CZ2004254A3

CZ2004254A3 - Enzymatické štěpení terc@butyltaxanových derivátů

Info

Publication number: CZ2004254A3
Application number: CZ2004254A
Authority: CZ
Inventors: Patelárameshán
Original assignee: Bristol@Myersásquibbácompany
Priority date: 2001-08-21
Filing date: 2002-08-21
Publication date: 2004-10-13
Also published as: WO2003016543A3; AU2002323346B2; JP2007503201A; HUP0500645A2; US7063977B2; US20030069415A1; PL374278A1; KR20040053114A; CN1545555A; WO2003016543A2; MXPA04001631A; HUP0500645A3; IL160061A0; EP1425407A4; EP1425407A2; CN1294274C; BR0211999A

Description

Tento vynález se týká enzymatického štěpení taxanových derivátů a dvou způsobů přípravy perorálně aktivních protinádorových sloučenin z těchto taxanových derivátů.

Tato patentová přihláška má právo přednosti z US předběžné patentové přihlášky č. 60/313 757 podané 21. srpna 2001.

Dosavadní stav techniky

Paklitaxel je přirozený produkt extrahovaný z kůry tichomořských tisů Taxus brevifolia a je aktivní složkou protinádorového prostředku TAX0L^R. Má znamenitou protinádorovou aktivitu při modelových pokusech na zvířatech in vitro a nedávné studie ukazují jeho jedinečný mechanismus působení, který zahrnuje abnormální polymerizaci tubulinu a přerušení mitózy. Používá se v klinice proti řadě lidských nádorů. Je důležitým protinádorovým prostředkem terapeuticky i komerčně. Pokračují četné klinické zkoušky pro rozšíření a zvýšení použitelnosti tohoto prostředku při léčení lidských proliferačních onemocnění. Výsledky klinických studií prostředku TAX0L^R popisuje řada autorů. Zcela nedávné kompilaci článků řady různých autorů se věnuje celé číslo Seminars on Oncology, 26 (1, Suppl. 2) 1999. Další příklady jsou v pracích autorů Rowinsky a kol., v ΤΑΧΟΙ/⁵·: A Novel Investigational Antimicrotubule Agent, J. Nati. Cancer Instl., 82, 1247-1259 (1990), Rowinsky a Donehower v The Clinícal Pharmacology and Use of Antimicrotubule Agents in Cancer Chemotherapeutics, Pharmac. Ther., 52, 35-84 (1991), Spencer • · • · a Faulds v Paclitaxel, A Review of its Pharmacodynamic and Pharmacokinetic Properties and Therapeutic Potential in the Treatment of Cancer, Drugs, 48, 794-847 (1994), K. C. Nicolaou a kol., v Chemistry and Biology of ΤΑΧΟΙΛ, Angew. Chem., Int. (angl. vyd.), 33, 15-44 (1994), F. A. Holmes, A. P. Kudelka, J. J. Kavanaugh, Μ. H. Huber, J. A. Ajani, V. Valero v knize Taxane Anticancer Agents Basic Science and Current Status, redakce I. Georg Gunda, Thomas T. Chen,

Iwao Ojima a Dolotrai M. Vyas, 1995, American Chemical Society, Washington, DC, 31-57, Susan G. Arbuck a Barbara Blaylock v knize ”TAXOL^R Science and Applications, redakce Mathew Suffness, 1995, CRC Press lne., Boča Raton, Florida, 379-416 a rovněž v literatuře, kterou tito autoři citují.

Polosyntetický analog paklitaxelu nazvaný docetaxel má rovněž dobrou protínádorovu účinnost a je účinnou složkou v komerčně dostupného protinádorového prostředku TAXOTERE^R. Viz práce Biological Active Taxol Analogues with Deleted A-Ring Side Chain Substituents and Variable C-2' Configurations, J. Med. Chem., 34, 1176-1184 (1991), Relationships between the Structure of Taxol Analogues and Their Antimitotic Activity, J. Med. Chem., 34. 992-998 (1991), které se zde zahrnují formou odkazu. Přehled klinického působení TAXOTERE¹¹ poskytuje Jorge E. Cortes a Richard Pazdur v Journal of Clinical Oncology, 13.(10) , 2643-2655 (1995) . Níže se znázorňují struktury paklitaxelu a docetaxelu spolu s konvenčním způsobem číslování pro molekuly, které patří do této skupiny a tento způsob číslování se rovněž používá v této přihlášce.

• · • · • *

paklitaxel (TAXOL^R): R = fenyl, R¹ = acetyl docetaxel (TAXOTERE^R) : R = terc-butoxy, R¹ = vodík

Četné důkazy o tom, že paklitaxel nemá žádnou perorální účinnost lze nalézt v následujícím tvrzení PCT patentové přihlášky WO 98/53811 původců Samuela Brodera, Kenneth L. Duchina a Sami Selima a v odkazech, které citují, kde se říká: Paklitaxel se velmi špatně absorbuje při perorálním podání (méně než 1 %), viz Eiseman a kol., Second NC1 Workshop on Taxol and Taxus (září 1992), Suffness a kol., v TAXOL Science and Applications (CRP Press 1995). Eisemann a kol. ukazují, že paklitaxel má při perorálním podání biologickou dostupnost 0 % a Suffness a kol. udávají, že perorální podávání paklitaxelu se nezdá být možné, neboť po perorálním podání až 160 mg/kg/d se neprokazuje žádná protinádorová aktivita. Navíc není žádný účinný způsob, který by umožnil efektivní podávání perorálního paklitaxelu (to jest způsob zvyšování biologické dostupnosti paklitaxelu při perorálním podání) nebo dalších perorálních taxanů nebo paklitaxelových analogů, jako je docetaxel, které vykazují protinádorovou účinnost. Z tohoto důvodu se paklitaxel dosud nepodává u lidí a určitě se nepodává v průběhu či při léčení paklitaxel-responsivních onemocnění, Jiná zpráva J. Terwog• · • · · · · · • · · · · · · · · · * • ·· · · ··· · · · · • · ····· ·· · · · · · · · ·· ········ ta a kol. z Lancet (25. července), 352, 285 (1998) rovněž poskytuje nízkou biologickou dostupnost pro dávky dosahující 160 mg/kg/inj v modelech myších tumorů (sc M109) bez známek jakékoliv účinnosti a tento autor dochází k závěru, podobně jako Suffness, že další zvyšování dávky by neposkytlo účinnost/ i když se nedosahuje toxických dávek. Dále snahy původců tohoto vynálezu prokázat aktivitu perorálně podaného paklitaxelu proti xenotransplantátům lidských tumorů implantovaných buď athymickým myším nebo athymickým krysám jsou dosud neúspěšné.

