CZ2011722A3 - Metoda pro stanovení koncentrace uromodulinu v séru a jeho pouzití jako sérového markeru pro diagnózu nefropatie - Google Patents

Abstract

Stanovení koncentrace lidského uromodulinu, jako indikátoru nefropatie v séru, a pouzití uromodulinu jako sérového markeru pro diagnózu nefropatie.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu stanovení koncentrace uromodulinu v séru a jeho použití jako sérového markéru pro diagnózu nefropatie. Dále se vynález týká systému pro imunologické testy pro stanovení této koncentrace.

Oblast použití se týká medicíny, zejména lékařské diagnostiky. Přesněji vynález spadá do oblasti diagnostiky nefropatie a stanovení příslušného markéru.

Dosavadní stav techniky

Diagnostika i diferenciální diagnostika nefropatie je v současné době založena především na laboratorním vyšetření kombinace řady parametrů (tzv. multiplex analýzy) a zobrazovacích technikách (scintigrafie, sonografie, CT, NMR). Méně často, i když ne zcela ojediněle, jsou využívány invazivní metody k odhadu poruchy renální morfologie i funkcí (biopsie ledvin, invazivní metody k odhadu glomerulární filtrace) i k sestavení finální diagnózy.

Optimální neinvazivní screeningový ukazatel pro hodnocení renálních funkcí však chybí. Pro odhad významnějších z postižení se využívá stanovení cystatinu C či kreatininu v různých matematických modelech, nicméně i jejich kombinace umožní odhad až významnějších forem nefropatie. Pro odhad incipietních postižení renálních funkcí či morfologie jsou často využívány kombinace stanovení různých proteinů v moči. Diferenciální diagnostika typu proteinurie je jednou z nedílných součástí diagnostiky onemocnění ledvin. Příčinou proteinurie bývá buď zvýšená kapilární permeabilita pro proteiny s překročením kapacity tubulů pro jejich zpětnou resorpci (tzv. glomerulární proteinurie), porucha zpětné resorpce filtrovaných bílkovin (tzv. tubulární proteinurie), extrémní zvýšení některého proteinu v krvi (tzv. prerenální proteinurie) či zánětlivé a cytolytické procesy v urotraktu (tzv. postrenální proteinurie). Diagnosticky se k vyšetření proteinurie a jejího typu obvykle využívá stanovení indexu bílkovina/kreatinin v moči, elektroforetické vyšetření moči, vyšetření albuminu a jeho poměru ke kreatininu v moči, výpočet indexu selektivity proteinurie, stanovení α-1-mikroglobulinu, lehkých řetězců imunoglobulinů, ev. paraproteinu v moči.

« « · · · t • ···»·· ··· y· ··· ··« ··· ···

Nevýhodu těchto analýz je, že jejich diagnostická efektivita nebývá dostatečná a výsledky jsou často zavádějící.

V současné nefrologii tak chybí diagnostický parametr, který by splňoval úlohu screeningového ukazatele (robustnost, dostatečná diagnostická efektivita). Nejen proto je intenzivně hledán parametr, který by umožnil jednoduchým stanovením odhad přítomnosti, ev. etiologie nefropatie již v časném stadiu.

Tamm Horsfallův protein (inhibitor hemaglutinace, THF) byl před 50 lety izolován v moči u lidí.

Sikri et al. (1981) lokalizovali THP v epiteliálních buňkách v tlustých vzestupných raméncích Henleyovy kličky a svinutých distálních tubulech ledvin.

Muchmore and Decker (1985) izolovali z moči těhotných žen glykoprotein 85kDa známý jako Tamm Horsfallův urinární glykoprotein, pro nějž navrhli jméno uromodulin (dále také jen UMD), a to především díky své schopnosti inhibovat antigenem indukovanou proliferaci T buněk a monocytární cytotoxitu. Ukázali, že uromodulin (UMD) potlačuje antigen-specifickou proliferaci in-vitro. Uromodulin (UMD) je nejhojnější protein v normální lidské moči. O pár let později bylo sekvenací zjištěno (Pennica et al), že UMD je totožný sTHF. THF se skládá z 616 AMK, obsahuje 48 cysteinových residuí a 24 disulfidových můstků (86-90 kDa).

