CZ2005428A3 - Prostredek pro stanovení chromozomální translokace t(1;29) ve spermiích býku - Google Patents

Abstract

Resení se týká prostredku pro stanovení chromozomální translokace t(1;29) ve spermiích býku, kdy jeho specifická smes fragmentu DNA detekuje ve spermiích úsek DNA specifický pro translokaci. Prostredek umoznuje presné, jednoduché a velmi rychlé stanovení kvality spermií, aby nedocházelo k prenosu nezádoucího genetického poskození na dalsí generaceskotu.

Description

Prostředek pro stanovení chromozomální translokace t(1;29) ve spermiích býků

Oblast techniky

Vynález se týká prostředku pro stanovení translokace t(1;29) v chromozomech pohlavních buněk býků za použití fluorescenční in šitu hybridizace (FISH), umožňující odhalení cytogenetického poškození skotu.

Dosavadní stav techniky

U hospodářských zvířat byla popsána řada typů strukturálních a numerických poruch chromozomů, u skotu jsou nejčastější spojení v centromerách (centrické fúze), tzv. robertsonovské translokace. Jak název naznačuje, vznikají centrické fúze spojením dvou konců chromozomů za vzniku jednoho chromozomu. Nedochází k podstatné ztrátě genetického materiálu, je však redukován celkový počet chromozomů. Byla popsána řada typů centrických fúzí (souhrně viz. Fries R, Popescu P (1999) Cytogenetics and physical chromosome maps. ln: Fries R, Ruvinsky A, eds. The Genetics of Cattle. CABI, Oxon, pp 257-261). Z hlediska kontroly dědičnosti zdraví (KDZ) u skotu má význam zejména translokace t(1;29), ostatní translokace se vyskytují vzácně.

Robertsonovská translokace t(1;29) je dědičná chromozomální anomálie, vzniklá fúzí chromozomů 1 a 29. Heterozygotní zvířata přenášejí translokaci na 50 % svých potomků, a proto se může nežádoucně velmi rychle rozšířit v populaci. Tato translokace byla • · · · · · • · • 9 9 9 ·· 99·· • 9

9 9

9 99

9 9

9 9

9 9

9 9 99 popsána asi u 50 plemen skotu na celém světě. Četnost této odchylky se značně liší a je závislá na počtu vyšetřených zvířat v jednotlivých zemích. Pohybuje se nejčastěji od 0,1 do 20 %. Heterozygotní býci nositelé translokace t(1;29) jsou fenotypicky normální, sexuální chování není narušeno a jejich semeno nevykazuje kvalitativní ani kvantitativní změny. Schopnost oplození není ovlivněna. Hlavní problém vzniká u heterozygotních dcer býků - nositelů translokace. Ty produkují část nevyvážených pohlavních buněk (gamet), které dávají vznik embryím odumírajícím v počátečních stádiích vývoje, což způsobuje asi 5% redukci plodnosti (Dyrendahl, I. a Gustavsoon, I. Sexual functions, semen characteristics and fertility of bulíš carrying the 1/29 chromosome translocation. Hereditas 90: 281-289, 1979). Vzhledem k velkým ekonomickým ztrátám, které vznikají používáním býků s touto translokací v inseminaci, je v některých státech prováděna její eliminace (eradikace). V České republice jsou býčci, určeni pro plemenitbu, cytogeneticky vyšetřeni analýzou krve na základě vyhlášky č. 471/2000 Sb. O kontrole dědičnosti zdraví zvířat, kterou se provádějí některá ustanovení Zákona č. 154/2000 Sb., o šlechtění, plemenitbě a evidenci zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon).^ Problém je, že okolo 50 % inseminačních dávek, používaných v České republice, je importováno, takže krev k vyšetření není dostupná. Kvalita semene pro inseminaci se ovšem sleduje i/dalších státech, takže se vlastně jedná o naléhavý celospolečenský problém. Aby bylo nyní možno ověřit, zda semeno je od býka, který je nositelem uvedené translokace, bylo doposud nutné čekat až na jeho první potomky, kteří pak mohli být cytogeneticky vyšetřeni a teprve potom případně vyloučeni z další plemenitby. To samozřejmě je finančně velmi nákladné, zdlouhavé a komplikované.