Tento vynález poskytuje enzymatické štěpení racemických směsí zvláště účinných C-4 taxanových analogů rozpustných ve vodě popisovaných v US patentové přihlášce č.

09/712 352, která se zde zahrnuje formou odkazu, které vykazují perorální aktivitu a jsou proto použitelné proti proliferačním onemocněním po perorálním podání. Níže se popisuje výchozí stav oboru ve vztahu k tomuto vynálezu.

V oboru se popisují určité taxanové deriváty s modifikacemi na C-4 hydroxylové skupině.

US patent č. 5 808 102 autorů Poss a kol. a patentová přihláška č. WO 94/14787 vydaná PCT obsahuje popisy analogů taxanu s modifikacemi v polohách C-4.

Gunda I. Georg a kol. popisují přípravu C-4 esterového analogu v Tetrahedron Letters, 35, 8931-8934 (1994) .

S. Chen a kol. popisují přípravu C-4 cyklopropylesterového analogu v Journal of Organic Chemistry, 59., 6156-6158 (1994) .

• · ·· · • ·· · · · · · · · · · • · ··· · · · · ♦ · · · ···· ·· · » · · · · · · • · · · ·· ·· ·· ·

US patent č. 5 840 929 Shu-Hui Chena pokrývajíc! C-4 methoxyetherové deriváty publikovaný 24. listopadu 1998.

Shu-Hui Chen. První příprava C-4 methyletherových analogů paklitaxelu a neočekávaná reaktivita 4-deacetyl-4-methyletherbaccatinu III. Tetrahedron Lett., 37. 3935-39388 (1996) .

Následující práce diskutuje řadu C-4 esterových nebo karbonátových analogů: Shu-Hui Chen, Jian-Meí Wei, Byron H. Long, Craig A. Fairchild, Joan Carboni, Steven W. Mamber, William C. Rose, Kathy Johnston, Anna M. Casazza a kol., Novel C-4 paclitaxel (Táxol) analogs: potent antitumor agents, Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 2741-2746 (1995).

Přípravu C-4 aziridinylkarbamátových analogů popisují Shu-Hui Chen, Craig Fairchild, Byron H. Long v práci Synthesis and Biological Evaluation of Novel C-4 Aziridine-Bearing Paclitaxel (Taxol) Analogs. J. Med. Chem., 3_8, 263-267 (1995) .

Následující práce popisují reakce či transformace popisované jako příprava C-4 analogů.

Nový způsob modifikace polohy C-4 10-deacetylbaccatinu III. Kouichi Uoto, Haruhiro Takenoshita, Takashi Ishiyama, Hirofum Terasawa, Tsunehiko Soga, Chem. Pharm. Bull., 45, 2093-2095 (1997).

Gamini Samaranayake, Kurt A. Neidigh, David G. I. Kiingston. Modified Taxols, 8. Deacylation and Reacylation of Baccatin III. J. Nat. Prod., 56, 884-898 (1993).

0

00 0 · 000 0 000 0 0 000 00 00 0 00 0 000 00 0 0000 00 0

00 00 00 00 0

Apurba Datta, Lalith R. Jayasinghe, Georg I. Gunda. 4-Deacetyltaxol and 10-Acetyl-4-deacetyltaxotere: Synthesis and Biological Evaluation. J. Med. Chem., 37, 4258-4260 (1994) .

Přes výše popsané příklady C-4 analogů nebo způsobů jejich přípravy není žádný důkaz ohledně perorálně aktivních C-4 analogů. Tento vynález poskytuje způsob štěpení racemických směsí C-4 analogů majících perorální účinnost.

Následující práce popisují způsoby nebo možnosti způsobů týkající se taxanů s perorální aktivitou.

Způsoby podávání taxanů za přítomností modulátorů se uvádějí pro zvýšení množství taxanů v krevní plazmě po perorálním podání: M. Meerum Terwogt Jetske, Jos H. Beijnen,

Ten Bokkel Huinink, W. Wim, Hilde Rosing, Jan Η. M. Schellens, Coadministration of cyclosporin enables oral therapy with paclitaxel. Lancet, 352 (9124), 285 (1998) .

Jetski M. Meerum Terwogt, Miřte M. Malingre, Jos H. Beijnen, Huining Wim W. ten Bokkel, Hilde Rosing, Franciska J. Koopman, Olaf Van Tellingen, Martha Swart, Jan Η. M. Schellens, Co-administration of oral cyclosporin A enables oral therapy with paclitaxel. Clin. Cancer Res., 5.,

3379-3384 (1990) .

Steven B. Hansel popisuje způsob přípravy taxanů, které jsou biologicky dostupné pří současném podávání cinchoninu. Mezinárodní přihláška PCT WO 97/27855 vydaná 7. srpna 1997.

Samuel Broder, Kenneth L. Duchin, Sami Selím. Způsob • · • · · · • ·· · • · · ♦ ··· • · · ·· · a kompozice pro perorálni podávání humánním pacientům s použitím cyklosporinu pro zvýšení biologické dostupnosti. PCT mezinárodní přihláška WO 98/53811 -vydaná 3. prosince 1998. Tyto zprávy neobsahují žádné údaje ohledně protinádorové účinnosti, avšak přítomnost taxanů v krevní plazmě se extrapoluje pro ukázání jejich možnosti protinádorového použití.

Uvádí se alespoň jedna zpráva o perorálni aktivitě prekurzorů na preklinických modelech na zvířatech. Paul M. Scola, John F. Kadow, Dolatrai M. Vyas. Příprava paklitaxelových prekurzorových derivátů. Evropská patentová přihláška EP 747385 vydaná 11. prosince 1996. Perorálni biologická dostupnost lékového prekurzorů s perorálni účinností se nepopisuje a nevyskytují se žádné další zprávy o těchto sloučeninách ve směru k humánnímu použití.

