CZ2013240A3

CZ2013240A3 - Biodegradable maintenance method of contaminated soil

Info

Publication number: CZ2013240A3
Application number: CZ2013-240A
Authority: CZ
Inventors: Petra Innemanová; Radka Velebová; Xuemin Zhao; Tomáš Cajthaml; Zdena Křesinová; Alena Filipová; Branislav Slávik
Original assignee: Dekonta A.S.; Mikrobiologický ústav Akademie věd ČR, v.v.i.
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2014-04-02
Also published as: CZ304378B6

Abstract

Způsob biodegradační sanace znečištěné zeminy inokulací mikrobiálního preparátu obsahujícího alespoň jeden alochtonní mikroorganismus, zejména alespoň jeden bakteriální kmen ze skupiny pseudomonas fluorescens, pseudomonas veronii, acinetobacter calcoaceticus, pseudomonas putida, pseudomonas stutzeri, arthrobacter protophormiae, bacillus megaterium, psychobacter sp., spočívá v tom, že v prvním kroku se mikrobiální preparát inokuluje do znečištěné zeminy, kde probíhá jeho kultivace přirozeným rozmnožováním. Ve druhém kroku se inokulovaná zemina alespoň jednou smíchá s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou v hmotnostním poměru v rozmezí od 1:20 do 1:100. Následně probíhá kultivace populace mikrobiálního preparátu v celém objemu směsi.The method of biodegrading the contaminated soil by inoculating a microbial preparation comprising at least one allochthonous microorganism, in particular at least one bacterial strain of pseudomonas fluorescens, pseudomonas veronii, acinetobacter calcoaceticus, pseudomonas putida, pseudomonas stutzeri, arthrobacter protophormiae, bacillus megaterium, psychobacter sp. that, in the first step, the microbial preparation is inoculated into the contaminated soil, where it is cultivated by natural propagation. In a second step, the inoculated soil is mixed at least once with uninoculated soil contaminated in a weight ratio ranging from 1:20 to 1: 100. Subsequently, the population of the microbial preparation is cultivated throughout the mixture.

Description

Oblast technikyField of technology

Vynález se týká způsobu biodegradační sanace znečištěné zeminy, konkrétně inokulace mikrobiálním preparátem do sanované zeminy. Vynález spadá do oblasti sanačních prací, kdy se snižuje koncentrace organického polutantu v zemině biologickými procesy in situ nebo ex situ.The invention relates to a method for biodegradation remediation of contaminated soil, in particular inoculation with a microbial preparation into the remediated soil. The invention belongs to the field of remediation works, where the concentration of organic pollutant in the soil is reduced by in situ or ex situ biological processes.

Dosavadní stav technikyState of the art

Bioremediace je technologie odstraňování polutantů, která využívá biologického systému k úplnému rozkladu nebo transformaci různých nežádoucích chemických sloučenin na látky méně nebezpečné. Konečnými produkty efektivní bioremediace jsou látky netoxické, které již nejsou nebezpečím pro životní prostředí ani živé organismy, v ideálním případě na CO2 a vodu. Bioremediaci lze využít pro čištění odpadních a podzemních vod, půdy, plynů a kalů.Bioremediation is a pollutant removal technology that uses a biological system to completely decompose or transform various undesirable chemical compounds into less hazardous substances. The end products of effective bioremediation are non-toxic substances that are no longer a danger to the environment or living organisms, ideally to CO2 and water. Bioremediation can be used to treat wastewater and groundwater, soil, gases and sludge.

Současné přístupy k procesu bioremediace jsou následující:Current approaches to the bioremediation process are as follows:

- monitorování přirozeného biodegradačního procesu, provádění modifikace prostředí, ve kterém k biologickému procesu dochází (přídavek nutrientů, aerace apod.), přídavek mikroorganismů (tzv. bioaugmentace).- monitoring of the natural biodegradation process, modification of the environment in which the biological process takes place (addition of nutrients, aeration, etc.), addition of microorganisms (so-called bioaugmentation).

Bioremediace se provádí technologiemi, ve kterých se degradace polutantu provádí přímo v místě kontaminace (in situ), tedy půda není odtěžována a kontaminovaná spodní voda není pumpována na povrch. Tyto technologie vyžadují relativně nízké náklady, jsou však pomalejší a průběh degradace polutantu je jen těžce kontrolovatelný. Jiné technologie jsou aplikovány na odtěžený kontaminovaný materiál v místě často vzdáleném od původní lokality (ex situ). Manipulací s kontaminovaným materiálem sice vzrůstají náklady, ale celý degradační proces je pod kontrolou a veškerá rizika dalšího znečištění jsou minimalizována.Bioremediation is performed by technologies in which the degradation of the pollutant takes place directly at the site of contamination (in situ), ie the soil is not mined and the contaminated groundwater is not pumped to the surface. These technologies require relatively low costs, but are slower and the degradation of the pollutant is difficult to control. Other technologies are applied to the extracted contaminated material in a place often remote from the original site (ex situ). Although handling contaminated material increases costs, the entire degradation process is under control and all risks of further contamination are minimized.

Současný bioremediační sanační trend se zabývá především intenzifikací činnosti autochtonní/alochtonní mikroflóry ve formě hledání vhodných substrátů, formou aplikace substrátu (zasakování, reakční bariery se zakotveným mikrobiálním činitelem), zlepšení dostupnosti sorbovaného polutantu pomocí detergentů, samotný výběr mikrobiálních kmenů a jejich genetická modifikace a další.The current bioremediation remediation trend deals mainly with the intensification of autochthonous / allochthonous microflora in the form of finding suitable substrates, substrate application (seepage, reaction barriers with anchored microbial agent), improving the availability of sorbed pollutant by detergents, selection of microbial strains and their genetic modification and more. .

V současné době se běžně používá níže uvedený technologický postup inokulace a aplikace mikrobiálního preparátu na sanovanou zeminu, zejména v okruhu biodegradačních sanací. Postupuje se krokovým namnožením kultur v kapalném médiu v kultivačních reaktorech do potřebného objemu kapalného inokula k sanované zemině.At present, the following technological procedure of inoculation and application of a microbial preparation on remediated soil is commonly used, especially in the field of biodegradation remediation. It proceeds by stepwise multiplication of cultures in liquid medium in culture reactors to the required volume of liquid inoculum to the remediated soil.

Podrobnější technologický postup je následující. Čisté výchozí bakteriální kmeny jsou uchovávány buď v lyofílizované formě, nebo na agarových plotnách. Je možné vycházet z firemní sbírky mikroorganismů schválené státním zdravotním ústavem nebo si požadované kmeny zakoupit v komerční sbírce mikroorganismů. Vybrané bakteriální kmeny jsou kvalifikovaným pracovníkem namnoženy nej častěji v minerálních či peptonových médiích. Z důvodu zachování degradačních vlastností mikrobiálních kmenů bývají růstová média obohacena typem cíleného kontaminantu, např. nafta, fenol.A more detailed technological procedure is as follows. Pure starting bacterial strains are stored either in lyophilized form or on agar plates. It is possible to start from the company's collection of microorganisms approved by the state health institute or to purchase the required strains in the commercial collection of microorganisms. Selected bacterial strains are most often multiplied by a qualified worker in mineral or peptone media. In order to preserve the degradation properties of microbial strains, growth media tend to be enriched with the type of targeted contaminant, eg diesel, phenol.