·· ··· · • · • · · ·

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky zcela odstraňuje prostředek pro chromozomální stanovení translokace t(1;29) ve spermiích býků, podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že 100 μΙ vodného roztoku prostředku obsahuje 5 až 50 mM Tris-HCI a dále 10 až 40 ng/μΙ fragmentů DNA o velikosti 100 až 500 bp, které se skládají z neznačených nukleotidů dATP, dCTP, dGTP, dTTP a fluoresceinem značeným dUTP, přičemž frekvence vloženého fluorescenčního nukleotidu je 1 značený nukleotid na 12 až 20 neznačených nukleotidů.

Prostředek podle vynálezu je dále charakterizován tak, že 100 μΙ vodného roztoku prostředku obsahuje 10 mM Tris-HCI a 20 ng/μΙ fragmentů DNA o velikosti 200 až 250 bp, které se skládají z neznačených nukleotidů dATP, dCTP, dGTP, dTTP a fluoresceinem značeným dUTP, přičemž frekvence vloženého fluorescenčního nukleotidu je 1 značený nukleotid na 15 neznačených nukleotidů.

Prostředek podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že umožňuje přesnou detekci DNA specifickou pro chromozomální translokaci t(1 ;29), přičemž se specifická DNA nachází na translokovaném chromozomu v oblasti vymezené satelitní DNA IV a III.

Prostředek podle vynálezu umožňuje přesné a rychlé stanovení přítomnosti translokace t(1;29) vyšetřením spermií býků, přičemž vlastní provádění stanovení zahrnuje následující kroky: dekondenzaci chromatinu spermií pomocí DTT, FISH s detekční směsí a zjištění přítomnosti translokace (specifického signálu) pomocí fluorescenční mikroskopie. Prostředek podle vynálezu je založen na originálním

4444

4

4 4 4 •4 4444

4

4 4

4 4

4 4

4 4

4

4

4 4

444 zjištění původců vynálezu, že na translokovaném chromozomu t(1;29) se v oblasti ohraničené na jednom konci satelitní DNA IV a na opačném konci satelitní DNA III nachází sekvence DNA specifická pro translokaci t(1;29), která není fluorescenční in šitu hydridizací zjistitelná na normálních (netranslokovaných) chromozomech 1 a 29 ani na žádném z dalších normálních chromozomů.

Základním cílem předkládaného vynálezu bylo umožnit detekci translokace t(1;29) ve spermiích býků, protože dosavadní známé metody umožňovaly detekci této translokace pouze na chromozomech získaných kultivací z krve nebo tkání živých zvířat, což bylo zdlouhavé a často nemožné, protože býci nejsou k dispozici (např. jsou již odporaženi, chováni v zahraničí apod.). Prostředkem podle vynálezu, při kterém jsou vyšetřované spermie fixované na mikroskopickém skle a hybridizovány se specifickou fluorescenčně značenou DNA-sondou, se uvedeného cíle dosáhlo. V předkládaném vynálezu byla na translokovaném chromozomu t(1;29) původci vynálezu objevena specifická DNA charakteristická pro tuto translokaci. Ta byla využita pro konstrukci specifické DNA-sondy (činidla, detekční směsi) identifikující tuto translokaci metodou FISH. Prostředek podle vynálezu umožňuje rychlou detekci translokace t(1 ;29) v pohlavních buňkách, ale i v chromozomech a interfázních somatických buňkách skotu jakéhokoliv plemene bez ohledu na věk zvířete. FISH je hybridizace DNA buněk fixovaných na mikroskopickém podložním skle s fluorescenčně značenou komplementárním DNA (detekční směsí). Pokud se na DNA ve zkoumaném mikroskopickém preparátu nachází sekvence homologní detekční směsi DNA, je identifikována fluorescenčním signálem v místě hybridizace.

»· ···· • · • ··· • ·

Přípravu prostředku podle vynálezu lze rozdělit do několika kroků:

U savců se v krátkých nebarvitelných oblastech chromozomů (centromerách) nebo jejich blízkosti nachází tzv. satelitní DNA, která obsahuje tandemově uspořádaná opakování (repetice), ln šitu hybridizační studie u skotu prokázaly přítomnost různých satelitních DNA I až IV. Na chromozomu 1 je přítomna satelitní DNA I a III, není přítomna satelitní DNA IV. Na chromozomu 29 je přítomna satelitní DNA I a IV, není přítomna satelitní DNA III. Na translokovaném chromozomu t(1 ;29) satelitní DNA I chybí, jsou přítomny satelitní DNA III a IV. To dokumentuje skutečnost, že při vzniku translokace t(1;29) došlo k rozsáhlé chromozomální přestavbě v centromerických opakujících se (repetitivních) oblastech. Původci vynálezu bylo objeveno, že na translokovaném chromozomu t(1;29) se nachází specifická oblast, která není FISH detekovatelná na normálních chromozomech 1 ani 29, a umožňuje proto průkaz této translokace pomocí metody FISH.

