CZ200315A3

CZ200315A3 - Fotodynamické zpracování a ozařování UV-B-zářením suspenze thrombocytů

Info

Publication number: CZ200315A3
Application number: CZ200315A
Authority: CZ
Inventors: Harald Mohr
Original assignee: Blutspendedienst Der Landesverbände Des Deutschen
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2003-01-03
Publication date: 2003-05-14
Also published as: DE50106329D1; ZA200300257B; BR0111958A; DE10031851A1; DK1307241T3; HUP0301717A3; CN1264577C; EA200300111A1; MXPA02012663A; SK1002003A3; ATE296118T1; EA004246B1; AU2001279556B2; PT1307241E; AU7955601A; EP1307241B1; WO2002002152A1; DE10031851B4; PL363076A1; HU226418B1

Description

Vynález se týká způsobu dezaktivace virů a ničení leukocytů v suspenzích thrombocytů kombinací fotodynamického zpracování a ozařováním UV-B-zářením.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že terapeutické použití krevních preparátů skrývá riziko, že příjemce krevního preparátu bude infikován viry. Je možno uvést např. viry virové hepatitidy B (HBV) a C (HCV), jakož i původce AIDS HIV-1 a HIV-2. Toto riziko existuje vždy, kdy se při výrobě preparátu neprovádí krok dezaktivace nebo eliminace virů.

U vyčištěných plazmaproteinových koncentrátů jako např. albuminu a preparátů z faktoru VIII a faktoru IX se postupy dezaktivace nebo eliminace virů používají, takže jsou zatím pokládány za virově bezpečné. Také virové riziko čerstvé plazmy může být alespoň sníženo prostřednictvím použití různých metod. Jednou metodou je např. skladování v karanténě. Přitom se zmrazená plazma skladuje po dobu 3 až 6 měsíců a uvolňuje se pro použití teprve poté, kdy je nový krevní vzorek krve dotyčného dárce znovu přezkoušen na obvyklých indikátorech pro HBV, HCV, HIV-1 a HIV-2 a je zjištěn jako negativní. Takováto metoda není použitelná pro buněčné krevní produkty, jako např. erythrocytové resp. thrombocytové koncentráty, neboť ty mají trvanlivost asi 7 týdnů resp. 5 dnů. Buněčné krevní produkty ze zřejmých důvodů nemohou být učiněny virově bezpečnými ani prostřednictvím zpracování rozpouštědlem/detergentem, jak je «« · ·· · možné v případě plazmaproteinových koncentrátů a v případě plazmy, neboť by tím byl způsobena lýze erythrocytů a thrombocytů.

Pracuje se intenzivně na tom, dekontaminovat buněčné krevní produkty pomocí fotodynamických postupů. Fotodynamícká dezaktivace virů spočívá v tom, že se příslušný preparát v roztoku nebo suspenzi osvětluje v přítomnosti fotoaktivní látky, fotosenzibilizátoru. Vyzařované světlo musí mít vlnovou délku, která je absorbována fotoaktivní látkou. Ta se tím aktivuje a přenáší tuto aktivační energii buď přímo na substrát, který tím ničí nebo poškozuje, nebo také na molekulu kyslíku: aktivované sloučeniny kyslíku, tzn. kyslíkové radikály nebo jednoatomový kyslík totiž mají silný viricidní účinek. Ve výhodném případě má použitá fotoaktivní látka velkou afinitu ke složkám viru, např. k virové nukleové kyselině, a jen malou k ostatním složkám, které jsou v příslušném preparátu přítomny. Tak jsou dezaktivovány viry, a jiné složky se nemění. Širšího použití nachází v současné době fotodynamický způsob podle evropského patentu EP-B1 0 491 757 (H.Mohr a B.Lambrecht, Verfahren zur Inaktivierung von Vířen in Blut und Blutprodukten). Používá se k dezaktivaci virů v čerstvé plazmě. Jako fotoaktivní látka slouží při technické aplikaci především fenothiazinová methylenová modř. Namísto methylenové modře je možno použít také toluidinovou modř. Také produkty demethylace methylenové modři, tzn. azurové barvivo A, B a C jakož i thionin jsou fotodynamicky aktivní a jsou vhodné k fotodynamické dezaktivaci virů.

