku se pro březovou kůru používají většinou mlýny. Pro lepší účinnost extrakce triterpenů je navíc vhodné alespoň hrubě oddělit vnější kůru s podstatně vyšším obsahem těchto látek od vnitřní kůry, což lze udělat průmyslově flotací částeček za přítomnosti smáčedla nebo např. selektivním fukarem využívajícím vyšší měrné hmotnosti částic vnitřní kůry.Betulin is by far the most commonly isolated from birch bark. In order to obtain extractables from natural materials efficiently, it is usually necessary to grind the raw material sufficiently. On an industrial scale, mills are mostly used for birch bark. In addition, for better efficiency of triterpene extraction, it is suitable to at least roughly separate the outer crust with a substantially higher content of these substances from the inner crust, which can be done industrially by flotation of particles in the presence of wetting agent or by a selective blower using higher specific gravities of inner crust particles.
Extrakci triterpenů z březové kůry lze po rozemletí nebo po rozdrcení suché kůry také usnadnit či urychlit působením ultrazvuku, aktivací kury pomocí vodní páry nebo přehřáté vodní páry nebo působením mikrovln. Vlastní extrakce triterpenů má velké množství modifikací, lišících se především použitými extrakčními činidly. Mnohá z nich však jsou pro průmyslové využití nevhodná, buď pro svou vyšší cenu a menší dostupnost, pro svou horší recyklovatelnost (např. destilací^ nebo pro nebezpečnost pro zdraví či pro životní prostředí. V literatuře se lze setkat napr. s použitím methanolu, ethanolu, propanolu, butanolu, heptanu, hexanu, cyklohexanu, petroléteru, toluenu, xylenů, acetonu a jiných ketonů, dichlorethanu, chloroformu, ethylacetátu a jiných esterů, limonenu, éterů a dokonce i iontových látek na bázi imidazolu. Velmi často se také používají různé směsi organických rozpouštědel, někdy i směsi obsahující nezanedbatelné množství vody (WO 2005/04^04 a EP 2^514^130).Extraction of triterpenes from birch bark after grinding or crushing the dry bark can also be facilitated or accelerated by ultrasound, activation of the bark with steam or superheated steam or microwaves. The actual extraction of triterpenes has a large number of modifications, differing mainly in the extraction reagents used. However, many of them are unsuitable for industrial use, either due to their higher cost and lower availability, due to their poorer recyclability (eg by distillation) or due to health or environmental hazards. In the literature, for example, methanol, ethanol can be found. , propanol, butanol, heptane, hexane, cyclohexane, petroleum ether, toluene, xylenes, acetone and other ketones, dichloroethane, chloroform, ethyl acetate and other esters, limonene, ethers and even ionic imidazole-based substances. organic solvents, sometimes mixtures containing a considerable amount of water (WO 2005/04 ^ 04 and EP 2 ^ 514 ^ 130).
Poněkud složitější a technicky náročnější jsou superkritické extrakce využívající jako extrakční činidlo oxid uhličitý v superkritickém stavu (EP 2^25^860) nebo oxid uhličitý ve směsi s methanolem, ethanolem nebo acetonem v superkritickém stavu (CN^634^72, U^00^158414).Somewhat more complex and technically demanding are supercritical extractions using supercritical carbon dioxide (EP 2 ^ 25 ^ 860) or carbon dioxide in a mixture with methanol, ethanol or acetone in the supercritical state (CN ^ 634 ^ 72, U ^ 00 ^) as the extracting agent. 158414).
Betulin však může být před vlastní extrakcí převeden ještě v kůře na diacetát (EP 2jj25j860).However, betulin can be converted to diacetate in the bark before the actual extraction (EP 2jj25j860).
Je také známá metoda sublimační, kdy je vysušená kůra zahřívána na vysokou teplotu (až přes 300 C) při atmosférickém tlaku nebo za podtlaku a betulin (patrně s lupeolem) je vysublimován (M. Guidoinet al., Themochim. Acta, 2003, 398, 153).A sublimation method is also known, in which the dried bark is heated to a high temperature (up to 300 ° C) at atmospheric pressure or under vacuum and betulin (probably with lupeol) is sublimed (M. Guidoinet et al., Themochim. Acta, 2003, 398, 153).
Ze způsobů purifikace betulinu z primárních extraktů se v laboratorním měřítku používají převážně metody založené na kapalinové chromatografii, resp. flash-chromatografii, které jsou ale použitelné víceméně jen pro laboratorní přípravu, protože kapalinová chromatografíe by v poloprovozním nebo průmyslovém měřítku byla při purifikaci triterpenů příliš náročná na čas, na materiál použitý jako stacionární fáze (po několika purifíkacích by i přes promývání kolon nakonec došlo k jejich zanesení; u flash-chromatografie jsou pak kolony jednorázové) a hlavně na množství použitých elučních činidel, tedy organických rozpouštědel. Proto se pro použití ve výrobě větších množství betulinu a jiných triterpenů mnohem lépe hodí metody založené na rozdílné rozpustnosti v různých rozpouštědlech a na rekrystalizaci.Among the methods of purification of betulin from primary extracts, mainly methods based on liquid chromatography, resp. flash chromatography, which are more or less usable only for laboratory preparation, because liquid chromatography would be too time-consuming for the purification of triterpenes on a pilot scale or industrial scale, for material used as stationary phase (after several purifications, despite column washing) in flash chromatography, the columns are disposable) and mainly on the amount of eluents used, i.e. organic solvents. Therefore, methods based on different solubilities in different solvents and on recrystallization are much better suited for use in the production of larger amounts of betulin and other triterpenes.
Lupeol se obvykle izoluje z jiných rostlin, které většinou neobsahují betulin a není jej tak třeba oddělovat, např. z rostlin rodu Lupinus, Calotropis, Oxystelma a mnoha dalších. Nicméně pro průmyslovou výrobu lupeolu se jeví jako nejvýhodnější zdroj březová kůra hlavně díky masivní dostupnosti této suroviny.Lupeol is usually isolated from other plants that usually do not contain betulin and do not need to be separated, such as plants of the genus Lupinus, Calotropis, Oxystelma and many others. However, for the industrial production of lupeol, birch bark appears to be the most advantageous source mainly due to the massive availability of this raw material.
Izolaci lupeolu z březové kůry popisuje CNThe isolation of lupeol from birch bark is described by CN
161. Metoda je zpočátku relativně jednoduchá, založená na extrakci dichlormethanem, přečištění cyklohexanem a dvojí krystalizací ze směsi ethanol/aceton. Takto byla získána frakce obohacená lupeolem až na cca 80 %. Ovšem další přečištění na „pure lupeol se již děje klasickou chromatografii na silikagelu elucí směsí petroléter/ethylacetát, což metodu pro průmyslové použití výrazně komplikuje. Zmíněný patent nijak neřeší izolaci a případnou purifikaci betulinu, která by mohla probíhat současně.161. The method is initially relatively simple, based on extraction with dichloromethane, purification with cyclohexane and double crystallization from ethanol / acetone. Thus, a fraction enriched with lupeol up to about 80% was obtained. However, further purification to "pure lupeol" already takes place by classical chromatography on silica gel, eluting with a petroleum ether / ethyl acetate mixture, which considerably complicates the method for industrial use. The said patent does not address in any way the isolation and possible purification of betulin, which could take place simultaneously.
US 200^153(776 popisuje izolaci a purifikaci betulinu z březové kůry. Používá málo dostupná a drahá rozpouštědla, z hlediska ekologického nevhodná (toluen, xylen, vyšší étery společně s vodou, se kterou tato rozpouštědla tvoří azeotropickou směs a jejich část je tudíž obtížně recyklovatelná). Deklarovaná čistota konečného produktu je pod 96 %, přičemž autoři uvádějí o 3 C vyssi teplotu táni, nez je všeobecne publikovaná. Způsob extrakce z kůry pak vykazuje relativně velmi malou účinnost. Obdobně je tomu - včetně dosažené čistoty - i u DE10204278.U.S. Pat. No. 200,153 (776) describes the isolation and purification of betulin from birch bark. It uses little available and expensive, environmentally unsuitable solvents (toluene, xylene, higher ethers together with water, with which these solvents form an azeotropic mixture and are therefore difficult to The declared purity of the final product is below 96%, the authors reported a melting point 3 C higher than the generally published method, and the bark extraction method shows a relatively low efficiency, as is DE10204278.
