CZ20031866A3 - Způsob pro stanovení účinnosti léčení mykobakteriální infekce - Google Patents

Description

Způsob pro stanovení účinnosti léčby mykobakteriální infekce

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsob sledování progrese mykobakteriální infekce a způsobu pro detekci latentní mykobakteriální infekce.

Dosavadní stav techniky

U zdravých jedinců s latentní infekcí neexistují prostředky pro sledování toho, zda jsou bacily živé či nikoliv. Existujícím testem na latentní infekci M. tuberculosis je tuberkulinový kožní test (TST) a ten zůstává pozitivní i poté, co byly bakterie M. tuberculosis usmrceny vhodnou preventivní léčbou, např. preventivní léčbou isoniazidem (IPT),

U pacientů s léčenou aktivní tuberkulosou neexistuje markér progrese růstu bakterií in vivo. Expektorované bakterie ve sputu a bakterie izolované z jiných lokalizací onemocnění (například z pleurální kapaliny nebo mozkomíšního moku) reprezentují extracelulární bakterie. Ačkoliv bakterie (při mikroskopické hodnocení, kultivačním hodnocení, PCR nebo testech na bázi fágů) postupně mizí z klinických vzorků (z lokalit onemocnění) při účinné terapii, nejsou tato měření (a) dobrým testem pro určení celkového obsahu bakterií v těle, a (b) neříkají nic o zbývajících intracelulárních bakteriích poté, co jsou extracelulární bakterie v místě onemocnění nedetekovatelné.

Běžné imunologické testy neposkytují vhodný náhradní markér pro progresi infekce. Protilátkové reakce nejsou dostatečně dynamické a zůstávají pozitivní dlouho po ukončení léčby.

• » · · · · « r

··· < « «

Všechny buněčné imunologické testy, které byly dosud použity vykazují při léčbě vzestup v důsledku ne zcela prozkoumaného nespecifického imunosupresivního účinku TB samotných.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje prostředek pro sledování infekce M. tuberculosis sekvenčním měřením ex vivo frekvence ESAT-6-specifických T-lymfocytů pomocí ex vivo interferonELISPOT testu. Když je pacientovi s aktivní tuberkulosou nebo zdravému kontaktu s latentní infekcí podána účinná léčba antituberkulosním lékem in vivo, tak se počet bakterií postupně snižuje. Po 6-9 měsících léčby se předpokládá, že u většiny jedinců (>95%) budou všechny intracelulární bakterie usmrceny, protože u těchto jedinců dojde vzácně k dalšímu relapsu tuberkulosy (pokud se znovu exogenně neinfikují). Dlouhodobé sledování pacientů s aktivní tuberkulosou a zdravých kontaktů s latentní infekcí M. tuberculosis během anti-tuberkulosní léčby ukázalo, že frekvence ESAT-6-specifických T-lymfocytů měřená ex vivo se, oproti jiné buněčné imunitní reakci, progresivně snižuje s délkou trvání terapie. Po dokončení terapie jsou ESAT-6-specifické T-lymfocyty měřené ex vivo nedetekovatelné ve většině případů (toto potenciálně nabízí prostředek pro stanovení toho, zda byla mykobakteriální infekce eradikována terapeutickou intervencí). Podle srovnání byly kinetiky degradace ESAT-6-specifických T-lymfocytů u pacientů dostávajících 2. a 3. linii antibiotik pro mnohotně resistentní TB pomalejší a korelovaly s pomalejší konverzí sputa na kultivační negativitu (a pacienti s resistentní TB vykazovaly mnohem pomalejší klinické a bakteriologické zlepšení).

Pokles ESAT-6-specifických T-lymfocytů při účinné chemoterapii, která snižuje počet bakterií o několik řádů, naznačuje, že pro daného jedince frekvence ESAT-6-specifických ··« ««·· ·· *

T-lymfocytů, jak je určena v ELISPOT testu ex vivo, souvisí s obsahem antigenu. V biologických systémech, kde jsou měřitelné in vivo růst patogenu a příslušný obsah antigenů, je známo, že frekvence antigen-specifických T-lymfocytů stanovená ex vivo koreluje s a je částečně řízena obsahem antigenu. Ačkoliv neexistuje žádné kvantitativní absolutní stanovení bakteriálního nebo antigenního obsahu při TB, musí být přímo a těsně související, a ex vivo kvantifikace ESAT-6-specifických T- lymfocytů může tedy být způsobem pro longitudinální sledování změn v obsahuj bakterií M tuberculosis u jedince.

Předkládaný vynález tedy poskytuje způsob pro sledování progrese infekce M. tuberculosis v čase pomocí přímé ex vivo kvantifikace ESAT-6-specifických T-lymfocytů. Dosud získaná data jsou všechna založena na použití ELISPOT testu ex vivo, ale mohou být použity také jiné metody pro ex vivo stanoveni antigen-specifických T-lymfocytů (např. MHC tetramer-peptidové komplexy, intracelulární cytokinové barvení).

Předkladatelé vynálezu zjistili, že po podání účinné léčby pacientovi s mykobakteriální infekcí dojde ke snížení počtu Tlymfocytů specifických pro mykobakteriální antigen, jak jsou stanoveny přímo ex vivo. Toto je poprvé, co bylo zjištěno snížení množství T-lymfocytů specifických pro mykobakteriální antigeny po léčbě mykobakteriální infekce.

Vynález proto poskytuje způsob pro sledování progrese mykobakteriální infekce sekvenčním měřením ex vivo frekvence Tlymfocytů specifických pro mykobakteriální antigen.

Předkladatelé vynálezu také zjistili, že jedinci s latentní mykobakteriální infekcí mají detekovatelné koncentrace

T-lymfocytů specifických pro mykobakteriální antigeny. Proto může být detekce těchto T-lymfocytů použita pro diagnostiku • ♦ • *·· · *·· ι»·· latentní infekce.

V souladu s tím vynález poskytuje způsob pro stanovení účinnosti léčby mykobakteriální infekce u jedince, který zahrnuje stanovení toho, zda se ve vzorku od jedince počet Tlymfocytů specifických pro mykobakteriální antigen po léčbě snižuje, čímž se určí účinnost léčby.

Vynález také poskytuje způsob pro stanovení přítomnosti latentní infekce u jedince, který zahrnuje stanovení přítomnosti T-lymfocytů specifických pro mykobakteriální antigen ve vzorku od jedince.

Vynález dále poskytuje způsob pro stanovení efektu terapeutické intervence na mykobakteriální infekci u jedince, při kterém se stanovení množství T-lymfocytů ve vzorku od jedince, čímž se určí efekt intervence.

Způsobem detekce T-lymfocytů je výhodně přímé stanovení ex vivo. T-lymfocyty jsou typicky specifické pro ESAT-6 nebo CFP10, ale mohou být také specifické pro jakýkoliv jiný mykobakteriální antigen.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje frekvence ESAT-6 peptide-specifických IFN-γ secernujících T-lymfocytů pro 5 různých skupin jedinců. Každý kroužek představuje jednoho jedince; frekvence IFN-γ secernujících T-lymfocytů pro každý peptid byly sečteny za zisku celkového počtu ESAT-6 T-lymfocytů specifických pro peptid. Valná většina kontaktů a pacientů s tuberkulosou odpovídala (Tabulka 2) a jsou uvedeni pouze odpovídající jedinci. Horizontální grafy představují medián frekvence ESAT-6 • ··· 4 • · · *»· ····

T-lymfocytů specifických pro peptid pro každou skupinu.

Obr. 2 ukazuje pokles frekvence ESAT-6 peptid-specifických IFN—secernujícich T-lymfocytů při anti-tuberkulosní chemoterapii (p=0,005; n=12). Suma T-lymfocytů specifických pro ESAT-6 peptid pro každého pacienta, stanovená ELISPOT testem ex vivo, je uvedena v různých dobách během terapie. Celková frekvence T-lymfocytů specifických pro ESAT-6 peptid secernujícich IFN-γ poklesla průměrně o faktor 0,62 (95% Cl: 0, 37 - 0,76) (to znamená na 38% původních hodnot) během uvedené doby. Průměrná rychlost poklesu byla 5,5% (95% Cl: 2,4- 8,4) za týden. Tento pokles byl zaznamenán u všech skupin sledovaných pacientů: C+PTB (kultivačně pozitivní plicní tuberkulosa: n4) ; TBLN (tuberkulozní lymfadenitis; n=3) a EPTB (extrapulmonální tuberkulosa: miliární, n=l; pleurální, n=2, osteomyelitida, n=l) . Pro jednoho pacienta s EPTB (NPH232: miliární) se frekvence T-lymfocytů nejprve zvýšila, a potom snížila.

Obr. 3 ukazuje CD4 epitopovou mapu ESAT-6, jak byla definována ex vivo peptidově-specifickými IFN-γ ELISPOT reakcemi pro všech 88 tuberkulosnich pacientů a kontaktů. Je uvedeno procento jedinců, kteří odpovídaly na každý peptid a všech 88 jedinců bylo testováno na každý peptid. Pro rESAT-6 antigen bylo testováno 35 tuberkulosnich pacientů a kontaktů.

Obr. 4 ukazuje odpovědi CD4 T-lymfocytů na imunodominantní epitopy ESAT-6^ a ESAT-6₇₁__e5, které jsou HLA-DQ- restrihované.

IFN-γ SFC specifické pro peptidy ΕΞΑΤ-β^ (Obr. 4A-C) a ESAT-6₇₁._e5 (Obr. 4D, E) jsou výrazně sníženy anti-HLA- DQ protilátkou, ale ne protilátkami k HLA-DR nebo HLA-DP. Pro ESAT-6_W5 j sou uvedeny výsledky pro ex vivo PBMC od zdravého kontaktu NPH2O9 (4A), ESAT-S^-speci f ickou T-lymfocytární linii od zdravého kontaktu GM19 (4B) a ESAT-6₁_₁₅-spéci fickou T6 • » • ·♦· lymfocytární linii od pacienta s TBLN NPH223 (4C) . Pro ESAT-6₇₁. _es jsou uvedeny výsledky pro ex vivo PBMC od zdravého kontaktu GM19 (4D) a ESAT-6₇₁_e₅“Specifickou T-lymfocytární linii pacienta s TBLN NPH223 (4D). V každém případě je frekvence IFN-γ SFC uvedena jako průměr ze dvou duplikátních jamek.

Obr. 5 ukazuje frekvence ESAT-6 peptide-specifických a PPDspecifických IFN-y-secernujících T-lymfocytů stanovené ex vivo enzymovým imunoskvrnovým testem (ELISPOT) u 50 kultivačně pozitivních tuberkulosních pacientů v Indii. Pro každého jedince byl sečten počet T-lymfocytů specifických pro peptid pro každý peptid odvozený od ESAT-6.

Obr. 6 ukazuje frekvence ESAT-6 a CFP10 peptid-specifických, a PPD-specifických IFN-y-secernuj ících T-lymfocytů stanovené ex vivo enzymovým imunoskvrnovým testem (ELISPOT) u 100 zdravých dospělých (bez anamnesy tuberkulosy a s normálním rentgenovým snímkem hrudníku) z Murnbai, Indie (A) a u 40 zdravých dospělých z UK (B). Pro každého jedince byl sečten počet T-lymfocytů specifických pro peptid pro každý peptid odvozený od ESAT-6 nebo CFP10.

Obr. 7 ukazuje epitopové mapy ESAT-6 a CFP10. Epitopová mapa ESAT6 u tuberkulosních pacientů v Indii (A), epitopová mapa ESAT-6 u zdravých dospělých z Mumbaie, Indie (B) a epitopová mapa CFP10 u zdravých dospělých z Mumbaie, Indie (C). Pro každý antigen se počet jedinců odpovídajících na daný peptid vyjádřil jako procento celkového počtu jedinců odpovídajících na antigen.

Obr. 8 ukazuje progresivní snížení frekvence T-lymfocytů specifických pro ESAT-6 peptid secernujících IFN-γ během antituberkulosní chemoterapie v sérii 5 dlouhodobě sledovaných • 4 4 « 4 • 4 44 * 444 · • 4 • 4 44 • 4 «·4 4444 kultivačně pozitivních pacientů s tuberkulosou. Pro každého jedince se počet peptid-specifických T-lymfocytů pro každý peptid odvozený od ESAT-6, který se stanovil ex vivo enzymovým imunoskvrnovým testem (ELISPOT), sečetl v každou hodnocenou dobu.

Podrobný popis vynálezu

Vynalez poskytuje způsob/ který muže byt použit pro měření účinnosti dané léčby nebo intervence při mykobakteriální infekci u jedince. Ve způsobu se sleduje efekt léčby na úrovni konkrétních T lymfocytů. Vynález také poskytuje způsob pro diagnostiku latentní mykobakteriální infekce pomocí detekce přítomnosti T-lymfocytů. Vynález také poskytuje způsob pro určení efektu intervence na mykobakteriální infekce. Termín způsob zde označuje jakoukoliv z těchto metod, pokud z kontextu nevyplývá jinak.

Intervence může být přirozená nebo umělá, úmyslná nebo neúmyslná, a může se například jednat o jinou infekci, jako je infekce HIV nebo virem hepatitidy B.

Způsob se obvykle provádí na vzorku od jedince, kterým je člověk nebo zvíře, obvykle zvíře, které bylo přirozeně nebo uměle infikováno mykobakterií. Jedincem může tedy být savec, jako je primát, kráva, ovce, prase, jezevec nebo hlodavec, například krysa nebo myš. Jedinec obvykle má aktivní nebo latentní mykobakteriovou infekci, měl takovou infekci nedávno nebo je podezřelý z toho, že má latentní mykobakteriální infekci. Jedinec může mít pozitivní nebo negativní Mantoux test. Jedinec může být rizikový z hlediska mykobakteriální infekce, typicky ze socio-ekonomických důvodů, nebo může mít genetické nebo získané predispozice k mykobakteriální infekci. Jedinec může být zdravý nebo může mít příznaky mykobakteriální « · ··· ··· ·· ·« infekce.