Zcela nedávno vyšel abstrakt v American Association of Caner Researchers, Philadelphia, 1999 popisující taxanový analog (IDN-5109) s perorálni aktivitou proti tumorům u myší. Odkaz na tento abstrakt je: G. Pratesi, D. Polizzi, M. Totoreto, A. Riva, E. Bombardelli, F. Zunino: IND5109 A New Taxane Active After Oral Administration. Proč. Am. Assoc. Cancer Res., 1999, 40, Abs. 1905, Instituto Nazionale Tumori, 20133 Milan a Indena SpA, 20139, Milan, Itálie. Struktura této sloučeniny je zcela odlišná od sloučenin popisovaných v tomto vynálezu. Na rozdíl od sloučenin, které patří do tohoto vynálezu, se IDN-1509 odvozuje od 14-betahydroxybaccatinu III a na hydroxylové skupině v poloze C-4 má acetát.

Pro úplnost se zahrnují dva odkazy na aktivitu této sloučeniny.

·· 99 9· ·· 9 • · 9 · · · · 9 · 9 · • 99 · 9 9 9 · 9 999

9 999 99 99 999 9 9999

9 9999 99 9

Μ. L. Nicoletti, C. Rossi, C. Monardo, S. Stura, P. Morazzoni, E. Bombardelli, G. Valoti, R. Giavazzi. Antitumor efficacy of the paclitaxel analogue, IDN5109, on human ovarian carcinoma xenografts with different sensitivity to the paclitaxel. Proč. Am. Assoc. Cancer Res., 1999, 40, Abs.

1910 [hodnocení + citace].

Donatella Polizzi, Graziella Pratesi, Monica Tortoreto, Rosanna Šupino, Antonella Riva, Ezio Bombardelli, Franco Zunino. A novel taxane with improved tolerability and therapeutic activity in a panel of human tumor xenografts. Cancer Res., 59, 1038-1040 (1999).

Paklitaxel je lék vysoce závislý na rozpisu podávání, který má tradičně výhodu při dlouhých dobách expozice tumoru. To se týká mechanismu působení paklitaxelu, jelikož taxany rozpoznávají pouze polymerizovaný stav tubulinu a váží se na tubulin v tomto stavu, který se vyskytuje pouze v průběhu krátkého času cyklu nádorových buněk. Současně používané intravenózní infuze (1 až 3 h) jsou nyní dobře přijatelné a účinné a poskytují možnost vyhnout se rutinnímu užívání protrahovaných (více než 24 h) nepřetržitých rozpisů. Avšak perorální taxan může poskytnout vyhovující a cenově efektivní způsob uskutečnění takové dlouhodobé expozice. Existuje nedávný důkaz klinické použitelnosti s použitím opakovaného podávání jednou týdně mírných (to jest jiných než maximálně tolerovaných) dávek TOXOLU^R a perorální taxan by byl pro takové protrahované způsoby podávání ideální. Další smysluplné klinické indikace pro použití taxanu (to jest revmatická arthritida, mnohočetná skleróza) by rovněž čerpaly prospěch z dostupnosti perorálního taxanu. Perorálně podávaný účinný taxan by nabízel jednak atraktivní alternativu parenterálního způsobu, který se nyní používá v klinice, a jednak poten- 9 ··· ciální terapeutickou výhodu vzhledem ke mnoha způsobům rozpisu podávání, které je dosud třeba zkoumat.

Proto zde existuje zřejmá potřeba získávání taxanů v čisté, vysoce rozlišené formě s dobrou perorální biologickou dostupností a dobrou perorální účinnosti srovnatelnou s vlastnostmi dosažitelnými při parenterálním podání paklitaxelu.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje ve své části účinné způsoby štěpení enantiomerních směsí, přednostně racemických směsí, sloučenin identifikovaných a zvláště použitelných jako meziprodukty při přípravě perorálně podávaných taxanů, jako je taxol, a tak poskytuje stereospecifický způsob přípravy těchto sloučenin. V dalším aspektu tohoto vynálezu se tyto oddělené enantiomery používají pro přípravu taxanů použitelných pro perorální podávání u teplokrevných živočichů včetně člověka.

Tento vynález zejména poskytuje způsob štěpení směsi obsahující enantiomery obecných vzorců la a lb, ve kterých

R¹ je v poloze cis vzhledem k terc-butylové skupině v obou vzorcích la a lb znázorněných níže.

C - N (la) ·« 9* • »9 9 • 9 9 9 • 9 999

9 9

99 *’

9 9

9 9 9 • 9 9 9

9 9

99 «9 9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9

db) nebo ve kterých

R¹ je v poloze trans vzhledem k terc-butylové skupině v obou vzorcích Ha a lib.

R.’ t-butyl \_z

(Ha)

ve kterých *0 • 0 * · • 0 0 0 « 0 000 ·

0 0

00 • 0 0· ·0 *

0 0 · 0 « 0 • 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9000

0 0 0 0 0 >

00 00 0

R¹ je -0-C(O)-alkylová skupina, -0-C(0)-arylová skupina nebo -0-C(0)-cykloalkylová skupina, zahrnující kroky (a) uvedení do styku této směsi s některou hydrolasou esteru karboxylové kyseliny nebo s mikroorganismem poskytujícím některou hydrolasu karboxylové kyseliny, kde tento enzym katalyzuje stereoselektivní hydrolýzu této směsi s poskytnutím směsi dvou sloučenin, ve kterých v jedné sloučenině R¹ je -0-C(0)-alkylová skupina, -0-C(0)-arylová skupina nebo -0-C(0)-cykloalkylová skupina a v druhé sloučenině R¹ je hydroxylová skupina a (b) oddělení jedné či obou těchto sloučenin.

Následuje podrobný popis vynálezu.

Způsoby provedení tohoto vynálezu se popisují níže.

Cis enantiomery

Následující pár cis enantiomerů lze rozdělit enzymatickými způsoby podle tohoto vynálezu.