• · . * -.UPRAVENÁ STRANA diíiQZ. Mho i VJfehvC.AÁ lij® Ki MW 3. VK n>'í<

US patent 5 545 516 extracellular enveloped pomoci metody (S.J. Wagner: Inactivation of víruses in blood and blood components by phenthíazin-5-ium dyes plus light) popisuje dezaktivací mimobuněčných virů pomocí fenothiazinových barviv v kombinaci s viditelným světlem. Podle US 5 545 516 se preparáty před fotodynamickým zpracováním speciálních filtrů zbavují leukocytů, neboť desaktivace virů nepostihují s buňkou asociované viry nebo proviry. Tyto metody rovněž nejsou schopny dezaktivovat malé, neobalené viry, nacházející se v krvi, jako např. viry hepatitidy A (HAV). Volné viry, které mají lipidové obálky, jako např. původce AIDS HIV-1, viry hepatitidy B a C (HBV, HCV) jsou naproti tomu tímto způsobem dezaktivovatelné. Také z WO 00/04930 a WO 96/08965 jsou známy způsoby dezaktivace vzorcích, absorbuj i aktivují se ozařováním zářením v oblasti vlnových délek od UV-A až do viditelné oblasti.

které používají v UV-A-oblasti, a patogenů v biologických fotoaktivní látky, které

Leukocyty v krevních produktech mohou být zničeny pomocí UV-ozařování. V případě suspenzí thrombocytů se ukázalo účelné ozařování UV-B-zářením (oblast vlnových délek 290-320 nm) , neboť pro odstranění leukocytů zpravidla stačí energie 1 až 3 J/cm², která příliš nepoškozuje thrombocyty, takže jsou terapeuticky použitelné.

Přivádění energie ozařováním UV-B-zářením větší než 10 J/cm² působí navíc viricidně (K.N. Prodoux; J.C. Fratanoni, E.J. Boone a R.F. Bonner v Blood, 70(2), 589-592(1987): Use of Laser-UV for inactivation of virus in blood products) . Avšak přitom jsou thrombocyty poškozeny tak, že je nutno vzít v úvahu jejich použitelnost (J.C. Fratanoni a K.N. Prodoux v Transfusion 30(6); 480-481 (1990): Viral inactivation of blood products).

···· .4.

• ♦

UPRAVENÁ STRANA

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je poskytnout efektivní metodu dezaktivace patogenních virů a leukocytů v suspenzích thrombocytů, zejména thrombocytových koncentrátech (TK) . TK se získávají z darované krve diferneciální centrifugací nebo přímo od dárců aparátovou aferézou thrombocytů.

S překvapením bylo zjištěno, že kombinace fotodynamického zpracování s UV-B ozařováním v suspenzích thrombocytů nebo TK efektivně postihuje víry přístupné fotodynamické dezaktivaci virů, a současně ničí leukocyty obsažené v médiu, a odstraňuje tak riziko infekce s buňkou asociovanými viry nebo proviry. Dále bylo s překvapením zjištěno, že prostřednictvím kombinace těchto způsobů může být množství UV-B-záření potřebné pro zničení leukocytů značně menší, než při samotném ozařování UV-B-zářením. Rovněž s překvapením bylo zjištěno, že přídavné zpracování suspenzí thrombocytů UV-B-zářením s intenzitou, která je sama o sobě téměř neúčinná při dezaktivaci virů, značně zvyšuje účinnost fotodynamického zpracování.

Způsob zpracování suspenze thrombocytů podle vynálezu se vyznačuje následujícími kroky:

(A) vystavení suspenze záření v oblasti vlnové délky 400 až

750 nm, s výhodou 550 až 700 nm, v přítomnosti jedné nebo více fotoaktivních látek, které v dané oblasti vlnových délek vykazují jedno nebo více absorpčních maxim, a (B) vystavení suspenze záření v oblastí vlnových délek 270 až 320 nm s přiváděním energie 0,1 až 10 J/cm², přičemž kroky (A) a (B) se provádějí v libovolném pořadí a/nebo se časově překrývají, a v kroku (B) není přítomna zářením v oblasti vlnových délek podle kroku (B) aktivovatelná fotoaktivní látka. Výhodná provedení jsou předmětem závislých nároků nebo nezávislého nároku 13.