Jedinec je obvykle infikován - nebo je podezřelý z infekce - mykobakteriem. Mykobakterie exprimují ESAT-6 nebo CFP 10, a může se jednat o M. tuberculosis. Mykobakterií může být M. marinum nebo M. kansasii. Klinické příznaky mohou být použity pro odlišení mezi těmito dvěma organismy a M. tuberculosis. Mykobakterií může být M. bovis (která může infikovat člověka).

Ve způsobu pro určování účinnosti léčby se účinnost léčby na úrovni změny T-lymfocytů specifických pro mykobakteriální antigen určí měřením množství takových T-lymfocytů ve vzorku od jedince. Pro stanovení změny v množství T-lymfocytů se množství T-lymfocytů ve vzorku určené po podání léčby (dále následující vzorek) srovnává s referenčním vzorkem odebraným před léčbou od stejného pacienta.

Obvykle je referenční vzorek odebrán od pacienta před podáním léčby nebo před intervencí nebo před tím, než může mít aplikovaná léčba jakýkoliv účinek, například během jedné nebo dvou hodin po podání léčby. Následující vzorek je obvykle odebrán během šesti měsíců po podání léčby, například měsíc nebo 2 po podání léčby. Ve způsobu pro detekci účinku intervence může být vzorek odebrán v jakékoliv výše uvedené době po intervenci.

Léčba, jejíž účinnost je určována, je obvykle nová nebo stará léčba. Léčbou může být léčba přirozeným činidlem, jako je vitamín (např. vitamín D), minerální nebo rostlinný produkt. Léčbou může být preventivní nebo terapeutická vakcína. Léčbou je obvykle isoniazid, rifampicin, ethambutol, pyrazinamid nebo streptomycin.

Pokud má určitá léčba nízkou účinnost, tj. léčba ··· « •

·« * ♦ ·· i · · · • · * Ml ·9·» nezpůsobuje významné snížení množství T-lymfocytů, pak musí být jedinci podána jiná léčba. Snížení počtu T-lymfocytů může být srovnáváno se snížením dosaženým v případě úspěšné léčby. V jednom provedení způsobuje málo účinná léčba snížení o méně než 5% (např. méně než 1%) za týden v počtu T-lymfocytů.

Jinou léčbou, která je obvykle podávána tehdy, když má první léčba nízkou účinnost (například tehdy, když jsou bakterie resistentní na první linii léčby), může být kyselina para-amino-salicylová, kanamycin, capreomycin, ethionamid, cycloserine, thiacetazon nebo flourchinolon (např. ciprofloxacin).

U některých jedinců se může množství T-lymfocytů snižovat po léčbě a potom může zůstávat na detekovatelné a v podstatě konstantní úrovni i po dobu 2 měsíců. Toto může ukazovat na změnu infekce z aktivní na latentní, pokud nedojde k reexpozici mykobakteriím, kdy se množství T-lymfocytů může zvýšit.

Obvykle se ve způsobu pro stanovení přítomnosti latentní mykobakteriální infekce bere detekce frekvence alespoň 20 Tlymfocytů specifických ESAT-6 nebo 20 T-lymfocytů specifických pro CFP-10 na milion mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) za ukazatel přítomnosti latentní infekce. Předpokládá se, že frekvence těchto buněk bude zůstávat relativně konstantní u jedince s neléčenou latentní infekcí.

T-lymfocyty, které jsou detekovány ve způsobu podle předkládaného vynálezu, rozpoznávají mykobakteriální proteinový antigen. Proto jsou T-lymfocyty specifické pro a váží se na peptidy z tohoto proteinu, tj. specificky se váží na určité fragmenty (nebo epitopy) proteinu. Obvykle jsou T-lymfocyty specifické pro peptidy z ESAT-6 nebo CFP-10. T-lymfocyty mohou být CD4 nebo CD8 T-lymfocyty. T-lymfocyty byly pre• · · « • · · · ♦ · »· ·* · »9 • t ·» · • * ft ·· ·· senzibilizovány in vivo na mykobakteriálni proteiny a mohou být přítomny v periferní krvi jedince, který se setkal s mykobakterii, ve frekvenci 1 na 10⁶až 1 na 10³ PBMC.

Ve výhodném provedeni se množství nebo přítomnost Tlymfocytů detekuje kontaktováním buněk ve vzorku s (i) celým mykobakteriálním proteinem, nebo (ii) peptidem, který je fragmentem mykobakteriálního proteinu, nebo (iii) analogem (i) nebo (ii), který je rozpoznáván receptorem T-lymfocytů, které rozpoznávají (i) nebo (ii) . Tak může být rozpoznávanou peptidovou sekvencí fragment ESAT-6 nebo CFP-10.

Sekvence, která je rozpoznávána, má délku alespoň 8 aminokyselin, obvykle alespoň 12, 15, 20 nebo více aminokyselin.

Peptidem použitým ve způsobu podle předkládaného vynálezu je tedy obvykle peptid, který má nebo obsahuje sekvenci, která je stejná jako fragment ESAT-6 nebo CFP-10 uvedené výše, např. fúzní protein. Peptid má obvykle délku alespoň 8, 10, 15, 20 nebo více aminokyselin, a typicky mé délku méně než 100 aminokyselin, například 80 nebo méně než 60 aminokyselin.

Stanovení toho, zda T-lymfocyty rozpoznávají peptid, se obvykle provede detekcí změny ve stavu T-lymfocytů za přítomnosti peptidu stanovením toho, zda T-lymfocyty váží peptid. Změna stavu je obvykle způsobena antigen- specifickou funkční aktivitou T-lymfocytu po vazbě receptorů T-lymfocytu na peptid. Obecně, když se při vazbě na receptor T-lymfocytů peptid váže na molekuly MHC třídy I nebo II, které jsou typicky přítomny na povrchu buněk prezentujících antigen (APC).

Změnou stavu T-lymfocytů může být zahájení nebo zvýšení sekrece substancí z T-lymfocytů, jako jsou cytokiny, zejména

IFN-γ, IL-2 nebo TNF-. Intracelulární změny mohou být detekovány, například, za použití technik intracelulárního barvení, typicky intracelulárního barvení na cytokiny (např. pro jakýkoliv výše uvedený cytokin). Po takovém barvení může být provedena detekce za použití techniky pro třídění buněk, například za použití FACS techniky.

Zejména výhodné je stanovení sekrece IFN-γ. Substance mohou být detekovány tak, že se nechají navázat na specifické vazebné činidlo a potom se měří přítomnost komplexu specifické vazebné činidlo/substance. Specifickým vazebným činidlem je obvykle protilátka, například monoklonální nebo polyklonální protilátka. Protilátky k cytokinům jsou komerčně dostupné nebo mohou být připraveny za použití standardních technik.

Obvykle je specifické vazebné činidlo imobilizováno na pevném nosiči. V jednom provedení toto umožňuje stanovení skutečného počtu odpovídajících T-lymfocytů, protože po vazbě činidla bude substance zůstávat poblíž T-lymfocytu, který ji produkuje. Tak mohou na nosiči vzniknout skvrny komplexu substance/činidlo, kde každá skvrna reprezentuje T-lymfocyt, který secernuje substanci. Kvantifikace skvrn )o obvykle srovnání s kontrolou) umožňuje stanovení rozpoznávání peptidu.

Poté, co se substance nechá navázat na pevný nosič, může být tento nosič promyt pro odstranění materiálu, který není specificky navázán na činidlo. Komplex činidlo/substance může být detekován za použití druhého vazebného činidla, které se potom naváže na komplex. Obvykle se druhé činidlo naváže na substanci v místě, které je odlišné od místa vazby prvního činidla. Druhým činidlem je výhodně protilátka a toto činidlo je přímo nebo nepřímo označeno sondou.

9 9

9 9 9

9999 99 9

Tak může být druhé činidlo detekováno třetím činidlem, které je přímo nebo nepřímo označeno sondou. Například může druhé činidlo obsahovat biotinovou skupinu, což umožňuje detekci třetím činidlem, které obsahuje streptavidinovou skupinu a obvykle alkalickou fosfatasu jako detekovatelnou skupinu.

V jednom provedení je detekčním systémem, který je použit, ex vivo ELISPOT test popsaný ve WO 98/23960. V tomto testu je

IFN- ysecernovaný z T-lymfocytu navázán na první IFNspecifickou protilátku, která je imobilizována na pevném nosiči. Vazba IFN-y se potom detekuje za použití druhé IFNspecifické protilátky, která je značená detekovatelnou skupinou. Taková značená protilátka může být získána od MABTECH (Stockholm, Sweden). Další detekovatelné skupiny, které mohou být použity, jsou uvedeny dále.

Obecně jsou T-lymfocyty, které jsou kontaktovány ve způsobu podle předkládaného vynálezu, získány z krevního vzorku od jedince, ačkoliv mohou být použity i jiné typy tělních vzorků, které obsahují T-lymfocyty. Vzorek může být přidán přímo do testu nebo může být nejprve zpracován. Obvykle zpracování zahrnuje naředění vzorku, například vodou nebo pufrem. Obvykle je vzorek naředěn 1,5-100-krát, například 2-50-krát nebo 5-10krát.

Zpracování může zahrnovat separaci složek vzorku. Typicky se ze vzorku separují mononukleární buňky (MC). MC obsahují Tlymfocyty a APC. V uvedeném způsobu mohou tedy APC přítomné v separovaných MC prezentovat peptid T-lymfocytům. V jiném provedení mohou být ze vzorku přečištěny pouze T-lymfocyty, například pouze CD4 T-lymfocyty. PBMC, MC a T-lymfocyty mohou být separovány ze vzorku za použití technik dobře známých v • · fe · ·♦· ···* oboru, například za použití technik popsaných v Lalvani et al (1997) J. Exp. Med. 186, str. 859-865.

Výhodně jsou T-lymfocyty, které jsou detekovány, ve formě nezpracovaných nebo naředěných vzorků. T-lymfocyty jsou výhodně přímo ex vivo, tj. nejsou kultivovány před použitím ve způsobu podle předkládaného vynálezu. T-lymfocyty jsou výhodně čerstvě izolované T-lymfocyty (například ve formě čerstvě izolovaných MC nebo PBMS).

APC, které jsou obvykle přítomny ve způsobu podle předkládaného vynálezu, mohou být od stejného jedince jako Tlymfocyty nebo mohou být od jiného jedince. APC mohou být přirozené APC nebo artificiální APC. APC je buňka, která je schopná prezentovat peptid T-lymfocytu. Je jí typicky B lymfocyt, dendritická buňka nebo makrofág. Je obvykle separována ze stejného vzorku jako T-lymfocyt a je obvykle přečištěna současně s T-lymfocytem. Tak mohou být APC přítomny v MC nebo v PBMC. APC je obvykle čerstvě izolovaná ex vivo buňka nebo kultivovaná buňka. Může být ve formě buněčné linie, například krátkodobé nebo imortalizované buněčné linie. APC může exprimovat na svém povrchu prázdné molekuly MHC třídy II.

Ve způsobu podle předkládaného vynálezu může být použito jednoho nebo více peptidů (obvykle alespoň 2, 5, 10 nebo více různých peptidů). Tak mohou být T-lymfocyty umístěny do testu se všemi peptidy (tj. se souborem peptidů), které mají být testovány. Alternativně mohou být T-lymfocyty rozděleny a umístěny do samostatných testů, které každý obsahují některé z peptidů, které mají být testovány.

V jednom provedení je peptid sám přidán přímo do testu obsahujícího T-lymfocyty a APC. Jak bylo uvedeno výše, Tlymfocyty a APC v takovém testu mohou být ve formě MC. Když jsou použity peptidy, které mohou být rozpoznány T-lymfocyty bez potřeby prezentace APC, tak není použití APC nutné.

Analogy, které obsahují nebo napodobují původní peptid navázaný na MHC molekulu, jsou příkladem takového peptidu.

V jednom provedení je peptid dodán APC za nepřítomnosti Tlymfocytů. APC se potom dodá T-lymfocytům, obvykle poté, co se umožnila prezentace antigenu na jejím povrchu. Peptid může být vychytán do APC a prezentován, nebo může být rovnou vychytáván na povrchu APC bez toho, že by pronikal do APC.

Trvání kontaktu peptidu s T-lymfocyty se liší podle způsobu použitého pro stanovení rozpoznávání peptidu. Obvykle je 10⁵ až 10⁷, výhodně 5xl0⁵ až 10® PBMC přidáno do každého testu. V případě, že je peptid přidán do testu přímo, tak je jeho koncentrace od 10¹ do 10³ g/ml, výhodně 0,5 až 50 g/ml nebo 1 až 10 g/ml.

Obvykle je doba, po kterou jsou T-lymfocyty inkubovány s peptidem, od 4 do 24 hodin, výhodně od 6 do 16 hodin. Při použití ex vivo PBMC může být 0,3x10®PBMC inkubováno v 10 g/ml peptidu po dobu 12 hodin při teplotě 37°C.

Ve způsobu podle předkládaného vynálezu může být místo peptidu použit analog, který je rozpoznáván T-lymfocytárním receptorem, který rozpoznává peptid. Obecně tedy, když je analog přidán k T-lymfocytům za přítomnosti ekvivalentu uvedeného peptidu, obvykle též za přítomnosti APC, tak analog inhibuje rozpoznávání ekvivalentního peptidu. Vazba analogu na uvedené T-lymfocytární receptory může být testována standardními technikami. Například může být T-lymfocytární receptor izolován z T-lymfocytů, které rozpoznávají peptid (např. za použití jakéhokoliv testu na rozpoznávání antigenu popsaného výše). Demonstrování vazby analogu na T-lymfocytární receptory může být potom provedeno tím, že se určí, zda Tlymfocytární receptory inhibují vazbu analogu na substanci, která se váže na analog, jako je například protilátka k analogu. Obvykle je v takové inhibici testu vazby analog navázán na molekulu MHC třídy II.