WO 2005/04^304 využívá k izolaci a purifikaci betulinu, lupeolu a kyseliny betulinové systém extrakcí, srážení a krystalizací s použitím organických rozpouštědel (xylenu, acetonu, cyklohexanu a isopropanolu). Není zde vyřešen problém s recyklací značného množství použitého xylenu tvořícího s vodou azeotropickou směs.WO 2005/0444304 uses a system of extraction, precipitation and crystallization using organic solvents (xylene, acetone, cyclohexane and isopropanol) for the isolation and purification of betulin, lupeol and betulinic acid. The problem of recycling a considerable amount of used xylene to form an azeotropic mixture with water is not solved here.
RU 2^27(^202 popisuje pro oddělení a purifikaci betulinu a lupeolu systém extrakcí, rozpouštění, filtrací a krystalizací. Extrakční kroky jsou mnohokrát opakovány (např. na dvou místech purifikačního procesu 5 stejných extrakcí najeden purifikační krok), což nejenže zvyšuje ztráty v procesu, především však proces velmi prodlužuje. Získané produkty mají čistotu deklarovanou pod 96 %.RU 2 ^ 27 (^ 202 describes a system for extraction, dissolution, filtration and crystallization for the separation and purification of betulin and lupeol. The extraction steps are repeated many times (eg at two sites of the purification process 5 identical extractions per purification step), which not only increases losses in The products obtained have a purity declared below 96%.
EP 2^51^430 nárokuje metodu kontinuální purifikace betulinu a kyseliny betulinové z extraktu březové kůry. Základem „kontinuality“ purifikace jsou 4 chromatografické/filtrační kolony s náplní silikagelu nebo hydratovaného oxidu hlinitého propojené důmyslným systémem ventilů. Na kolonách má dojít k účinné separaci betulinu, kyseliny betulinové a polárních barevných komponent. Tento systém má nevýhody snižující hodnotu tohoto náročného technického uspořádání, a to zejména fakt, že výchozí surovinou pro purifikační krok je extrakt z březové kury minimálně dvakrát predčištěný krystalizací, což se vše děje vsádkově, takže „kontinualita“ vlastní purifikace je diskutabilní. Dále je to vysoká spotřeba rozpouštědel použitých jak pro eluci purifikováných látek, tak pro následné recyklační promývání kolon, přičemž jejich recyklace je kvůli vzájemnému míchání různých rozpouštědel velmi náročná. Složitá aparatura kolon, potrubí, ventilů a pump je náročná na údržbu, zvláště tehdy, když nebude možný kontinuální přísun dávkovou extrakcí získaného a krystalizací přečištěného výchozího materiálu a v aparatuře se začnou usazovat nečistoty a rozpouštědla se budou postupně vypařovat. Také recyklační promytí kolon nemůže být při rozumné spotřebě promývacích rozpouštědel dokonalé, bude nejspíše nutné adsorpční materiál kolon častěji vyměňovat, což nejenže prodraží výrobu, ale také naruší onu „kontinualitu“ purifikace. Celý popsaný systém purifikace je založen na předpokladu, že ve výchozím materiálu není přítomen lupeol či další neuvedené triterpenoidy. To možná splňuje druh břízy, který autoři použili (B. papyrifera), u jiných druhů však je lupeol jako nečistota triterpenoidní povahy při purifikaci betulinu majoritní a dosahuje až 20 % obsahu betulinu (např. u v Evropě nej rozšířenější B. pendula). Snaha o izolaci a purifikaci kyseliny betulinové může být vzhledem k jejímu malému obsahu u mnoha druhů bříz poněkud neefektivní (viz. vysoká spotřeba rozpouštědel při purifikaci), zvláště, vezme-li se v úvahu relativní snadnost její chemické výroby oxidací betulinu přes kyselinu betulonovou.EP 2 51 51 claims a method for the continuous purification of betulin and betulinic acid from birch bark extract. The basis of the "continuity" of the purification are 4 chromatographic / filtration columns packed with silica gel or hydrated alumina connected by an ingenious valve system. Effective separation of betulin, betulinic acid and polar color components should occur on the columns. This system has disadvantages which reduce the value of this demanding technical arrangement, in particular the fact that the starting material for the purification step is birch bark extract at least twice pre-purified by crystallization, all batchwise, so the "continuity" of the purification itself is questionable. Furthermore, it is a high consumption of solvents used both for the elution of the purified substances and for the subsequent recycling washing of the columns, their recycling being very difficult due to the mixing of the different solvents. The complex apparatus of columns, pipes, valves and pumps is difficult to maintain, especially when continuous feed extraction of the obtained starting material by crystallization and crystallization of the starting material is not possible and impurities begin to settle in the apparatus and the solvents gradually evaporate. Also, the recycling washing of the columns cannot be perfect with a reasonable consumption of washing solvents, it will probably be necessary to change the adsorbent material of the columns more often, which will not only make production more expensive but also disrupt the "continuity" of purification. The entire purification system described is based on the assumption that lupeol or other unspecified triterpenoids are not present in the starting material. This may be met by the species of birch used by the authors (B. papyrifera), but in other species lupeol is the major impurity of the triterpenoid nature in betulin purification and reaches up to 20% betulin content (eg the most widespread B. pendula in Europe). Efforts to isolate and purify betulinic acid may be somewhat inefficient for many species of birch due to its low content (see high solvent consumption in purification), especially given the relative ease of its chemical production by oxidation of betulin via betulinic acid.
R ΛΛ Λ79 (¾842^ popisuje relativně jednoduchou přípravu betulinu z březové kůry věetně popisu technického zařízení, čistota získaného betulinu je však nízká (v nejlepším případě pod 95 %). Jako hlavní nečistota je uveden lupeol (přes 7 %). R ΛΛ Λ 79 (¾ 842 ^ describes a relatively simple preparation of betulin from birch bark, including a description of the technical equipment, but the purity of the obtained betulin is low (at best below 95%), the main impurity being lupeol (over 7%).
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Předkládaný vynález řeší problémy stavu techniky poskytnutím způsobu purifíkace betulinu a lupeolu systémem extrakcí, rozpouštění, filtrací a krystalizací, který vede k získání těchto látek v alespoň 99% čistotě, s použitím dobře recyklovatelných (pomocí destilace), levných a dostupných rozpouštědel, coz snižuje celkovou spotřebu energie. Díky využití vhodných způsobů srážení z roztoku jsou purifikační kroky velmi účinné a celý extrakční a purifikační proces je bezpochyby podstatně rychlejší a čistota získaného betulinu a lupeolu je zřetelně vyšší než v dosavadním stavu techniky (přesahuje 99 % pro betulin a 95 % pro lupeol).The present invention solves the problems of the prior art by providing a process for purifying betulin and lupeol by an extraction, dissolution, filtration and crystallization system which yields these substances in at least 99% purity, using well recyclable (by distillation), cheap and available solvents. energy consumption. Thanks to the use of suitable precipitation methods from solution, the purification steps are very efficient and the whole extraction and purification process is undoubtedly considerably faster and the purity of the obtained betulin and lupeol is clearly higher than in the prior art (exceeding 99% for betulin and 95% for lupeol).