Na přípravu mikrobiálního preparátu/inokula se nejčastěji používá sekvenční submersní kultivace ve vsádkových reaktorech (v laboratorním měřítku se jedná o kultivační baňky, reakční lahve apod., dále pak biorcaktory, fermentory), kdy se postupně zvyšuje objem daného média (scale up). Bioreaktory je nezbytné udržovat v čistotě. Vnitřek bioreaktoru se myje tlakovou vodou. V případě silného znečištění se čistí mechanicky vhodným detergentem a kartáčem. Vždy následuje důkladné omytí čistou vodou. Před napuštěním vymytého bioreaktoru technologickou vodou se zkontroluje její pH. V případě, že hodnota pH je nižší než 6, nebo vyšší než 9, je nutné vodu neutralizovat přídavkem hydroxidu nebo roztokem kyseliny.For the preparation of a microbial preparation / inoculum, sequential submerged cultivation in batch reactors is most often used (on a laboratory scale, these are culture flasks, reaction flasks, etc., as well as biofactors, fermentors), which gradually increases the volume of the medium (scale up). It is essential to keep bioreactors clean. The inside of the bioreactor is washed with pressurized water. In case of heavy soiling, it is cleaned mechanically with a suitable detergent and brush. Thorough washing with clean water always follows. Before filling the washed bioreactor with process water, its pH is checked. If the pH is lower than 6 or higher than 9, the water must be neutralized by adding hydroxide or an acid solution.

Dalším nezbytným krokem pro zachování sterilního prostředí je sterilizace celého objemu reaktoru včetně připraveného živného média, které obsahuje dostatečný zdroj C, P, N a ostatních minerálů. Obecně je možná chemická sterilizace, kdy se nej častěji používají prostředky na bázi chloru. Odstranění chloru se provádí thiosírenem sodným. Úspěšné provedení zákroku se kontroluje zkumavkovým testem s o-toulidinem do vymizení reakce na chlornan. V průmyslovém měřítku se dále používá sterilace ohřevem do 100°C, popřípadě sterilizace vlhkou parou za teploty 121°C a tlaku 101,5 kPa. Sterilizace fermentoru se provádí před každou kultivací preparátu. V závislosti na typu sterilizace a přidávaných růstových substrátů se sterilizace provádí před nebo po přídavku substrátu.Another necessary step to maintain a sterile environment is to sterilize the entire reactor volume, including the prepared nutrient medium, which contains a sufficient source of C, P, N and other minerals. In general, chemical sterilization is possible, with chlorine-based agents being most commonly used. Chlorine removal is performed with sodium thiosulfate. Successful completion of the procedure is checked by a test tube with o-toulidine until the hypochlorite reaction disappears. On an industrial scale, sterilization by heating up to 100 ° C or sterilization by wet steam at a temperature of 121 ° C and a pressure of 101.5 kPa is also used. The fermentor is sterilized before each culture of the preparation. Depending on the type of sterilization and the growth substrates added, sterilization is performed before or after the addition of the substrate.

Všechny tyto dílčí kroky představují časově i investičně náročné operace, včetně kontrolních a nápravných opatření, jejichž výsledek je často ovlivněn i lidským faktorem. Minimalizace či úplná eliminace těchto kroků tak znamená optimalizaci celého procesu. Po namnožení v malém laboratorním fermentoru je inokulum následně naředěno v poměru 1:100 a přeneseno do velkých bioreaktorů, kde probíhá příprava biopreparátu za stejných podmínek.All these partial steps represent time-consuming and investment-intensive operations, including control and corrective measures, the result of which is often influenced by the human factor. Minimization or complete elimination of these steps thus means optimization of the whole process. After multiplication in a small laboratory fermentor, the inoculum is subsequently diluted 1: 100 and transferred to large bioreactors, where the biopreparation is prepared under the same conditions.

v/in/

Biopreparát se v bioreaktorů kultivuje nejméně 24 h^d| při 25 a 30 °C za neustálého intenzivního provzdušňování. Po ukončení kultivace se do sterilní nádobky odebere vzorek a doručí se co nejdříve do laboratoře, kde je provedena mikrobiologická kontrola. Koncentrace takto narostlé mikrobiální populace dosahuje hodnot řádově 10⁸ až 10⁹ kolonií v 1 mililitru inokula (stanovení heterotrofních kultivovatelných bakterií).The biopreparation is cultured in bioreactors for at least 24 hours at 25 and 30 ° C with constant intensive aeration. At the end of the cultivation, a sample is taken in a sterile container and delivered as soon as possible to the laboratory, where a microbiological control is performed. The concentration of such an increased microbial population reaches values of the order of 10 ⁸ to 10 ⁹ colonies in 1 milliliter of inoculum (determination of heterotrophic culturable bacteria).

Aplikace připraveného média na biodegradační plochu se provádí několika známými způsoby. V zásadě se na kontaminované pole aplikuje kapalný bakteriální preparát o dávkování zhruba 10 1 na 1 tunu kontaminované zeminy, což představuje mnohdy nutnost přípravy/přepravy/aplikace mikrobiálního preparátu v objemech desítek až stovek m .The application of the prepared medium to the biodegradation area is carried out in several known ways. In principle, a liquid bacterial preparation is applied to the contaminated field at a dosage of approximately 10 l per 1 ton of contaminated soil, which often necessitates the preparation / transport / application of a microbial preparation in volumes of tens to hundreds of m.

Aplikace za použití stabilního rozvodu napojeného přímo na fermentor se provádí napojením rozprašovacích trysek na výstupy ze stabilního rozvodu biopreparátu. V případě nedostatečného dosahu jednotlivých trysek pro aplikaci na celé ploše, jsou na přípojná místa připojeny požární hadice „C“ a postřik je prováděn proudnicí s jemným rozstřikem. Další možností je použití cisternového vozu, požárního či podobného vozidla. Vždy je nutné dodržovat čisté a sterilní prostředí v zásobních nádobách. Pro aplikaci je používáno čerpadlo o dostatečném výkonu a tlaku. Aplikace je prováděna pomocí požární hadice s připojenou proudnicí a vyžaduje práci minimálně jednoho technika. Po aplikaci biopreparátu je nutné vyčistit zásobní nádoby včetně hadic, potrubí apod.The application using a stable distribution connected directly to the fermenter is carried out by connecting the spray nozzles to the outlets of the stable distribution of the biopreparation. In case of insufficient reach of individual nozzles for application on the entire surface, fire hoses "C" are connected to the connection points and spraying is performed by a jet with fine spraying. Another option is to use a tank truck, fire truck or similar vehicle. It is always necessary to maintain a clean and sterile environment in the storage containers. A pump with sufficient power and pressure is used for the application. The application is performed using a fire hose with a connected jet and requires the work of at least one technician. After application of the biopreparation, it is necessary to clean the storage containers, including hoses, pipes, etc.