Obvykle analog inhibuje vazbu peptidu na T-lymfocytární receptor. V tomto případě je množství peptidu, které se může vázat na T-lymfocytární receptor za přítomnosti analogu, sníženo. Toto je způsobeno tím, že analog je schopen vázat se na T-lymfocytární receptor a tak kompetuje s peptidem o vazbu na T-lymfocytární receptor.

T-lymfocyty pro použití ve výše uvedených vazebných experimentech mohou být izolovány od pacientů s mykobakteriální infekcí.

Další vazebné charakteristiky analogu jsou také stejné jako charakteristiky peptidu a proto se analog váže na stejné molekuly MHC třídy II jako peptid. Analog se typicky váže na protilátky specifické pro peptid a proto inhibuje vazbu peptidu na takové protilátky.

Analogem je obvykle peptid. Může vykazovat homologii s původním peptidem. Peptid, který je homologní s jiným peptidem, je obvykle alespoň ze 70% homologní s peptidem, výhodně alespoň z 80 nebo 90% a více homologní a výhodně alespoň z 95%, 97% nebo 99% homologní s peptidem, například v regionu velikosti alespoň 15, výhodně alespoň 30, například alespoň 40, 60 nebo 100 nebo více sousedících aminokyselin. Způsoby pro měření homologie proteinů jsou dobře známé v oboru a v předkládaném vynálezu je homologie vypočítávána podle aminokyselinové identity (která se někdy označuje jako hrubá homologie). Například UViGCG Program obsahuje BESTFIT program, který může být použit pro výpočet homologie (například při použiti zadaných chybových parametrů) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, str. 387-395).

Analog, kterým je peptid, má obvykle délku (v aminokyselinách) uvedenou výše pro peptidy popisované výše. Obvykle jsou aminokyseliny v analogu v ekvivalentních pozicích jako aminokyseliny v původním peptidu přispívající k vazbě na MHC molekulu nebo odpovědné za rozpoznávání T-lymfocytárním stejné nebo konzervované.

Obvykle obsahuje peptidový analog jednu nebo více modifikací, kterými mohou být přirozené post-translační modifikace nebo artificiální modifikace. Modifikace mohou dodávat chemickou skupinu (typicky substitucí vodíku, například vazby C-H), například amino, acetylovou, hydroxylovou nebo halogenovou (např. fluor) skupinu nebo karbohydrátovou skupinu. Typicky je modifikace přítomna na N-nebo C-konci.

Analog může obsahovat jednu nebo více artificiálních aminokyselin, například aminokyselin, ve kterých se vedlejší řetězec liší od přirozeného vedlejšího řetězce. Artificiální aminokyseliny mají obvykle N-konec a/nebo C-konec. Artificiální aminokyselinou může být L- nebo D- aminokyselina. Analog má obvykle tvar, velikost, flexibilitu nebo elektronovou konfiguraci podobnou jako původní peptid. Jedná se typicky o derivát původního peptidu.

V jednom provedení analog napodobuje původní peptid navázaný na MHC molekulu třídy I nebo II. Analog může napodobovat původní peptid navázaný na 2, 3, 4 nebo více MHC molekul třídy I nebo II asociované nebo navzájem na sebe navázané. Tyto MHC molekuly se na sebe mohou vázat za použití systému na bázi biotinu/streptavidinu, ve kterém se obvykle 2, nebo 4 biotinem značené molekuly MHC váží na streptavidinovou skupinu. Tento analog obvykle inhibuje vazbu komplexu peptid/MHC třídy I nebo II na T-lymfocytární receptor nebo protilátku, které jsou specifické pro komplex. Analogem je obvykle protilátka nebo fragment protilátky, například Fab nebo (Fab)₂ fragment.

Analog může být imobilizován na pevném nosiči, zejména analog, který napodobuje peptid navázaný na MHC molekulu.

Analog je obvykle navržen počítačovými metodami a potom je syntetizován za použití metod známých v oboru. Alternativně může být analog vybrán z knihovny sloučenin. Knihovnou může být kombinatoriální knihovna nebo zobrazovací knihovna, jako fágová zobrazovací knihovna. Knihovna sloučenin může být exprimována v zobrazovací knihovně ve formě navázané na molekulu MHC třídy I nebo II, jako je MHC molekula, na kterou se váže původní peptid. Analogy jsou obvykle vybrány z knihovny podle své schopnosti napodobovat vazebné charakteristiky původních peptidů. Analogy mohou být tedy vybrány podle své schopnosti vázat se na T-lymfocytární receptor nebo na protilátku, která rozpoznává původní peptid.

V jednom provedení jsou T-lymfocyty detekovány nikoliv podle své reakce na substanci, ale podle své schopnosti vázat se na specifické vazebné činidlo. Činidlem obvykle je jakýkoliv z proteinů, peptidů nebo analogů uvedených výše. Činidlo může být značené (například za použití jakékoliv detekovatelné skupiny uvedené výše. Specifické vazebné činidlo může obsahovat MHC molekulu a výhodně jím je komplex MHC tetramer-peptid (například uvedený výše).

Peptid nebo analog podle předkládaného vynálezu může být připraven za použití standardních technik chemické syntézy, například za použití automatizovaného syntezátoru. Může být vyroben z delšího polypeptidu, např. fúzního proteinu, a tento polypeptid obvykle obsahuje sekvenci peptidů, a může být odvozen od polypeptidu například hydrolýzou polypeptidu, například za použití proteásy; nebo fyzikálním štěpením polypeptidu. Polypeptidem je obvykle ESAT-6 nebo CSF-10, které byly exprimovány rekombinantně.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě farmaceutických prostředků, které obsahují činidlo a a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo. Mezi vhodné nosiče a ředidla patří izotonické salinické roztoky, například fosfátem pufrovaný salinický roztok. Obvykle je činidlo podáno parenterálním, intravenosním, intramuskulárním, podkožním, transdermálním, intradermálním, orálním, intranasálním, intravaginálním, nebo intrarektálním podáním.

Dávka činidla může být určena podle různých parametrů, jako konkrétní typ činidla; věk, hmotnost a celkový stav léčeného pacienta; způsob podání; a vybraný režim podání. Lékař bude schopen určit způsob aplikace a dávku pro každého konkrétního pacienta. Vhodná dávka může být v rozmezí od 10 g do 10 g, například od 100 g do 1 g činidla.

Vynález je nyní ilustrován v následujících příkladech:

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Detekce korelace mezi koncentrací CD4 T-lymfocytů a množstvím bakterií

Metody

Jedinci

Dospělý pacienti a kontakty se zařazovali prospektivně z Londýna a Oxfordu. Vzorek heparinizované krve se odebral od všech jedinců. Žádný z jedinců neměl příznaky HIV infekce a pacienti, o kterých bylo známo, že mají HIV infekci, byli vyřazeni. Demografické charakteristiky ukazuje tabulka 1.

zdravých kontaktů ze stejné domácnosti (HHC) se zařadilo podle následujících kriterií. Všichni žili v téže domácnosti jako jedinec s neléčenou plicní tuberkulosou s pozitivním nátěrem ze sputa během posledních 6 měsíců, byli asymptomatičtí a měly normální rentgenový snímek hrudníku. Dále, všichni HHC měli silně pozitivní TST (Heaf stupeň 3 nebo 4), který byl proveden standardizovaným tuberkulinovým kožním testem za použití 6 jehlového Heaf přístroje (Bignall 2000, Bignall Surgical Instruments, UK) a koncentrovaného přečištěného proteinového derivátu (PPD) v dávce 100000 tůberkulinových jednotek/ml (Evans Medical, Liverpool, UK) podle UK doporučení pro hodnocení tuberkulosních kontaktů. 23 HHC mělo BCG-vakcinaci a u žádného se nevyvinula tuberkulosa při 12-měsíčním sledování. Žádný z těchto jedinců nedostával chemoprofylaxi v době odběru krve.

zdravých neexponovaných kontrol (UC) bez anamnesy tuberkulosy a bez známého kontaktu s tuberkulosou se sledovalo prospektivně. Nej častěji se jednalo o zaměstnance laboratoře a z nich mělo BCG vakcinaci.

pacientů s kultivačně pozitivní PTB (C+PTB) mělo klinické a rentgenologické nálezy odpovídající tuberkulose a pozitivní kultivace na M. tuberculosis z jednoho nebo více respiračních vzorků. 18/25 (72%) PTB pacientů nemělo buď žádnou terapii, nebo byly v době odběru krve léčeni méně než 4 týdny.

pacientů s kultivačně negativní PTB (C-PTB) mělo klinickou diagnosu stanovenou na základě vysoce suspektního rentgenu plic a pozitivního tuberkullnového kožního testu. Všichni byli asymptomatičtí a neměly dřívější anamnesu tuberkulosy. Všechny respirační vzorky, tj. 3 vzorky sputa (nebo 3 výplachy žaludku za absence produktivního kašle) a bronchoalveolární laváž pro každého pacienta, byly kultivačně negativní na M. tuberculosis. 6/8 (75%) pacientů v této skupině nemělo žádnou terapii nebo mělo méně než 4 týdny terapie.

pacientů s tuberkulozní lymfadenitidou (TBLN) mělo odpovídající klinické nálezy, pozitivní TST a dobrou odpověď na anti-tuberkulozní chemoterapii. 7 z nich mělo biopsii z mízních uzlin, a v 5 případech byly vykultivovány M. tuberculosis. 5/11(45%) TBLN pacientů v této skupině nemělo žádnou terapii nebo mělo méně než 4 týdny terapie v době odběru krve.

pacientů s non-uzlinovou extrapulmonální tuberkulosou (EPTB) se zařadilo podle klinických nálezů a pozitivních kultivací na M. tuberculosis z jednoho nebo více klinických vzorků. 4 pacienti měli tuberkulosní osteomyelitidu, 2 měly muskuloskeletální tuberkulosu (absces v m.psoas), 4 měly pleurální postižení, 3 měly miliární onemocnění, 3 měly břišní onemocnění a 1 měl meningitidu. Malý počet pacientů zabránil statistickému srovnání frekvencí T-lymfocytů mezi podskupinami EPTB.

Peptidy peptidů pokrývajících délku ESAT-6 molekuly se syntetizovalo F-moc reakcemi na pevné fázi (Research Genetics, Alabama, USA). Každý peptid měl délku 15 aminokyselin a překrýval se se sousedním peptidem o 10 zbytků. Identita se potvrdila hmotnostní spektrometrií a čistota vysoce výkonou kapalinovou chromatografií. Prohledávání SwissProt a translatované GeneBank proteinových databází na homologii potvrdilo, že tyto peptidy jsou jedinečně restrihovány na ESAT6 protein komplexu M tuberculosis.

Ex vivo ELISPOT test na uvolňování IFN-γ z jednotlivých buněk: počítání cirkulujících T-lymfocytů specifických pro ESAT-6 peptid z periferní krve

PBMC se separovaly z 20 ml krve za použití standardních prostředků a suspendovaly se v RPMI doplněném 2 mM L-glutaminu, 100 g/ml ampicilinu, 50 g/ml gentamicinu, 1 mM pyruvátu sodného a 10% teplem inaktivovaným fetálním telecím sérem (Sigma, St. Louis, MO, USA) (R10). Jak bylo popsáno dříve (1,2), 96-jamkové PVDF plotny (MAIPS45, Millipore, Bedford, MA, USA), předem potažené 15 g/ml anti-IFN-γ mAb 1-D1K (Mabtech, Stockholm, Sweden), se blokovaly R10 po dobu 2 hodin. 3 x 10⁵ PBMC se přidalo ve 100 1 RlO/jamku a peptidy se přidaly individuálně do jednotlivých jamek v koncentraci 10 g/ml. PPD (šarže RT49, Statens Seruminstitut, Copenhagen, Denmark) se také testoval v koncentraci 20 g/ml. Fytohaemaglutinin (PHA) (ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) se přidal v dávce 5 g/ml pro duplikování pozitivních kontrolních jamek a žádný peptid se nepřidal do negativních kontrolních jamek. Rekombinantní ESAT-6 se přidal do jedné jamky v dávce 10 g/ml pro 35 subjektů.

Po 14 h inkubaci při 37°C, 5% CO₂, se plotny promyly PBS 0

05% Tween-20 (Sigma, St. Louis, MO, USA), Přidalo se 50 1 1 g/ml biotinylované anti-IFN-γ mAh, 7-B6-l-biotin (Mabtech) . Po 2 hodinách se plotny promyly a přidal se konjugát streptavidinalkalická fosfatasa (Mabtech) v konečném ředění 1:1000. Po 1 hodině a dalším promytí se přidalo 50 1 naředěného chromogenního substrátu pro alkalickou fosfatasu (Biorad, Hercules, CA, USA). Po 20 minutách se plotny promyly a nechaly se usušit.

ELISPOT test na uvolňování IL-4 jednotlivými buňkami

Tyto testy se provedly způsobem popsaným výše za použití vysoce afinitních protilátek specifických pro IL-4 (IL-4-I zachycovací protilátka a biotinylovaná IL-4-II detekční protilátka (Mabtech)) a 60 hodinové inkubační doby.

Určení počtu buněk vytvářejících IFN-y skvrny (SFC)

IFN-γ SFC se počítaly za použití zvětšovací optiky a odpovědi se považovaly za pozitivní tehdy, když testované jamky obsahovaly alespoň o 5 IFN- SFC více než negativní kontrolní jamky a tento počet byl alespoň dvojnásobkem počtu v negativních kontrolních jamkách. Tato předem definovaná hranice (5 IFN- SFC na 3xl0⁵ PBMC) se přenáší do prahu detekce 17 specifických T-lymfocytů na milion PBMC, nebo 1/59000 PBMC. Osoba provádějící odečty testů neznala klinický stav různých skupin pacientů s HHC, ale znala UC. Základní počet SFC v negativních kontrolních jamkách byl menší než 5. Po odečtení základních hodnot se počet IFN- SFC specifických pro každý peptid sečetl a tento celkový počet ESAT-6 peptid-specifických SFC pro každého jedince se použil pro srovnání mezi skupinami jedinců a mezi různými časy léčby jednotlivých pacientů.