Předmětem předkládaného vynálezu je způsob purifíkace betulinu a lupeolu z extraktu směsi triterpenů březové kůry. Způsob purifíkace betulinu a lupeolu z extraktu směsi triterpenů březové kůry obsahuje následující kroky:The present invention relates to a process for the purification of betulin and lupeol from an extract of a mixture of birch bark triterpenes. The process for purifying betulin and lupeol from a birch bark triterpene extract comprises the following steps:
a) Pro odstranění polárních nečistot se extrakt směsi triterpenů březové kůry rozpustí v acetonu, s výhodou v 45 až Stonásobném objemu acetonu vzhledem k hmotnosti extraktu, s výhodou za varu.a) To remove polar impurities, the extract of the birch bark triterpene mixture is dissolved in acetone, preferably in a 45 to 100-fold volume of acetone relative to the weight of the extract, preferably at boiling.
b) Vzniklý roztok se přefiltruje, s výhodou za horka, filtrát se naředí destilovanou vodou, s výhodou polovičního az stejného objemu jako aceton a vznikla suspenze, s výhodou nejprve přivedená k varu a poté ochlazena na laboratorní teplotu, se přefiltruje. Sraženina obsahující triterpeny a méně polární nečistoty se promyje destilovanou vodou a vysuší. Po vysušení a případném smíchání jednotlivých subfrakcí je získána první purifíkovaná frakce triterpenů v celkovém množství přesahujícím cca 80 % původní hmotnosti extraktu směsi triterpenů březové kůry. Jako filtr lze s výhodou použít papírový nebo keramický filtr.b) The resulting solution is filtered, preferably hot, the filtrate is diluted with distilled water, preferably half and from the same volume as acetone, and a suspension is formed, preferably first brought to boiling and then cooled to room temperature, filtered. The precipitate containing triterpenes and less polar impurities is washed with distilled water and dried. After drying and optionally mixing the individual subfractions, the first purified fraction of triterpenes is obtained in a total amount exceeding about 80% of the original weight of the biter bark triterpene mixture extract. A paper or ceramic filter can advantageously be used as the filter.
Tento purifikační krok mj. velice usnadňuje další práci s materiálem, neboť všechny meziprodukty pro získání čistého betulinu a lupeolu jsou nadále buď krystalické, nebo jako amorfní dostatečně hrubé, a tudíž jsou dobře fíltrovatelné, snadno promývatelné a dobře sušitelné. V tomto kroku téměř vymizí i kyselina betulinová, která jako polárnější triterpen zůstává rozpuštěna ve zředěném acetonu.This purification step, among other things, greatly facilitates further work with the material, since all intermediates for obtaining pure betulin and lupeol are still either crystalline or amorphous sufficiently coarse, and are therefore well filterable, easy to wash and easy to dry. In this step, betulinic acid, which, like the more polar triterpene, remains dissolved in dilute acetone, almost disappears.
Postupné srážení triterpenů vodou z acetonového roztoku může též napomoci získat různé subfrakce s odlišným poměrem zastoupení lupeolu a betulinu. Čím menší množství vody je použito, tím je ve sraženině více zastoupen lupeol.Gradual precipitation of triterpenes with water from acetone solution can also help to obtain different subfractions with different ratios of lupeol and betulin. The less water is used, the more lupeol is in the precipitate.
Z odpadního filtrátu je možné prostou destilací s následnou frakění destilací recyklovat většinu použitého acetonu. Nahnědlý odpad zbývající ve vodném roztoku po oddestilování podstatného množství acetonu nebyl analyzován ani nijak využit.It is possible to recycle most of the used acetone from the waste filtrate by simple distillation followed by fractional distillation. The brownish waste remaining in the aqueous solution after distilling off a substantial amount of acetone has not been analyzed or used in any way.
c) Pro odstranění látek kyselé povahy včetně zbytků kyseliny betulinové a dalších nečistot se sraženina vzniklá v kroku b) rozpustí vethanolu za varu. S výhodou se použije 35 Násobný objem ethanolu vzhledem k hmotnosti frakce. Hmotnostně pětinové množství NaOH vzhledem k množství sraženiny vzniklé v kroku b) je rozpuštěno v 25?násobném objemu ethanolu o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a bodemf varu rozpouštědla (vzhledem k hmotnosti NaOH) a ekvimolámí množství bezvodého CaCl2 vzhledem k použitému NaOH je odděleně rozpuštěno v ufiásobném objemu ethanolu o teplotě v rozmezí mezi 40 °C varu rozpouštědla'(vzhledem k hmotnosti CaCl2). K ethanolovému roztoku triterpenů se za intenzivního míchání přidá roztok CaCI2 vethanolu o teplotě v rozmezí mezi 40 »C roztoku, a k takto vzniklému éej>^roZtOkU “ pomalu píidává etha olov>'' roztok NaOH o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a varu roztoku, za postupného vzniku nerozpustného Ca(OH)2, zpočátku jako bílá sraženina, při zvyšujícím se pH však stále intenzivněji hnědnoucí. Suspenze se přivede k varu a následně se sraženina odfiltruje a promyje ethanolem o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a&^° varu. Tato sraženina může být dále použita k získání látek vysrážených převážně jako nerozpustné vápenaté sloučeniny či adsorbovaných na sraženinu (vě. určité části betulinu). Nahnědlý filtrát, obsahující převážně betulin a lupeol, se odpaří na přibližně třetinový objem a ponechá se krystalizovat, s výhodou při teplotě nižší než 25 °C, výhodněji při teplotě nižší než 10 °C. Vzniklá krystalická sraženina se zfiltruje, promyje ethanolem a vodou a vysuší. Po vysusem je získáno cca 65 % (vzhledem k výchozímu množství sraženiny v kroku c)) velice světlé, slabě béžové jemně krystalické látky.c) To remove acidic substances, including residues of betulinic acid and other impurities, the precipitate formed in step b) is dissolved in boiling ethanol. Preferably, 35 times the volume of ethanol relative to the weight of the fraction is used. One-fifth by weight of NaOH relative to the amount of precipitate formed in step b) is dissolved in 25 times the volume of ethanol at a temperature between 40 ° C and the boiling point of the solvent (relative to the weight of NaOH) and the equimolar amount of anhydrous CaCl 2 relative to the NaOH used is separately dissolved in an appropriate volume of ethanol at a temperature between 40 ° C and the boiling point of the solvent (based on the weight of CaCl 2 ). To an ethanol solution of triterpenes with vigorous stirring, a solution of CaCl 2 in ethanol at a temperature in the range between 40 »C solution when thus prepared EEJ> ^ Solution" slow píidává ethanolamine ols> 'solution of NaOH at a temperature in the range between 40 ° C and reflux solution, with the gradual formation of insoluble Ca (OH) 2 , initially as a white precipitate, but browning more and more intensively as the pH increases. The suspension is brought to boiling and then the precipitate is filtered off and washed with ethanol at a temperature between 40 ° C and boiling point. This precipitate can further be used to obtain substances precipitated predominantly as insoluble calcium compounds or adsorbed on the precipitate (i.e. certain parts of betulin). The brownish filtrate, containing predominantly betulin and lupeol, is evaporated to about one third volume and allowed to crystallize, preferably at a temperature below 25 ° C, more preferably at a temperature below 10 ° C. The resulting crystalline precipitate is filtered off, washed with ethanol and water and dried. After drying, about 65% (relative to the initial amount of precipitate in step c)) of a very light, slightly beige fine crystalline substance is obtained.
Filtrát lze destilací ethanolu odpařit dosucha a odparek použít jako přídavek k výchozí sraženině při příštím cyklu purifíkace, čímž se výrazně zvýší celkový výtěžek, aniž by se snížila čistota konečného produktu.The filtrate can be evaporated to dryness by distillation of ethanol and the residue used as an addition to the starting precipitate in the next purification cycle, thus significantly increasing the overall yield without reducing the purity of the final product.
Tento purifikační krok odstraňuje převážnou část látek kyselé povahy a látek výrazně barevných v alkalickém prostředí, patrně polyfenolické povahy, taninů, mastných kyselin a jejich esterů. Rovněž odstraňuje zbytky kyseliny betulinové, vždy doprovázející betulin a lupeol v březové kůře.This purification step removes most of the substances of an acidic nature and substances which are strongly colored in an alkaline environment, probably of a polyphenolic nature, of tannins, fatty acids and their esters. It also removes residual betulinic acid, always accompanying betulin and lupeol in birch bark.