Lidský urinární glykoprotein (HGP92) odštěpený z Tamm Horsfallova proteinu (THP) byl purifikován Fontánem et al. (1995), kteří navrhli, že imunostimulační vlastnosti Tamm Horsfallova proteinu byly důsledkem jeho kontaminace proteinem HGP92.

Santambrogio et al. (2008) popsali C-terminální štěpení vylučované formy zralého proteinu ledvin.

Jovine et al. (2002) uvádí, že zóna pellucida (ZP), oblast, která se vyskytuje u mnoha eukaryotních extracelulárních proteinů a je přítomna v uromodulinu (UMD), umožňuje polymeraci proteinů do filamentů.

V posledních letech bylo zjištěno, že UMD je produkován vzestupným i sestupným raménkem i Henleyovou kličkou tubulů (u krys nalezen i v astrocytech) a vylučován do moče v koncentraci kolem 50 mg/l. Uromodulin inhibuje bakteriální kolonizaci močového traktu, tvorbu močových kamenů, váže a aktivuje leukocyty a hraje zřejmě roli také v nepropustnosti tlustého vzestupného raménka Henleovy kličky pro vodu. Ovlivňuje pravděpodobně adhezi patogenů (E.coli) v urotelu, má : *3 · : *: · : ·.

··· ··· ··· ··· ··· ··· signální účinky a interaguje s cytokiny. Současně se zdá, že inhibuje agregaci krystalů kalcium oxalátu v moči a ovlivňuje transport iontů (Na i Cl) v tubulech.

V rámci experimentálních modelů bylo zjištěno, že mutace genu pro UMD bývá spojena s výskytem familiární hypertrofické nefropatie (FJHN) či medullary kidney disease (MCFD2). Myši, u kterých byl gen pro UMD odstraněn byly predisponovány k infekci E.coli, což je považováno za důkaz, že UMD snižuje adhezi

E.coli na urotelu. Současně trpí často kalcium oxalátovou urolitiázou a nefrokalocinózou (UMD obsahuje vazebné domény pro Ca2+, které inhibují krystalizaci kalcium oxalátu); pokles UMD v moči vede tedy logicky až k nefrokalocinóze.

Podobné efekty UMD byly prokázány i v rámci humánních studií. Mutace UMD vedla u lidí k poklesu UMD v moči, vzniku kalcium oxalátové urolitiázy až k renálnímu selhání. Současně bylo zjištěno, že UMD funguje jako aktivátor granulocytů, které hrají roli v primární obraně proti infekci, a jeho nedostatek v moči vede k uroinfekci. Snížení UMD v moči vedlo i k tubulární atrofii a intersticiální infiltraci, kdy byla prokázána existence souvislosti mezi nízkým UMD a chronickou renální insuficiencí, údaje se však ve studiích lišily a nebyly konsistentní.

V nedávné době však bylo prokázáno, že zvýšené močové koncentrace uromodulinu jsou také spojeny s jedním z polymorfismů genu UMD a zvyšují významně riziko vývoje chronické renální insuficience (Kóttgen A, Hwang S-J, Larson MG, et al. Uromodulin levels associate with a common UMD variant and risk for incident CKD. J Am Soc Nephrol 2010;21:337-344).

Vdokumentu US 2011091915 je popsán způsob testování onemocnění ledvin na základě stanovení lidského uromodulinu a imunoglobulinu A ve vzorku moči. Dále je zde popsána testovací souprava zahrnující protilátky proti lidskému uromodulinu a imunoglobulinu A. Bylo ukázáno, že pacienti s onemocněním ledvin měli v moči vyšší koncentraci uromodulinu.