·*· ···· «ί

Příprava T-lymfocytárních linií specifických pro peptid in vitro

T-lymfocytární linie se připravily způsobem popsaným dříve (2). Stručně, PBMC se suspendovaly v koncentraci 5xl0⁵ buněk/ml v AB mediu (RPMI doplněné L-glutaminem 2 mM, ampicillinem 100 g/ml, gentamicinem 5 g/ml a 10% teplem inaktivovaným kombinovaným lidským AB sérem (National Blood Transfusion Service, Bristol, UK) a 200 1 na jamku se přidalo do 96-jamkové plotny v kulatým dnem. Peptid se přidal v dávce 10 g/ml. 10 U/ml IL-2 ve formě Lymphocult-T (Biotest, Dreiech, Germany) se přidávalo každé tři dny. Po 12 dnech se T-lymfocytární linie imunomagneticky depletovaly a znovu se testovaly stimulujícím peptidem ve dvoujích jamkách v ELISPOT testech na IFN-γ za použití l-5xio⁴ buněk/jamku.

Imunomagnetická deplece buněk

CD4 a CD8 T-lymfocyty se depletovaly z T-lymfocytárních linií 30 minutovou inkubací s anti-CD4 nebo anti-CDS mAb konjugovanými na železnaté korálky v poměru 10 korálků na 1 buňku za použití Dynabeads M-450 (Dynal, Oslo, Norway) v 200 1 R10 na ledu. Po naředění v R10 se buňky potažené konjugátem odstranily pomocí magnetu (Dynal, Oslo, Norway). Tyto Dynabeads spolehlivě odstraní >99% cílové buněčné populace.

Lymfoproliferativní testy využívající inkorporace ³H-thymidinu x 10⁵ PBMC se umístilo do jamky ve 200 1 AB media v 96jamkových plotnách s oblým dnem. Peptidy se přidaly v dávce 10 g/ml, do negativních kontrolních jamek se přidalo pouze medium a do pozitivních kontrolních jamek se přidal PPD v dávce 20 • « ·« « · ·· ··♦ ·«· · ·♦ 4« g/ml. Všechny podmínky byly provedeny třikrát. Po inkubaci při 37°C, 5% CO₂, po dobu 5 dnů se do každé jamky přidal 1 Ci ³Hthymidinu. Po 18 hodinách se obsah jamek odebral a inkorporace ³H-thymidinu se měřila v -kameře (Wallac, UK). Výsledky byly považovány za pozitivní, pokud byl index stimulace 3 nebo více.

Inhibice T-lymfocytární reakce v ELISPOT testech protilátkami proti MHC třídy II

Restrikce odpovědi CD4 T-lymfocytů na dva imunodominantní peptídy ESAT-6^ a ESAT-6₇₁._8S HLA antigeny třídy II byla zkoumána za použití T-lymfocytárních buněčných linií, stejně jako ex vivo PBMC. Myší monoklonální protilátky L243, L2 a B7.21, které blokují prezentaci peptidu CD4 T-lymfocytům cestou HLA-DR, -DQ a -DP, v příslušném pořadí, se přidaly v dávce 10 g/ml ke 3 separátním párům dvou jamek v ELISPOT testech a o 90 minut později se přidal peptid v dávce 10 g/ml. Do kontrolních jamek se přidal pouze peptid nebo se do nich nepřidal ani peptid, ani protilátka.

Statistické metody

Sumované frekvence ESAT-6-peptid-specifických IFN-γ SFC pro reagující jedince se srovnávaly mezi skupinami pacientů za použití neparametrického Mann-Whitneyho testu (2-cestného) a mezi prvním a posledním odběrem vzorku během léčby u jednotlivých pacientů za použití neparametrického Wilcoxon Signed Rank testu (2-cestného). Poměrné snížení frekvence antigen-specifických T-lymfocytů během terapie se vypočetlo za použití Student’s t testu na log transformovaná data.

Příklad 2

Frekvence ESAT-6 specifických T-lymfocytů ♦

·*· ·«·«

Bylo zjištěno, že ESAT-6 peptid-specifické IFN— secernujicich CD4 T-lymfocyty cirkulují ve vysokých hladinách u jedinců infikovaných M tuherculosis a tyto hladiny korelují s klinicky definovanou protektivní imunitou. Takové T-lymfocyty byly detekovány téměř u všech tuberkulosních pacientů a u většiny kontaktů. Odpovědi byly pozorovány u 10/11 TBLN pacientů, 7/8 C-PTB pacientů, 23/25 C+PTB pacientů a 23/27 HHC (Tabulka 1). Je možné, že 4 HHC, kteří neodpověděli na ESAT-6, nebyli infikováni M tuberculosis; jejich pozitivní TST mohly být důsledkem předchozí BCG vakcinace. Naopak, žádný z 32 UC (z nichž 28 bylo BCG-vakcinováno) neodpověděl na ESAT-6 peptidy v ex vivo ELISPOT testu pro IFN-γ (Tabulka 1), což je v souladu s tím, že ESAT-6-specifické odpovědi byly specifické pro M. tuberculosis. Frekvence ESAT-6 peptid-specifických IFN— secernujicich T-lymfocytů pro všechny odpovídající subjekty jsou uvedeny na obr. 1 a shrnuty v tabulce 1. Pro HHC, kteří odpověděli na ESAT-6 (n=23) byly frekvence ESAT-6-specifických T-lymfocytů významně vyšší (p=0,009) než pro odpovídající C+PTB pacienty (n=23) a vyšší (p=0, 044) než pro PTB (C+ a C-) skupinu jako celek (n=30). Obě skupiny ESAT-6-reagujících pacientů s minimální, paucibacilární nemocí, TBLN (n=10) a C-PTB (n=7), měly také významně vyšší frekvence T-lymfocytů specifických pro ESAT-6 peptid než C+PTB pacienti (p=0,002 a p=0,029, v příslušném pořadí).

Také bylo zjištěno, že frekvence cirkulujících ESAT-6specifických IFN-γ secernujicich T-lymfocytů u tuberkulosních pacientů se progresivně snižuje při léčbě. Když je nižší frekvence ESAT-6-specifických IFN-y-secernujicích T-lymfocytů u pacientů s aktivní C+PTB důsledkem nespecifické imunosuprese asociované s onemocněním, tak by se měly frekvence T-lymfocytů při úspěšné léčbě zvyšovat. Proto jsme longitudinálně sledovali • · pacientů (4 C+PTB, 3 TBLN a 5 EPTB) na anti-tůberkulozní chemoterapii a pozorovali jsme snížení celkové frekvence Tlymfocytů specifických pro ESAT-6 peptid (p=0,005) (Obr. 2). Průměrné snížení během průměrné doby sledování 18,6 týdnů bylo snížení o faktor 0,62 (95¾ Cl: 0,37-0,76), to znamená na 38% původních hodnot, a rychlost poklesu byla 5,5% (95% Cl:

2,4-8,4) za týden. Frekvence T-lymfocytů specifických pro každý z peptidů se snižovala paralelně, ale pro srozumitelnost je uvedena pouze souhrnná odpověď na všechny peptidy odvozené od ESAT-6.

Pomocí ex vivo ELISPOT testu byl každý z překrývajících se

16-merových peptidů odvozených od ESAT-6 rozpoznáván IFN-γsecernujícími T-lymfocyty od jednoho nebo více z 88 testovaných tuberkulosních pacientů a kontaktů (obr. 3). V této populaci jsou rozpoznávány zejména peptidy

ESAT-6^, ESAT-6^ a ESAT-6₇₁._e5, a to 59%, 45% a 37% jedinců, v příslušném pořadí.

T-lymfocytárních linií se připravilo od několika pacientů a HHC proti 15 peptidům odvozeným od ESAT-6. Po 12 denní kultivaci s doplňováním IL-12 se provedly ELSPOT testy před a po imunomagnetické depleci CD4 nebo CD8 T-lymfocytů. Pro 55/59 T-lymfocytárních linií byly peptidově-specifické reakce vyrušeny CD4 depleci (tabulka 2); 4 T-lymfocytární linie specifické pro konkrétní peptidy byly CD8 pozitivní (2, 3).

Reakce v ex vivo ELISPOT testu na IFN-γ ukazuje na Tlymfocyty zprostředkovanou sekreci IFN-γ během 14 hodin po expozici peptidů. Pro stanovení toho, jak rychle mohou tyto Tlymfocyty uvolňovat IFN- po setkání s antigenem jsme provedly 6 hodinové ex vivo ELISPOT testy u 3 jedinců (2 HHC a 1 C-PTB) s 11 peptidy. V každém případě byly IFN- SFC snadno detekovány v ··* ··«·

6. hodině pro všechny peptidy, které měly odpověď ve 14.

hodině. Frekvence peptidově-specifických IFN-y-secernujících Tlymfocytů stanovená v 6 hodině byla 80-90% ve srovnání s frekvencí ve 14 hodině (data nejsou uvedena), což ukazuje že Tlymfocyty specifické pro ESAT-6 peptid jsou schopné rychlé efektorové funkce (1).

Za použití PBMC od 15 jedinců se provedly iymfoproliferativní testy paralelní k ex vivo IFN-γ ELISPOT testům, za použití 16 různých peptidu. Překvapivě jsme nedetekovali proliferaci na peptidy ESAT-a ESAT-6₇₁_₈₅ u několika jedinců s IFN—secernujícími T-lymfocyty specifickými pro tyto peptidy v ex vivo ELISPOT (Tabulka 2). 12 jedinců odpovídalo na ESAT-6^ v ex vivo ELISPOT (průměrné peptidspecifické IFN-γ SFC pro reagující jedince: 77/10⁶ PBMC [IQ rozsah: 38-100]) oproti 3 jedincům, kteří reagovali v testu lymfoproliferace. Pro ESAT-6₇₁_₈₅10 jedinců reagovalo v ex vivo

ELISPOT (průměrné peptid-specifické IFN-γ SFC pro reagující jedince: 121/10⁶ PBMC [IQ rozsah: 65-171]) oproti 5 jedincům, kteří reagovali v testu lymfoproliferace. Nicméně,

Iymfoproliferativní reakce na pozitivní kontrolu, PPD, byly silné: průměrný stimulační index: 82 (IQ rozsah: 35-98). Nicméně, peptidově-specifické T-lymfocytární linie se snadno připravily peptidovou stimulací in vitro s doplňováním IL-2; proto tyto T-lymfocyty specifické pro ESAT-6 peptid, ačkoliv vykazují rychlé efektorové funkce po kntaktu s antigenem, nemohou proliferovat in vitro za nepřítomnosti exogenního IL-2. Pro několik dalších peptidů byly však tyto dva testy v souladu (tabulka 2).

< ..

Příklad 3

HLA restrikce ΕΒΑΤ-β^ΕΞΑΤ-β·,^

Pokusili jsme se určit MHC restrikci dvou peptidů, které byly imunodominantní v ex vivo ELISPOT testu, ale které dávaly odlišné výsledky v testech lymfoproliferace. Použili jsme monoklonální protilátky pro blokování prezentace peptidu Tlymfocytárním liniím a ex vivo PBMC v ELISPOT testech. Pro

ESAT- 6^5 byly u všech 3 testovaných jedinců IFN-γ SFC významně sníženy anti-HLA-DQ protilátkou, ale ne protilátkou k HLA-DR nebo -DP (Obr. 4A-C) . Pro ESAT-6₇₁__a5 byly testováni 2 jedinci a v obou případech byla odpověď blokována pouze anti-HLA-DQ protilátkou (Obr, 4 D, E). Naopak bylo prokázáno, že reakce v ex vivo ELISPOT na jiné testované peptidy (ΕΞΑΤ-β^ο, ESAT-6₅₁_ _ffi, ESAT-6_e6_₈₀ a ESAT-6₇₆__W) jsou HLA-DR-restrihované (data nejsou uvedena).

Příklad 4

Další charakterizace T-lymfocytů specifických pro ESAT-6

TJ 35 jedinců (28 pacientů a 7 HHC) se rESAT-6 antigen testoval v ex vivo ELISPOT testech paralelně s ESAT-6 peptidy a 30/35 (86%) reagovalo na rESAT-6 (obr. 3). 5 jedinců, kteří neodpovídali na protein, byli jedinci, kteří neodpovídali na ani jeden ze 17 peptidů. Tak ze 30 pacientů, kteří odpovídali na jeden nebo více peptidů, všichni odpovídali na rESAT-6 antigen, což ukazuje, že rESAT-6 je zpracováván a prezentován T- lymfocytům v ex vivo ELISPOT testu.

Čerstvě izolované PBMC od 10 tuberkulosních pacientů (5 C+

PTB a 5 EPTB) a 8 HHC se testovaly ex vivo proti všem 17 peptidům odvozeným od ESAT-6 v ELISPOT testu na IL-4 paralelně s ELISPOT testem na IFN-γ. Počet SFC se sečetl pro každý * · * * · • ·· ··· peptid. Z tuberkulosních pacientů mělo 10/10 ESAT-6 peptid-specifické IFN-γ-secernujicí T-lymfocyty (průměr: 668

IFN-γ SFC/milion PBMC), zatímco 0/10 měl ESAT-6 peptid-specifické IL-4-secernující T- lymfocyty. Pro HHC 6/8 reagovalo v IFN-γ ELISPOT testu (průměrná frekvence u reagujících jedinců: 414 ESAT-6 peptid-specifických IFN-γ SFC/milion PBMC), oproti 2/8 reagujících jedinců v IL-4 ELISPOT testu (průměrná frekvence u reagujících jedinců: 93 ESAT-6 peptid-specifických IFN-γ SFC/milion PBMC). Pozitivní kontroly pro IFN- a IL-4 ELISPOT testy se stimulací PHA byly také více než 500 IFN-γ nebo IL-4 SFC na 10⁶ PBMC, v příslušném pořadí.