V kroku d) se krystalická sraženina vzniklá v kroku c) rozpustí v chloroformu, s výhodou v 16-násobném objemu chloroformu vzhledem k hmotnosti frakce, za varu, a vzniklý roztok se vysráží petroléterem a/nebo benzinem a/nebo (C5 až C8) uhlovodíkem, s výhodou vybraným ze skupiny obsahující pentan, hexan, cyklohexan a heptan. Vzniklá suspenze se s výhodou přivede k varu, zfiltruje a sraženina betulinu se promyje petroléterem a/nebo benzinem a/nebo (C5 až C8) uhlovodíkem, s výhodou vybraným ze skupiny obsahující pentan, hexan, cyklohexan a heptan, a vysuší, přičemž proces varu, filtrace a sušení je s výhodou alespoň ještě jednou zopakován. S výhodou je ke srážení použit 2o]násobek (vzhledem k hmotnosti frakce) objemu petroléteru, benzinu nebo (C5 až C8) uhlovodíku, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující pentan, hexan, cyklohexan a heptan. Filtrát získaný odfiltrováním téměř bílé, jen velmi slabě nažloutle amorfní sraženiny betulinu, obsahující lupeol, se odpaří dosucha. Takto se získá cca 5 az 10 hmotnostních % (vzhledem k hmotnosti sraženiny vzniklé v kroku c)) téměř bílé amorfní frakce lupeolu použitelné dále k získání a případné další purifikaci lupeolu.In step d), the crystalline precipitate formed in step c) is dissolved in chloroform, preferably in 16 times the volume of chloroform by weight of the fraction, at boiling, and the resulting solution is precipitated with petroleum ether and / or petrol and / or (C5 to C8) a hydrocarbon, preferably selected from the group consisting of pentane, hexane, cyclohexane and heptane. The resulting suspension is preferably brought to a boil, filtered and the betulin precipitate is washed with petroleum ether and / or petrol and / or (C5 to C8) hydrocarbon, preferably selected from the group consisting of pentane, hexane, cyclohexane and heptane, and dried, the boiling process , filtration and drying is preferably repeated at least once more. Preferably, 20 [mu] m (based on the weight of the fraction) of the volume of petroleum ether, petrol or (C5 to C8) hydrocarbon, preferably selected from the group consisting of pentane, hexane, cyclohexane and heptane, are used for precipitation. The filtrate obtained by filtering off an almost white, only very slightly yellowish amorphous precipitate of betulin containing lupeol is evaporated to dryness. Thus, about 5 to 10% by weight (based on the weight of the precipitate formed in step c)) of an almost white amorphous fraction of lupeol usable for obtaining and possibly further purifying lupeol is obtained.
Tento purifíkační krok využívá velice rozdílné rozpustnosti betulinu a lupeolu v nízkých uhlovodících nebo jejich směsích (petroléteru, benzinu). Zatímco petroléter je častým extrakčním činidlem při získávání lupeolu, betulin je v něm málo rozpustný. Jako velmi málo ucmnou se však ukázala přímá extrakce lupeolu z původní jemně krystalické frakce získané v kroku c). Příčinou byla bezpochyby právě krystaličnost oné frakce, kdy povrch směsných krystalu nerozpustného betulinu s lupeolem neumožnily vniknutí petroléteru dovnitř krystalů a vymyti vetšmy lupeolu. Proto je zvoleno srážení betulinu uhlovodíky z jeho chloroformového roztoku, což se ukázalo jako mimořádně účinné. Z filtrátů lze recyklovat chloroform a použité uhlovodíky pro opakované použití frakční destilací.This purification step uses very different solubilities of betulin and lupeol in low hydrocarbons or their mixtures (petroleum ether, petrol). While petroleum ether is a common extractant in the recovery of lupeol, betulin is sparingly soluble in it. However, direct extraction of lupeol from the original fine crystalline fraction obtained in step c) proved to be very poor. The reason was undoubtedly the crystallinity of that fraction, when the surface of the mixed crystals of insoluble betulin and lupeol did not allow the penetration of petroleum ether inside the crystals and to wash out most of the lupeol. Therefore, precipitation of betulin by hydrocarbons from its chloroform solution is chosen, which has proven to be extremely effective. Chloroform and used hydrocarbons can be recycled from the filtrates for reuse by fractional distillation.
e) sraženina betulinu nebo odparek filtrátu s lupeolovou frakcí z kroku d) se rozpustí v chloroformu, s výhodou v co nejmenším množství chloroformu, za laboratorní teploty, vzniklý roztok se přefiltruje přes silikagel v chloroformu a bezbarvý filtrát se odpaří dosucha. V tomto kroku se odstraní poslední zbytky polárních nečistot. Množství použitého silikagelu je s výhodou cca dvojnásobek hmotnosti použité frakce z kroku d) v malé chromatografícké kolonce, kde výská sloupce silikagelu je 1,5 až dvojnásobná oproti průměru kolony. Malé zbytky barevných nečistot se zcela zachytí v prvních přibližně 20 % výšky sloupce silikagelu. Kolona se následně promyje ještě asi polovičním množstvím chloroformu použitého pro rozpuštění frakce z kroku d). Z naprosto bezbarvého filtrátu se poté zcela oddestiluje chloroform, čímž se získá čistě bílý odparek amorfního prášku betulinu nebo lupeolu.e) The precipitate of betulin or the filtrate residue with the lupeol fraction from step d) is dissolved in chloroform, preferably in as little chloroform as possible, at room temperature, the resulting solution is filtered through silica gel in chloroform and the colorless filtrate is evaporated to dryness. In this step, the last remnants of polar impurities are removed. The amount of silica gel used is preferably about twice the weight of the fraction used from step d) in a small chromatographic column, where the column height of the silica gel is 1.5 to twice the diameter of the column. Small residues of colored impurities are completely trapped in the first approximately 20% of the height of the silica gel column. The column is then washed with about half the amount of chloroform used to dissolve the fraction from step d). Chloroform is then completely distilled off from the completely colorless filtrate to give a pure white residue of an amorphous powder of betulin or lupeol.
Tento krok využívá vyšší afinity polárních nečistot k povrchu polárního silikagelu v nepolárním prostředí chloroformu. Jedná se o filtraci, která je oproti klasické chromatografii mnohem rychlejší a nesrovnatelně méně náročná na materiál, rozpouštědla a vybavení. Prakticky veškerý chloroform použitý v tomto purifikačním krokuje recyklovatelný prostou destilací.This step utilizes the higher affinities of polar impurities for the surface of polar silica gel in a non-polar chloroform environment. This is a filtration that is much faster than conventional chromatography and incomparably less demanding on material, solvents and equipment. Virtually all of the chloroform used in this purification step is recyclable by simple distillation.
Ve výhodném provedení se acetonový filtrát vzniklý v kroku b) naředí destilovanou vodou a vznikla suspenze se zfiltruje, promyje destilovanou vodou a vysuší pro získání další frakce betulinu a lupeolu, přičemž tento postup se může opakovat vícekrát.In a preferred embodiment, the acetone filtrate formed in step b) is diluted with distilled water and the resulting suspension is filtered, washed with distilled water and dried to obtain another fraction of betulin and lupeol, which process may be repeated several times.