(Ia) a

9 · ··· η 1 >t-butyl

C - N

(lb) to jest enantiomery obecných vzorců la a lb, ve kterých je R¹ v poloze cis vzhledem k terč-butylové skupině v obou případech la a lb.

Preferuje se štěpení směsi cis enantiomerů podle popisu výše způsoby podle tohoto vynálezu.

Enantiomery trans

Enzymatickými způsoby podle tohoto vynálezu lze rozdělit následující pár enantiomerů trans

_.^-butyl

C - N (Ha) a

R.

Λ ^t-butyl ,C - N

(lib) to jest enantiomery obecných vzorců Ha a lib, ve kterých R¹ je v poloze trans vzhledem k terc-butylové skupině v obou případech.

Preferované způsoby štěpení směsí enantiomerů

Směs obsahující smísené enantiomery sloučenin obecných vzorců Ia a lb nebo Ha a lib se přednostně štěpí stereoselektivní hydrolýzou za přítomnosti některé hydrolasy esteru karboxylové kyseliny, přednostně z některého mikroorganismu .

Takto připravené páry sloučenin jsou neenantiomerní a mohou se následně rozdělit s obdržením opticky aktivních, přednostně opticky čistých sloučenin. Preferuje se optická čistota vyšší než 99 %, zejména vyšší než 99,5 %.

Tento vynález též poskytuje sloučeninu směsi v podstatě prostou jiných isomerů, kterou lze připravit způsoby podle tohoto vynálezu.

Navíc se tento vynález týká způsobu přípravy vybraných taxanových sloučenin s použitím meziproduktů obdržených

Φφ φ · φ · • φ φ · φ φ Φ· φ φ φ · φ φ · · ♦Φ ·* výše popsanými způsoby.

Definice

Pojem stereoselektivní konverze, jak se zde používá, se týká preferenční reakce jednoho enantiomeru oproti druhému, to jest asymetrické, enantioselektivní reakce. Podobně pojem stereoselektivní hydrolýza se týká preferenční hydrolýzy jednoho enantiomeru vzhledem k druhému.

Pojem směs, jak se zde používá ve vztahu k enantiomerním sloučeninám, označuje směsi mající stejná (racemické sloučeniny) nebo nestejná množství enantiomerů.

Pojem štěpení, jak se zde používá, označuje částečné stejně tak jako preferované úplné štěpení.

Pojem neenantiomerní forma, jak se zde používá, označuje strukturu sloučeniny, původně jedné z enantiomerního páru, ve které je alespoň jedna skupina modifikovaná, takže tato sloučenina jíž není zrcadlovým obrazem druhé sloučeniny z původního enantiomerního páru.

Pojmy enzymatický proces nebo enzymatický způsob, jak se zde používají, označuj i. proces či způsob podle tohoto vynálezu používající enzym nebo mikroorganismus.

Pojmy alkylová skupina, alkan nebo alk, jak se zde používají, bud' samotné nebo jako části názvu jíně skupiny, přednostně označují uhlovodíky s přímým či rozvětveným řetězcem o 1 až 15 uhlících v normálním řetězci, které mohou být případně substituované, přednostně o 1 až 6 atomech uhlíku, jako je methylová skupina, ethylová skupina, propy- 15 ·· · · » · · « » · · ¹ lová skupina, isopropylová skupina, butylová skupina, terc-butylová skupina, pentylová skupina, hexylová skupina, isohexylová skupina, heptylová skupina, 4,4-dimethylpentylová skupina, oktylová skupina, 2,2,4-trimethylpentylová skupina, nonylová skupina, decylová skupina, undecylová skupina, dodecylová skupina, jejich různé isomery s rozvětveným řetězcem a podobně. Příklady substituentů mohou zahrnovat alespoň jednu skupinu zvolenou z následujících případů: atom halogenu (zejména chloru), trihalomethylová skupina, alkoxyskupina (například s vytvořením acetalu ze dvou alkoxyskupin), arylová skupina, jako je substituovaná arylová skupina, alkyl-arylová skupina nebo haloarylová skupina, cykloalkýlová skupina, jako je nesubstituované cykloalkylová skupina nebo alkyl-cykloalkylová skupina, hydroxylové skupina nebo chráněná hydroxylové skupina, karboxylové skupina, alkyloxykarbonylová skupina, alkylaminoskupina, alkylkarbonylaminoskupina, aminoskupina, arylkarbonylaminoskupina, nitroskupina, kyanoskupina, thioskupina nebo alkylthioskupina. Zvláště preferovanými substituenty alkylové skupiny jsou hydroxy1ové skupiny.

Pojem cykloalkylová skupina, jak se zde používá samotný nebo jako část názvu další skupiny, přednostně označuje případně substituované nasycené cyklické uhlovodíkové skupiny obsahující jeden až tři kruhy a 3 až 12 uhlíků kruhu, přednostně 3 až 8 uhlíků kruhu, které zahrnují cyklopropylovou skupinu, cyklobutylovou skupinu, cyklopentylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu, cykloheptylovou skupinu, cyklooktylovou skupinu, cyklodecylovou skupinu, cyklododecylovou skupinu a adamantylovou skupinu. Příklady substituentů zahrnují jednu či více alkylových skupin, jak se popisují výše nebo jednu či více skupin popisovaných výše jako substituenty alkylových skupin.

Pojem arylová skupina, jak se zde používá, přednostně označuje monocyklické či bicyklické substituované aromatické kruhy o 6 až 12 atomech uhlíku v kruhové části, jako je nesubstituovaná fenylová skupina, bifenylová skupina, naftylová skupina nebo tyto skupiny substituované substituenty, jako je alkylová skupina, haloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, atom halogenu, alkoxyskupina, haloalkoxyskupina, hydroxylové skupina, arylová skupina a podobně.

Pojem skupina chránící hydroxylovou skupinu, jak se zde používá, označuje skupinu schopnou ochrany volné hydroxylové skupiny, kterou lze po provedení reakce, v jejímž průběhu se používá, odstranit bez porušení zbytku molekuly. Různé skupiny chránící hydroxylovou skupinu a způsoby jejich obdržení lze nalézt například v Protective Groups in Organic Synthesis T. W. Greene, John Wiley and Sons, 1981 nebo Fišer & Fišer a tato publikace se zde zahrnuje formou odkazu. Příklady skupin chránících hydroxylovou skupinu jsou methoxymethylová skupina, 1-ethoxyethylová skupina, benzyloxymethylová skupina, {β-trimethylsilylethoxy)methylová skupina , tetrahydropyranylová skupina, 2,2,2-trichlorethoxykarbonylová skupina, terc-butyl(difenyl)silylová skupina, trialkylsilylová skupina, trichlormethoxykarbonylová skupina a 2,2,2 -trichlorethoxymethylová skupina.