V současné době je způsob rozmnožení mikrobiálních kmenů v kapalném médiu závislá především na aktuálních podmínkách jednotlivých biodegradačních lokalit, kde je nej výhodnější mít bioreaktory v místě aplikace a pomocí potrubí daný biopreparát rozstříkat. Bohužel v praxi tato situace není automatická a je třeba začlenit krok kultivace na technologicky vybaveném místě s následným nákladným převozem a rozstříkání biopreparátu, především při aplikaci in situ.At present, the method of multiplication of microbial strains in a liquid medium depends mainly on the current conditions of individual biodegradation sites, where it is most advantageous to have bioreactors at the application site and to spray the biopreparation using piping. Unfortunately, in practice this situation is not automatic and it is necessary to incorporate the step of cultivation at a technologically equipped site with subsequent costly transport and spraying of the biopreparation, especially when applied in situ.

Z podstaty pomalé biologické degradace bývají sanační práce dlouhodobého charakteru a proces inokulace musí být prováděn z pravidla 1 x za měsíc podle mikrobiologických a chemických analýz v časovém horizontu měsíců až roků podle typu polutantu. Napěstování a rozsev alochtonních kmenů tak představuje technologicky významnou část.Due to the nature of slow biological degradation, remediation work tends to be of a long-term nature and the inoculation process must be performed once a month according to microbiological and chemical analyzes in a time horizon of months to years depending on the type of pollutant. The cultivation and distribution of allochthonous strains thus represents a technologically important part.

Dokument WO 2011/1^1291 popisuje způsob dekontaminace pevných matric vnesením externího pevného nosiče s imobilizovanými mikrobiálními degradéry nebo nosiče impregnovaného kapalinou usnadňující biodegradační proces (např. zdroj nutrietů). Tento nosič je po stanovenou dobu ponechán v kontaktu s kontaminovanou matricí a následně vyjmut.WO 2011/11291 discloses a method of decontaminating solid matrices by incorporating an external solid support with immobilized microbial degraders or a liquid impregnated support facilitating the biodegradation process (e.g. a nutrient source). This carrier is left in contact with the contaminated matrix for a specified time and then removed.

Výhody v současné době používaných technologických postupů metody inokulace spočívají v tom, že je možné přesné vedení optimálních podmínek růstu zanášené mikrobiální kultury před aplikací biopreparátu do celého objemu sanované zeminy (temperace optimální teploty, pH, složení růstového média, aseptické prostředí).The advantages of the currently used technological methods of the inoculation method are that it is possible to precisely control the optimal growth conditions of the clogged microbial culture before applying the biopreparation to the entire volume of remediated soil (optimal temperature tempering, pH, growth medium composition, aseptic environment).

Nevýhody současných známých postupů jsou následující:The disadvantages of the current known methods are the following:

Při rozsáhlých bioremediačních sanačních pracích je nutné připravit kapalné inokulum v objemu řádově desítek až stovek m³ v bioreaktorech. Tento technologický krok se pojí s nezanedbatelnou spotřebou elektrické energie (temperace teploty během kultivace na 25^30^0, aerace), lidské práce (čištění zařízení, příprava médií, sterilace, inokulace, monitoring kultivace), časovou náročností (scale up do potřebného objemu), velká spotřeba primárních mikrobiálních substrátů, technologické vody, chemikálií na sterilaci procesu, apod.During extensive bioremediation remediation works, it is necessary to prepare a liquid inoculum in the volume of tens to hundreds of m ³ in bioreactors. This technological step is associated with a significant consumption of electricity (temperature tempering during cultivation to 25 ^ 30 ^ 0, aeration), human work (cleaning equipment, media preparation, sterilization, inoculation, cultivation monitoring), time consuming (scale up to the required volume ), high consumption of primary microbial substrates, process water, process sterilization chemicals, etc.

Převoz a aplikace mikrobiálního preparátu na sanovanou lokalitu, který je taktéž spojen se zajištěním cisteren, hasicích vozů, požárních hadic, potrubních zařízení apod., pojící se na spotřebu pohonných hmot, přítomnost technika a pravidelné čištění veškeré techniky.Transport and application of microbial preparation to the rehabilitated site, which is also associated with the provision of tanks, fire trucks, fire hoses, piping, etc., associated with fuel consumption, the presence of technicians and regular cleaning of all equipment.

. V případě kultivací náročných čistých kultur v objemech řádově jednotek až desítek m³ biopreparátu pro provozní potřeby, se zvyšuje neúměrně jednotková cena biopreparátu vzhledem k nutnosti kultivovat inokulum ve specializovaných (investičně náročných) bioreaktorech.. In the case of cultivation of demanding pure cultures in volumes of the order of up to tens of m ³ of biopreparation for operational needs, the unit price of the biopreparation increases disproportionately due to the need to cultivate inoculum in specialized (investment-intensive) bioreactors.

Kultivace mikrobiálních konsorcií, kdy ve velkém objemu často dochází ke kultivaci jednoho kmene na úkor ostatních.Cultivation of microbial consortia, where one strain is often cultivated in large volumes at the expense of others.

. Vzhledem k faktu, že alochtonní mikroflora je do poslední chvíle řízeně kultivována v bioreaktorech, je zde minimální aklimatizační interval na reálné podmínky (fyzikálněchemický a chemický charakter zeminy, přítomnost autochtonní mikroflóry, meteorologické podmínky, apod.), může dojít k inhibici biodegradaění aktivity vnesených mikroorganismů.. Due to the fact that the allochthonous microflora is cultivated in bioreactors until the last moment, there is a minimum acclimatization interval to real conditions (physicochemical and chemical character of the soil, presence of autochthonous microflora, meteorological conditions, etc.), biodegradation activity of introduced microorganisms may be inhibited. .

Úkolem vynálezu je odstranit výše uvedené nedostatky stávajících známých postupů biodegradaění sanace a vytvořit takový způsob biodegradaění sanace, který by odstranil náročné kroky předkultivace mikrobiálního preparátu pro inokulaci znečištěné zeminy, odstranil fázi převozu předkultivovaného preparátu a zvýšil dobu aklimatizace na reálné podmínky, tj. na fyzikálně-chemický a chemický charakter zeminy.The object of the invention is to eliminate the above-mentioned shortcomings of the existing known remediation biodegradation processes and to provide such a remediation biodegradation method which eliminates the demanding pre-cultivation steps of a microbial preparation for inoculation of contaminated soil, eliminates chemical and chemical character of the soil.