Ve výhodném provedení následuje po kroku e) ještě krok f), ve kterém se odparek z předchozího kroku e) dále čistí rekrystalizací. Jako rozpouštědlo pro rekrystalizaci se s výhodou použije ethanol pro betulin (resp. hexan pro lupeol). Při rekrystalizaci betulinu z ethanolu se odparek betuhnu s výhodou rozpustí ve 40[násobku objemu vroucího 96% čistého ethanolu (vzhledem k hmotnosti použitého odparku) a po úplném rozpuštění se roztok rychle zfiltruje za horka. Nasledne se čirý filtrát ponechá volně krystalizovat, s výhodou při teplotě nižší než 25 °C, výhodněji při teplotě nižší než 10 °C. Krystalická sraženina se poté zfiltruje za sníženého tlaku,’ promyje malým množstvím ledového ethanolu a vysuší za laboratorní teploty na vzduchu. Získá se takto přibližně 70 % z původního množství použitého odparku. Ethanol (resp. hexan) lze recyklovat prostou destilací filtrátu.In a preferred embodiment, step e) is followed by step f), in which the residue from the previous step e) is further purified by recrystallization. Ethanol for betulin (or hexane for lupeol) is preferably used as the solvent for recrystallization. When recrystallizing betulin from ethanol, the betuene residue is preferably dissolved in 40 times the volume of boiling 96% pure ethanol (based on the weight of the residue used) and, after complete dissolution, the solution is rapidly filtered hot. Subsequently, the clear filtrate is allowed to crystallize freely, preferably at a temperature below 25 ° C, more preferably at a temperature below 10 ° C. The crystalline precipitate is then filtered under reduced pressure, washed with a small amount of ice-cold ethanol and air-dried at room temperature. Approximately 70% of the original amount of residue used is thus obtained. Ethanol (or hexane) can be recycled by simply distilling the filtrate.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž betulin připravitelný výše uvedeným způsobem, který má čistotu alespoň 99 %.The present invention also relates to betulin obtainable by the above process having a purity of at least 99%.
Dále je předmětem vynálezu lupeol připravitelný výše uvedeným způsobem, který má čistotu alespoň 95 %.The invention further relates to lupeol obtainable by the above process having a purity of at least 95%.
K získání extraktu směsi triterpenů březové kůry, ze kterého vychází způsob purifíkace betulinu a lupeolu podle předkládaného vynálezu, vede několik způsobů již dříve popsaných v literatuře. Jako nejúčinnější a nej efektivnější způsob jak z hlediska časového, tak z hlediska spotřeby rozpouštědla a energie vynaložené na jeho recyklaci se jeví extrakce v Soxhletově aparatuře. Výchozí surovinou pro extrakt směsi triterpenů je vnější kůra břízy, která je po vysušení náležitě rozemleta či rozdrcena. Pro průmyslové využití jako zdroj připadá v úvahu hlavně odpadní kůra pn zpracování březového dřeva např. v papírenském průmyslu, která by byla rozmělněna a připadne její vnější vrstva vytříděna některým ze známých způsobů. Jako extrakční krok pro získání triterpenů z vnější březové kůry může být zvolena jednoduchá extrakce technickým ethanolem denaturovaným benzinem v Soxhletově extraktoru, která je mimořádně účinná a rychlá (celý extrakční proces i s vysušením produktu trvá pouze 1 2 hodiny). K extrakci triterpenů z březové kůry lze však použít libovolný jiný způsob uvedený ve výše uvedených patentech či jiných odborných článcích.To obtain an extract of a mixture of birch bark triterpenes, from which the method for purifying betulin and lupeol according to the present invention is based, several methods already described in the literature lead. Extraction in the Soxhlet apparatus appears to be the most efficient and effective way both in terms of time and in terms of solvent consumption and energy spent on its recycling. The starting material for the extract of the triterpene mixture is the outer bark of the birch, which is properly ground or crushed after drying. For industrial use as a source, the waste bark for birch wood processing, for example in the paper industry, which comes into consideration and, if appropriate, its outer layer, sorted by some of the known methods, comes into consideration. As an extraction step for obtaining triterpenes from the outer birch bark, a simple extraction with technical ethanol denatured petrol in a Soxhlet extractor can be chosen, which is extremely efficient and fast (the whole extraction process, even with drying the product, takes only 1 2 hours). However, any other method mentioned in the above-mentioned patents or other technical articles can be used to extract triterpenes from birch bark.
^Stručný přehled obrázků-/^ Brief overview of pictures- /
Obr. 1: Chromatogramy GC-MS pro frakce: BO, Bia, Blb, Blc, Bld, B2, B3, L3 a B5 (neuvedená frakce B4 má prakticky totožný chromatogram jako frakce B5)Giant. 1: GC-MS chromatograms for fractions: BO, Bia, Blb, Blc, Bld, B2, B3, L3 and B5 (unspecified fraction B4 has practically the same chromatogram as fraction B5)
Obr. 2: Tabulka zastoupení triterpenů ve všech frakcíchGiant. 2: Table of representation of triterpenes in all fractions
Obr. 3: A - krystalky frakce B5, B - drúzy krystalů frakce B5b po volném odpaření ethanoluGiant. 3: A - crystals of fraction B5, B - drusen of crystals of fraction B5b after free evaporation of ethanol
Obr. 4. Schéma extrakce a purifikace použité v předkládaném vynálezu uíkuhz&k/ní'Giant. 4. Scheme of extraction and purification used in the present invention for use.
Příklady hrovedeníf vynálezuExamples of embodiments of the invention
Všechny frakce jsou označeny písmenem (B - betulinová frakce, L - lupeolová frakce) a číslem označujícím číslo purifikačního kroku (0 pro původní extrakt z kůry, 1 pro krok b), 2 pro krok c), 4 pro krok e), 5 pro krok f)). Z každé frakce bylo odebráno jisté množství pro analýzu a pro další případné účely, takže do dalšího purifikačního kroku je použito menší množství, než bylo získáno v předešlém kroku. Čistota vzorků byla kontrolována pomocí GC-MS: Vzorky všech frakcí a subfrakcí v množstvích U2 mg byly rozpuštěny v pyridinu a derivatizovány N,Obis(trimethylsilyl)trifluoroacetamidem. Poté byly analyzovány plynovou kapilární chromatografií s hmotnostně-spektrometrickou detekcí. Jako standardy pro určení elučních časů byly použity betulin (min. 98 %), lupeol (min. 94 %) a kyselina betulinová (min. 98 %) od firmy Sigma-Aldrich (USA).All fractions are identified by a letter (B - betulin fraction, L - lupeol fraction) and a number indicating the number of the purification step (0 for the original bark extract, 1 for step b), 2 for step c), 4 for step e), 5 for step f)). An amount was taken from each fraction for analysis and other possible purposes, so that less was used in the next purification step than in the previous step. The purity of the samples was checked by GC-MS: Samples of all fractions and subfractions in amounts of U2 mg were dissolved in pyridine and derivatized with N, Obis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide. They were then analyzed by gas capillary chromatography with mass spectrometric detection. Betulin (min. 98%), lupeol (min. 94%) and betulinic acid (min. 98%) from Sigma-Aldrich (USA) were used as standards for determining elution times.
Příklad 1: Extrakce triterpenů z březové kůry g vysušené ručně oloupané vnější kůry z pokácené břízy Betula pendula (lokalita Hradec Králové) bylo nastříháno na malé kousky a rozsekáno sekáčkem kuchyňského mixeru. Takto upravená kůra byla podrobena extrakci technickým ethanolem denaturovaným benzinem v Soxhletově extraktoru, přičemž byl zkondenzovaný teplý ethanol z extrakční nádobky jen sedmkrát vyprázdněn. Ze získaného ethanolového roztoku byl ethanol destilací úplně odstraněn. Takto bylo získáno 12,9 g suchého hrubého extraktu BO (BO na ®br. 1 a 2).Example 1: Extraction of triterpenes from birch bark g dried hand peeled outer bark from felled birch Betula pendula (locality Hradec Králové) was cut into small pieces and chopped with a kitchen mixer chopper. The bark thus treated was subjected to extraction with technical ethanol denatured gasoline in a Soxhlet extractor, the condensed warm ethanol being emptied from the extraction vessel only seven times. The ethanol was completely removed from the obtained ethanol solution by distillation. Thus, 12.9 g of dry crude BO extract (BO in Figures 1 and 2) were obtained.