Výchozí látky

Směs výchozích látek obsahujících sloučeniny obecných vzorců la a Ib lze obdržet způsoby známými tomu, kdo má zkušenost v oboru, jako jsou způsoby popsané v evropské patentové přihlášce č. 400 971, která se zde zahrnuje formou od• · kazu. Například racemickou směs cis-S-laktamových sloučenin obecných vzorců la a lb lze připravit tvorbou iminu vzorce terč-butyl-CH=Nreakcí aldehydu vzorce terč-butyl-CHO.

Takto připravený imin se poté může podrobit reakci s některým acylchloridem obecného vzorce

O r¹—ch₂—c—Cl ve kterém R¹ se definuje výše, jako je acetoxyacetylchlorid, s obdržením racemícké směsi cis-S-laktamových sloučenin obecných vzorců la a lb. Tato reakce se může provádět za přítomnosti báze, jako je triethylamin, v některém rozpouštědle, jako je methylenchloríd, při teplotě, jako je -20 °C, s následným ohřátím na teplotu 25 °C.

Po tomto způsobu může následovat modifikace vytvořeného laktamu, pokud se· požaduje jako výchozí látka jiný laktam.

Výchozí směsi, které jsou jiné než racemické směsi, lze obdržet například přidáním jedné či více sloučenin obecných vzorců la nebo lb k racemické směsi těchto sloučenin.

Výchozí směs může například obsahovat diastereomery sloučenin obecných vzorců la a lb, i když se preferuje, aby « 4 • *

I 4 ··

4·· · « 4 se tyto sloučeniny oddělily před provedením způsobů enzymatického štěpení podle tohoto vynálezu.

Enzymy a mikroorganismy

Enzymy nebo mikroorganismy používané ve způsobech podle tohoto vynálezu mohou být jakékoliv enzymy či mikroorganismy, které mají schopnost katalyzovat stereoselektivni konverze, jak se zde popisují. Různé enzymy, jako jsou esterasy, lipasy, amidasy a acylasy bez ohledu na původ či čistotu, mohou být například ve formě živočišných či rostlinných enzymů nebo jejich směsí, buněk mikroorganismů, rozdrcených buněk, extraktů buněk nebo mohou být syntetického původu .

Pokud jde o použití mikroorganismů, lze způsob podle tohoto vynálezu provádět s použitím jakéhokoliv mikrobiálního buněčného materiálu schopného katalyzovat stereoselektivní konverze, které se zde popisují. Buňky lze použít ve formě neporušených vlhkých buněk nebo sušených buněk, jako jsou lyofilizované buňky, buňky sušené ve spreji nebo buňky sušené teplem. Buňky lze též použít ve formě zpracovaného buněčného materiálu, jako jsou prasklé buňky nebo buněčný extrakt. Buňky nebo buněčné materiály mohou být buňky nebo buněčný extrakt. Buňky nebo buněčné materiály lze použít ve volném stavu nebo immobilizované na nosiči, jako je immobilizace fyzikální adsorpcí či zachycením.

Příklady rodů mikroorganismů vhodných jako zdroje katalyzujících enzymů zahrnují Mucor, Escherichia, Staphylococcus, Agrobacterium, Acinetobacter, Rhizopus, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Trichoderma, Candida, Rhodotorula, Torulopsis, Próteus, Bacillus, Alcaligenes, Pseudomonas, φφ φ φ

Rhodococcus, Brevibacterium, Geotrichum, Enterobacter, Chromobacterium, Arthrobacter, Microbacterium, Mycobacteríum, Saccharomyces, Penicillium, Methanobacterium, Botrytis, Chaetomium, Ophiobolus, Cladosporium a podobně. Uvažuje se též použití hostitelských buněk zpracovaných způsoby genetického inženýrství.

Specifické mikroorganismy vhodné pro použití ve způsobu podle tohoto vynálezu zahrnují Chromobacterium viscosum, Pseudomonas aeuriginosa jako je ATCC 25619, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, jako je ATCC 31303, Pseudomonas ovalíš, Escherichia coli, Staphylococcus aureas, Alcaligenes faecalis, Streptomyces griseus, Pseudomonas cepacia, Candida rugosa, jako je ATCC 14830, Geotrichum candidum, jako je ATCC 32345, Streptomyces clavuligerus, Nocardia erythropolis, Nocardia asteraides, Mycobacteríum phlei, Agrobacterium radiobacter, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae a podobně. Při provádění těchto způsobů lze použít dva či více druhů stejně tak jako jeden druh mikroorganismů. Pojem ATCC, jak se zde používá, poskytuje odkaz na přístupové číslo sbírky American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ve které je organismus s tímto číslem uložený.

Způsoby štěpení podle tohoto vynálezu lze provádět po vypěstování použitého mikroorganismu (použitých mikroorganismů) nebo současně s jejich pěstováním fermentací in šitu a štěpením. Pěstování mikroorganismů může provádět ten, kdo má zkušenost v oboru, například použitím příslušného média obsahujícího živné složky, jako jsou zdroje uhlíku a dusíku a stopové prvky.