Cílem vynálezu je včasné rozpoznání nebo sledování poruchy ledvin nefropatie. Úkolem vynálezu tedy je poskytnout způsob pro včasné rozpoznání nebo sledování nefropatie, sérový markér pro tuto diagnostiku a systém pro imunologické testy, kterým je možné stanovit vhodný parametr, který by splňoval úlohu screeningového ukazatele pro posuzování rizik a sledování průběhu v diagnostice a léčbě poruchy ledvin (nefropatie) podobně, jako tomu bylo u způsobu a systému pro rozpoznání metabolického syndromu popsaném v EP1904082.

: *4 · : : · : :

··· ··· ··· ··· ··· · · ·

Podstata vynálezu

Na základě rozsáhlého výzkumu a testování bylo zjištěno, že v séru zdravých jedinců je UMD přítomno a navíc hodnoty UMD v séru jsou u zdravých jedinců vyšší než u osob s nefropatií. Vynález je tedy založen na této překvapivé skutečnosti, která je v naprostém nesouladu s dosud nabytými znalostmi a literárními údaji.

Tudíž vynález se týká způsobu diagnózy nefropatie spočívající v tom, že je stanovena koncentrace lidského uromodulinu v séru, která je následně využita jako indikátor nefropatie.

Původním předpokladem bylo nalézt sérový markér poškození ledviny, který se nevyskytuje v séru za normálních podmínek u zdravých jedinců a je striktně ledvinového původu. Jeho výskyt v séru by poukazoval na poškození ledviny a jeho únik do cirkulace krve. Překvapivě se ukázalo, že uromodulin, který je klasickým močovým proteinem a v séru nebyl očekáván a tudíž dosud ani měřen, se nejen v séru zdravých jedinců vyskytuje, ale že je jeho hladina statisticky velmi významně snížena, oproti předpokládanému zvýšení, u pacientů trpících nefropatiemi ve srovnání se zdravými jedinci.

S výhodou jsou při provádění způsobu pro diagnózu nefropatie pro stanovení koncentrace lidského uromodulinu v séru použity systémy pro imunologické testy, zejména v kombinaci s optickým nebo biosenzorickým vyhodnocením, které umožňují jednoduché a rychlé stanovení koncentrace UMD v séru. K tomuto účelu lze přitom použít nejrůznější systémy, s jejichž pomocí se dá koncentrace UMD stanovit, např. paralelní nebo po sobě jdoucí měření koncentrací, jestliže se provede kalibrace stanovenými, popř. známými koncentracemi UMD, titrací nebo použitím různých stanovených koncentrací u vychytávacích molekul, které se vážou na pevnou fázi/materiál nosiče a mají afinitu k UMD nebo z něho odvozeným strukturám.

Vhodné jsou přitom takové metody, které zahrnují materiály nosiče, na jejichž povrchu se imobilizují substance, které jsou vhodné ke stanovení UMD v séru. Jako materiál nosičů jsou vhodné jakékoli materiály, na jejichž povrchu se dají imobilizovat molekuly nebo materiály pro biofyzikální imobilizaci. Pro aplikaci způsobu podle tohoto vynálezu jsou vhodné zejména materiály nosičů s alespoň částečně planárně vytvořenými povrchy, např. skleněné nebo umělohmotné čipy nebo destičky pro metodu ELISA, protože umožňují zvláště jednoduchou aplikaci způsobu podle tohoto : *5 · · : · : :

•·· ··· ··· ··· ··· ··· vynálezu, např. pomocí skenerů nebo ELISA readerů. Vedle planárních povrchů jsou pro stanovení koncentrace UMD zvláště vhodné i plochy dna jamek destiček pro metodu ELISA.