Všechny molekulárně-genetické metody a operace genetické manipulace, pokud není dále původci uvedeno jinak, byly provedeny podle metody popsané v 1989 Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, E.F. a Maniatis, T., Cold Spring Haror Laboratory Press). Pokud byly použity komerční reagencie a soupravy, postupy byly provedeny podle přiložených instrukcí.

Kultivace chromozomů z krve a zpracování mikroskopických preparátů byly prováděny dle metod popsaných v Human

Chromosomes, manual of basic techniques (Ram S. Verma and Arvind

Babu, Pergamon Press, 1989).

Metody in šitu hybridizace, pokud není uvedeno jinak, byly provedeny původci podle metod popsaných v práci Trask B.J.: DNA sequence localization in metaphase and interphase celíš by fluorescence in šitu hybridization. Methods Cell Biol 35:3-35, 1991,

Prostředek podle vynálezu připravili jeho původci tak, že translokované chromozomy t(1;29) získali kultivací krve odebrané ze zvířete stranslokací t(1;29) pomocí standardní cytogenetické techniky. Jejich centomerické oblasti byly získány pomocí mikrodisekčního (mikropreparačního) zařízení (např. PALM® MicroLaser systém). Odebrané části chromozomu (20 kopií) byly centrifugací přeneseny do 20 pl 10 mM Tris-HCI, pH 8,8 a DNA byla pomnožena pomocí DOP PCR (polymerázová řetězová reakce s primery obsahujícími náhodně včleněné nukleotidy; primer je krátká sekvence DNA). Pět μΙ PCR produktu bylo analyzováno elektroforézou na 1,5% agarozovém gelu. Zbývající PCR produkt byl přečištěn od zbytků primerů a nakloňován (včleněn) do plazmidu množícím se v buňkách laboratorního kmene bakterií Escherichia coli. Rekombinantní(s včleněnou DNA) klony byly identifikovány podle bílé barvy kolonií. Přítomnost nakloňované DNA byla v rekombinantních klonech ověřena pomocí PCR.

Pozitivní klony byly vyhledány metodou DOT BLOT (tečkovou) hybridizaci na nylonovém filtru. Poté byly testovány pomocí FISH tak, že amplifikační produkty byly naznačeny v sekundární PCR přidáním 0,2 μΙ 1 mM fluorescenčního nukleotidu (Spectrum Orange-dUTP,VYSIS) do reakční směsi. Z jednotlivých naznačených amplifikačních produktů byl odebrán 1 μΙ a použit do FISH na chromozomech získaných z krve zvířete stranslokací t(1;29). Z rekombinantních plazmidů vykazujících «« · ·· ···· ·· ···· · ··· · · · · · · • · · · · · · ♦ ···

Ί ·······♦·· J *·.* ·!· *··* ί ·· ··· pozitivní FISH signál byla vyizolována DNA a byla zjištěna její sekvence. Na základě zjištěných sekvencí byly vybrány vhodné primery pro PCR. Tato dvojice primerů s označením t(1;29)S a t(1;29)A je uložena ve Sbírce patogenních mikroorganizmů, která je vedena ve Výzkumném ústavu veterinárního lékařství, ul. Hudcova 70, 612 32 Brno, Česká republika.

Prostředek podle vynálezu vykazoval specifický hybridizační signál pod centromerou t(1;29), který nebyl detekovatelný na normálních chromozomech 1 a 29 ani na žádném jiném chromozomu. Tento specifický signál, který byl viditelný v buňkách, jednoznačně prokazuje přítomnost translokace t(1;29) ve vyšetřovaném genetickém materiálu skotu.