Diskuse

Přímou ex vivo analýzou jsme identifikovali populaci antigen-specifických IFN-γ-secernujících CD4 T-lymfocytů, které cirkulují v krvi téměř všech jedinců infikovaných M tuberculosis, ale které jsou nepřítomné u neinfikovaných, BCGvakcinovaných kontrol. Přítomnost vysoké frekvence cirkulujících IFN-y-secernujících ESAT-6-specifických CD4 Tlymfocytů u PPD-pozitivních nedávno exponovaných HHC, kteří byli klinicky i rentgenologicky bez onemocnění, ukazuje, že tyto T-lymfocyty nejsou nutně asociovány s tkáňovou patologií jako takovou. Spíše je jejich přítomnost u těchto jedinců v souladu s jejich úlohou v kontrole M. tuberculosis in vivo.

Tato hypotéza je podporována pozorováním, že ESAT-6-specifické CD4 T-lymfocyty cirkulují ve vyšších frekvencích u HHC než u C+ PTB pacientů (obr. 1). V podskupinách tuberkulosních pacientů je frekvence těchto T-lymfocytů vyšší v těch skupinách, u kterých dochází k relativně úspěšnější kontrole M tuberculosis in vivo.

• 9 ·· ·· • ·*»· ·· 9·

Tak mají TBLN pacienti (s vysoce lokalizovaným onemocněním, minimálními příznaky a častějším spontánním vyhojením) a C-PTB pacienti (bez příznaků a bez důkazu probíhající bakteriální replikace ve více klinických vzorcích) vyšší frekvence ESAT-6- specifických CD4 T-lymfocytů než C+PTB pacienti s M.tuberculosis aktivně rostoucím v respiračních sekretech (Tabulka 1 a Obr. 1). Proto se zdá, že celková frekvence ESAT-6- specifických IFN—secernujících CD4 T-lymfocytů koreluje s klinicky definovanou protektivní imunitou.

Nicméně, aktivní tuberkulosa způsobuje špatně definovanou nespecifickou imunosupresi. Proto je možné, že imunitní reakce, které jsou slabší u pacientů s pokročilejším onemocněním než u pacientů s minimálním onemocněním, jsou pouze sekundárně suprimované v důsledku aktivní tuberkulosy jako takové. Pokud je tomu tak, tak by se měly imunitní reakce při léčbě zlepšovat a během anti-tuberkulosní terapie by se měly zvyšovat antigenspecifická nebo PPD-specifická sekrece IFN-γ v kulturách PBMC a lymfoproliferativní reakce. Proto dříve identifikovaná asociace silnější T-lymfocytární reakce u minimálního onemocnění nekoreluje s protektivní imunitou z důvodu slabších reakcí u pacientů s rozsáhlejším onemocněním, ke kterým dochází během léčby. Proto není pomocí těchto běžných testů možné identifikovat koreláty klinicky definované protektivní imunity. Nicméně, dlouhodobé sledování tuberkulosních pacientů pomocí ex vivo ELISPOT testu ukázalo, že frekvence ESAT-6 specifických IFN- secernujících CD4 T-lymfocytů skutečně při léčbě klesá (p=0, 005) (obr. 2). Toto naznačuje, že nižší frekvence ESAT-6specifických T-lymfocytů u pacientů s rozsáhlejším onemocněním není sekundárním efektem imunosuprese související s onemocněním, ani sekvestrace T-lymfocytů specifických pro M.

tuberculosis do míst aktivního onemocnění. Místo toho snížení

ESAT-6- specifických T-lymfocytů během terapie, která snižuje ·* ·· ··* «··· ·· ·· obsah bakterii o několik řádů, naznačuje, že u daného jedince souvisí frekvence ESAT-6-specifických T-lymfocytů s obsahem antigenu. Toto pozorování bylo možné díky testu, který přímo kvantifikuje antigen-specifické T-lymfocyty bez nutnosti proliferace in vitro. Náš objev je analogický s poklesem CD4 a CD8 T-lymfocytů specifických pro virus, které jsou počítány přímo z periferní krve, u pacientů infikovaných HIV během terapie a, obecně se - pro intracelulární patogeny - frekvence antigen-specifických T- lymfocytů, když jsou přímo kvantifikovány ex vivo, zdá být řízena obsahem antigenu.

Ačkoliv u tuberkulosy neexistuje kvantitativní absolutní měření obsahu bakterií nebo antigenu, musí tento údaj přímo a těsně souviset s onemocněním. Obsah antigenu je téměř vždy mnohem nižší u HHC než u pacientů a mezi pacienty by měl být nižší u TBLN pacientů a C-PTB pacientů než u C+PTB pacientů. Za předpokladu, že obsah antigenu určuje frekvenci ESAT-6specifických CD4 T-lymfocytů je zaznamenání hodné, že jedinci infikovaní M.tuberculosis s menším obsahem antigenu mají vyšší hladiny ESAT-6-specifických CD4 T-lymfocytů. Tato inverzní korelace je podobná korelaci pozorované pro hladiny virusspecifických CD8 T-lymfocytů a obsah viru v plasmě u pacientů infikovaných HIV, a jde o zjištění, které významně podporuje protektivní roli CD8 T-lymfocytů v kontrole HIV a možnosti jeho využití závisí zejména na prostředku pro kvantifikaci antigenspecifických T-lymfocytů ex vivo přímo z periferní krve. Různé frekvence ESAT-6-specifických T-lymfocytů v závislosti na různém obsahu bakterií v různých skupinách jedinců infikovaných M. tuberculosis dále podporují naší hypotézu, že tyto Tlymfocyty kontrolují infekci M. tuberculosis in vivo. Všechny skupiny pacientů měli podobné podíly jedinců, u kterých proběhla terapie, s výjimkou HHC, kde žádný nedostával chemoprofylaxi. Kromě toho, efekt léčby na frekvenci ΕΞΑΤ-6 peptid-specifických T-lymfocytů se zdál být podobný pro všechny sledované skupiny pacientů (obr. 2). Proto není pravděpodobné, • « *·» ··· ·· ·4 že by rozdíly ve frekvenci ESAT-6-specifických CD4 T-lymfocytů mezi 3 skupinami pacientů byly způsobeny odlišnostmi v trvání léčby, ačkoliv toto nelze aplikovat ma HHC.

Naší interpretací těchto zjištění je, že v době prvotní infekce M. tuberculosis se u HHC vyvine silná reakce CD4 Tlymfocytů typu Thl na M. tuberculosis a zejména na ESAT-6, což omezí replikaci bakterií. Jedinci, u kterých se rozvine aktivní onemocnění, mají oproti tomu slabou reakci CD4 T-lymfocytů a bakterie mohou dosáhnout vyššího počtu, což vede ke vzniku onemocnění. U HHC se tedy udržuje vysoká frekvence ESAT-6specifických CD4 T-lymfocytů díky limitované antigenní stimulace nízkým obsahem bakterií, zatímco u C+PTB pacientů stimuluje vyšší obsah bakterií slabší, méně účinnou proliferaci antigen-specifických CD4 T-lymfocytů in vivo. Tento model je analogický s modelem navrženým pro některé chronické virové infekce, u kterých se předpokládá, že CD8 T-lymfocyty specifické pro virus zprostředkují protektivní imunitu. Rozdíly mezi HHC a PTB pacienty mohou spočívat v individuální reaktivitě T-lymfocytů, která byla dříve definována jako rychlost, kterou T-lymfocyty specifické pro patogen proliferují in vivo po setkání s infikovanou buňkou. Místo toho bylo nedávno časné objevení a účinná proliferace CD4 T-lymfocytů secernujících IFN-γ in vivo identifikována jako zásadní faktor v časné kontrole mykobakteriální infekce v myších modelech. ESAT- 6 obsahuje mnoho CD4 T-lymfocytárních epitopů. Obr. 3 ukazuje, že několik peptidů odvozených od ESAT-6 je rozpoznáváno T- lymfocyty od etnicky a geneticky odlišných pacientů a HHC, což naznačuje, že tyto peptidy mohou být volně restrihovány různými HLA haplotypy třídy II. Hierarchie imunodominance podle ex vivo ELISPOT testu (obr. 3) je dosti odlišná od hierarchie popisované jinými výzkumníky za použití konvenčnějších testů spočívajících v proliferaci in vitro. Konkrétně, výrazná imunodominance peptidů ESAT-6_>1:, a ESAT-6₇₁_₈₅ • rf ··· ···· *· nebyla dříve pozorována v uvedeném rozsahu a může odrážet skutečnost, že ex vivo ELISPOT test může detekovat T-lymfocyty, které ztratily proliferační potenciál in vitro. Proto jsme testovali tyto a jiné peptidy odvozené od ESAT-6 na jejich schopnost stimulovat T-lymfocyty v lymfoproliferačních testech. Ačkoliv pro většinu peptidů byla shoda mezi reakcí T-lymfocytů v těchto testech a v ex vivo ELISPOT, pro peptidy ESAT-6^ a ESAT-6₇₁._g5 byla patrná značná diskrepance (tabulka 2) . Narušená schopnost ESAT- 6^ specifických a ESAT-6₇₁._B5 specifických T-lymfocytů proliferovat in vitro pravděpodobně vysvětluje to, proč nebyla imunodominance těchto peptidů dosud plně určena. Zajímavé však je to, že tyto T-lymfocyty proliferují in vitro, pokud jsou stimulovány současně IL-2 a peptidem.

Protože jsou peptidy ESAT-6^ a ESAT-6₇₁_₈₅ rozpoznávány ex vivo T-lymfocyty od velmi vysokého podílu pacientů infikovaných M. tuberculosis, byla jejich HLA restrikce předmětem značného zájmu. Imunodominantní, permisivně restrihované CD4 epitopy jsou obvykle HLA-DR-restrihované a tak je tomu i v případě tuberkulosy. Překvapivě bylo dokázáno, že peptidy ΕδΑΤ-β^υa ESAT-6₇₁_₀₅ jsou HLA-DQ restrihované, a toto bylo zjištěno v ELISPOT testech (obr. 4). Jedná se, podle našich znalostí, o první imunodominantní HLA-DQ-restrihované mykobakteriální epitopy, které byly identifikovány.

Vzhledem k tomu, že většina jedinců infikovaných

M.tuberculosis má vysoké hladiny ESAT-6-specifických IFN-γsecernujících CD4 T-lymfocytů, jsme se ptali, zda jsou ESAT-6specifické CD4 T-lymfocyty Th2 typu indukovány také ve stejném rozsahu. Ex vivo ELISPOT testy na IL-4 v podskupině pacientů a HHC ukázaly, že oproti téměř universální přítomnosti ESAT-6specifických IFN—secernujících T-lymfocytů u pacientů infikovaných M. tuberculosis jsou IL-4-secernující T-lymfocyty specifické pro ESAT-6 vzácné. ESAT-6-specifické CD4 T-lymfocyty ······ indukované přirozenou infekcí M tuberculosis tak mají vysoce polarizovaný Thl charakter sekrece cytokinů.

Identifikovali jsme populaci cirkulujících IFN-y-secernujících CD4 T-lymfocytů specifických pro antigen M. tuberculosis, které cirkulují ve vysokých hladinách u asymptomatických jedinců s latentní infekcí M tuberculosis, stejně jako u tuberkulosních pacientů. Náš přímý kvantitativní ex vivo postup vedl k některým klíčovým zjištěním, která nebyla určena pomocí dřívějších testů. Oproti jiným buněčným imunitním reakcím při tuberkulose se frekvence ESAT-6-specifických CD4 T-lymfocytů progresivně snižuje při léčbě, což naznačuje, že hladiny těchto T-lymfocytů jsou určovány, alespoň částečně, obsahem antigenů. Proto se předpokládá, že u pacientů s rozsáhlejším onemocněním a vyšším obsahem bakterií bude nejvyšší koncentrace antigenspecifických T-lymfocytů. Pozorovali jsme však opak: ve skupinách tuberkulosních pacientů se zdá, že koncentrace těchto T-lymfocytů koreluje s klinicky definovanou protektivní imunitou; to znamená, že inverzně koreluje s předpokládaným obsahem bakterií. Tato zjištění jsou v souladu s úlohou antigen- specifických CD4 T-lymfocytů Thl-typu v této populaci v kontrole M. tuberculosis in vivo. Tyto výsledky, společně se skutečnosti, že ESAT-6 obsahují více CD8 T-lymfocytárních epitopů, naznačují, že tento antigen může být cílem protektivní imunitní reakce u lidí infikovaných M. tuberculosis; jejich nepřítomnost při M bovis BGG může být příčinou, alespoň částečně, omezené účinnosti BCG vakcinace.

Příklad 5:

Detekce CD4 T-lymfocytů u jedinců s latentní infekcí

Metody • · · 9 • 9 ··· ····

Studovaná populace:

Všichni jedinci byli zařazeni prospektivně a byly z Mumbai a Oxford. Vzorek heparinizované krve se odebral po získání informovaného souhlasu.

Do pokusu se zařadilo 50 pacientů s klinickými a rentgenologickými příznaky tuberkulosy a s pozitivními kultivacemi na M. tuberculosis z jednoho nebo více klinických vzorků. 45 pacientů mělo plicní tuberkulosu, 4 měli tuberkulozní lymfadenitidu a 1 měl tuberkulozní pleuritidu. 6 pacientů (5 s plicní a jeden s pleurální tuberkulosou) byli pozitivní na HIV protilátku. Žádný z těchto 44 pacientů neměl klinické příznaky ukazující na HIV infekci. Průměrný věk pacientů byl 33 let (rozsah: 14 - 69) a poměr muži:ženy byl 33:17. Pacienti byli etnicky odlišní a skupina zahrnovala Maharashtrany (n=23), Gujaratis (n=6), Muslimy (n=6), Jižní Indy (n=4), Punjabis (n=3), UttarPradeshany (n=2) a Sindhy (n=l) . 35 pacientů (70%) mělo méně než 1 měsíc terapie nebo byly neléčeni do doby odběru krve pro ELISPOT testy; zbývajících 15 pacientů bylo na konci terapie (< 1 rok).