Příklad 2: Purifikační krok b): částečné odstranění polárních nečistot z hrubého extraktu B0 g hrubého extraktu BO bylo rozpuštěno v 500 ml acetonu za varu. Ještě horký roztok byl zfíltrován na papírovém filtru malé hustoty. Nerozpuštěný sediment o hmotnosti 0,91 g po vysušení byl označen jako frakce Bia a obsahoval přes 24 % lupeolu a 75 % betulinu (Bia na 0br. 1 a 2). Filtrát byl naředěn asi 200 ml destilované vody a vzniklá suspenze byla krátce povařena. Světlá sraženina triterpenů a méně polárních nečistot byla po zchlazení zfiltrována opět na papírovém filtru, promyta destilovanou vodou a vysušena. Takto bylo získáno 1,7 g frakce Blb s obsahem přes 22 % lupeolu a přes 77 % betulinu (Blb na ®br. 1 a 2). Do filtrátu bylo následně přilito dalších asi 200 ml vody, nově vzniklá sraženina byla opět zfiltrována a promyta vodou. Takto bylo získáno 4,96 g frakce Blc s obsahem přes 19 % lupeolu a přes 80 % betulinu (Blc na Obr. 1 a 2). Do filtrátu bylo přilito následně ještě asi 100 ml destilované vody a obdobným způsobem bylo získáno 3,19 g frakce Bld s obsahem přes 8 % lupeolu a přes 91 % betulinu (Bld na 0br. 1 a 2). Celkem tedy bylo získáno cca 10,76 g první purifikované frakce triterpenů Bl. Kyselina betulinová a případné další triterpeny se od této frakce vyskytují prakticky jen ve stopách.Example 2: Purification step b): partial removal of polar impurities from the crude extract B0 g of the crude extract BO was dissolved in 500 ml of boiling acetone. The still hot solution was filtered on a low density paper filter. Undissolved sediment weighing 0.91 g after drying was designated as the Bia fraction and contained over 24% lupeol and 75% betulin (Bia in Figures 1 and 2). The filtrate was diluted with about 200 ml of distilled water and the resulting suspension was boiled briefly. After cooling, the light precipitate of triterpenes and less polar impurities was filtered again on a paper filter, washed with distilled water and dried. Thus, 1.7 g of a Blb fraction containing over 22% lupeol and over 77% betulin were obtained (Blb in Figures 1 and 2). An additional 200 mL of water was then added to the filtrate, and the newly formed precipitate was filtered again and washed with water. Thus, 4.96 g of a Blc fraction containing over 19% lupeol and over 80% betulin were obtained (Blc in Figures 1 and 2). Subsequently, about 100 ml of distilled water was added to the filtrate, and in a similar manner, 3.19 g of the Bld fraction containing over 8% lupeol and over 91% betulin was obtained (Bld in Figures 1 and 2). Thus, a total of about 10.76 g of the first purified fraction of triterpenes B1 was obtained. Betulinic acid and any other triterpenes occur practically only in traces of this fraction.
Výsledky analýzy ukazují, že zastoupení lupeolu a betulinu ve sraženině do značné míry závisí na poměru aceton/voda při srážení. Pro přípravu či výrobu samotného lupeolu je vhodnější použít k prvnímu srážení méně vody. V každém případě však je možno další vodou nakonec vysrážet prakticky veškeré zbylé množství betulinu a lupeolu a po vysušení konečnou sraženinu znovu použít spolu s výchozím extraktem při purifikaci v další várce purifikačního cyklu.The results of the analysis show that the proportion of lupeol and betulin in the precipitate depends to a large extent on the acetone / water ratio during the precipitation. For the preparation or production of lupeol itself, it is more appropriate to use less water for the first precipitation. In each case, however, virtually all of the remaining betulin and lupeol can finally be precipitated with additional water, and after drying, the final precipitate can be reused with the starting extract for purification in the next batch of the purification cycle.
Příklad 3. Purifikační krok c): odstraněni látek kyselé povahy a dalších nečistot z frakce BlExample 3. Purification step c): removal of acidic substances and other impurities from fraction B1
5,5 g směsné frakce Bl bylo rozpuštěno ve 200 ml ethanolu za varu. Vedle toho byl připraven horký roztok 1,1 g NaOH ve 20 ml ethanolu a horký roztok 3 g bezvodého CaCl2 v 50 ml ethanolu. K vroucímu roztoku frakce Bl byl za intenzivního míchání přilit horký roztok CaCl2 a k takto vzniklému čirému roztoku byl přidáván horký ethanolový roztok NaOH pozvolna po dobu cca 30 sekund. Okamžitě začala vznikat sraženina v ethanolu nerozpustného Ca(OH)2, zpočátku bílá, při zvyšujícím se pH však stále intenzivněji hnědnoucí. Po krátkém povaření byla tmavě hnědá sraženina za horka zfiltrována. Z čirého nahnědlého filtrátu bylo následně oddestilováno asi 100 ml ethanolu a zbytek byl ponechán cca 3 h při 7 °C krystalizovat. Po odfiltrování, promytí malým množstvím ethanolu a vysušení bylo takto získáno 3,55 g velice světlé, slabě béžové jemně krystalické frakce B2 s obsahem přes 80 % betulinu a přes 19 % lupeolu (B2 na Obr. 1 a 2).5.5 g of the mixed fraction B1 was dissolved in 200 ml of boiling ethanol. In addition, a hot solution of 1.1 g NaOH in 20 ml ethanol and a hot solution of 3 g anhydrous CaCl 2 in 50 ml ethanol were prepared. A hot CaCl 2 solution was added to the boiling solution of fraction B1 with vigorous stirring, and the hot ethanolic NaOH solution was slowly added to the resulting clear solution over a period of about 30 seconds. A precipitate of ethanol-insoluble Ca (OH) 2 immediately began to form, initially white, but browning more and more intensively as the pH increased. After brief boiling, the dark brown precipitate was filtered hot. About 100 ml of ethanol were then distilled off from the clear brownish filtrate and the residue was allowed to crystallize at 7 DEG C. for about 3 hours. After filtration, washing with a small amount of ethanol and drying, 3.55 g of a very light, light beige fine crystalline fraction B2 containing over 80% betulin and over 19% lupeol were obtained (B2 in Figures 1 and 2).
Příklad 4: Purifikační krokd): oddělení betulinu a lupeolu z frakce B2Example 4: Purification step): separation of betulin and lupeol from fraction B2
2,5 g frakce B2 bylo rozpuštěno ve 40 ml chloroformu za varu. Do takto vzniklého čirého roztoku bylo poté přidáno 100 ml petroléteru 40*60 °C. Okamžitě začala vznikat sraženina v petroléteru málo rozpustného betulinu. Po cca 10 minutovém povaření a následném zchlazení byla sraženina zfiltrována na papírovém filtru a promyta cca 30 ml čistého petroléteru. Vysušená sraženina byla opět rozpuštěna, tentokrát ve 30 ml vroucího chloroformu, a po úplném rozpuštění bylo přidáno 80 ml petroléteru. Vzniklá sraženina byla zfiltrována na fritě a promyta cca 30 ml petroléteru. Po vysušení sraženiny bylo získáno 1,61 g téměř bílé, jen velmi slabě nažloutlé amorfní frakce B3 s obsahem betulinu téměř 99 % (B3 na 0br. 1 a 2). Při použití heptanu místo petroléteru vzniká sraženina betulinu pozvolna a je zapotřebí delšího času po zchlazení a před filtrací. Sraženina se zdá být jemnější a o trochu hůře filtrovatelná, než při použití petroléteru jako srážecího činidla a oddělení lupeolu je méně účinné (o cca 10 %). Naproti tomu je snadnější recyklace původních rozpouštědel frakční destilací na koloně.2.5 g of fraction B2 was dissolved in 40 ml of boiling chloroform. To the resulting clear solution was then added 100 ml of petroleum ether 40 * 60 ° C. A precipitate immediately began to form in the petroleum ether of the sparingly soluble betulin. After boiling for about 10 minutes and subsequent cooling, the precipitate was filtered on a paper filter and washed with about 30 ml of pure petroleum ether. The dried precipitate was redissolved, this time in 30 ml of boiling chloroform, and after complete dissolution, 80 ml of petroleum ether was added. The resulting precipitate was filtered on a frit and washed with about 30 ml of petroleum ether. After drying the precipitate, 1.61 g of an almost white, only very slightly yellowish amorphous fraction B3 with a betulin content of almost 99% were obtained (B3 in Figures 1 and 2). When heptane is used instead of petroleum ether, a precipitate of betulin forms slowly and a longer time is required after cooling and before filtration. The precipitate appears to be finer and slightly less filterable than when using petroleum ether as a precipitating agent and the separation of lupeol is less effective (by about 10%). In contrast, it is easier to recycle the original solvents by fractional distillation on a column.