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Tento úkol je vyřešen vytvořením způsobu biodegradaění sanace znečištěné zeminy inokulaci mikrobiálního preparátu podle předloženého vynálezu, kdy mikrobiální preparát obsahuje alespoň jeden alochtonní mikroorganismus, zejména bakteriální kmeny ze skupiny pseudomonas fluorescens, pseudomonas veronii, acinetobacter calcoaceticus, pseudomonas putida, pseudomonas stutzeri, arthrobacter protophormiae, bacillus megaterium, psychobacter sp.This object is solved by creating a method of biodegradation of remediation of contaminated soil by inoculation of a microbial preparation according to the present invention, wherein the microbial preparation contains at least one allochthonous microorganism, especially bacterial strains from pseudomonas fluorescens, pseudomonas veronii, acinetobacter calcoaceticus, megaterium, psychobacter sp.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvním kroku se mikrobiální preparát inokuluje do znečištěné zeminy, kde probíhá jeho kultivace přirozeným rozmnožováním, a ve druhém kroku se inokulovaná zemina alespoň jednou smíchá s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou v hmotnostním poměru v rozmezí od 1 : 20 do 1 : 100 a následně probíhá kultivace populace mikrobiálního preparátu v celém objemu směsi. Roznesení alochtonních biodegradačních mikrobiálních kmenů novou metodou inokulace je potvrzeno na základě provedených biodegradačních testů (zvýšení degradační rychlosti daného polutantu) a na základě vyhodnocení z amplikonů DNA bakterií a jejich separace pomocí denaturační gradientově gelové elektroforézy (DGGE) z kolonií vyrostlých na agarových plotnách, jak je uvedeno v příkladu III.The essence of the invention is that in the first step the microbial preparation is inoculated into the contaminated soil, where its cultivation takes place by natural propagation, and in the second step the inoculated soil is mixed at least once with the uninoculated contaminated soil in a weight ratio ranging from 1:20 to 1: 100 and then the population of the microbial preparation is cultured in the entire volume of the mixture. The distribution of allochthonous biodegradable microbial strains by the new inoculation method is confirmed on the basis of biodegradation tests (increase of degradation rate of a given pollutant) and on evaluation of bacterial DNA amplicons and their separation by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) from colonies grown on agar plates. shown in Example III.

Mikrobiální preparát je v prvním kroku aplikován v množství 5 až 15 ml na 1 kg sušiny znečištěné zeminy. Ve vzorku zeminy se mikrobiální preparát nechá namnožit. Indikátorem dostatečného oživení půdy je výsledek výsevu heterotrofních mikroorganismů nad 1,00 E + 0,6 CFU/gsuj, kterého je obvykle dosaženo během jednoho týdne kultivace.In the first step, the microbial preparation is applied in an amount of 5 to 15 ml per 1 kg of dry soil of contaminated soil. The microbial preparation is allowed to multiply in the soil sample. An indicator of sufficient soil recovery is the result of sowing heterotrophic microorganisms above 1.00 E + 0.6 CFU / gsuj, which is usually achieved within one week of cultivation.

V jakékoli fázi během prvního kroku či druhého kroku se znečištěná zemina provzdušňuje a/nebo hnojí a/nebo zvlhčuje, aby bylo dosaženo dostatečného rozšíření alochtonních mikroorganismů.At any stage during the first step or the second step, the contaminated soil is aerated and / or fertilized and / or moistened to achieve sufficient spread of allochthonous microorganisms.

Je výhodné, že se provádí homogenizace přidávaného hnojivá se znečištěnou zeminou a zároveň provzdušnění znečištěné zeminy během druhého kroku. Pracuj e-li se ve velkých objemech na biodegradačních plochách, jek těmto účelům používána těžká technika (rypadla, bagry), kterou se sanovaná zemina homogenizuje (rovnoměrný přísun živin a vody, provzdušnění). Druhý krok zahrnující míšení oživené a neoživené zeminy je tedy výhodné provádět současně, což přináší další úsporu času a energie.It is advantageous to homogenize the added fertilizer with the contaminated soil and at the same time aerate the contaminated soil during the second step. When working in large volumes on biodegradation areas, heavy machinery (excavators, excavators) is used for these purposes, which homogenizes the remediated soil (even supply of nutrients and water, aeration). The second step, which involves mixing revived and un revived soil, is therefore advantageous to carry out simultaneously, which saves further time and energy.

V případě nedostatku živin v inokulované zemině se v průběhu prvního kroku do inokulované znečištěné zeminy přidává minerální hnojivo NP (K) v množství 0,5 % hmotn. a v inokulované znečištěné zemině se upravuje obsah sušiny na maximálně 80 % hmotn..In the case of a lack of nutrients in the inoculated soil, during the first step, the mineral fertilizer NP (K) is added to the inoculated contaminated soil in an amount of 0.5% by weight. and the dry matter content in the inoculated contaminated soil is adjusted to a maximum of 80% by weight.

Kultivace populace mikrobiálního preparátu v inokulované zemině ve druhém kroku probíhá až do doby, kdy je dosaženo mikrobiální osídlenosti heterotrofními kultivovatelnými organismy alespoň na hodnotu 1,00 E + 0,6 CFU/g_SUš, kde zkratka „suš“ označuje sušinu ve sledovaném vzorku půdy, čímž je dosaženo sanace znečištěné zeminy. Přidání vzorku inokulované půdy je možné opakovat až do dosažení rozšíření alochtonních mikrobiálních organismů v celém objemu sanované zeminy.The cultivation of the population of the microbial preparation in the inoculated soil in the second step takes place until the microbial population of heterotrophic cultivable organisms is reached at least 1.00 E + 0.6 CFU / g _SU š, where the abbreviation "dry" indicates dry matter in the monitored sample. soil, thus achieving the remediation of contaminated soil. The addition of a sample of inoculated soil can be repeated until the spread of allochthonous microbial organisms in the entire volume of the remediated soil.

Po ukončení druhého kroku se sanovaná zemina smíchá s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou v hmotnostním poměru v rozmezí od 1 : 20 do 1 : 100 a následně probíhá kultivace populace mikrobiálního preparátu v celém objemu směsicAt the end of the second step, the remediated soil is mixed with the so far uninoculated contaminated soil in a weight ratio ranging from 1:20 to 1: 100, and then the population of the microbial preparation is cultivated in the entire volume of the mixtures.

Míchání sanované zeminy s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou se cyklicky opakuje až do dosažení sanace celého objemu znečištěné zeminy určeného k biodegradaění sanaci v dané lokalitě. Míchání zeminy v druhém kroku se provádí pomocí těžké zemní techniky zejména bagru, nakladače, traktoru s radlicí nebo buldozeru.Mixing of remediated soil with not yet inoculated polluted soil is repeated cyclically until the remediation of the entire volume of polluted soil intended for biodegradation is achieved by remediation in the given locality. The mixing of the soil in the second step is carried out using heavy earthmoving equipment, especially an excavator, loader, tractor with a blade or a bulldozer.