• ·· ·

• ΦΦΦ φφ	• · · Φ Φ · « • 9 ·	• · Φ » • Φ	Φ ·· Φ Φ •
	W 9 9 9 9 9
5 -	• · · · 99 φφ	• · · • Φ Φ · φ	• « Φ »	Φ « • ·

Suspenze thrombocytů má s výhodou koncentraci více než 5xl0⁸ thrombocytů na ml, zvláště výhodně více než 10⁹/ml. Thrombocyty mohou být např. suspendovány v plazmě nebo v médiu pro uložení thrombocytů s libovolným obsahem plazmy.

Krok A zahrnuje fotodynamické zpracování suspenze thrombocytů v přítomnosti fotoaktivní látky viditelným světlem; krok B zahrnuje ozařování preparátu - suspenze obsahující thrombocyty - světlem v oblasti vlnových délek UV-B. Oblast záření UV-B znamená ve smyslu vynálezu oblast vlnových délek 270 až 330 nm.

Koncentrace použité fotoaktivní látky a přívod energie osvětlováním a UV-B-ozařování se měří tak, aby byly dezaktívovány případně přítomné viry a zničeny leukocyty obsažené v suspenzi thrombocytů, avšak aby byla zachována funkčnost thrombocytů.

Jako nádoby pro zpracování suspenzí thrombocytů slouží nádoby proustné pro UV-B-záření, které s výhodou sestávají z plastu, a mohou mít formu sáčků. Je však také možné provádět fotodynamické zpracování a UV-B-zpracování v různých nádobách.

Také je možné provádět zpracování suspenze thrombocytů UV-B zářením zatímco se suspenze thrombocytů převádí z jedné nádoby do druhé.

Jako fotoaktivní látka může být použito např. fenothiazinové barvivo methylenová modř, azur A,B,C a thionin. Rovněž jsou použitelné jiné, z např. z literatury známé fotoaktivní látky, v koncentracích pro dezaktivaci virů v krevních produktech. V případě fenothiazinových barviv jako je thionin jsou možné koncentrace asi 0,1 až 10 μΜ, s výhodou asi 0,5 až 5 μΜ nebo 1 až 5 μΜ.

• •Μ

• · · «9 • 9 • * • 9 ·

Jako zdroje světla pro fotodynamické zpracování, zejména při použití thioninu, slouží s výhodou nízkotlaké sodíkové výbojky, jejichž maximum emise světla je kolem 590 nm. To odpovídá přibližně absorpčnímu maximu thioninu, které je ve vodném roztoku asi 595 nm. Jsou však možné také jiné zdroje světla, zejména tehdy, jestliže se použije fotoaktivní látka, která absorbuje světlo v jiné oblasti vlnových délek než například thionin.

Pro ozařování UV-B-zářením mohou být použity speciální výbojkové trubice, lampy nebo lasery, které emitují ultrafialové světlo v oblasti vlnových délek mezi asi 270 až 330 nm. Energie přiváděná ozařováním UV-B zářením může být 0,1 až 10 J/cm², s výhodou 0,3 až 6 J/cm², zvláště výhodně 0,5 až 3 J/cm².

Příklady provedení vynálezu

1. Obecné:

Následovně popsané pokusy byly prováděny s TK, které byly izolovány z jednotlivých dárců krve a suspendovány v krevní plazmě. Jako fotoaktivní látka byl použit thionin (Th). Obdobných výsledků je možno dosáhnout také pomocí jiných fotoaktivních látek, například fenothiazinového barviva methylenové modři a jejích derivátů azuru A,B a C. Příklady vynález pouze objasňují, neomezují však jeho rozsah.

2. Postupy a materiály

TK použité při pokusech byly až 5 dnů skladovány v ohrombocytových rotátorech. Skladovací nádoby byly komerčně dostupné PVC-sáčky. Pro fotodynamické zpracování a zpracování UV-B-zářením byly TK převedeny do plastikových

• · ♦ · · · • · · φ · · • · ·

9 9 9

9₉

-7«·· záření. Pro osvětlování v přítomnosti thioninu bylo použito zařízení, vybavené nízkotlakými sodíkovými výbojkami. TK byly osvětleny z obou stran. Pro ozařování UV-B-zářením byl použit plošný zářič, opatřený UV-trubicemi, které emitují převážně UV-světlo v oblastí vlnových délek 290 až 320 nm.