Příklady komerčně dostupných enzymů vhodných pro po♦♦ · ·· · · • * · ♦ « » « * • 9 9 99 · « · ·

9 * * • 9 9 9

9*99 + 99 99999

9 9 · ► ·· · užití v tomto vynálezu zahrnují lipasy, jako jsou Amano PS-30 (Pseudomonas cepacia), Amano GC-20 (Geotrichum candidum), Amano APF (Aspergillus niger), Amano AK (Pseudomonas sp.), Pseudomonas fluorescens lipase (Biocatalyst Ltd.), Amano Lipase P-30 (Pseudomonas sp.), Amano P (Pseudomonas fluorescens), Amano ΆΥ-30 (Candida cylindracea), Amano N (Rhizopus niveus), Amano R (Penicillíum sp.), Amano FAP (Rhizopus oryzae), Amano AP-12 (Aspergillus niger), Amano MAP (Mucor meihei), Amano GC-4 (Geotrichum candidum), Sigma L-038'2 a L-3126 (porcinní pankreasa), Sigma L-3001 (Wheat germ), Sigma L-1754 (Candida cylindracea), Sigma L-0763 (Chromobacterium viscosum) a Amano K-30 (Aspergillus niger). Navíc zahrnují příklady enzymů odvozených od živočišné tkáně esterasu z vepřových jater, a-chymotrypsin a pankreatin z pankreasu, jako je lipasa s vepřových jater a Porcine Pancreatic Lipase (Sigma). Při provádění těchto způsobů lze použít dva či více enzymů stejně tak jako jeden enzym.

Preferovaná ztělesnění tohoto vynálezu se dále popisují v následujících reakčních schématech. I když pro objasnění tato reakční schémata znázorňují štěpení určitých cis-enantiomerních směsí, je třeba si uvědomit, že tato ztělesnění, jak se popisují, rovněž platí pro štěpení jiných enantiomerních směsí podle tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Štěpení racemického cis-3-4-terc-butyl-3-acetyloxyazitidin-2-onu immobilizovanou lipasou PS-30 z Pseudomonas cepacia

Připraví se reakční směs obsahující 3 litry 10 mM • 0 ·· 0

0 · 0 ·00 •00 0000

0 0. 00 kalium-fosfátového pufru, 90 g racemického cis-3-4-terc-butyl-3-acetyloxyazitidin-2-onu a 45 mg immobilizované lipasy PS-30 z Pseudomonas cepacia. Reakce se provede při teplotě 40 °C za míchání při 150 min^-3-. pH reakční směsi se udržuje na 7,0 25% roztokem hydroxidu sodného. Po 4 h poskytuje reakce 49 % požadovaného chirálního acetátu (teoretický maximální výtěžek 50 %) s enantiomerním obohacením vyšším než 99 %.

Příklad 2

Štěpení racemického cis-3-4-terc-butyl-3-acetyloxyazitidin-2-onu immobílizovanou Pen V amidasou z Fusarium sp.

Připraví se reakční směs obsahující 20 ml 10 mM kalium-fosfátového pufru, 100 mg racemického cis-3-4-terc-butyl-3-acetyloxyazítidin-2-onu a 25 mg immobilizované Pen V amídasy z Fusarium sp. Reakce se provede při teplotě 40 °C za míchání při frekvenci otáčení 150 min^-3-. pH reakční směsi se udržuje na 7,0 0,1 N roztokem hydroxidu sodného. Po 3 h reakce poskytuje 36 % požadovaného chirálního acetátu (teoretický maximální výtěžek 50 %) a enantiomerní obohacení vyšší než 90 %.

Příklad 3

Štěpení racemického cis-3-4-terc-butyl-3-propionyloxyazitidin-2-onu immobílizovanou lipasou PS-30 z Pseudomonas cepacia a Pen V amidasou z Fusarium sp.

Připraví se reakční směs obsahující 20 ml 10 mM kalium-fosfátového pufru, 100 mg racemického cis-3-4-terc-butyl-3-propionyloxyazitidin-2-onu a 50 mg immobilizované ♦

v · · * « 9 9 99

9 « « 9 · · • · ·· ► » · « ► · *· ·♦ · ♦ · «

9 9 9

99999

9 9 «

lipasy PS-30 z Pseudomonas cepacia. Reakce se provede při teplotě 40 °C za míchání při frekvenci otáčení 150 min^-3·. pH reakční směsi se udržuje na 7,0 0,1 N roztokem hydroxidu sodného. Po 18 h reakce poskytuje 48 % požadovaného chirálního propionátu (teoretické maximum 50 %) a enantiomerní obohacení vyšší než 99 %.

Připraví se reakční směs obsahující 20 ml 10 mM kalium-fosfátového pufru, 100 mg racemického cis-3-4-terc-butyl-3-propionyloxyazatidin-2-onu a 25 mg immobilizované Pen V amidasy z Fusarium sp. Reakce se provede při teplotě 40 °C za míchání při frekvenci otáčení 150 min^-3·. pH reakční směsi se udržuje na 7,0 0,1 N roztokem hydroxidu sodného. Po 20 min reakce poskytuje .25 % požadovaného chirálního propionátu (teoretické maximum 50 %) a enantiomerní obohacení vyšší než 98 %.

Příklad 4

Štěpení racemického cis-3~4~terc-butyl-3-hexanoyloxyazitidin-2-onu immobílízovanou lipasou PS-30 z Pseudomonas cepacia

Připraví se reakční směs obsahující 20 ml 10 mM kalium-fosfátového pufru, 100 mg racemického cis-3-4-terc-butyl-3-hexanoyloxyazitidin-2-onu a 50 mg immobilizované lipasy PS-30 z Pseudomonas cepacia. Reakce se provede při teplotě 40 °C za míchání při frekvenci otáčení 150 min^-1. pH reakční směsi se udržuje na 7,0 0,1 N roztokem hydroxidu sodného. Po 30 min reakce poskytuje 48 % požadované chirální hexanoylové sloučeniny (teoretické maximum 50 %) a enantiomerní obohacení vyšší než 99 %.

• · ·· 9

Příklad. 5

Štěpení racemického cís-3-4-terc-butyl-3-fenylacetyloxyazitidin-2-onu Pen V amidasou z Fusarium sp.

Připraví se reakční směs obsahující 20 ml 10 mM kalium-fosfátového pufru, 100 mg racemického cis-3-4-terc-butyl-3-fenylacetyloxyazitidin-2-onu a 25 mg immobilizované Pen V amidasy z fusarium sp. Reakce se provádí pří teplotě 40 °C za míchání při frekvenci otáčení 150 min^-1. pH reakční směsi se udržuje na 7,0 0,1 N roztokem hydroxidu sodného. Po 18 h poskytuje reakce 25 % požadované chírální fenylacetylové sloučeniny (teoretické maximum 50 %) a enantiomerní obohacení vyšší než 99 %.