108 zdravých obyvatel Mumbaie se prospektivně sledovalo na klinice; všichni byli vedoucími pracovníky vyšetřovanými kvůli zdravotnímu pojištění a neměli příznaky. 7 jedinců mělo předchozí anamnesu tuberkulosy a jeden pocházel ze Zambie; těchto 8 jedinců bylo vyloučeno. Zbývajících 100 jedinců mělo normální rentgenový snímek hrudníku a žádný neměl příznaky HJIV infekce. Poměr muži/ženy byl 73:22 a průměrný věk byl 47 let (rozsah: 13 -70). Pracovníci byli etnicky odlišní a skupina zahrnovala Gujaratisany (n=36), Maharashtrany (n=22), Jižní Indy (n=14), Sindhisany (n=7), Parsis (n=6), Punjabisany (n=6), Marwarisany (n=4), Muslimy (n=3) a Bengálce (n=2) .

zdravých obyvatel UK se sledovalo v Oxfordu. Žádný z » * ··· ··«· • · · ·· ·· nich nežil v oblasti endemické pro tuberkulosu po dobu delší než jeden měsíc a žádný neměl anamnesu tuberkulosy ani kontakt s tuberkulosou. Všichni náleželi etnicky k bílé kavkazské rase a poměr muži:ženy byl 21:19 a průměrný věk byl 32 let (rozsah: 23-49). 33/40 (82%) mělo jizvu po BCG nebo anamnesu BCG vakcinace.

bakteriologicky potvrzených tuberkulosních pacientů se sledovalo v UK a ESAT-6 peptid-specifické IFN-y-secernujicí Tlymfocyty se hodnotily v různou dobu během anti-tuberkulozni chemoterapie. 3 z těchto pacientů měly plicni tuberkulosu, 1 měl pleurální onemocněni (DD1) a 1 měl tuberkulozní lymfadenitidu (DD8).

Peptidy odvozené od ESAT-6 a CFP10

Získalo se 17 peptidů pokrývajících délku ESAT-6 molekuly a 18 peptidů pokrývajících délku CFP10 molekuly a jejich identita se testovala způsobem popsaným pro peptidy příkladu 1. Každý peptid měl délku 15 aminokyselin a překrýval se se sousedním peptidem o 10 zbytků. Prohledávání SwissProt a translatované GeneBank proteinových databází na homologii potvrdilo, že tyto peptidy jsou jedinečně restrihovány na ESAT6 a CFP-10 proteiny komplexu M tuberculosis.Odpověď na jeden neo více z těchto 35 peptidů byla považována za ukazatel infekce M.tuberculosis.

Ex vivo enzymový 'immunospoť (ELISPOT) test na uvolňování

IFN-γ z jednotlivých buněk: hodnocení cirkulujících T-lymfocytů specifických pro ESAT-6 peptid z periferní krve

PBMC se separovaly z 15 ml krve za použití standardních prostředků a suspendovaly se v RPMI doplněném L-glutaminem 2 • · φ ·· ·* ·· ·· ··· »··· mM, penicilinem 100 u/ml a 10% teplem inaktivovaným fetálním telecím sérem {Sigma, St. Louis, MO, USA) (R10). ELISPOT test se provedl způsobem popsaným v příkladu 1.

2,5xlO⁵PBMC {3xl0⁵ pro UK jedince) se přidalo ve 100 1 R10/jamku a každý z 35 peptidů odvozených od ESAT-6 a CFP10 se přidal jednotlivě do jednotlivých jamek v dávce 10 g/ml. PPD (Šarže RT49, Staatens Seruminstitut, Copenhagen, Denmark) se také testoval v dávce 20 mg/ml ve dvojích jamkách.

Fytohemaglutinin (ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) v dávce 5 g/ml se přidal do dvojích pozitivních kontrolních žádný peptíd se nepřidal do dvojích negativních kontrolních jamek; úplný rekombinantní ESAT-6 se přidal v dávce 10 g/ml pro 11 pacientů s tuberkulosou a pro všechny zdravé dospělé.

Inkubace a další promytí se provedly stejně jako v příkladu 1. Reakce se považovaly za pozitivní, když testované jamky obsahovaly alespoň o 5 IFN-γ SCF více než negativní kontrolní jamky a když byl tento počet alespoň dvojnásobkem hodnoty v negativních kontrolních jamkách. Osoby provádějící test znaly stav pacientů z hlediska tuberkulosy, ale odečet SFC je kvantitativní, kriteria pro pozitivní reakci byla přísná a předem definovaná a SFC v negativních kontrolních jamkách byly nižší než 15, takže pozitivní reakce byly jasně dané. Pozitivní a negativní reakce byly rozpoznatelné ihned při přímém prohlížení plotny, před přesným spočítáním za použití zvětšovacího skla. ELISPOT testovací jamky, ve kterých počet IFN- SFC přesáhl 250, nemohly být přesně spočítány v důsledku splývání skvrn. 250 SFC na jamku (což je ekvivalentní 1000 SFC na milion PBMC) se proto stanovilo jako horní limit přesné kvantifikace. Celkový počet ESAT-6- a CFP 10-specifických Tlymfocytů u daného jedince se vypočetl sečtením všech IFN-γ SFC specifických pro každý peptíd odvozený od ESAT-6- nebo CFP 10 • · · · ·· ·· ·*· »·*« (po odečtení základního počtu SFC v negativních kontrolních jamkách), v příslušném pořadí.

Testování na HIV protilátky

HIV protilátky se detekovaly za použití rychlého testu s rekombinantním proteinem (Immunocomh II, Orgenics Ltd, Israel) a potom 2 různými mikrotitračními ELISA testy se syntetickými peptidy z různých antigenů (Laboratory Systems, Finland and Innogenetics, Innogenetics N. V, Belgium).

Tuberkulinový kožní test

TU PPD (1:10000) (Spán Diagnostics, India) se injikovala intradermálně na flexorové straně předloktí za vzniku bílého pupenu. Kožní indurace se měřila pravítkem za 72 hodin a indurace >10 mm se považovala za pozitivní.

Příklad 6

Výsledky

Značný podíl tuberkulosních pacientů z Indie měl cirkulujících ESAT-6 peptid-specifické IFN-yy-secernujících Tlymfocyty a ex vivo ELISPOT na bázi ESAT-6 také detekoval tuberkulosní pacienty s HIV infekcí. Obr. 5 ukazuje, že 40/50 bakteriologicky potvrzených případů tuberkulosy reagovalo na ex vivo ELISPOT test na bází ESAT-6. Všech 6 tuberkulosních pacientů se současnou infekcí HIV reagovalo v tomto testu. Medián ESAT-6 peptid specifických T-lymfocytů u 40 reagujících pacientů byl 128 (interkvartilní rozsah: 73-208) na milion PBMC. Mnoho pacientů reagovalo na více peptidu. Pozitivní reakce byla jasně definované ve srovnání s negativními ·· ·· ··· ·<*· kontrolními jamkami a z celkem 40 pozitivních reakcí měly pouze 2 tuberkulosnich pacienti hraničně pozitivní reakce (20 peptid-specifických T-lymfocytů na milion PBMC). Z 11 pacientů testovaných proti celému rekombinantnímu ESAT-6, včetně 4 pacientů se současnou infekcí HIV, reagovali všichni na rekombinantní antigen, stejně jako na jeden nebo více peptidů odvozených od ESAT-6. 6 tuberkulosnich pacientů (včetně 3 s HIV infekcí) mělo TST: všech 6 bylo negativních podle Mantouxe, ale pozitivních v ex vivo ELISPOT testu na bázi ESAT-6.

Vysoké frekvence T-lymfocytů specifických pro RDI kódovaný antigen secernujícich IFN-γ u 80% zdravých Indů

100 zdravých dospělých s normálním rentgenovým snímkem hrudníku a bez anamnesy tuberkulosy se testovalo ex vivo

ELISPOT testem pro IFN-γ na bázi ESAT-6 a CFP10 peptidu. 56 mělo detekovatelné T-lymfocyty specifické pro ESAT-6 peptid a 76 mělo T-lymfocyty specifické pro CFA10 peptid v periferní krvi (Obr. 6A). Celkem 20% reagovalo na buď ESAT-6, nebo CFP10 (tabulka 1). Pro reagující jedince byl medián frekvence ESAT-6 peptid-specifických T-lymfocytů 36 (interkvartilní rozsah: 43 156) na milion PBMC a medián frekvence T-lymfocytů specifických pro CFA10 peptid byl 158 (interkvartilní rozsah: 84 - 261) na milion PBMC. Tyto frekvence antigen-specifických T-lymfocytů jsou stejně vysoké (v případě ESAT-6) nebo i vyšší (v případě CFP10) než frekvence PPD-specifických IFN—secernujícich Tlymfocytů u 98 jedinců, kteří reagovali na PPD: medián 86 (interkvartilní rozsah: 56 - 222) na milion PBMC. Frekvence CFP10 peptid-specifických T-lymfocytů byly zvláště vysoké a 9 jedinců mělo více než 1000 CFPlO-specifických IFN— secernujícich T-lymfocytů na milion PBMC. Kombinovaná frekvence

IFN—secernujícich T-lymfocytů specifických pro peptidy odvozené od ESAT-6 a CFP 10 u 80 jedinců, kteří reagovali na • « ··· ···· ·· ·· jeden z těchto dvou antigenů (medián 208 na milion PBMC [interkvartilní rozsah: 116-357]) je vyšší než frekvence IFN— secernujících PPD-specifických T-lymfocytů. Tak jsou u zdravých obyvatel endemických oblastí pro tuberkulosu tyto dva antigeny samotné účinnějšími cíly pro IFN- secernující T-lymfocytů ex vivo než PPD, který obsahuje více než 200 antigenů.

Z 56 zdravých jedinců, kteří reagovaly na peptidy odvozené od ESAT-6, většina (n=47) reagovala také na celý rekombinantní antigen, což naznačuje, že při exogenním přidání rekombinantního antigenů k PBMC v ELISPOT testech dochází ke zpracování a prezentaci takového antigenů. Toto je v souladu s našimi dřívějšími pozorováními a podporuje to skutečnost, že reakce specifické pro peptid nejsou artificiální. Již dříve jsme pozorovali, že jedinci infikovaní M. tuberculosis, kteří reagují na peptidy odvozené od ESAT-6, ale ne na celý antigen v ex vivo ELISPOT testu, mají ESAT-6-specifické CD8 T-lymfocyty; chybění rozpoznávání celého antigenů je způsobeno tím, že exogenně přidaný ESAT-6 nebyl zpracován cestou MHC I zpracování antigenů, zatímco virus vakcinie rekombinantní pro ESAT6 bude prezentován CDS T-lymfocytům. Tak byla u 9 jedinců, u kterých nebyly reakce specifické pro peptid doprovázeny reakcí na exogenně přidaný antigen, reakce T-lymfocytů na ESAT-6 pravděpodobně zprostředkovaná CD-8.

Absence ESAT-6 a CFPlO-specifických T-lymfocytů u zdravých obyvatel neendemických oblastí zdravých dospělých obyvatel UK bez předchozí anamnesy tuberkulosy se testovalo prospektivně ex vivo ELISPOT testem pro IFN- na bázi ESAT-6 a CFP10 peptidu. Žádný z jedinců neudával jakýkoliv kontakt s tuberkulosou. Obr. 6B ukazuje, že žádný jedinec nereagoval na žádný CFP10 nebo ESAT-6 peptid. Naopak, 33/40 jedinců reagovalo na PPD v ex vivo ELISPOT testu ··· ««· » · ·· ·· pro IFN-γ s mediánem frekvence 83 (interkvartilní rozsah: 53 215) PPD-specifických T-lymfocytů na milion PBMC, což byl velmi podobný výsledek jako frekvence PPD-specifických T-lymfocytů u zdravých dospělých Indů. Vysoká prevalence PPD-specifických reakcí u neexponovaných obyvatel UK pravděpodobně odráží skutečnost, že 33/40 jedinců bylo vakcinováno BCG.

Epitopové mapování ESAT-6 a CFP10 tuberkulosních pacientů z Indie a u zdravých dospělých

Mnoho pacientů a zdravých dospělých v Indii reagovalo na více peptidů a - jak je uvedeno na obr. 7A a 7B, ESAT-6 obsahuje více T-lymfocytárních epitopů, které jsou koncentrovány na amino a karboxy koncích molekuly. Tyto vysoce imunogenní peptidy jsou většinou CD4 T-lymfocytární epitopy, protože T-lymfocytární linie byly generovány in vitro proti peptidům ESAT-6_X_₁₅, ESAT-e^o, ESAT-6₁₆_₃₀, ESAT-6₂₁_₃₅, ESAT- 6₃₁__4£, ESAT-6₄₆__ffi, ESAT— 651-65, ESAT-6_£Ě__7O, ESAT—6₆₆._ao, ESAT—6₇₁__8£, ESAT—6₇₆_₉₀ a ESAT-6₈₁._9£, a v každém případě byly reakce specifické pro peptid vyrušeny imunomagnetickou deplecí CD4 T-lymfocytů (data nejsou uvedena). Dříve jsme identifikovaly 8-merové a 9-merové CD8 epitopy restrihované HLA třídou I v peptidech 4 a 14, ale protože jsou přísně restrihovány HLA-A6802 a HLA-1B52, v příslušném pořadí, reagovala pouze malá část infikovaných lidí. Oproti těmto CD8 epitopům bylo mnoho CD4 epitopů rozpoznáváno v této studii T- lymfocyty od relativně velkého procenta 150 etnicky odlišných Indů. Pro několik z těchto peptidů (ESAT-6^, ESAT-6^₀, ESAT-6₅₁_65 a ΕΞΑΤ-6₇₁_₉₅), jsme drive použili anti-HLA-DR, -DQ a -DP monoklonální protilátky pro blokování prezentace CD4 T- lymfocytům v ELISPOT testech. U všech tuberkulosních pacientů a kontaktů, u kterých bylo toto testováno (n=14), byly reakce restrihované MHC třídou II. Charakter ESAT6 epitopů, na které tuberkulosní pacienti reagovali, je podobný charakteru pro zdravé jedince (obr. 7A a 7B).