Jako testovací virus byl většinou požit virus vezikulární stomatitidy (VSV), který je snadno množitelný v buněčné kultuře a v souladu s tím je kvantifikovatelný pomocí testů CPE (CPE= cytopatický efekt). V pokusu 1 byla kromě toho použita ještě řada jiných virů. VSV byly množeny ve vero-buňkách. Tytéž buňky byly použity také pro testy infekčnosti, jejichž pomocí byl stanovován titr Použité médium s buněčnou kulturou bylo RPMI 1640 s plodového telecího séra a antibiotikem. Testy byly prováděny na mikrotitračních destičkách. Příslušné vzorky byly v 1. až

3. kroku postupně nařeďovány. Pro každé zředění bylo testováno 8 replikátů. Titr viru je vyjádřen jako logi₀TClD₅₀(TC1D= Tissue Culture Infective Doses, dávka infekční pro tkáňovou kulturu) a vypočten metodou podle Kárbera a Spearmana (G.Kárber; Naunym-Schmiedebers Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480-483 (1931): Beitrag zur kollectiven

Behandlung pharmakologischer Reihenversuche, a C.Spearman; Br.J.Psychol. 2, 277-282 (1908): The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss for mulae).

Jako test funkčnosti thrombocytů byla použita hypotonická šoková reakce a kolagenem indukovaná agregace.

Mononukleární buňky byly izolovány z krve dárců pomocí gradientově centrifugace. Při pokusech byly přidány v koncentraci 5xl0⁵/ml k suspenzím thrombocytů. Po fotodynamickém zpracování resp. UV-B-ozařování byly alikvotní podíly suspenzí odstřeďovány při nízkých otáčkách. (1500 ot/min po dobu 4 minut). Peletizované buňky byly třikrát propláchnuty kultivačním médiem (RPMI 1640 ε 10 0 ···· ·· • 9 ·

99 9 • 9 #

9

9 9 9

9 9

plodového telecího séra a s antibiotikem) , a poté v tomto médiu znovu suspendovány. Koncentrace buněk byla nastavena na 5xl0⁵/ml. Pro namnožovací pokusy byly buňky stimulovány Concavalínem A (ConA, 2 pg/ml) a ve 200μ1 alikvotních podílech kultivovány v inkubátoru v atmosféře C0₂ po dobu 34 dny při 37 °C. Poté byly přidány k buněčným kulturám. 0 čtyři hodiny později byly spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm (OD₄₅₀ ) stanoveny míry zabudování bromdeoxyuridinu (BRDU). Hodnoty extinkce jsou úměrné zabudování BRDU a tím životaschopnosti buněk.

Pokus 1: Dezaktivace virů v TK zpracováním pomocí thioninu a světla

Řada virů byla zkoumána na to, zda a v jaké míře jsou dezaktivovatelné zpracováním thioninem a světlem. Koncentrace fotoaktivní látky byla 1 μΜ. Jak ukazují výsledky shrnuté v tabulce 1, jeví se různé víry rozdílně citlivé: modelové viry lidské hepatitidy C virus BVDV a CSFV jakož i Togavirus SFV byly po 5 minutách osvětlování zcela dezaktivovány, zatímco infekčnost VSV a SV-40 nebyla plně odstraněna ani po 30 minutách.

Pokus 2: Dezaktivace VSV v TK ozařováním UV-B-zářením

Jak vyplývá z tabulky 2, VSV je velmi odolný proti ozařováním UV-B-zářením. Ani po 60 minutách ozařování resp. po přivedeni energie 20 J/cm² nebyl virus zcela dezaktivován. Od asi 10 minut ozařování resp. 3 J/cm² se ozařování UV-B-zářením naopak projevovalo negativně na funkci a skladovatelností thrombocytů (neznázorněno).

• ·· · ·· >· »· • · · · · · • · · 9 9

Tabulka 1: Fotodynamická dezaktivace virů v TK prostřednictvím zpracování thioninem a světlem

Virus	VSV	CSFV	BVDV	SFV
čeleď	Rhabdo	Flavi	Flavi	Tóga
genom	ssRNA	ssRNA	ssRNA	ssRNA
doba osvětlování (min)	30	5	5	5
snížení titru viru	4,4	>5,5	>4,9	>5,2
Virus	HIV-1	SHV-1	SV-40
čeleď	Retro	Herpes	Papova
genom	ssRNA	dsDNA	dsDNA
doba osvětlování (min)	30	10	30
snížení titru viru *	>5,7	>3, 6	3,9

VSV= Vesicular Stomatitis Virus; CSFV= Classical Swine Fever Virus; BVDV= Bovines Virales Diarrhoe Virus; SFV= Semliki Forest Virus; HIV-1= Humanes Immunodefizienz Virus typ 1; SHV-1= Suid Herpes-Virus, typ 1; SV-40= Simian-Virus 40; ssRNA= single strand RNA; dsDNA= double strand DNA, * snížení titru viru v log₁₀TClD₅o.