Výhody způsobu biodegradaění sanace znečištěné zeminy podle vynálezu jsou následující:The advantages of the method of biodegradation of remediation of contaminated soil according to the invention are the following:

Nová metoda vnesení mikrobiálních činitelů představuje výhodu vynechání kultivace mikrobiálních kmenů ve velkoobjemových bioreaktorech následovanou aplikací rozstřikem kapalného mikrobiálního preparátu, a tím i odstranění veškerých nevýhod těchto technologických kroků vyjmenovaných v oddílu dosavadní stav techniky.The new method of introducing microbial agents has the advantage of omitting the cultivation of microbial strains in large-volume bioreactors followed by spray application of a liquid microbial preparation, and thus eliminating all the disadvantages of these technological steps listed in the prior art section.

Technologický krok míšení zeminy za účelem homogenizace zeminy s alochtonními mikrobiálními kmeny se zeminou bez alochtonních kmenů v určitém hmotnostním poměru lze provádět současně s provzdušňováním zeminy, homogenizací přidávaných minerálních hnojiv a zajištěním rovnoměrné vlhkosti. Podpora mikrobiální růstové a degradaění aktivity je nutná ve všech případech biodegradaěních sanací ex situ/in situ bez závislosti na způsobu inokulace. Nová metoda inokulace tedy nepředstavuje nutnost pořizování dalšího technického zařízení a zajištění dalších pracovních sil.The technological step of mixing soil in order to homogenize soil with allochthonous microbial strains with soil without allochthonous strains in a certain weight ratio can be performed simultaneously with aeration of the soil, homogenization of added mineral fertilizers and ensuring uniform humidity. Support for microbial growth and degradation activity is necessary in all cases of ex situ / in situ biodegradation remediation, regardless of the method of inoculation. The new inoculation method therefore does not necessitate the acquisition of additional technical equipment and the provision of additional manpower.

Zkrácení aklimatizaění periody vnášených mikroorganismů. Mikrobiální kultura je aklimatizována na dané sanační podmínky od začátku inokulace, >^5/ / / ' ! 3 < iShortening the acclimatization period of the introduced microorganisms. The microbial culture is acclimatized to the given remediation conditions from the beginning of the inoculation,> ^ 5 / / / '! 3 <i

ObiasnenívykresukYDescription of the drawing

Vynález bude blíže objasněn pomocí obrázků na výkresech, na nichž znázorňují obr. 1 graf koncentrace PAU (polyaromatických uhlovodíků) se 3 a 4 aromatickými kruhy - I. stupeň inokulace, obr. 2 graf koncentrace PAU se 3 a 4 aromatickými kruhy - II. stupeň inokulace, obr. 3 graf koncentrace PAU v uměle kontaminované zemině - L stupeň inokulace, obr. 4 graf koncentrace PAU v uměle kontaminované zemině - II. stupeň inokulace a obr. 5 dendogram DGGE gelu reálně kontaminované zeminy.The invention will be further elucidated with the aid of the figures in the drawings, in which FIG. degree of inoculation, Fig. 3 graph of PAH concentration in artificially contaminated soil - L degree of inoculation, Fig. 4 graph of PAH concentration in artificially contaminated soil - II. degree of inoculation and Fig. 5 dendogram of DGGE gel of really contaminated soil.

Příklady uskutečnění vynálezuExamples of embodiments of the invention

Rozumí se, že jednotlivá uskutečnění vynálezu jsou představována pro ilustraci, nikoli jako omezení vynálezu na výčet zde uvedených příkladů provedení. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování mnoho ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána. I tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.It is to be understood that the various embodiments of the invention are presented by way of illustration and not by way of limitation. Those skilled in the art will find, or be able to ascertain using routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the invention specifically described herein. These equivalents will also be included within the scope of the following claims.

Příklad IExample I

Příklad I je proveden na reálně znečištěné zemině označené JČP (Jihočeská Plynárenská, odkud byla znečištěná zemina odebrána), zatížené polyaromatickými uhlovodíky (PAU) s počáteční koncentrací 7 399 mg/kg_SUš. Příklad je založen na sledování míry degradace PAU, kdy byla aplikována nová metoda inokulace mikrobiálním preparátem do sanované zeminy v porovnání s kontrolní variantou.Example I is performed on really polluted soil marked JČP (Jihočeská Plynárenská, from where the polluted soil was taken), loaded with polyaromatic hydrocarbons (PAH) with an initial concentration of 7,399 mg / kg _SU . The example is based on monitoring the degree of PAH degradation when applied a new method of inoculation with a microbial preparation into remediated soil in comparison with the control variant.

Příprava výchozí zeminy na experimentální pokus a postup provedení příkladu:Preparation of the starting soil for the experimental experiment and procedure of the example:

kg znečištěné zeminy bylo sušeno při laboratorní teplotě, proseto přes síto (velikost ok 2 mm) a homogenizováno. Množství znečištěné zeminy bylo voleno tak, aby bylo dostatečné množství zeminy na jednotlivé varianty pro dva stupně míšení zeminy + rezerva.kg of contaminated soil was dried at room temperature, sieved (mesh size 2 mm) and homogenized. The amount of contaminated soil was chosen so that there was a sufficient amount of soil for each variant for two stages of soil mixing + reserve.