Jako systém pro imunologické testy se tedy nabízí zejména Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA) nebo obdobné systémy, které používají barvivém značené molekuly, čímž je umožněna zvláště vysoká senzitivita systému ke stanovení koncentrace UMD. Materiál nosiče, na kterém je imobilizována jedna nebo více substancí, např. protilátky s afinitou k UMD nebo odvozeným molekulám, se přitom uvede do kontaktu se sérem (případně jinou tělní tekutinou), nebo s roztoky, které sérum obsahují, takže UMD, resp. odvozená forma/sekvence, který se v roztoku se sérem případně nalézá, se může se substancemi v blízkosti povrchu materiálu nosiče asociovat. K tomu může být sérum rozpuštěno v inkubačním roztoku, např. blokačním pufru, který například zmenšením nespecifických interakcí vede ke zlepšení poměru signál-šum. K prokázání asociovaného UMD nebo odvozených molekul na povrchu se na materiál nosiče nanese, většinou po nějakém mycím kroku, rozpuštěná substance, zejména anti-UMD protilátka, přičemž rozpuštěná substance použitá k prokázání UMD má rovněž afinitu k UMD a váže se na UMD asociovaný v blízkosti materiálu nosiče.

Detekce průkazní substance/protilátky navázané na UMD, popř. na z něho odvozené molekuly, může proběhnout nejrůznějším způsobem.

Průkazní substance, popř. anti-UMD protilátka již může být opatřena nějakým značením, např. barvivém, zejména fluorescenčním barvivém, nebo nějakým enzymem, který může opticky přeměnit substrát. Průkazní substance, zejména protilátka, může být ovšem rovněž opatřena nějakou molekulou, např. biotinem, která má zase afinitu k jiné značené látce.

Není-li průkazní substance/anti-UMD protilátka sama značena, jsou vhodné zejména značené sekundární protilátky, které se přidají většinou po nějakém mycím kroku a které průkazní substanci/anti-UMD protilátku na povrchu materiálu nosiče zviditelní, případně umožní následné optické vyhodnocení.

Podstatou vynálezu je tedy také použití uromodulinu jako sérového markéru pro diagnózu nefropatie.

Byl vyvinut ELISA test určený k stanovení uromodulinu v séru i moči. Stanovení uromodulinu v séru (UMD-S) má vynikající efektivitu pro odhad nefropatie (lepší než ostatní běžně užívané parametry). Další nezanedbatelnou výhodou je to, : *6 · : : · : :

··· ··· ··· ··· ··· ··· že test nefropatie je možné provádět kdykoli a získat tak bezprostřední výsledky, neboť krev (sérum) je možné kdykoli a snadno vyšetřovaným osobám odebrat.

Přehled obrázků

Vynález bude osvětlen pomocí obrázků, kde obr. 1 znázorňuje hodnoty koncentrace UMD v séru u zdravých jedinců a u pacientů trpících nefropatií u první provedené studie, obr. 2 znázorňuje hodnoty koncentrace UMD v moči u zdravých jedinců a u pacientů trpících neuropatií u první provedené studie, obr. 3 znázorňuje jednotlivé naměřené hodnoty koncentrace UMD v séru u zdravých jedinců a u pacientů trpících neuropatií s vyznačením hodnoty 125,4 ug/l získané při ROC analýze, obr. 4 znázorňuje příslušnou ROC křivku, obr. 5 znázorňuje hodnoty koncentrace UMD v séru u zdravých jedinců a u pacientů trpících nefropatií u druhé provedené studie, obr. 6 znázorňuje uromodulin RD172163100 na 12% SDS-PAGE, obr. 7 znázorňuje 12% SDS-PAGE separaci anti-lidských uromodulinových protilátek, obr. 8 znázorňuje příslušné purifikační chromatogramy, obr. 9 znázorňuje distribuci koncentrací uromodulinu v závislosti na věku a pohlaví u zdravých dospělých osob.