Tabulka 2: Desaktivace VSV v thrombocytových koncentrátech

UV-B (min)	ozařováním UV-B-zářením
J/cm²	titr viru (log₁₀TClD₅₀)	faktor snížení (logioTCIDso)
0	0	6, 44	0
10	3,25	5,48	0,96
20	6,5	4,53	1,91
30	9,75	4,35	2,09
40	13	3,28	3,16
50	16,25	2,33	4,11
60	19,5	1,61	4,83

···· • · ··♦ ·

10► · · I ·· 44

Pokus 3: Desaktivace VSV v TK kombinací zpracování thioninem a světlem a ozařování UV-B-zářením

Při těchto pokusech byla koncentrace thioninu opět

LiMa a doba osvětlování 30 min. Energie přiváděná ozařováním UV-B zářením byla 2,4 J/cm² (doba ozařování 8 minut). Samotným fotodynamickým zpracováním byla infekčnost snížena o 4 resp. 4,42 logio, samotným ozařováním UV-Bzářením o 1,97 resp. 2,21 logi₀. V kombinaci byla v prvním pokusu infekčnost v prvním pokusu zcela odstraněna (>7,04 logio) , ve druhém snížena o 6,26 log₁₀ (tab. 3).

Tabulka 3: Desaktivace VSV v TK zpracováním thioninem a světlem, ozařováním UV-B-zářením a kombinací obou pracovních kroků

Infekčnost (logioTClD₅o)

Thionin/světlo UV-B Pokus 1 Pokus 2

7,28±0,29 2,86±0,31 5,07±0,12 <0,24±0,00

6,68±0,21 2,68±0,12 4,71±0,17 0,42±0,21

Pokus 4: Vliv zpracování thioninem a světlem v kombinaci s ozařováním UV-B-zářením na funkci thrombocytů

Jak je zřejmé z tabulky 4 a 5, ani HSR (hypotonická šoková reakce), ani kolagenem indukovaná agregace TK není kombinovaným zpracováním thioninem a světlem a ozařováním UV-B zářením (pokusné podmínky jako v pokusu 3) ovlivněna silněji, než samotným fotodynamickým zpracováním.

AAAA AA

- 11 A A A « A

A A A • A A

A A

Tabulka 4: Vliv zpracování suspenze thrombocytů thioninem a světlem ± UV-B na HSR (vyjádřeno v %) měřený 1. den a 3. den po zpracování

č. Zpracování Pokus 1 Pokus 2 Pokus 3

	1. den	2 . den	1. den	2. den	1. den	2 . den
1	kontrolní	71,98	63,07	66,71	60,78	78,16	62,59
2	thionin/světlo	65,49	49,16	56,24	52,61	69, 30	55,49
3	UV-B-záření (2,4 J/cm²)	61,06	57,09	56,26	48,80	65, 67	52,49
4	thionin/světlo	47,86	51,16	42,37	30,26	54,45	48,31

+ UV-B-záření

Tabulka 5: Vliv zpracování suspenze thrombocytů thioninem a světlem ± UV-B na kolagenem indukovanou agregaci (vyjádřeno v %) měřený 1. den a 3. den po zpracování

č. Zpracování Pokus 1 Pokus 2 Pokus 3

	1. den	2 . den	1. den	2 . den	1. den	2 . den
1	kontrolní	88,00	23,00	83,33	30,00	79,67	30,33
2	thionin/světlo	73,25	13,75	84,67	27,67	69,67	15,67
3	UV-B-záření (2,4 J/cm²)	76,25	11,25	73,33	24,50	75, 67	20,00
4	thionin/světlo	69,75	16, 75	76, 67	53, 50	58,33	30,33

+ UV-B-záření

Pokus 5: Dezaktivace T-lymfocytů v TK pomocí UV-B-záření; vliv zpracování thioninem a světlem

K TK byly přidány mononukleární buňky v koncentraci 5xlO^s/ml; poté byly po různou dobu ozařovány UV-B-zářením, nebo navíc zpracovány thioninem a světlem (koncentrace barviva 2 μΜ; doba osvětlování 30 minut). Jak ukazují výsledky shrnuté v tabulce 6, byla pro úplnou dezaktivaci buněk potřebná doba ozařování alespoň 4 minuty (1,2 J/cnh) . Jestliže byly TK navíc zpracovány thioninem a světlem, mohla být zkrácena na asi 3 minuty, ačkoliv zpracováni thioninem a světlem samo nemělo sauny vliv na mnosan_ banán.