Ze 100 g takto připravené zeminy bylo připraveno základní inokulum, kdy bylo přidáno hnojivo NPK (zdroj dusíku N, fosforu P a draslíku K) (3 g/kg zeminy) a bakteriální směs definovaná v lab. 1. Bakteriální směs byla napěstována v peptonovém médiu a byla aplikována v množství 10 ml na 1 kg_suš zeminy. Takto upravená zemina byla kultivována v termostatu za teploty 22°C za stálého vlhčení a přístupu vzduchu. Mikrobiální nárůst byl kvantitativně hodnocen výsevem na plotny (DEV agar) a při hodnotách 1 · 10⁶ - 1 · 10⁹ CFU/gSUš (10 dnů) byl proveden L stupeň inokulace míšením zemin, a to přenosem 10 g mikrobiálně oživené zeminy do 200 g, 500 $ a 1000 g neinokulované znečištěné zeminy vždy ve dvou paralelách (AI 200g, BI 200g, AI 500g, BI 500g, AI 1000g, BI 1000g). Následovala kultivace za totožných podmínek do dosažení mikrobiálního osídlení 110⁶ - 1Ί0⁹ CFU/gsuj (16 dnů). Poté byl stejným způsobem jako I. stupeň inokulace proveden II. stupeň inokulace přenosem 10 g zeminy z I. stupně do výchozí neinokulované zeminy s následným značením All 200g, BII 200g, All 500g, BII 500g, All 1000g, BII 1000g . Celý experiment probíhal v termostatu při 22^C za stálého vlhčení a přístupu vzduchu. Před každým přenosem byla zemina odebrána a uchována pro pozdější izolaci DNA. Z narostlých agarových ploten byla DNA izolována průběžně. V průběhu celého experimentu byly pravidelně odebírány vzorky na monitoring degradačního trendu PAU vždy ve třech paralelách, s jejichž průměrem a odchylkami je následně pracováno.A basic inoculum was prepared from 100 g of the thus prepared soil, when NPK fertilizer (source of nitrogen N, phosphorus P and potassium K) (3 g / kg of soil) and bacterial mixture defined in lab were added. 1. The bacterial mixture was grown in peptone medium and applied in an amount of 10 ml per 1 kg of _dry soil. The treated soil was cultivated in a thermostat at 22 ° C with constant humidification and air access. Microbial growth was quantified by seeding on plates (DEV agar) and at values 1 · 10 ⁶ - 1 · 10 ⁹ CFU / gSUš (10 days) the L stage of inoculation was performed by mixing the soils, by transferring 10 g of microbially animated soil to 200 g , $ 500 and 1000 g of uninoculated contaminated soil always in two parallels (AI 200g, BI 200g, AI 500g, BI 500g, AI 1000g, BI 1000g). This was followed by cultivation under the same conditions until a microbial population of 110 ⁶ - 1Ί0 ⁹ CFU / gsuj (16 days) was reached. Thereafter, the II. degree of inoculation by transferring 10 g of soil from the first stage to the initial non-inoculated soil with subsequent marking All 200g, BII 200g, All 500g, BII 500g, All 1000g, BII 1000g. The whole experiment took place in a thermostat at 22 ° C with constant humidification and air access. Prior to each transfer, the soil was removed and stored for later DNA isolation. DNA was isolated from the grown agar plates continuously. Throughout the experiment, samples were regularly taken to monitor the degradation trend of PAHs, always in three parallels, the diameter and deviations of which are subsequently worked on.

Kontrolní varianta byla připravena z 1000 g znečištěné zeminy, která byla souběžně s ostatními experimentálními variantami vlčena, hnojena a kultivována za stejných podmínek. Nebyly přidávány žádné alochtonní mikroorganismy.The control variant was prepared from 1000 g of contaminated soil, which was dragged, fertilized and cultivated under the same conditions in parallel with the other experimental variants. No allochthonous microorganisms were added.

Tab. 1: Preparáty použité pro inokulaci kontaminovaných zeminTab. 1: Preparations used for inoculation of contaminated soils

Biopreparát Biopreparation označení designation Bakteriální kmen Bacterial strain BIOTECH I+III BIOTECH I + III 6 6 Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens 145 145 Pseudomonas veronii Pseudomonas veronii 147 147 Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter calcoaceticus 161 161 Pseudomonas putida Pseudomonas putida 171 171 Pseudomonas stutzeri Pseudomonas stutzeri BIOTECH-ARL BIOTECH-ARL PM1 PM1 Arthrobacter protophormiae Arthrobacter protophormiae PM2 PM2 Bacillus megaterium Bacillus megaterium PM3/2 PM3 / 2 Psychrobacter sp. Psychrobacter sp.

Výsledky degradace PAUPAH degradation results

Ze vzorků zemin JČP byly extrahovány PAU na přístroji ASE 200 (Dionex). Supernatant byl přečištěn 3x destilovanou vodou, nanesen na kolonku se síranem sodným a následně eluován 4 ml hexanu. Extrakty byly převedeny do ethyl acetátu, ředěny acetonitrilem a analyzovány metodou HPLC.PAHs were extracted from JČP soil samples on an ASE 200 instrument (Dionex). The supernatant was purified 3 times with distilled water, applied to a sodium sulfate column and then eluted with 4 ml of hexane. The extracts were taken up in ethyl acetate, diluted with acetonitrile and analyzed by HPLC.

Na obr. 13 a 14 je graficky znázorněn pokles PAU se 3 a 4 aromatickými kruhy. Vlivem přídavku minerálního hnojivá, vlhčení a provzdušňování je patrný pokles PAU u všech experimentálních variant včetně kontroly, což potvrzuje pozitivní aktivaci autochtonních mikroorganismů. Porovnáním kontroly a všech mikrobiálně obohacených variant A, B, zjistíme vyšší pokles všech PAU vlivem probíhající degradační aktivity alochtonních bakteriálních kmenů.Figures 13 and 14 show graphically the decrease in PAHs with 3 and 4 aromatic rings. Due to the addition of mineral fertilizer, humidification and aeration, a decrease in PAH is evident in all experimental variants, including the control, which confirms the positive activation of autochthonous microorganisms. By comparing the control and all microbially enriched variants A, B, we find a higher decrease of all PAHs due to the ongoing degradation activity of allochthonous bacterial strains.

Naftalen nebyl detekován ani v případě vstupní zeminy, což bylo zřejmě zapříčiněno přípravou zeminy. Při sušení došlo pravděpodobně k jeho vytékání.Naphthalene was not detected even in the case of input soil, which was probably caused by soil preparation. It probably leaked during drying.

V Tabulce 2 jsou shrnuty procentuální míry poklesu jednotlivých PAU detekovaných na konci pokusu, tj. po 4 měsících po II. stupni inokulace. Nejvýraznější rozdíl kontroly a oživených variant v porovnání se vstupní hodnotou byl zjištěn pro chrysen, který v kontrole dosáhl pouze 6.3% poklesu oproti nejlepší variantě IIA 1000g: 59, L%. Naproti tomu antracen ' h A v kontrolní variantě klesl o 72,4% a u nej lepší varianty IIA 1000g o 87,2%.Table 2 summarizes the percentage rates of decline of individual PAHs detected at the end of the experiment, ie after 4 months after II. degree of inoculation. The most significant difference between the control and the revived variants compared to the input value was found for chrysanthemum, which in the control reached only 6.3% decrease compared to the best variant IIA 1000g: 59.1%. In contrast, anthracene 'A in the control variant decreased by 72.4% and in the better variant IIA 1000g by 87.2%.