Příklady provedení vynálezu

Jako reprezentativní nelimitující ilustrace vynálezu se uvádějí následující příklady.

Příklad 1:

Použití ELISA testu pro stanovení uromodulinu (UMD) v tělních tekutinách jako markéru nefropatie.

Bylo vyšetřeno 127 osob, 66 mužů, 61 žen. Z toho 15 zdravých kontrol, 112 pacientů nefrologické ambulance nemocnice Prostějov (DM nefropatie, pyelonefritida, CRI NS, intersticiální nefropatie), kteří se nelišili skladbou pohlaví ani věkovou strukturou.

U všech byl vyšetřen UMD v séru i moči, ApoH v moči, osteopontin v moči, TFF1-3 v séru a moči, urea, kreatinin, ionty, bílkovina a albumin v moči, A1 MG v moči, cystatin C v séru.

: ’7 · · : · : · • ·· ··· ·· · ··· · · · · · ·

Nefropatie byla identifikována nefrologem a definována jako přítomnost minimálně tří znaků z: zvýšený kreatinin v séru, GF dle MDRD nebo cystatinu C < 1 ml/s, zvýšený cystatin v séru, zvýšený index albumin/kreatinin v moči, zvýšený alfa-1 mikroglobulin v moči.

Poté byly porovnány koncentrace UMD v séru a moči u zdravých jedinců a pacientů trpících neuropatií. Výsledky porovnání byly následující:

UMD v séru - vyšetření ukázalo, že zdraví jedinci měli hodnoty koncentrace UMD v séru významně vyšší než pacienti trpící nefropatií (241 vs. 70,6 ug/l, při p<0.01). Na obr. 1 jsou znázorněna nalezená rozmezí hodnot koncentrace UMD v séru.

UMD v moči - vyšetření ukázalo, že zdraví jedinci měli hodnoty koncentrace UMD v moči zpravidla významně vyšší než pacienti trpící nefropatií (11165 vs. 4860 ug/l, p<0.01). Na obr. 1 jsou znázorněna nalezená rozmezí hodnot koncentrace UMD v moči. Ovšem vzhledem k nezanedbatelnému přesahu hodnot naměřených u zdravých jedinců a pacientů trpících nefropatií má stanovení koncentrace UMD v moči nižší vypovídací schopnost.

Další popis se tedy týká pouze měření a vyhodnocování koncentrace UMD v séru.

Pro statistické vyhodnocení měření UMD v séru byla použita ROC analýza se stanovením sensitivity a specifičnosti, kdy bylo zjištěno následující: sensitivita 92%, specifičnost 100%, AUC 99% pro UMD-S pro postižení ledvin při hodnotě nad 125,4 ug/l. Uvedené hodnoty jsou znázorněny na obr. 3 a na obr. 4 je pak znázorněna příslušná ROC křivka.

Dále byla provedena analýza pomocí logistické postupné (stepwise) regrese (dg ano/ne, měřené ukazatele)

Vybrán pouze UMD-S (p<0.01), Ods 0,95 Korektně zařazeno 96,1 % pacientů.

AUC ROC 0,98 (0,965-0,99) *8 ·

Skutečnost Predikce Procento korektně zařazených

1

Y = 0 12 3 80,00%

Y = 1 2 110 98,21%

Procento korektně zařazených případů 96,06%

Spolehlivě se tedy ukázalo, že hodnoty UMD v séru jsou u zdravých jedinců vyšší než u osob s nefropatií.

Stanovení uromodulinu v séru má tedy vynikající efektivitu pro odhad nefropatie (lepší než výše uvedené parametry) a zařazuje ve čtyřpolní tabulce korektně více než 96 % vyšetřovaných.

Příklad 2:

Obdobná studie, i když menšího rozsahu, byla provedena také na První lékařské fakultě v Praze. Bylo vyšetřeno 7 osob postižených nefropatií a stejné množství zdravých jedinců. I přes relativně malý počet zúčastněných osob dává studie zajímavé výsledky, které odpovídají nálezu v příkladu 1.