.··. ···;

•: :. Opravená strana ·· ·· ►· ·· • · ·

- 12 ·

Tabulka 6: Dezaktivace

T-lymfocytů v thrombocytových koncentrátech ozařováním UV-B-zářením

č.	UV-B (J/cm²	Thionin/ ) světlo	Aktivace ConA	Absorpce OD450nm	Poznámky
1	0	0	-	0,276	negativní
					kontrolní vzorek
2	0	0	+	2,269	pozitivní
					kontrolní vzorek
3	0, 6	-	+	1,767
4	0, 9	-	+	0,747
5	1,2	-	+	0,297
6	0,6		+	1,020
7	0,9	+	+	0,387
8	1,2	+	+	0,240
Zesílení účinku předchozím zpracováním thioninem a světlem po dobu
30	minut.	Buňky byly po	ozařování	popř. zpracování thioninem a

světlem stimulovány pomocí hodnoty z trojího stanovení, po době kultivace 3 dny.

ConA. Hodnoty OD45o_nm jsou střední Představují zabudování BRDU do buněk

01^ /Γ~ .i. - TJ-UPRAVENÁ strana

Claims

1. Způsob zpracování suspenze thrombocytů, zahrnující následující kroky:

(A) vystavení suspenze záření v oblasti vlnové délky 400 až

750 nm v přítomností jedné nebo více fotoaktivních látek, které v této oblasti vlnových délek vykazují jedno nebo více absorpčních maxim, a (B) vystavení suspenze záření v oblasti vlnových délek 270 až 320 nm s přiváděním energie 0,1 až 10 J/cm², přičemž kroky (A) a (B) se provádí v libovolném pořadí a/nebo se časově překrývají, a v kroku (B) není přítomna fotoaktivní látka, která by měla absorpční maximum v oblasti vlnových délek záření podle kroku (B).

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že fotoaktivní látka je fenothiazinové barvivo.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako fenothiazinové barvivo se použije thionin, methylenová modř, toluidinová modř, a/nebo azurová barviva A, B nebo C.

4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že fotoaktivní látka v kroku (A) se použije v koncentraci 0,1 až 10 μΜ, s výhodou 0,5 až 5 μΜ.

5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že intenzita záření v kroku (B) se volí tak, že se schopnost množení T-lymfocytů, obsažených v thrombocvtovém koncentrátu, snižuje o alespoň 50 %, s výhodou o více než 75 %.

• · • · ·· ····

UPRAVENÁ STRANA • ·

6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že energie přiváděná v kroku (B) je 0,1 až 10 J/cm², s výhodou 0,3 až 3 J/cm².

7. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že v kroku (B) se suspenze vystaví záření v oblasti vlnových délek 290 až 320 nm.

8. Způsob podle některého z předcházejicích nároků, vyznačující se tím, že suspenze thrombocytů je thrombocytový koncentrát.

9. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že suspenze thrombocytů nebo thrombocytový koncentrát jsou získány z krve dárců nebo aferézou thrombocytů.

10. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zpracování suspenze podle kroku (A) a/nebo kroku (B) se provádí v plastových nádobkách propustných pro příslušné záření.

11. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zpracování suspenze podle kroku (A) a/nebo kroku (B) se provádí v aparatuře propustné pro příslušné záření.

12. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že koncentrace viru v suspenzi se sníží o alespoň 5, s výhodou 6 stupňů logio.

13. Způsob zpracování suspenze thrombocytů, zahrnující následující kroky:

(A) vystavení suspenze záření v oblastí vlnové délky 400 až

750 nm v přítomností jedné nebo více foroaktivních ·» ···* ♦··· ·· ♦ · · • · ·

Φ * * · • · · · ·♦ Φ»

Pravená strana látek, které v této oblasti vlnových délek vykazují jedno nebo více absorpčních maxim, a (B) vystavení suspenze záření v oblasti vlnových délek 270 až 320 nm s přiváděním energie 0,1 až 3 J/cm², přičemž kroky (A) a (B) se provádí v libovolném pořadí a/nebo se časově překrývají.