Opticky aktivní enantiomery, které se zde popisují, lze použít pro získávání protinádorových sloučenin obecného vzorce III nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí.

ve kterých

R¹ je podle výše popsané definice a ·« * · »» ·» ·· · « « « ♦ * *· · · · « ♦ · 9 · · « · · · «««

9 ·*♦ 9* · · · ♦ · · ···♦ «· ·«*·«·«« •A ·Λ «· »· ·· ·

R² je CH₃C{0)0- .

Zvláště preferovaná je sloučenina, ve které R¹ je O-C(O)-terč-butylová skupina.

Sloučeniny obecného vzorce III vykazují významný inhibiční účinek na abnormální buněčnou proliferaci a mají terapeutické vlastnosti umožňující léčit pacienty trpící patologickými stavy souvisejícími s abnormální proliferací buněk. Navíc tyto sloučeniny vykazují významnou perorální biologickou dostupnost a tak mohou uskutečnit pozitivní terapeutické účinky po perorálním podání.

Sloučeninu obecného vzorce III lze připravit způsoby znázorněnými ve schématu 1 níže. Tyto způsoby lze snadno přizpůsobit odchylkám pro obdržení sloučenin v rámci obecného vzorce III, které se však konkrétně nepopisují.

Jeden ze způsobů přípravy požadovaných sloučenin je obecný způsob znázorněný ve schématu 1. V kroku (a) tohoto schématu reagují enantiomery obecných vzorců la, Ib, Ha nebo lib, jak se popisují výše, se sloučeninou obecného vzorce IV (derivát baccatinu III) .

V kroku (a) schématu 1 je vhodné převést hydroxylovou skupinu na uhlíku 13 na kovový alkoxid před spojováním. Požadovaný kovový alkoxid lze obdržet reakcí sloučeniny obecného vzorce IV se silnou kovovou bází, jako je lithium-diisopropylamid, Cl-6 alkyllithium, lithium- nebo natriumnebo kalium-bis(trimethylsilyl)amid, fenyllithium, hydrid sodný, hydrid draselný, hydrid lithný nebo s podobnou bází. Požaduje-li se například lithium-alkoxid, může se sloučenina obecného vzorce IV ponechat reagovat s n-butyllithiem

9 • 9 9 ·· «99 · «

9» 9* 9

9 · · ♦ 9 * «« 9 9 « 9 « · 99» 9 9 ♦♦ 9

9 9 9 9 9 v inertním rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran. Ohledně případů spojení substituovaných baccatinů s vhodnou sloučeninou obecného vzorce la, Ib, Ha nebo lib způsobem Holtona viz US patent 5 175 315, US patent č. 5 466 834, US patent č. 5 229 526, US patent č. 5 274 124, US patent č. 5 243 045, US patent č. 5 227 400, US patent č. 5 336 785 a US patent Č. 5 254 580, US patent Č. 5 294 637 nebo EP 0 590 267 A2, které se zde všechny zahrnují formou odkazu.

Schéma 1

r' \ O NH II i OH· OR³

V t-butyl

Krok (b) Krok (c)

Skupiny R³ a R⁴ v tom smyslu, v jakém se zde uvažují, jsou konvenční skupiny chránící hydroxylovou skupinu, jak se znázorňují ve vzorci V a diskutují výše. Konvenční skupiny chránící hydroxylovou skupinu jsou zbytky, které lze použít pro blokování či ochranu hydroxylové skupiny a jsou dobře • 9

9* * ♦9

9 9 9 9 ·9 · · 99 • 99 9 9 9 9 · 9 999 « 999 9 9 99 «9 9 9999

99 9· 99 9· · známy těm, kteří mají zkušenost v oboru. Přednostně jsou tyto skupiny takové, které lze odstranit způsoby, které nevedou k žádné zřetelné destrukci zbývající části molekuly. Případy takových snadno odstranitelných skupin chránících hydroxylovou skupinu zahrnují chloracetylovou skupinu, methoxymethylovou skupinu, 1-methyl-l-methoxyethylovou skupinu, tetrahydropyranylovou skupinu, tetrahydrothiopyranylovou skupinu, skupinu dialkylsilyletherů, jako je dimethylsilylether a trialkylsilyletherů, jako je trimethylsilylether, triethylsilyether a terc-butyldimethylsilylether, skupinu dialkylalkoxysilyletherů, jako je diisopropylmethoxysilylether, 2,2,2-trichlorethyloxymethylovou skupinu, 2,2,2-trichlorethyloxykarbonylovou skupinu (nebo jednoduše trichlorethyloxykarbonylovou skupinu), benzyloxykarbonylovou skupinu a podobně. Další vhodné skupiny chránící hydroxylovou skupinu, které lze použít, lze nalézt v monografii T. W. Greene diskutované výše, stejně tak jako v kapitole 2 Protecting Groups in Organic Synthesis, 3. vydání, Theodora W. Greene a Peter G. M. Wuts (1999, John Wiley & Sons, New York), která se zde zahrnuje formou odkazu. Často v literatuře používanou skupinou chránící sloučeniny obecného vzorce IV je trialkylsilylová skupina. Nejpreferovanější skupinou R³ je 1-methyl-1-methoxyethylová skupina (MOP), skupina trialkylsilyletheru nebo dialkylsilyletherů, jako je skupina diisopropylmethoxysilyletheru.