Satelitní DNA

Pro amplifikaci různých satelitních DNA skotu byly použity primery připravené na základě informací z genové banky a literatury. Z krve zvířete bez translokace byla vyizolována DNA. Tato DNA (50 ng) byla použita do 50 pl PCR s primery vybranými pro zvolenou satelitní DNA. Část amplifikačních produktů (5μΙ) byla ověřena na 2% agarozovém gelu a 2 μΙ PCR produktu byly značeny ve 20 μΙ sekundární PCR za přidání 0,2 μΙ 1 mM fluorescenčního nukleotidu (Spectrum OrangedUTP.VYSIS). Z jednotlivých naznačených amplifikačních produktů byl odebrán 1 μΙ a použit jako DNA sonda do FISH na chromozomech získaných z krve zvířete stranslokací t(1;29) a chromozomech zvířete bez translokace. Ke stanovení vzájemné polohy satelitních různých DNA a DNA specifické pro translokaci t(1;29) na tomto chromozomu bylo použito dvoubarevné FISH, přičemž satelitní DNA byly značeny červeně

a t(1;29) specifické činidlo zeleně. Z výsledků hybridizace vyplynulo, že na translokovaném chromozomu t(1;29) chybí signál pro satelitní DNA I a další DNA leží v pořadí p-satelitní DNA IV - t(1;29)specifická DNA satelitní DNA III - q.

Dekondezace spermií

Vzorky spermií býků byly 3x promyty stejným objemem PBS (fyziologický roztok pH 7,4) obsahujícím 6 mM EDTA (etylendiamintetraoctová kyselina), resuspendovány do PBS obsahujícím 5 mM DTT (dithiothreitol) a inkubovány 20 min při teplotě 18 až 23 °C. Dekondenzované spermie byly 2x promyty PBS a fixovány ve fixativu. Pět μΙ suspenze bylo nakapáno na mikroskopické sklo a necháno uschnout při teplotě 18 až 23 °C.

ln sítu hybridizace

Jeden μΙ fluorescenčně značené DNA sondy byl přidán do hybridizačního roztoku. Mikroskopické preparáty byly denaturovány v 70% formamidu, 2xSSC (pH 7,0) při 72 °C 10 min u spermií a 2 min u chromozomů. Hybridizační roztok byl denaturován po dobu 10 min při 72 °C a nanesen na preparát pod krycí sklo. Preparáty byly hybridizovány 20 hodin při 37 °C. Po hybridizaci byla skla 2x promyta 5 min při 42 °C. Skla byla podbarvena DAPI (diamino-phenylindole dihydrochloride)) v montovacím mediu.

Pro lepší objasnění vynálezu jsou na přiložených obrázcích 1 až 5 uvedeny fotografie, které byly pořízeny při mikroskopickém sledování ·· · »· »··· ·· ···« • « · · ·· · · » · ·«· ··· · « ··· chromozomů spermatu skotu po použití prostředku podle vynálezu, aby se doložil jeho účinek.

Na obr. 1 světle zelená skvrna jasně zobrazuje průkaz translokace t(1;29) po použití specifického činidla na chromozomech zvířete s translokaci t(1;29): výrazný hybridizační signál se vyskytuje pouze na translokovaném chromozomu t(1;29).

Na obr. 2 je zobrazena detekce translokace t(1;29) po použití specifického činidla na spermiích zvířete s translokaci, kde světle červený hybridizační signál se vyskytuje asi v polovině spermií, což odpovídá statistické pravděpodobnosti výskytu této translokace ve spermiích.

Na obr. 3 je zobrazena hybridizace t(1;29) po použití specifického činidla na spermiích zvířete bez translokace t(1;29), kde se nevyskytuje žádný hybridizační signál.

Na obr. 4 je zobrazena společná hybridizace t(1;29) specifického činidla (zelený signál) a satelitní DNA III (červený signál) na chromozomech zvířete s translokaci t(1;29). Protože se obě DNA na chromozomu v tomto případě nacházejí na stejném místě, výsledkem je žlutý hybridizační signál.

Na obr. 5 je zobrazena společná hybridizace t(1;29) specifického činidla (zelený signál) a satelitní DNA IV (červený signál) na chromozomech zvířete s translokaci t(1 ;29).

• to toto·· to to • toto* • to ···

Na základě výše uvedených skutečností jasně vyplývá, že prostředek podle vynálezu umožňuje rychlé, přesné a jednoduché sledování kvality býčího spermatu s ohledem na případné genetické poškození dalších generací skotu při jeho plemenitbě.

V následujících příkladech provedení je prostředek podle vynálezu pouze podrobně doložen, aniž by byl příklady provedení jakkoliv omezován.