Odpařením prvního filtrátu a vysušením bylo získáno 0,126 g bílého prášku obsahujícího odstraněný lupeol o čistotě téměř 89 % a označeného jako frakce L3 (L3 na ®br. 1 a 2). Další purifikace probíhala jednou z následujících variant:Evaporation of the first filtrate and drying gave 0.126 g of a white powder containing removed lupeol with a purity of almost 89% and designated as fraction L3 (L3 in Figures 1 and 2). Further purification was performed in one of the following variants:
a) rozpuštění frakce L3 minimálním množství horkého chloroformu a opětovné vysrážení znečišťujícího betulinu 2<3 násobným objemem petroléteru, filtrace a odpaření čirého filtrátu nebo(a) dissolving fraction L3 with a minimum of hot chloroform and reprecipitating the contaminating betulin 2 <3 times with light petroleum, filtering and evaporating the clear filtrate, or
b) rozpuštění většiny frakce L3 v minimálním množství petroléteru za horka tak, aby zbyla nejméně % původního množství nerozpuštěna. Po zchlazení roztoku (čímž se část lupeolu vysrazi, spolu však strhne i většinu zbylého znečišťujícího betulinu) se roztok rychle zfiltruje a filtrát nechá odpařit. Takto se odstraní alespoň poloviční množství betulinu a čistota lupeolu je cca 95 % nebo více.(b) dissolving most of the L3 fraction in a minimum amount of light petroleum so that at least% of the original amount remains undissolved. After cooling the solution (whereby part of the lupeol precipitates, but together it entrains most of the remaining contaminating betulin), the solution is quickly filtered and the filtrate is allowed to evaporate. This removes at least half the amount of betulin and the purity of lupeol is about 95% or more.
Příklad 5: Purifikační kroke): vyčištění betulinu od zbytku polárních nečistot z frakce B3 g frakce B3 bylo na fritě promyto malým množstvím (cca 10 ml) petroléteru a po vysušení následně rozpuštěno v cca 40 ml chloroformu za laboratorní teploty. Takto vniklý roztok byl přefiltrován přes 2 g silikagelu nasypaného do malé kolonky s chloroformem. Vrstva silikagelu byla 1,5 cm silná. Malé zbytky barevných nečistot byly beze zbytku zachyceny v horních cca 3 mm sloupce silikagelu. Kolona byla následně promyta ještě 20 ml chloroformu. Ze zcela bezbarvého filtrátu byl poté úplně oddestilován chloroform, přičemž byl získán čistě bílý odparek amorfního prášku - frakce B4 (B4 na 0br. 2). Tato frakce s obsahem přes 99 % betulinu nebyla vážena a po odebrání malého množství vzorku k analýze (do 50 mg) bylo veškeré zbylé množství použito pro poslední purifikační krok.Example 5: Purification steps) Purification of betulin from residual polar impurities from fraction B3 g of fraction B3 was washed on a frit with a small amount (about 10 ml) of petroleum ether and, after drying, subsequently dissolved in about 40 ml of chloroform at room temperature. The solution thus obtained was filtered through 2 g of silica gel poured into a small column with chloroform. The silica gel layer was 1.5 cm thick. Small residues of colored impurities were completely removed in the upper column of about 3 mm of silica gel. The column was then washed with another 20 ml of chloroform. Chloroform was then completely distilled off from the completely colorless filtrate to give a pure white residue of an amorphous powder - fraction B4 (B4 in Fig. 2). This fraction containing over 99% betulin was not weighed and after taking a small amount of sample for analysis (up to 50 mg), all the remaining amount was used for the last purification step.
Příklad 6. Purifikační kroke): vyčištěni lupeolu od zbytku polárních nečistot z frakce L3Example 6. Purification steps): purification of lupeol from the residue of polar impurities from fraction L3
Konečné vyčištění lupeolu od zbytku nečistot bylo obdobné, jako je uvedené u betulinu, tedy filtrací chloroformového roztoku produktu na silikagelu (viz Příklad 5). V případě menších množství lupeolové frakce by byla možná jako vysoce účinný purifikační krok lupeolu i kapalinová chromatografie využívající mírně rozdílné lipofility lupeolu a betulinu (viz např. CN 1793161). Přečištěná lupeolová frakce L4 měla čistotu cca 95 %.The final purification of lupeol from residual impurities was similar to that described for betulin, i.e. by filtration of the chloroform solution of the product on silica gel (see Example 5). In the case of smaller amounts of lupeol fraction, liquid chromatography using slightly different lipophilities of lupeol and betulin would also be possible as a highly efficient lupeol purification step (see eg CN 1793161). The purified lupeol fraction L4 had a purity of about 95%.
Příklad 7: Rekrystalizace čistého betulinu z ethanoluExample 7: Recrystallization of pure betulin from ethanol
Téměř veškerá frakce B4 byla rozpuštěna ve 40 ml vroucího 96% čistého ethanolu a po úplném rozpuštění byl roztok rychle zfiltrován za horka. Následně byl původně čirý filtrát, při postupném chladnutí stále více se zakalující postupně vznikajícími zárodečnými krystalky, ponechán k volné krystalizaci cca 3 hodiny při 7 °C. Krystalická sraženina byla poté zfiltrována na fritě za podtlaku, promyta malým množstvím ledového ethanolu a vysušena za laboratorní teploty na vzduchu. Bylo získáno 0,693 g zcela bílé krystalické frakce B5 představující betulin o čistotě 99,6 % (B5 na 0br. 1 a 2). Drobné orthorhombické krystalky betulinu se jevily při pozc^vámv mikroskopu zcela průhledné a bezbarvé, žádné nečistoty nebyly pozorovány (Obr. 3A). Mod/ tání tohoto konečného produktu byl zjištěn mikroskopickým bodotávkem a ieho hodnota činila 255*256 °C, což zcela odpovídá literárním údajům a je o cca 1 °C vyšší, než standard betulinu od firmy Sigma-Aldrich s deklarovanou čistotou vyšší než 98 %.Almost all of the B4 fraction was dissolved in 40 ml of boiling 96% pure ethanol, and after complete dissolution, the solution was rapidly filtered hot. Subsequently, the initially clear filtrate, with gradual cooling, becoming more and more turbid with the gradually formed seed crystals, was allowed to crystallize freely for about 3 hours at 7 ° C. The crystalline precipitate was then filtered on a frit under reduced pressure, washed with a small amount of ice-cold ethanol and air-dried at room temperature. 0.693 g of an all-white crystalline fraction B5 representing betulin with a purity of 99.6% were obtained (B5 in Figures 1 and 2). The tiny orthorhombic crystals of betulin appeared completely transparent and colorless when viewed under a microscope, no impurities were observed (Fig. 3A). The melting / melting of this final product was determined by microscopic spotting and its value was 255 * 256 ° C, which fully corresponds to the literature data and is about 1 ° C higher than the betulin standard from Sigma-Aldrich with a declared purity higher than 98%.