Tabulka 2: procentuální míry poklesu jednotlivých PAUTable 2: percentage rates of decline of individual PAHs

acenaftylen ______ acenaphthylene ______ fluoren fluorene fenantren phenanthrene antracen anthracene acenaften acenaphthene fluoranten fluoranthene pyren pyrene benzo(a)antracen benzo (a) anthracene chrysen chrysanthemum Vstup 7399 mg/kg Input 7399 mg / kg 0.0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 Kontrola Control 28,7 28.7 51,5 51.5 25,4 25.4 72,4 72.4 98,4 98.4 19,7 19.7 22,1 22.1 12,3 12.3 6,3 6.3 IIA 200 g IIA 200 g 60,9 60.9 71,2 71.2 52,9 52.9 79,8 79.8 100,0 100.0 46,9 46.9 50,3 50.3 39,7 39.7 30,9 30.9 IIB 200 g IIB 200 g 64,7 64.7 72,3 72.3 53,7 53.7 79,8 79.8 100,0 100.0 47,1 47.1 50,6 50.6 40,2 40.2 31,4 31.4 IIA 500 g IIA 500 g 67,5 67.5 73,8 73.8 52,2 52.2 80,7 80.7 100,0 100.0 49,2 49.2 53,2 53.2 45,1 45.1 37,8 37.8 IIB 500 g IIB 500 g 67,4 67.4 73,3 73.3 53,4 53.4 80,6 80.6 100,0 100.0 46,6 46.6 52,6 52.6 42,4 42.4 34,7 34.7 IIA 1000 g IIA 1000 g 76,2 76.2 82,0 82.0 68,2 68.2 87,2 87.2 100,0 100.0 67,6 67.6 69,6 69.6 64,4 64.4 59,1 59.1 IIB 1000 g IIB 1000 g 73,3 73.3 80,3 80.3 66,5 66.5 85,7 85.7 100,0 100.0 64,2 64.2 66,8 66.8 60,6 60.6 55,4 55.4

Důležitou informací byla dále degradační aktivita v závislosti na poměru míchané inokulované/neinokulované zeminy. Pozitivní vliv alochtonní mikroflóry byl zřejmý u všech hmotnostních poměrech 10:200, 10:500 a 10:1000. Nej výraznějšího výsledku bylo dosaženo při postupném míchání zeminy v poměru 10:1000 (1:100), ovšem všechny poměry jsou v praxi použitelné.Another important information was the degradation activity depending on the ratio of mixed inoculated / non-inoculated soil. The positive effect of allochthonous microflora was evident at all weight ratios of 10: 200, 10: 500 and 10: 1000. The most significant result was achieved by gradually mixing the soil in a ratio of 10: 1000 (1: 100), but all ratios are applicable in practice.

Příklad IIExample II

Příklad II byl proveden na uměle znečištěné modelové zemině, kdy byly přidány jednotlivé PAU o výsledné koncentraci každé z látek 500 mg/kg_suš (naftalen, fluoranten, pyren a fenantren). Postup a příprava experimentu byl proveden totožně jako u příkladu I. Jediným rozdílem byl odlišný postup extrakce PAU, kdy v příkladu II byla zemina extrahována směsí hexan:aceton (2:1) po dobu 1 h v ultrazvukové lázni. Následná analýzy PAU probíhala totožně.Example II was performed on artificially contaminated model soil, where individual PAHs with a final concentration of 500 mg / kg _{dry matter} (naphthalene, fluoranthene, pyrene and phenanthrene) were added. The procedure and preparation of the experiment were carried out in the same way as in Example I. The only difference was the different PAH extraction procedure, where in Example II the soil was extracted with hexane: acetone (2: 1) for 1 h in an ultrasonic bath. Subsequent analysis of PAHs was identical.

U uměle znečištěné zeminy byly záměrně zvoleny nižší koncentrace kontaminantů z důvodu případné rychlejší adaptace vnesených degradérů a snížení toxického vlivu zeminy na tyto činitele.In the case of artificially contaminated soil, lower concentrations of contaminants were deliberately chosen due to the possible faster adaptation of the introduced degraders and the reduction of the soil's toxic effect on these factors.

Výsledky míry degradace PAU příkladu IIPAU degradation rate results of Example II

Významný pokles koncentrace PAU byl zaznamenán v případě uměle znečištěné zeminy, a to v obou stupních inokulace, viz obr. 3 a 4. Byla potvrzena podpora autochtonní mikroflóry patrná z výsledků degradace u kontroly bez přídavku bakteriálního preparátu. Ve všech variantách byl ovšem potvrzen výrazný pozitivní vliv vnesených bakteriálních činitelů, yA significant decrease in PAH concentration was recorded in the case of artificially contaminated soil, in both stages of inoculation, see Figs. In all variants, however, a significant positive effect of the introduced bacterial factors, y

K degradaci docházelo u všech přítomných PAU. V případě fenantrenu byl pokles 90.^93%, V v bez přítomnosti preparátu 77% (vztaženo k hodnotám koncentrace vstupní zeminy). Hodnoty Λ ·ιτί c ' koncentrace fluorantenu a pyrenu poklesly o 65r75% vůči vstupu, u kontrol o 30U5%. U varianty 1000 g v II. stupni inokulace docházelo k nepatrně vyšší degradaci pyrenu. Již při procesu umělé kontaminace došlo k vytékání 50% naftalenu. Není možné určit, zda byl naftalen degradován mikroorganismy, které tento polutant upřednostňují jako nejjednodušší substrát nebo byl výsledný pokles zapříčiněn volatilizací.Degradation occurred in all PAHs present. In the case of phenanthrene, the decrease was 90.93%, in the absence of the preparation 77% (relative to the input soil concentration values). The values of ant · ιτί c 'concentrations of fluoranthene and pyrene decreased by 65r75% compared to the input, in controls by 30U5%. In the variant 1000 g in II. slightly higher degradation of pyrene occurred in the inoculation step. Already during the process of artificial contamination, 50% of the naphthalene leaked. It is not possible to determine whether naphthalene has been degraded by microorganisms that prefer this pollutant as the simplest substrate or whether the resulting decrease was caused by volatilization.

U příkladu II nebyl potvrzen zásadní vliv na poměr míchané inokulované/neinokulované zeminy v jednotlivých stupních inokulace. Všechny vyzkoušené hmotnostní poměry 10:200, 10:500 a 10:1000 potvrdily intenzifikaci degradačních procesů.Example II did not confirm a significant effect on the ratio of mixed inoculated / uninoculated soil in the individual stages of inoculation. All tested weight ratios of 10: 200, 10: 500 and 10: 1000 confirmed the intensification of degradation processes.

Závěr příkladu I a IIConclusion of Example I and II

V příkladu I a II byla prokázána úspěšná metoda vnesení biologického činitele do sanované zeminy na základě porovnání degradačních aktivit experimentálních variant příkladu, kdy varianty obohacené speciálními bakteriálními kmeny schopnými rozkládat PAU vykazovaly rychlejší rozklad těchto látek. Zároveň byla potvrzena účinnost hmotnostních poměrů během míšení inokulovaných a neinokulovaných zemin 10:200, 10:500 a 10:1000. V rámci metody vnesení biologického činitele do sanované zeminy se tedy používá hmotnostní poměr v rozmezí 1:20 až 1:100.In Example I and II, a successful method of introducing a biological agent into remediated soil was demonstrated by comparing the degradation activities of experimental variants of the example, where variants enriched with special bacterial strains capable of decomposing PAHs showed faster decomposition of these substances. At the same time, the efficiency of the weight ratios during the mixing of inoculated and non-inoculated soils 10: 200, 10: 500 and 10: 1000 was confirmed. Thus, a weight ratio in the range of 1:20 to 1: 100 is used in the method of introducing a biological agent into the remediated soil.