Poté byly porovnány koncentrace UMD v séru u zdravých jedinců a pacientů trpících neuropatií. I toto vyšetření ukázalo, že zdraví jedinci měli hodnoty koncentrace UMD v séru významně vyšší než pacienti trpící neuropatií a žádný zdravý jedinec neměl koncentraci uromodulinu v séru nižší než kterýkoli nemocný, viz obr. 5.

Popis proteinu použitého ke zvýšení protilátek

U výše uvedených studií byl použit přírodní protein izolovaný z lidské moči, obsažený v ELISA testu RD172163100 od BioVendor.

: *9 · : : · : :

··· ··· ··· ··· ··· ···

Na obr. 6 je znázorněn uromodulin RD172163100 na 12% SDS-PAGE, přičemž první sloupec představuje M.W. markér- 14, 21, 31, 45, 66, 97 kDa2, druhý sloupec pak redukovaný a zahřátý vzorek (5pg / pruh3) a třetí sloupec neredukovaný a nezahřátý vzorek (5pg / pruh).

Výrobní postup

Protein byl purifikován z lidské moči, jak drive popsal Santambrogio et al. (2008). V krátkosti, 400 ml moči odebrané od několika mužů bylo smícháno s ekvivalentním objemem 1,6M NaCI a mícháno 16 hodin pri 3 - 9 °C. Poté byla suspenze odstředěna, oddělen supernatant, a sraženina byla rozpuštěna v 100 ml 0,58M NaCI a míchána po dobu 5 hodin při 3-9 °C. Načež byla suspenze odstředěna, supernatant oddělen, pevná složka resuspendována v 100 ml 0,58M NaCI a ihned znovu odstředěna. Výsledná pevná složka byla rozpuštěna v deinozované vodě a několikrát dialyzována proti deionizované vodě. Protein byl vysušen mrazením z deionizované vody, 0,3 ml per vial, při počáteční koncentraci 0,3 mg/ml.

Získání protilátek a zpracování

Polyklonální anti-uromodulinové protilátky byly vyrobeny a podrobeny afinitní purifikaci při imunizaci ovcí. Dvě ovce byly imunizovány podle následujícího schématu:

1. den	1x podkožně	300 pg antigenu + CFA, 1:1
14. den	1x podkožně	300 pg antigenu + ICFA, 1:1
28. den	1x podkožně	300 pg antigenu + ICFA, 1:1
56. den	1x podkožně	300 pg antigen u+ ICFA, 1:1
66. den	odběr krve	500 ml krve
67. -127.	den	přestávka
128. den	1x podkožně	300 pg antigenu + ICFA, 1:1
138. den	odběr krve	500 ml krve

CFA - complete Freund adjuvant, kompletní Freundův adjuvant (Sigma) IFCA - incomplete Freund adjuvant, nekompletní Freundův adjuvant (Sigma) *10· • ·

Získání séra

Krev ovcí byla odstřeďována 20 minut při 4°C a 2 400 G, získané sérum bylo uskladněno při -20 °C.

Afinitní purifikace

Vytvoření afinitní kolony - Poros AL (Applied Biosystems), 0.5 g, byla naplněna 1 mg uromodulinu (Biovendor) podle pokynů výrobce.

Purifikace protilátky byla provedena ve dvou krocích:

1- afinitní purifikace - protilátky byly navázány na afinitní kolonu v 0,1 M PBS, pH 7,4 a eluovány 0,1 PBS, 13mM HCI, 0,15 mM NaCI.

- finální čištění bylo provedeno na koloně s imobilizovaným proteinem G (Applied Biosystems). Afinitně purifikované protilátky byly navázány na kolonu s proteinem G v 0,1M PBS, pH 7,4, a eluovány 0,1 PBS, 13mM HCI, 0,15 mM NaCI.