Nejpreferovanější skupinou R⁴ je skupina dialkylalkoxysilyletheru, jako je diisopropylmethoxysílyether, avšak lze též preferovat trialkylsilyether nebo karbonát, jako je benzyl-karbonát. V kroku (b) se chránící skupina R³ nebo R⁴nebo případně obě odstraní ze sloučenin obecného vzorce V. Jestliže je R³ nebo R⁴ chránící skupina na bázi silylové skupiny, uskuteční se odstranění triethylamin-trihydrofluo- 27

0 • 0 0 0 O

00 0 » 00 0 · 00 0000 00 00 0000 • 0 000 ·0 00 000 t 0000

0 « 0000 00 0 00 00 · * ·0 00 0 ridem v tetrahydrofuranu jako rozpouštědle. Lze též použít jiné zdroje fluoridu. Například lze použít tetrabutylamonium-fluorid, pyridinium-hydrofluorid, fluorid draselný nebo fluorid česný. Fluorid draselný lze použít v kombinaci s komplexotvorným prostředkem, jako je 18-crown-6 či podobně, aby se napomohlo desilylaci. Za těchto podmínek se používá obvykle rozpouštědlo, jako je acetonitril. Další podmínky, jako je středně silný vodný roztok kyseliny fluorovodíkové nebo kyseliny trifluoroctové a pomocného rozpouštědla jako je acetonitril nebo tetrahydrofuran, mohou být vhodné pro odstranění chránících silylových skupin. Stejné kyselé podmínky jsou vhodné pro odstranění 1-methyl-1-methoxyethylové (MOP) chránící skupiny.

Skutečně použité podmínky závisí na chránících skupinách použitých pro R³ nebo R⁴. Například jeden preferovaný způsob může používat skupinu MOP jako R³ a skupinu diisopropylmethoxysilyletheru jako R⁴. V tomto případě by krok (b) zahrnoval mírně kyselé zpracování s použitím vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a organického rozpouštědla. Výsledná sloučenina zbavená chránící skupiny 2' by se exponovala fluoridovému zdroji, jako je triethylamin-trihydrofluorid v tetrahydrofuranu jako rozpouštědle v kroku (c) s obdržením sloučeniny III po chromatografické nebo krystalografické purifikaci.

··

ΦΦ ' φφ φφ φφ φ • φ · φ * φ φ « · φ φ « φ φ · φ φ φφ φφφφ

Φ Φ φφφ 4 · ΦΦ φ Φ Φ ΦΦΦΦΦ

ΦΦ ΦΦΦΦΦΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ φφφφ φφ Φ

Claims

1. Způsob štěpení směsi obsahující enantiomery obecných vzorců la a lb, ve kterých R¹ je v poloze cis vzhledem k terc-butylově skupině v obou obecných vzorcích la a lb (la) t-butyl (lb)

C - N nebo ve kterých

R'¹ je v poloze trans vzhledem k terc-butylové skupině v obou obecných vzorcích Ila a lib r!

5_ (Ila) >í-butyl • · 4

9 44

9 4 4 4

4 4 4

44 4

4 4 4'

4 4 4 4

4 4 44 4

4 4 4

44 · (lib) ve kterých

R¹ je -0-C(O)-alkylová skupina, -O-C(0)-arylová skupina nebo -0-C(0)-cykloalkylová skupina, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky (a) uvedení do styku této směsi s některou hydrolasou esteru karboxylové kyseliny, kde tento enzym katalyzuje stereoselektivní hydrolýzu této směsí s poskytnutím směsi dvou sloučenin, ve kterých v jedné sloučenině R^x je -0-C(0)-alkylová skupina, -0-C(0)-arylová skupina nebo -0-C(0)-cykloalkylová skupina a v druhé sloučenině R¹ je hydroxylová skupina a (b) oddělení jedné či obou těchto sloučenin.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že se tato směs štěpí za přítomnosti vody a/nebo některého organického alkoholu.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící se t i m, že R¹ je -0-C(0)-alkylová skupina.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačuj ící se t i m, že sloučeniny vytvořené v kroku (a) mají následující struktury:

φφ φ φφ φφ # ♦ φφ • * · · · · · » φφφ • φ · · φ φφφ φ * · · • φ φφφ «φ φφ φφφ φ φφφφ • Φ φ «φφφ φφ φ • · φ · φφ φφ φφ ·

5. Způsob podle nároku 3, vyznačuj ící se t í m, že sloučeniny vytvořené v kroku (a) mají následující struktury:

6. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že se tato hydrolasa esteru karboxylové kyseliny obdrží z některého mikroorganismu.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že se tento enzym volí ze skupiny zahrnující esterasu, lipasu, amidasu a acylasu.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačuj ící • 4 ·♦ * • * · • * · · • « ··· » · · ·· » se t í m, že tímto enzymem je lipasa.

9. Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící se t í m, že tímto enzymem je lipasa zvolená ze skupiny zahrnující lipasu PS-30 z Pseudomonas sp., lipasu P-30 z Pseudomonas cepacia, lipasu GC-20 z Geotrichium candidum, lipasu N z Rhizopus niveus, lipasu APF z Aspergillus niger, lipasu Ay-30 z Candida sp., lipasu AK z Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens a lipasu z pankreatu vepře.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že je tento enzym immobilizovaný na nosiči.

11. Způsob podle nároku 7, vyznačuj ící se t í m, že tímto enzymem je amidasa.

12. Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící se t í m, že tímto enzymem je Pen V amidasa obdržená z Fusarium sp.

13. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce III ·* · ve kterém

R¹ je -0-C(O)-alkylová skupina, -0-C(O)-arylová skupina nebo -0-C(0)-cykloalkylová skupina a

R² je skupina CH₃C(O)O-, vyznačující se tím, že se sloučenina zvolená ze sloučenin obecných vzorců Ia, lb, Ha a lib \_^t-butyl

O (Ia) (lb) \_._xxt-butyl (Ha) • 4 í-butyl • 4 ·* • 4 * 44 • · 4 4 · · ♦ ·

4 4 4 ♦ ·

44 ·· ··

4 · 4 · • 4 4444

4 · ·

44 · ' (lib) ve kterých

R¹ je -0-C(0)-alkylové skupina, -0-C(0)-arylová skupina nebo -0-C(0)-cykloalkylová skupina, ponechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce IV (IV) ve kterém

R² je skupina CH₃C(O)O- a

R⁴ je chránící skupina ·· ·· • · * · • · » · • · · ·♦ • · · ·« · · ·· ·· *· * • · · · · · · • · ·· · · · * • · » ♦ · · · *·4 • · ♦ · · · · ·· ·· ·· * a odstraní se skupina R⁴ s obdržením sloučeniny obecného vzorce III.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačuj í c í se t í m, že sloučenina obecného vzorce IV dále reaguje se silnou bázickou sloučeninou kovu pro převedení C-13 hydroxylové skupiny na metal-alkoxidovou skupinu.