··· ·«·*

Analýza T-lymfocytární reakce na 18 překrývajících se CFP10 peptidů u stovky obyvatel Mumbaie vytvořila první epitopovou mapu CFP10 (obr. 7C). Tato mapa ukázala dvě silně imunodominantní domény, CFP₅₁._{10 a} CFP·,^; téměř 50% zdravých Indů reagovalo na peptidy z těchto dvou regionů. 15-20% Indů reagovalo na CFP_ie_₃₀ a CFP₄₁_go, což identifikuje tyto peptidy jako další imunogenní regiony.

Progresivní snižování frekvence ESAT-6 peptid-specifických IFN-y- secernujících T-lymfocytů během anti-tuberkulosní léčby

Obr, 8 ukazuje progresivní pokles frekvence ESAT-6 peptidspecifických IFN-y-secernujících T-lymfocytů během antituberkulosní léčby u série pacientů s kultivačně potvrzenou tuberkulosou, kteří byli longitudinálně sledováni v UK (n=5). Všichni pacienti měli na léky sensitivní izoláty M. tuberculosis a dobře reagovali na terapii.

Diskuse

Identifikovali jsme ESAT-6-specifické IFN-y-secernující Tlymfocyty jako přesný markér infekce M tuberculosis u pacientů s bakteriologicky potvrzeným onemocněním a u latentně infikovaných TST pozitivních zdravých kontaktů ze stejné domácnosti, jako byli případy tuberkulosy s pozitivním nátěrem. CFP10 má stejnou specificitu jako ESAT-6 a tak není přítomen u žádného kmene M. bovis BCG a u většiny mykobakterií v prostředí. Zde jsme prokázali, že 80% našich vzorku od zdravých dospělých Indů obsahovalo cirkulujících IFN— secernující Tlymfocyty specifické pro alespoň jeden z těchto dvou antigenů kódovaných RDI, ESAT-6- a CFP10. Toto naznačuje, že alespoň 80% obyvatel Mumbaie se setkalo nebo bylo infikováno M.

I ί ί · ·· ·· ι

tuberculosis. Přísná absence ESAT-6 a CFPlO-specifických Tlymfocytů u všech neexponovaných obyvatel UK podporuje tento závěr a skutečnost, že 33/40 těchto jedinců bylo vakcinováno BCG dále ukazuje, že tento způsob je vysoce specifický a není falešně ovlivněn BCG-vakcinací. Vzhledem k tomu, že všichni obyvatelé Mumbaie byly asymptomatičtí a měli normální rentgenový snímek hrudníku naznačuje, že u těchto jedinců je infekce latentní a nikoliv aktivní.

Může být vysoká prevalence ESAT-6- a CFPlO-specifických Tlymfocytů v této populaci důsledkem expozice zkříženě reaktivním antigenům nepříbuzným M. tuberculosis, které jsou přítomné v Indii, ale které jsou nepřítomné v UK? Považujeme toto za nepravděpodobné, protože prohledávání SwissProt a translatované GenBank databáze na homologní sekvence pro peptidy odvozené od ESAT-6 a CFP 10 ukázalo, že sekvence všech těchto peptidů jsou jedinečně omezené na ESAT-6 a CFP10 komplex M. tuberculosis. Nicméně, esat-6 gen (a proto též pravděpodobně gen pro CFP 10, který je ve stejném operonu jako esat-6), je přítomen u 4 atypických mykobakterii: M. kansasii, szulgai, flavescens a marinum. Je proto představitelné, že ESAT-6 a CFP

10-specifické reakce mohou být důsledkem infekce jedním z těchto organismů. Aby mohla být příčinou výrazného rozdílu v ESAT-6- a CFP 10-specifických reakcích v Indii a UK, museli by být tyto mykobakterie příčinou značně rozšířených infekcí v Mumbaii, ale ne v jižní Anglii. Žádné z těchto mykobakterii však neodpovídá této geografické distribuci, ani není specificky asociováno s tropickým klimatem. Místo toho je M. kansasii nejběžnějším non-HIV asociovaným nontuberkulozním mykobacteriem izolovaným od pacientů v jižní Anglii a bylo izolováno z vodovodní vody v městech tohoto regionu. Naopka, onemocněni způsobené M. kansasii nebylo popsáno v Mumbai, ačkoliv toto může odrážet špatné zpracování v místních laboratořích. Absence T-lymfocytů specifických pro antigeny • · ·· * » ·♦ * 0 * ♦ ··· ···· • · kódované RD-1 u 40 obyvatel UK tak čini z M.kansasii nepravděpodobnou příčinu rozdílů v reakci mezi UK a Indií. Infekce M. marinum je obvykle získána traumatem ve slané nebo sladké vodě nebo při úpravě ryb; tyto situace budou dosti vzácné u vedoucích pracovníků vyšetřovaných pro účely zdravotního pojištění v naší instituci v Mumbai. M. szulgai a M. flavescens jsou velmi vzácnou příčinou infekcí u člověka. M. szulgai bylo izolováno od pacientů v celém světě, včetně UK, ale izoláty z prostředí nebyly popsány. M. flavescens bylo objeveno v dodávkách vody v několika Evropských zemích a proto nemůže být, stejně jako M. kansasii, příčinou všeobecné senzibilizace na ESAT-6 a CFP 10 u obyvatel Mumbaie a přisné absence senzitizace u obyvatel UK.

Cirkulující IFN-y-secernující T-lymfocyty specifické pro ESAT-6 a CFP 10 byly schopné rychlé efektorové funkce, protože uvolňovaly IFN- v ex vivo ELISPOT testu bez nutnosti předchozí stimulace in vitro. Toto naznačuje, že dárci jsou latentně infikováni M.tuberculosis, které stále secernují ESAT-6 a CFP 10, protože vysoké frekvence cirkulujících efektorových Tlymfocytů jsou pravděpodobně udržovány nedávným setkáním s antigenem in vivo. Protože probíhající, aktivní sekrece ESAT-6 a CFP10 vyžaduje metabolicky aktivní a životaschopné bacily, je přítomnost cirkulujících ESAT-6 a CFP 10-specifických efektorových T-lymfocytů u zdravých jedinců ukazatelem toho, že jsou latentně infikováni a ne že se pouze někdy setkaly s infekcí. Nicméně, nemůžeme vyloučit možnost, že cirkulující

IFN-y-secernující T-lymfocyty podléhají opakované stimulaci in vivo, v důsledku dlouhodobé persistence ESAT-6 a CFP10 v dendritických buňkách za absence živých bakterií. Nicméně, longitudinální sledování tuberkulosních pacientů v UK ukazuje, že frekvence ESAT-6 peptid-specifických IFN—secernujících CD4 T-lymfocytů se progresivně snižuje během anti-tuberkulosní chemoterapie (obr. 8), což naznačuje, že frekvence těchto T45 lymfocytů jsou udržovány in vivo ESAT-6 secernovaným živými bakteriemi.

TST sledování v Indii dává různorodé výsledky, s prevalencí TST pozitivity u dospělých v rozmezí 38 - 81%. Toto široké rozmezí je částečně důsledkem špatné standardizace používaných PPD přípravků, rozdílů v metodologii, rozdílů v odečtech výsledků kožních testů, chybné klasifikace a nestability oddálené přecitlivělosti v čase. Tato omezení, společně se špatnou vlastní specificitou PPD, činí hodnocení prevalence latentních infekcí M.tuberculosis značně diskutabilním. Náš nový, kvantitativní přístup je objektivnějším hodnocením, které není narušeno předchozí BCG vakcinací a s největší pravděpodobností není ovlivněno jinými mykobakteriálními infekcemi. 80% prevalence u vedoucích pracovníků společností je vyšší, než by bylo očekáváno podle minulých TST sledování, zejména když se bere v úvahu, že tyto předchozí sledování byla prováděna v zemědělských oblastech nebo městských slumech. Zajímavé je, že prevalence pozitivních výsledků v ELISPOT testu na bázi antigenů kódovaných RDI byla vyšší u mužů (64/73 = 82%) než u žen (16/22 - 73%),což odpovídá rozdílům mezi pohlavími zjištěným v TST sledováních. Zjištěná prevalence latentní infekce je tedy neočekávaně vysoká u mužů i u žen, zejména pokud se bere v úvahu relativní bohatství a chybění přelidněnosti v našem vzorku populace.

Oproti ELISPOT testu pro IFN-γ využívajícího dva antigeny kódované RDI se testy využívající PPD nelišily mezi obyvateli Mumbaie a UK, kdy 93% a 85% těchto populací, v příslušném pořadí, reagovalo na PPD (Obr. 6A a 6B). 83% (33/40) prevalence PPD-specifických reakcí u obyvatel UK bez kontaktu s tuberkulosou je velmi pravděpodobně způsobena tím, že 33/40 bylo vakcinováno BCG. Oproti ESAT-6- a CFP 10-specifickým T• · ·«« · • · » *· ·· • * lymfocytům tedy PPD-specifické IFN-γ secernující T-lymfocyty nerozlišují mezi latentně infikovanými obyvateli endemických oblastí tuberkulosy a neexponovanými obyvateli neendemických oblastí, kteří byli vakcinováni BCG; toto snižuje praktické výhody použití definovaných antigenů s vysoce restrihovanou druhovou distribucí.

Z 50 pacientů s aktivní tuberkulosou, kteří byli testováni pouze s peptidy odvozenými od ESAT-6, mělo 80% T-lymfocyty specifické pro ESAT-6 peptid podle ex vivo ELISPOT. Není jasné, proč je tento podíl odpovědí nižší než podíl odpovědí u skupiny pacientů s aktivní tuberkulosou z UK, kde 45/47 (96%) pacientů reagovalo na jeden nebo více peptidů odvozených od ESAT-6, ale zdá se, že relevantní jsou následující 3 faktory. Za prvé, peptid ESAT-6_>15 byl imunodominantním a permisivně rozpoznávaným epitopem v předchozí UK studii, kde 60% pacientů reagovalo na tento peptid samotný, zatímco v Mumbai pouze 25% pacientů reagovalo na tento peptid (obr. 7A). Toto pravděpodobně odráží jiné HLA pozadí těchto 2 populací. Ačkoliv bylo 50% tuberkulosních pacientů v UK z Indického subkontinentu, žádný z nich nebyl Maharashtransan, a dalších 50% byli karibští černoši nebo běloši. Z tuberkulosních pacientů sledovaných v Indii bylo 56% Maharashtransanů a zbytek byl z jiných indických etnických skupin. Peptid ESAT-G^může být tedy restrihovaný molekulami HLA třídy II, které jsou vzácné Maharashtransanů. Za druhé, medián frekvence celkových ESAT-6-specifických T- lymfocytů u pacientů z Mumbaie, kteří reagovali (128 na milion PBMC; interkvartilní rozsah: 72 - 208), byl o něco nižší než u pacientů s plicní tuberkulosoiu z Londýna (177 na milion PBMC; interkvartilní rozsah: 104 - 392). Pacienti z Mumbaie budou proto mís s větší pravděpodobností nižší počty cirkulujících ESAT-6-specifických T-lymfocytů a pokud bude absolutní frekvence ESAT-6-specifických T-lymfocytů u daného jedince nižší než práh našeho testu (20 na milion PBMC), tak nebudou takoví pacienti detekováni ex vivo ELISPOT testem. Za třetí, 2 z UK pacientů, kteří nereagovali, měli pokročilou plicní tuberkulosu s kachexií, a zatímco toto bylo vzácné u pacientů v UK, mělo mnoho pacientů v Mumbai pokročilé stadium onemocnění. Zajímavé je, že všech 6 tuberkulosních pacientů s infekcí HIV mělo detekovatelné T-lymfocyty specifické pro ESAT-6 peptid podle ex vivo ELISPOT. Tyto předběžné výsledky jsou prvním důkazem ESAT-6-specifických T-lymfocytů u tuberkulosních pacientů infikovaných HIV a naznačují, že klinická a epidemiologická použitelnost ex vivo ELISPOT testu na Tlymfocyty specifické pro M.tuberculosis může trvat i u jedinců infikovaných HIV.

Konečně, frekvence ESAT-6 a CFP 10-specifických Tlymfocytů u zdravých městských Indů, stejně jako prevalence pozitivních reakcí, byla také velmi vysoká (tabulka 3). Medián frekvence celkových CFP10 peptid-specifických T-lymfocytů pro CFP10 reagující jedince (158 na milion PBMC; interkvartilní rozsah: 84 - 261) byl skutečně vyšší než medián frekvence PPDspecifických T-lymfocytů pro PPD reagující jedince (86 na milion PBMC; interkvartilní rozsah: 56 - 222), zatímco medián frekvence celkových T-lymfocytů specifických pro ESAT-6 peptid (86 na milion PBMC; interkvartilní rozsah: 43 - 156) byl podobný jako pro PPD. Mnoho z těchto reakcí bylo kromě toho namířeno proti diskrétním imunodominantním regionů v ESAT-6 a CFP10 molekulách (Obr. 7A a 73). Imunitní reakce u pacientů s aktivní tuberkulosou pravděpodobně přispívá k patogenesi a destrukci tkání, stejně jako k obraně. Tato intenzivní a vysoce lokalizovaná T-lymfocytární reakce u obyvatel endemických regionů pro tuberkulosu, kteří nemají aktivní tuberkulosu, naznačuje, že tyto T-lymfocyty specifické pro antigeny kódované RDI nejsou nutně asociované s aktivním onemocněním jako takovým. Spíše je přítomnost těchto T-lymfocytů u latentně infikovaných zdravých jedinců v souladu s jejich protektivní ·

• · ·· * * « * » · · · ·· «· ··· «·· úlohou ve dlouhodobé kontrole M. tuberculosis in vivo.