Matečný louh po krystalizaci frakce B5 byl v misce ponechán na vzduchu do úplného odpaření ethanolu. Byly získány jehličkovité drúzy dlouhých tenkých krystalů ukázaných na 0br. 3B. Matečný louh lze také s výhodou použít místo čistého ethanolu pro rozpuštění frakce B4 při příští purifikaci.The mother liquor after crystallization of fraction B5 was left in the dish in air until complete evaporation of the ethanol. Needle-like drusen of the long thin crystals shown in Fig. 1 were obtained. 3B. The mother liquor can also be advantageously used instead of pure ethanol to dissolve fraction B4 in the next purification.
Pro krystalizaci je využit velký rozdíl rozpustnosti betulinu v ethanolu za normální teploty a za varu, kdy je rozpustnost zhruba pětinásobná. Ethanol je však také krystaliformní látkou a nejen rozpouštědlem, neboť betulin krystaluje v průhledných bezbarvých orthorhombických krystalech s jednou molekulou ethanolu na jednu molekulu betulinu, kde jsou vzájemně provázány vodíkovými můstky (S.A. Kuznetsova et al., Russian Journal ofBioorganic Chemistry, 2014, 40, 742). Po ztrátě krystalického ethanolu se krystaly betulinu rozpadají na amorfní bílý prášek. Schéma celého provedeného procesu izolace a purifíkace betulinu a lupeolu z březové kůry je uvedeno na 0br. 4.A large difference in the solubility of betulin in ethanol at normal temperature and at boiling is used for crystallization, when the solubility is about five times. However, ethanol is also a crystalliform substance and not just a solvent, as betulin crystallizes in transparent colorless orthorhombic crystals with one molecule of ethanol per molecule of betulin, where they are interconnected by hydrogen bonds (SA Kuznetsova et al., Russian Journal of Organic Chemistry, 2014, 40, 742 ). After loss of crystalline ethanol, the betulin crystals disintegrate into an amorphous white powder. A scheme of the whole performed process of isolation and purification of betulin and lupeol from birch bark is shown in 0br. 4.
Příklad 8: Rekrystalizace čistého lupeolu z hexanuExample 8: Recrystallization of pure lupeol from hexane
VIN
Rekrystalizace frakce L4 lupeolu byla provedena analogicky jako v příkladu 7, rozpouštědlem byl v tomto případě hexan a nikoli ethanol (krystalická sraženina má pak mnohem lepší a hrubší strukturu).The recrystallization of the L4 fraction of lupeol was carried out analogously to Example 7, in this case the solvent was hexane and not ethanol (the crystalline precipitate then has a much better and coarser structure).
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Navržený postup je pro svou technologickou jednoduchost (v podstatě pouze rozpouštění, srážení, filtrace a destilace) a nízkou náročnost na spotřebovaný materiál velice vhodný pro poloprovozní nebo průmyslovou výrobu velmi čistého betulinu a čistého lupeolu z odpadní březové kůry pro medicínské, farmaceutické, kosmetické či výzkumné použití. Použitá rozpouštědla jsou levná, recyklovatelná, s výjimkou chloroformu netoxická a prakticky neškodí životnímu prostředí. Většinu všech použitých rozpouštědel lze recyklovat pomocí prosté nebo frakční destilace.Due to its technological simplicity (basically only dissolution, precipitation, filtration and distillation) and low demands on the consumed material, the proposed process is very suitable for pilot or industrial production of very pure betulin and pure lupeol from waste birch bark for medical, pharmaceutical, cosmetic or research use. The solvents used are cheap, recyclable, with the exception of chloroform, non-toxic and practically environmentally friendly. Most of the solvents used can be recycled by simple or fractional distillation.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-670A CZ2015670A3 (en) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | Purification process of betulin and lupeol and betulin and lupeol prepared thereby |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-670A CZ2015670A3 (en) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | Purification process of betulin and lupeol and betulin and lupeol prepared thereby |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ306293B6 CZ306293B6 (en) | 2016-11-16 |
| CZ2015670A3 true CZ2015670A3 (en) | 2016-11-16 |
Family
ID=57353929
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-670A CZ2015670A3 (en) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | Purification process of betulin and lupeol and betulin and lupeol prepared thereby |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2015670A3 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109988216A (en) * | 2017-12-31 | 2019-07-09 | 中国医学科学院药物研究所 | Betulin crystalline substance D type substance and preparation method and its composition and purposes |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI20225170A1 (en) * | 2022-02-24 | 2023-08-25 | Innomost Oy | Method for recovering of high purity betulin from birch bark |
| FI20225169A1 (en) * | 2022-02-24 | 2023-08-25 | Innomost Oy | Method for processing birch bark |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2250481A1 (en) * | 1998-11-02 | 2000-05-02 | Andre Pichette | Betulinol derivatives preparation process using silver birch bark |
| US6392070B1 (en) * | 1999-08-10 | 2002-05-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Birch bark processing and the isolation of natural products from birch bark |
| DE10204278C1 (en) * | 2002-02-02 | 2003-08-07 | Boehringer Ingelheim Pharma | Process for obtaining betulin |
| RU2283655C1 (en) * | 2005-04-06 | 2006-09-20 | Тамара Федоровна Никуленкова | Method for production of biologically active substances |
| CZ301038B6 (en) * | 2007-01-15 | 2009-10-21 | Univerzita Karlova v Praze, Prírodovedecká fakulta | Process for preparing betulin diacetate from birch bark from paper mills |
-
2015
- 2015-09-30 CZ CZ2015-670A patent/CZ2015670A3/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109988216A (en) * | 2017-12-31 | 2019-07-09 | 中国医学科学院药物研究所 | Betulin crystalline substance D type substance and preparation method and its composition and purposes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ306293B6 (en) | 2016-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8197870B2 (en) | Depolymerization extraction of compounds from birch bark | |
| WO2009036674A1 (en) | A method for recovering sulfuric acid from concentrated acid hydrolyzate of plant cellulose material | |
| CN104529984B (en) | A kind of method extracting genistin from Flemingia macrophylla | |
| CZ2015670A3 (en) | Purification process of betulin and lupeol and betulin and lupeol prepared thereby | |
| CN115232187B (en) | Method for extracting 7 beta-hydroxy betulinic acid from borneol camphor and application thereof | |
| CN106317148B (en) | A method of extracting cordycepin from Cordyceps militaris | |
| US7833994B2 (en) | Ethanol extraction of phytosterols from corn fiber | |
| Liu et al. | Separation and purification of glabridin from a deep eutectic solvent extract of Glycyrrhiza glabra residue by macroporous resin and its mechanism | |
| CN101058597A (en) | Process of preparing ardisiacrispin monomer | |
| EP2125860B1 (en) | Method of preparation and isolation of betulin diacetate from birch bark from paper mills and its optional processing to betulin | |
| Paže et al. | Apparatus and selective solvents for extraction of triterpenes from silver birch (Betula pendula Roth.) outer bark | |
| CN1234723C (en) | Method for extracting fucosterol from alga | |
| CN105037313B (en) | A kind of method of myricetrin and catechin compounds in separation Chinese waxmyrtle bark | |
| EP1937707B1 (en) | Improved method for the production of betulinic acid | |
| CN108384276B (en) | Purple sweet potato pigment and production method thereof | |
| RU2812565C1 (en) | Method of processing plant raw materials | |
| RU2381031C1 (en) | Method for production of biologically active substances from birch bark | |
| RU2523545C1 (en) | Method of obtaining betulin (versions) | |
| CN103601788B (en) | Method of extracting and separating triterpenoid ellagitannin compound from castanopsis fissa leaves | |
| CN102993247A (en) | Method for separating anthraquinone ingredient of semen cassiae by low-pressure and medium-pressure preparative column | |
| RU2668976C1 (en) | Method of producing betulin | |
| CN102351935A (en) | Method for preparing sterol monomer separated from mixed plant sterol | |
| Daf et al. | Clerodendrum Infortunatum Linn | |
| CN104926915A (en) | One-step method for separating pectin, chlorophyll and tigogenin in sisal pressed liquid | |
| Abbas et al. | Ethanol extraction of phytosterols from corn fiber |