Testování protilátek - Purifikované protilátky byly odděleny ve 12% SDS-PAGE a obarveny Coomassie modří.

Titrační stanovení nepřímou ELISA - Mikrotitrační destička (Nunc) byla naplněna uromodulinem 25 mg/jamku. Purifikované protilátky byly pipetovány v počáteční koncentraci 1 mg/ml a naředěny 1:3 v sadách. Titr byl definován jako roztok protilátky, který měl absorbanci menší než 1,5.

Ovce - titr: 30 000

Na obr. 7 je pak zobrazena 12% SDS-PAGE separace anti-lidských uromodulinových protilátek, kde představují pruh 1: MWstd.: 97, 66, 45, 31,21, 14 kDa pruh 2: Anti-lidské uromodulinové protilátky 2,5 pg/pruh, redukující

Na obr. 8 jsou znázorněny purifikační chromatogramy, kde představují

A- chromatogram afinitní purifikace

B- chromatogram purifikace proteinu G • li· : : * : :

··· ··· · · 4 44« 9 9 9 9 9 9

Vývoj ELISY

Naplnění mikrotitrační destičky:

Mikrotitrační destička byla naplněna afinitně purifikovanou ovčí protilátkou (BioVendor, 2 pg/ml v uhlovodíkovém pufru 0,1M) a uskladněna přes noc při 4°C. Po 16 až 20 hodinách plnění přes noc při 4 °C byly destičky omyty TBS-Tween. Neobsazená místa na mikrotitračních destičkách byla zablokována blokačním pufrem (TBS - 0,5 % BSA - 4 % sacharózy) a inkubována při laboratorní teplotě po dobu 1 hodiny.

Konjugát:

Afinitně purifikovaná ovčí protilátka (BioVendor) byla konjugována s Biotin-LCLC-NHS-sulfo, kat. č. 21338 podle pokynů výrobce a použita v konečné koncentraci 0,25 pg/ml.

Byl použit streptavidin-HRP konjugát od Roche comp. (kat. č. 11089153).

Kalibrátor:

Přírodní lidský uromodulin byl lyofilizován a použit jako hlavní standard v počáteční koncentraci 320 ng/ml.

Nakonec byly sestaveny následující charakteristiky testů:

a) Typická standardní křivka pro lidský uromodulin: v rámci ELISA vykazoval dolní limit detekce menší než 0,12 ng/ml uromodulinu

b) Linearita (tabulka 1)

Vzorek	Ředění	Naměřeno (ng/ml)	Očekáváno (ng/ml)	Výtěžnost N/O (%)
1	-	437.55	-	-
	1:2	215.25	218.78	98.4
	1:4	110.70	109.39	101.2
	1:8	54.60	54.69	99.8
2	-	423.00	-	-
	1:2	212.05	211.50	100.3
	1:4	108.10	105.75	102.2
	1:8	51.65	52.88	97.7

Tabulka 1 : 12* • · · · · ·

c) Výtěžnost přídavku (tabulka 2)

Vzorek	Naměřeno (ng/ml)	Očekáváno (ng/ml)	Výtěžnost N/O (%)
1	94.45	-	-
	480.60	494.45	97.2
	282.95	294.45	96.1
	187.90	194.45	96.6
2	104.35	-	-
	506.40	504.35	100.4
	281.20	304.35	92.4
	186.55	204.35	91.3

Tabulka 2

d) Vnitrolaboratorní preciznost (Tabulka 3)

Vzorek	Průměr (ng/ml)	SD (ng/ml)	CV (%)
1	314.98	8.93	2.8
2	136.08	1.68	1.2

Tabulka 3

e) Mezilehlá přesnost (Tabulka 4)