Příklad IIIExample III

Příklad III je zaměřený na potvrzení přítomnosti vnesených mikrobiálních činitelů do experimentálních zemin příkladu I na základě molekulární metody DGGE (denaturační gradientová elektroforéza). Touto metodou byla stanovena míra osídlenosti jednotlivých vnesených bakterií ve vzorcích výchozí zeminy a na konci experimentu.Example III is aimed at confirming the presence of microbial agents introduced into the experimental soils of Example I on the basis of the molecular DGGE method (denaturing gradient electrophoresis). This method was used to determine the degree of population of individual introduced bacteria in the samples of the starting soil and at the end of the experiment.

Gely z denaturační gradientově elektroforézy byly vyhodnoceny metodou shlukové (klastrové) analýzy (BioNumerics 7.0, Applied Maths, USA). Podobnost, či odlišnost jednotlivých skupin vzorků (klastrů) na základě „proužků“ bakteriální 16S rDNA je vizualizována pomocí dendrogramu. Na horizontální ose je zobrazen koeficient podobnosti [%] a na vertikální ose jsou vyneseny objekty (vzorky).Denaturing gradient electrophoresis gels were evaluated by cluster analysis (BioNumerics 7.0, Applied Maths, USA). The similarity or difference of individual groups of samples (clusters) based on the "bands" of bacterial 16S rDNA is visualized using a dendrogram. The similarity coefficient [%] is shown on the horizontal axis and objects (samples) are plotted on the vertical axis.

Z dendrogramu na Qbr.5 je patrná odlišnost znečištěné zeminy a kontroly (bez přídavku bakt. izolátů) od vzorků zemin s přidanými bakteriemi. Tato skutečnost potvrzuje pozitivní vliv přidaných izolátů na bakteriální společenství ve znečištěné zemině a zároveň schopnost adaptace těchto kmenů na přítomné podmínky. Tuto schopnost vykazuje především vnesený bakteriální kmen Acinetobacter calcoaceticus, jehož přítomnost byla zaznamenána pouze u inokulovaných zemin. Pomocí klastrové analýzy byla prokázána také vysoká genomová příbuznost bakterií rodu Pseudomonas, která zároveň znemožňuje odlišení kmenů P. putida od P. veronii, které jsou pravděpodobně v inokulované i znečištěné zemině přítomné. Ve znečištěné i inokulované zemině se také pravděpodobně vyskytuje P. fluorescens, P. stutzeri a Arthrobacter protophormiae, jejichž přítomnost nebyla zaznamenána v kontrole. Nedochází tedy k negativnímu vlivu vnesených mikroorganismů na původní mikroflóru, spíše naopak.The dendrogram on Qbr.5 shows the difference of contaminated soil and control (without the addition of bacterial isolates) from soil samples with added bacteria. This fact confirms the positive effect of the added isolates on the bacterial community in the contaminated soil and at the same time the ability of these strains to adapt to the present conditions. This ability is demonstrated mainly by the introduced bacterial strain Acinetobacter calcoaceticus, the presence of which was recorded only in inoculated soils. Cluster analysis also demonstrated the high genomic relatedness of bacteria of the genus Pseudomonas, which also makes it impossible to distinguish P. putida strains from P. veronii, which are probably present in inoculated and contaminated soil. P. fluorescens, P. stutzeri and Arthrobacter protophormiae, the presence of which was not recorded in the control, are also likely to occur in contaminated and inoculated soil. Thus, there is no negative effect of the introduced microorganisms on the original microflora, on the contrary.

Přítomnost uměle vnesené bakterie Acinetobacter calcoaceticus metodou vnesení biologického činitele do sanované zeminy na konci experimentu jednoznačně potvrzuje účinnost této metody. Metodou DGGE bohužel nebylo možné prokázat přítomnost dalších inokulováných bakterií, protože jejich odezva se kryla s autochtonními kmeny.The presence of artificially introduced bacterium Acinetobacter calcoaceticus by the method of introducing a biological agent into the remediated soil at the end of the experiment clearly confirms the effectiveness of this method. Unfortunately, it was not possible to prove the presence of other inoculated bacteria using the DGGE method, because their response coincided with autochthonous strains.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Způsob biodegradaění sanace znečištěné zeminy podle vynálezu lze využít pro bioremediační odstraňovaní polutantů, zejména PAU ex situ a in situ.The method of biodegradation of remediation of contaminated soil according to the invention can be used for bioremediation removal of pollutants, especially PAHs ex situ and in situ.

iand

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS

Claims

PATENT CLAIMS / iCc

A method for biodegradation remediation of contaminated soil by inoculation of a microbial preparation containing at least one allochthonous microorganism, in particular at least one bacterial strain from the group pseudomonas fluorescens, pseudomonas veronii, acinetobacter calcoaceticus, pseudomonas putida, pseudomonas stutzeri, in that in the first step the microbial preparation is inoculated into the contaminated soil, where it is cultivated by natural propagation, and in the second step the inoculated soil is mixed at least once with the as yet inoculated contaminated soil in a weight ratio ranging from 1:20 to 1: 100 and subsequently, the population of the microbial preparation is cultured in the entire volume of the mixture.

Method according to at least one of Claims 1 to 3, characterized in that the microbial preparation is applied in the first step in an amount of 5 to 15 ml per kg of dry matter of the contaminated soil.

Method according to claims 1 or 2, characterized in that at any stage during the first step or the second step, the contaminated soil is aerated and / or fertilized and / or moistened.

Method according to claim 3, characterized in that the homogenization of the added fertilizer is carried out with the contaminated soil and at the same time the contaminated soil is aerated during the second step,

Method according to claims 3 or 4, characterized in that during the first step, the mineral fertilizer NP (K) is added to the inoculated contaminated soil in an amount of 0.5% by weight.

Method according to at least one of Claims 3 to 5, characterized in that during the first step, the dry matter content of the inoculated contaminated soil is adjusted to a maximum of 80% by weight.

Method according to at least one of Claims 1 to 6, characterized in that the cultivation of the microbial preparation population in the inoculated soil takes place in the second step until microbial population through heterotrophic cultivable organisms is reached to at least 1.00 E + 0.6 CFU / g _{dry matter} , where the abbreviation "dry matter" means dry matter in the monitored soil sample, thus achieving remediation of the contaminated soil.

8. The method according to claim 7, characterized in that after the completion of the second step, the remediated soil is mixed with the so far uninoculated contaminated soil in a weight ratio ranging from 1:20 to 1: 100 and then the population is cultivated. microbial preparation in the entire volume of the mixture.

The method according to claim 8, characterized in that the mixing of the remediated soil with the not yet inoculated contaminated soil is repeated cyclically until the remediation of the entire volume of contaminated soil intended for biodegradation remediation in a given locality is reached.

Method according to at least one of Claims 1 to 9, characterized in that the mixing of the soil in the second step is carried out by means of heavy earthmoving technology, in particular an excavator, a loader, a blade tractor or a bulldozer.