Příklady provedení

Příklad 1

Z krve zvířete sjiž prokázanou translokací t(1;29) je vyizolována DNA za využití běžně dostupné soupravy (např. QIAamp DNA blood mini kit QIAGEN). Z 200 pl krve se získá 100 μΙ DNA. Koncentrace izolované DNA je stanovena spektrofotometrem. Z této DNA je za využití specifických primerů t(1;29)S a t(1;29)A uložených ve Sbírce patogenních mikroorganizmů, vedené ve Výzkumném ústavu veterinárního lékařství, ul. Hudcova 70, 612 32 Brno, Česká republika, syntetizován amplifikační produkt pomocí PCR.

Na přípravu 100 μΙ prostředku podle vynálezu je použito:

μΙ 10x PCR pufr (200 mM Tris-HCI, pH 8,4, 500 mM KCI) μΙ 50 mM MgCI₂ μΙ 10 mM dNTP μΙ primert(1;29)S μΙ primer t(1;29)A

100 ng DNA

U enzymu (LA polymerases mix TOP BIO), zbývající objem je doplněn vodou.

PCR probíhá za podmínek: počáteční denaturace 5 min při 95 °C, pak 30 cyklů: 1 min při 95 °C; 1 min při 56 °C; 2 min při 72 °C; závěrečné prodloužení 5 min při 72 °C.

Část připraveného amplifikačního produktu (5μΙ) je ověřena na 1% agarozovém gelu. Amplifikační produkt se přečistí pomocí soupravy (High PCR purification kit ROCHE) a spektrofotometricky je stanovena koncentrace DNA.

Značení detekčního prostředku podle vynálezu (hybridizační sondy):

500 ng přečištěné detekční směsi je denaturováno varem po dobu 5 minut s následným prudkým ochlazením na ledu po dobu 5 minut. Denaturovaná DNA v detekčním prostředku podle vynálezu je značena za použití dostupné soupravy (např. Prime-a-Gene Labeling System PROMEGA). Značící směs se připraví smícháním 500 ng denaturované DNA, 10 pl 5x značícího pufru, 2 μΙ BSA, 1,5 μΙ dATP, 1,5 μΙ dCTP, 1,5 μΙ dGTP, 0,15 μΙ dTTP, 0,4 μΙ Spectrum Green-dUTP nebo 0,4 μΙ Spectrum Red-dUTP, 2 μΙ enzymu a je doplněna vodou do objemu 50 μΙ. Značení probíhá při teplotě 26 °C po dobu 2 hodin. Značená detekční směs je přečištěna pomocí výše uvedené soupravy (např. Prime-a-Gene Labeling System PROMEGA), přičemž výsledný objem je asi 40 μΙ naznačeného detekčního prostředku podle vynálezu, které má na přiložených obrázcích 1, 4, 5 zelenou, na obr. 2 červenou barvu.

Dekondenzace spermií

Vzorek spermií (stačí 10 μΙ semene) je centrifugován 5 min. při 2000 rpm (otáčky/min). Odstředěný roztok je odstraněn a sediment 3x promyt stejným objemem PBS obsahujícím 6 mM EDTA. Odstředěný

·· • · • ·	• ·· •	• · • · • ·	• · · · « •	·» • · • ·	·**· •
					•
• ·	• ··	··	•	·♦	♦ ··

roztok se odstraní a sediment je rozpuštěn v 300 μΙ PBS obsahujícím 5 mM DTT a inkubován 20 min. při teplotě 18 až 23 °C. Po této dekondenzaci je vzorek zcentrifugován a sediment 2x promyt v 300 μΙ PBS a 2x ve fixačním roztoku (metanol : kyselina octová 3 : 1). Po posledním promytí je sediment rozpuštěn ve fixačním roztoku a fixovaná suspenze spermií je po 5 μΙ nakapána na mikroskopické sklo a nechána uschnout při teplotě 18 až 23 °C.