Vzorek	Průměr (ng/ml)	SD (ng/ml)	CV (%)
1	166.07	8.59	5.2
2	433.47	32.76	7.6

Tabulka 4

f) Vliv pohlaví na hladiny uromodulinu je uveden v tabulce 5

Pohlaví	Věk (roky)	n	Průmě r	SD	Min.	Max.
			Uromodulin(ng/ml)
Muži	23-29	10	233.29	76.82	80.95	330.50
	30-39	19	197.48	86.56	62.65	382.65
	40-49	22	203.56	79.20	37.30	393.85
	50-65	7	184.34	31.92	139.5 0	229.75
Ženy	22-29	9	215.11	77.84	123.0 0	406.70
	30-39	14	269.14	110.6 1	92.90	501.15
	40-49	17	220.60	56.53	107.7 0	312.05
	50-61	5	206.24	73.34	88.20	282.25

Tabulka 5

Distribuce koncentrací uromodulinu v závislosti na věku a pohlaví u zdravých dospělých osob jsou uvedeny na obrázku 9. Z obrázku je patrné, že koncentrace UMD je rovnoměrně rozdělena a na pohlaví nebo věku osoby nezávisí.

Průmyslová využitelnost

Vynález nalezne široké použití v medicíně, konkrétně lékařské diagnostice. Použití způsobu pro stanovení koncentrace uromodulinu v séru jako markéru nefropatie a systému pro imunologické testy pro stanovení této koncentrace umožní snadné a bezprostřední odhalení nefropatie u vyšetřovaného pacienta a tím dává možnost zavést v krátké době příslušná opatření.

*

Literatura

1. Sikri, K.L., Foster, C.L., MacHugh, N. & Marshall, R.D. Localization of TammHorsfall glycoprotein in the human kidney using immuno-fluorescence and immuno-electron microscopical techniques. J. Anat 132, 597-605 (1981).

2. Santambrogio, S. et al. Urinary uromodulin carries an intact ZP domain generated by a conserved C-terminal proteolytic cleavage. Biochem. Biophys. Res. Commt/n 370, 410-413 (2008).

3. Muchmore, A.V. & Decker, J.M. Uromodulin: a unique 85-kilodalton immunosuppressive glycoprotein isolated from urine of pregnant women. Science 229,479-481 (1985).

4. Jovine, L., Qi, H., Williams, Z., Litscher, E. & Wassarman, P.M. The ZP domain is a conserved module for polymerization of extracellular proteins. Nat Cell Biol 4, 457-461 (2002).

5. Fontán, E., Jusforgues-Saklani, H., Briend, E. & Fauve, R.M. Purification of a 92 kDa human immunostimulating glycoprotein obtained from the Tamm-Horsfall glycoprotein. J. Immunol. Methods 187, 81-84 (1995).

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob diagnózy nefropatie, vyznačující se tím, že je stanovena koncentrace lidského uromodulinu v séru, která je následně využita jako indikátor nefropatie.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že ke stanovení koncentrace lidského uromodulinu v séru je použitý systém pro imunologické testy.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se použije materiál nosiče, na kterém se imobilizují substance, které mají afinitu k UMD nebo jeho částem.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že imobilizované substance, které mají afinitu k UMD nebo jeho částem, se vytvoří jako protilátky.
5. 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že materiál nosiče přinejmenším zčásti tvoří planární povrch.
6. 6. Způsob podle nároků 3 až 4, vyznačující se tím, že materiál nosiče je obsažen v destičce pro metodu ELISA.
7. 7. Způsob podle nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že systémem pro imunologické testy je metoda ELISA.
8. 8. Způsob podle nároků 7, vyznačující se tím, že ELISA obsahuje anti-UMD protilátku, sekundární detekční protilátky, materiály nosiče a mycí, inkubační a detekční roztoky.
9. 9. Způsob podle nároků 2 až 9, vyznačující se tím, že k vyhodnocení se použije skener nebo ELISA reader.
10. 10. Použití uromodulinu jako sérového markéru pro diagnózu nefropatie.