Závěrem, prokázali jsme, že 80/100 zdravých dospělých v Mumbaii má vysokou frekvenci T-lymfocytů specifických pro dva antigeny M.tuberculosis kódované RDI, což naznačuje, že alespoň 80% této městské populace může být latentně infikováno M. tuberculosis. Toto představuje první hodnocení prevalence latentní infekce M. tuberculosis v endemickém regionu za použití přístupu na bázi T-lymfocytů a antigenů s přesně definovanou druhovou specificitou.

• · * · « * · ·· ···· *

« · • 4 • « ** «·

Odkazy

1. Lalvani, A., R. Brookes, S. Hambleton, W.J. Briton, A.V. Hill, and A.J. McMichael. 1997. Rapid effector function in CD8+ memory T cells. J.Exp.Med. 186:859-65.

2. Lalvani, A., R. Brookes, R.J. Wilkinson, A.S. Maim, A.A. Pathan, P. Andersen, H. Dockrell, G. Pasvol, and A.V. Hill.

1998. Human cytolytic and interferon gamma-secreting CD8+ T lymphocytes specific for Mycobacterium tuberculosis. Proč Nati Acad Sci USA. 95:270-5.

3. Pathan, A.A., K.A. Wilkinson, R.J. Wilkinson, M. Latif, H. McShane, G. Pasvol, A.V. Hill, and A. Lalvani. 2000, High frequencies of circulating IFN-gamma-secreting CD8 cytotoxic T cells specific for a novel MHC class I-restricted Mycobacterium tuberculosis epitope in M. tuberculosis-infected subjects without disease. Eur J Immunol. 30:2713-21.

» * »»· « * » ·

4· • »4 * «4 ·« t

4·· • 4 «*·4

	UC (n=32)	HHC (n-27)	TBLN (n=ll)	C-PTB (n=8)	C+PTB (H»25)
Průměrný věk v rocích	32	37	32	31	34
(rozsah)	(22-65)	(19-65)	(27-41)	(19-54)	(19-61)
Pohlaví	15M/17F	16M/11F	5M/6F	SM/OF	17M/SF
Rasa - y;
ISC	10 .	16	7	6	12
Afričan	0	4	4	1	5
•Běloch	22	5	0	1	7
Orientálec	0	2	,.Q	0	1
Počet jedinců	0(0)	23 (85)	10- (91)	7(83).	. 23.(92)
reagujících na
ESAT6 peptidy (%)
Medián ESAT-6	0	667	-Sil -	474	177
specifických IFM-γ	(0-0)	(197-965)	(570-1505)	(272-1267)'	(104-392)
SFC/milion PBMC
(IQ rozsah)

Tabulka 1: Demografické charakteristiky a medián frekvence ESAT-6 peptid-specifických IFN- SPC/million PBMC pro všechny jedince. *Medián počtu ESAT-6 peptid-specifických CD4 T-lymfocytů (součet pro všechny peptidy) pro všechny- reagující jedince ve skupině (C+ - kultivačně pozitivní; c- = kultivačně negativní; PTB - plicní tuberkulosa; TBLN = tuberkulosní lymfadenitis; HHC = zdravé domácí kontakty; UC = neexponované kontroly; IQ rozsah - interkvartilní rozsah; ISC = Indický subkontinent).

	51	• » • · ♦ *	··· · » « · · * · · · · •· ··· ···· >*
Peptid*	Sekvence	Peptid-specifická T-lymfocytámí linie, která byla určena jako CD4 pozitivní	Reakce v ex vivo ELISPOT (n=l5)	Reakce v lymfoprol iterativním testu (n= 15)
ESAT-6,.,^	mteqqmnfagieaaa	10/10	12	1
ESAT-Ó&.20	WNFAGIEAAASAIQG	4/4.	NT	NT
ES ÁT’6| t-25	IEAAASAIQGNVTSI	1/1	3	1
ESAT-6,6.30	. SAIQGNVTSIHSLLD	3/4	4	• 0
ESAT-621.35	NVT5IESLLDEGKQS	4/4	4	. 1
ESAT-č;£^o	HSLLDEGKQSLTKLA	NT	’ ‘ 2	0
ESAT-ójmj	E GKQ SLTKLAAAWGG	1/1	1	θ
ESAT-Ójů.jo	LTKLAAAWGGS GS EA	1/1	I	• 0
ESAT-6ít.j5	AAWGGS G S EAYQGVQ.	NT	0	0 .
ESAT-ó^^o	SGSEAYQGVQQKWDA	• VI '	I .	0'
ESAT-5j,.<j	YQGVQQKWDATATEL	3/3	4	4
ESAT-6;6.7o	QKWDATATELNNALQ	2/3	3	'· 2
ESAT-6ei-7j	TATELMNALQNLART	IP- '	1 '	. 0 . ·
ESAT-tys-ao	nnalqnlartiseag	8/9	8	7
ESAT-Ó71.3J	NLAATISEAGQAMAS	8	11	; 5
ESAT-6 76-90	ISEAGQAMASTEGNV	6	11	' 9
ESAT-6si-95	QAMASTEGNVTGMFA	2	0	0

Tabulka'2. Většina peptidů odvozených od ESAT-6 jsou cíle CD4 T-lymfocytů: počet dárců, od kterých byla peptid-specifická T-lymfocytárni linie CD4 pozitivní podle imunomagnetické aeplece, je uveden v poměru k celkovému počtu dárců, od kterých byly T-lymfocytární linie testovány na tento peptid.

T-lymfocyty specifické pro určité imunodominantní peptidy odvozené od ESAT-6, jak byly uspočítány ex vivo ELISPOT testem, nebyly detekovatelné v lymfoproliferačních testech: PBMC od 15 jedinců byly testovány paralelně s ex vivo ELISPOT testy pro IFN- a testy inkorporace ^:H-thymidinu, ve kterých byl stimulační index '3 nebo více považován za pozitivní.

* · · I ·· »« ·· •*· ·«

Tabulka

	3	Η		>
Q			1	c
Oj	?-	Φ	a
μ	1	ϋ		2
	ζ	3	,μ	>ϊ
3	μ	Φ	υ	C y
	Η	>	'>1	C
O		μ	μ	c
,—1	0	φ	υ
1	3	Μ	•Η
μ	a	μ	μ	1
μ			Ή	τ
u	3	3	0	ř·
	μ	'3	Φ
3	W	Η	a
	0)	U	η
co	μ	Φ	I
1		2	3
H		—	Φ
<	Η		a
to	Ο	•	Ή
ω	μ	μ	μ
	co	3?	3
Ό	Η		to
0	μ	3
	ω		Φ
Ό)	—-	Φ	σ
3		•Η	3	.—
Φ	-	Τ)	Φ	»3
N	μ	3	>	ϋ
0	0	Η	Λί	3
>	a		Φ	-Η
u	ω	μ	Μ	τ> ’
o	0	Φ	μ	φ
	C	μ		μ
	3	3	φ
Ό	β	>	Ν	Λ
	•Η	>Ί	3	υ
μ		μ	0	μ 1
a		0	a	ϋ
OJ	β			Ή
a	'φ	μ	ω
	>	υ	η	3
3	0	'>1	3	σ>
3	e	I—i	>υ	3
	>1	>φ	3	Φ
Ή	Ν	a	3	μ
υ	3	10	Ν
μ	ω	0	0	3
φ		Ό
φ	ο		-3	3
μ	>	μ	μ	μ
	Ή	υ
μ	>		σ	ϋ
Φ		>	0	0
>υ		(0	μ	μ
3	<Ρ	3	£	β
0		Ό	>,	^>1
ω	>	Ν	μ	ι—1

C '

O, tň

O

Ι/Ί (N

V3 co tí

Pft.

U

CO

W _ í*¹ μ ^Lo cc

PP.

CJ

O

5· .o

-ίQ a

Pa

O

Ό i

f<

co μ

o

Qfl

		<Ν
		Γ4
		C4 ,
CO
σ%		1
		'•C
ΟΟ	Ό
Ck	co

SO i

CO til

o a		i*—\ o		v> *7
a		. CO		' Ό
U	O		CO	j-
	o	O	o
5	f—*	CO’	CM

fo a

co μ

ω o

>

o

J= o

>.

c ce >

o

a.

ΙΛ υ

ω >□ o

a co d

Ό

£/ kC r-	co LT]	1 •r co
X-K		<0 vk
VD ÍT)		t
	\O	m
U-)	CO ·

	x
	□
	s>>
	Jsi
	ϋ
		o
	’5 (υ Cl <Λ	w >1
ox	O £
X	1 C Q .SP	E 2>
r-> >	X c	ř—
+-»		X
*N	ϋ	U
O ‘	O	k3
Q_ ·	c u
Q >□	>	c u
O	u	CJ
IX	C	u a>
	c	(Λ
	?2	>-
	□	> Z
	a	UL.

(interkvartilní rozsah) υ

Σ μ

a <

·· * *

·» * · • · ♦ ♦· ·*·· * · · · * · * a ·· ··

Tabulka 4

ESAT-6: Μ TE Q Q WNF AGIE A A AS AI QGNVTSIHSLLD

I I 1 I I

CFP10: MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQID

ESAT- 6: E GK QS LTKLAA A WGGSGSEAYQGVQQKWD A

I i I l i

CFP1O: QVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQE

ESAT- 6: T ATELNNALQNLART IS E AG

I i |il

CFP1O: AANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQ

EAST-6: - QAMAST-E GNVTGMFA

Claims (22)

1. Patentové nároky

   1. Způsob pro stanovení účinnosti léčby mykobakteriální infekce u jedince vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení snižování hladin T-lymfocytů specifických pro mykobakteriální antigen po léčbě ve vzorku, čímž se určí účinnost léčby.
2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že T-lymfocyty jsou CD4 T-lymfocyty.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2vyznačujicí se tím, že mykobakteriálním antigenem je ESAT-6 nebo CFP 10.
4. 4. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že zahrnuje detekci hladin uvedených T-lymfocytů v prvním vzorku odebraném před léčbou a ve druhém vzorku odebraném po léčbě.
5. 5. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že T-lymfocyty jsou detekovány ve formě přímo extrahovaných buněk ex vivo.
6. 6. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že hladina T-lymfocytů se detekuje kontaktováním buněk ve vzorku s (i) celým mykobakteriálním proteinem, nebo (ii) peptidem, který je fragmentem mykobakteriálního proteinu, nebo (iii) analogem (i) nebo (ii), který je rozpoznáván receptorem T-lymfocytů, které rozpoznávají (i) nebo (ii), a měřením počtu T-lymfocytů, které rozpoznávají (i), (ii) nebo (iii).

   *

   9 · »« *·· 9·9·
7. 7. Způsob podle nároku 6vyznačující se tím, že uvedené měření je provedeno detekcí cytokinu secernovaného Tlymfocyty po rozpoznání peptidu nebo analogu.
8. 8. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že cytokinem je IFN-γ.
9. 9. Způsob podle nároku 7 nebo 8vyznačující se tím, že cytokin se detekuje umožněním vazby cytokinu na imobilizovanou protilátku specifickou pro cytokin a potom detekováním přítomnosti komplexu protilátka/cytokin.
10. 10. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že mykobakteriální infekcí je infekce M. tuberculosis nebo M. bovis.
11. 11. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda po léčbě přetrvává nižší hladina CD4 T-lymfocytů po určitou dobu, což ukazuje na to, že jedinec má latentní infekci.
12. 12. Použití činidla, které zabraňuje nebo léčí mykobakteriální infekci, ve výrobě léčiva pro léčbu jedince, u kterého bylo za použití způsobu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 11 zjištěno, že terapeutická substance má slabou účinnost, kde činidlo je odlišné od terapeutické substance.
13. 13. Způsob pro stanovení přítomnosti latentní infekce u jedince vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení přítomnosti T-lymfocytů specifických pro mykobakteriální antigen ve vzorku od jedince.
14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že T-lymfocyty jsou CD4 T-lymfocyty.
15. 15. Způsob podle nároku 13 nebo 14 vyznačující se tím, že mykobakteriálním antigenem je ESAT6 nebo CFP 10.
16. 16. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 15 vyznačující se tím, že T-lymfocyty jsou detekovány způsobem podle jakéhokoliv z nároků 5 až 9.
17. 17. Použití činidla, které zabraňuje nebo léčí mykobakteriální infekci, ve výrobě léčiva pro léčbu jedince, u kterého bylo za použití způsobu podle jakéhokoliv z nároků 13 až 16 zjištěno, že má latentní infekci.
18. 18. Způsob pro určení efektu intervence při mykobakteriální infekci u jedince vyznačující se tím, že zahrnuje stanoveni efektu na hladiny T-lymfocytů, jak je definováno v jakémkoliv z nároků 1 až 3 ve vzorcích od jedince, čímž se určí efekt intervence.
19. 19. Způsob léčby jedince infikovaného mykobakteriemi vyznačující se tím, že zahrnuje podání činidla, které zabraňuje nebo léčí mykobakteriální infekci jedinci, u kterého bylo způsobem podle jakéhokoliv z nároků 1 až 11 zjištěno, že léčba za použití terapeutické substance má malou účinnost, kde činidlo je odlišné od terapeutické substance.
20. 20. Způsob léčby jedince infikovaného mykobakteriemi vyznačující se tím, že zahrnuje podání činidla, které zabraňuje nebo léčí mykobakteriální infekci jedincí, u kterého bylo způsobem podle jakéhokoliv z nároků 13 až 16 * 9 • ··· · zjištěno, že má latentní infekci.
21. 21. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že snížení hladiny T- lymfocytů na nedetekovatelnou úroveň ukazuje na eradikaci mykobakteriální infekce.
22. 22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že znovuobjevení se T-lymfocytů ukazuje na reinfekci mykobakteriem.