In šitu hybridizace

Jeden μΙ detekčního prostředku podle vynálezu se přidá do hybridizačního roztoku, 10 μΙ hybridizačního roztoku obsahuje 50% formamid, 2xSSC, 10% dextran sulphate a 1 μΙ vysycovací DNA (salmon sperm DNA,SIGMA). Nátěry spermií jsou denaturovány v 70% formamidu, 2xSSC (pH7,0) po dobu 10 min při 72 °C a dehydratovány ve vychlazené etanolové řadě po 2 min v 70%, 85% a 90% etanolu. Hybridizační roztok je denaturován 10 min při 72 °C a nanesen na vzorek pod krycí sklo 24x24 mm. Vzorky spermií jsou hybridizovány 20 hodin při 37 °C. Po hybridizaci se podložní skla s nátěry spermií 2x promyjí roztokem 2xSSC po dobu 5 min při 42 °C, 2x v 50% formamidu, 2xSSC 5 min při 42 °C a v2xSSC 5 min při 42 °C. Spermie jsou podbarveny pomocí flourescenčního barviva DAPI rozpuštěného v montovacím mediu (např. Vectechield, VECTOR LABORATORIES), 10 μΙ montovacího media s DAPI (0,05 pg/ml) je použito pod krycí sklo o velikosti 24x32 mm.

Vyšetření spermií

Podložní skla se spermiemi jsou vyšetřeny pomocí fluorescenčního mikroskopu s vhodnou sadou dvoupásmových fluorescenčních filtrů

DAPI/Texas Red nebo DAPI/FITC. Je detekován barevný signál ve spermiích, který se vyskytuje v přítomnosti translokace t(1;29). Protože většina pozitivních býků jsou heterozygotní nositelé, mají signál v přibližně 50-ti procentech spermií. Pro stanovení kvality spermatu stačí vyšetřit 20 až 30 spermií, neboť prostředek podle vynálezu poskytuje rychlé a přesné určení.

Průmyslová využitelnost

Prostředek podle vynálezu pro stanovení translokace t(1;29) ve spermiích býků umožňuje přesné, jednoduché a velmi rychlé sledování kvality hovězího spermatu, zamezující nežádoucí genetické poškození populace skotu v dalších generacích. Prostředek podle vynálezu je na bázi vodného roztoku Tris-HCI, fragmentů DNA o velikosti 100 až 500 bp obsahujících neznačené nukleotidy dATP, dCTP, dGTP, dTTP a fluoresceinem značený dUTP.

/fy x

	00	0··0	00	0000
• 0	• 0	0 0	0	0 0	0
0 0	0	0 0	0	0 0	000
					0
					0
00	0 00	00	0	00	000

Seznam zkratek

bp	páry bází (jednotka délky DNA)
dATP	deoxyadenozin-trifosfát
dCTP	deoxycytozin-trifosfát
dGTP	deoxyguanozin-trifosfát
DNA	kyselina deoxyribonukleová
EDTA	ethylenediaminetetraacetic acid
dTTP	deoxytymidin-trifosfát
dUTP	deoxuridin-trifosfát
KCI	chlorid draselný
MgCI2	chlorid hořečnatý
ng	nanogram
SSC	pufr obsahující citrát sodný a chlorid sodný
Tris-HCI	trishydroxymethylaminomethan

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   ·· • · • · • ·· • ·« • · • · ···· • • • · • * • · ···· ··· ·· • ·· ·· • ·· • ···

   1. Prostředek pro stanovení chromozomální translokace t(1;29) ve spermiích býků, vyznačující se tím, že 100 μΙ vodného roztoku prostředku obsahuje 5 až 50 mM Tris-HCI a dále 10 až 40 ng/μΙ fragmentů DNA o velikosti 100 až 500 bp, které se skládají z neznačených nukleotidů dATP, dCTP, dGTP, dTTP a fluoresceinem značeným dUTP, přičemž frekvence vloženého fluorescenčního nukleotidu je 1 značený nukleotid na 12 až 20 neznačených nukleotidů.
2. 2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že 100 μΙ vodného roztoku prostředku obsahuje 10 mM tris-HCI a 20 ng/μΙ fragmentů DNA o velikosti 200 až 250 bp, které se skládají z neznačených nukleotidů dATP, dCTP, dGTP, dTTP a fluoresceinem značeným dUTP, přičemž frekvence vloženého fluorescenčního nukleotidu je 1 značený nukleotid na 15 neznačených nukleotidů.
3. 3. Prostředek podle nároku 1 se vyznačuje tím , že přesně detekuje DNA specifickou pro chromozomální translokaci t(1;29), přičemž se specifická DNA nachází na translokovaném chromozomu v oblasti vymezené satelitní DNA IV a III.

   ·· 9 99 8889 88 9999
4. 8 9 99 8 9 8 9 8 9
5. 9 9 9 8 9 9 9 8 898

   99 999 99 9 99 888