CZ200213A3 - Prostředky k regulaci motility zaľívací soustavy a přijímání potravy - Google Patents

Description

Prostředky k regulaci motility zažívací soustavy a přijímání potravy

Oblast techniky

Vynález se týká obecně oblasti léčby obezity a regulace přijímání potravy. Zejména se vynález týká prostředků a způsobů regulace přijímání potravy, při nichž se podávají trichotheceny, jejich deriváty a analogy, nebo purinergní sloučeniny za účelem změny motility zažívací soustavy a tím přesycenosti. Vynález se také týká způsobů skríningu derivátů nebo analogů trichothecenů a také agonistů a antagonistů purinergních receptorů, které jsou užitečné pro regulaci přijímání potravy.

Dosavadní stav techniky

Přejídání vedoucí k obezitě je velký zdravotní problém. Obezita zvyšuje riziko diabetů, onemocnění srdce, rakoviny a jiných chronických chorob kromě zvýšení fyzikálních a mechanických omezení kladených na tělo. I když takové nepříznivé účinky obezity na zdraví jsou vědecky dobře dokumentovány a obvykle veřejností dobře chápány, byla účinná regulace chuti a přejídání na individuální bázi těžko dosažitelným cílem pro miliony lidí. Má se za to, že přibližně 25 procent dětí v Severní Americe má nadváhu nebo je obézních. Obyvatelé Severní Ameriky sami utrácejí přibližně 40 bilionů dolarů ročně za léčby pro snížení hmotnosti a toto množství patrně poroste. Nedávná studie odhadla střídmě roční náklady na léčbu obezity v Kanadě na 1,8 bilionu dolarů, což představuje 2,4 procenta celkových výdajů na zdravotní péči pro všechny choroby (viz Náklady na léčbu obezity: 1,8 bilionu US dolarů, ve Pharmaceutical Manufacturers Association of Canada, březen 1999, strana 11).

• · ·· ···· · ·

Běžně dostupná léčiva proti obezitě účinkují většinou tak, že působí na cesty centrálního nervového systému (CNS), aby se vyvolalo potlačení chuti. Avšak tyto léky mají řadu vedlejších účinků ve spojitosti s CNS, jako úzkost, a existuje zde možnost vzniku chronických zdravotních problémů, jako hypertenze, kardiovaskulární choroby a cukrovka. Jiný běžný přístup k léčení obezity spočívá v regulaci chuti použitím volumenózních produktů, které se podávají místo normální stravy. S těmito volumenózními produkty je spojen problém změny nutričního stavu tím, že volumenózní produkty neobsahují potřebný rozsah žádoucích živin. Kromě toho jedinec, který se živí volumenózním produktem, může odmítat požívat jakoukoliv potravu, dokonce i žádoucí živiny.

Léky, které potlačují chuť k jídlu, patří k nejméně žádoucím prostředkům pro léčbu obezity, protože po přerušení podávání těchto léků se obvykle zase hmotnost vrátí. Dále použití těchto léků mohou omezit nežádoucí vedlejší účinky včetně zvýšeného rizika chorob, jako primární pulmonární hypertenze. Například prostředky pro potlačení chuti k jídlu fenfluramin a dexfenfluramin byly nedávno staženy z trhu jejich výrobci pro potenciální vážné nepříznivé účinky na plíce a srdce.

Jiný typ léčby obezity, který se nedávno objevil, spočívá v použití léků, které zasahují do absorpce tuků z tenkého střeva. Takový lék může například potlačit pankreatické enzymy používané pro trávení tuku. Nestrávený tuk pak projde střevy a je vyloučen. Snížení absorpce tuku může mít za následek olejovitou stolici, olejovité skvrny na spodním prádle, plynatost, častou stolici a snížení absorpce živin rozpustných v tucích, jako vitaminů A, D a E.

Běžně neexistuje žádný léčebný přístup, který by umožnil zamezení zvýšení hmotnosti bez nezdravých vedlejších účinků nebo zvýšeného rizika onemocnění. Zůstává tedy potřeba • · · · ···· · ·

účinného léčení obezity a způsobů regulace zvyšování hmotnosti u lidí a jiných živočichů bez nežádoucích nutričních a zdravotních vedlejších účinků.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou způsoby léčby obezity a regulace přijímání potravy u lidí a jiných živočichů. Vynález je založen na zjištění, jak mykotoxintrichotheceny vyvolávají odmítání potravy nebo krmení u lidí a jiných obratlovců, a také na objasnění nervovým systémem regulovaných charakterů motorické aktivity zažívací soustavy (motilita zažívací soustavy), která pohání potravu orgány zažívací soustavy. Zde popsané způsoby léčby zahrnují podávání sloučeniny, která ovlivňuje charakter motility zažívací soustavy, to znamená charakter kontrakcí, relaxací a klidového stavu tkáně hladkého svalstva orgánů zažívací soustavy. Stimulace charakteru nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy signalizuje přesycenost, to znamená pocit plnosti, který zkracuje dobu jednotlivce strávenou jídlem nebo krmením. Sloučeniny, kter,é stimulují charakter nasycenosti motility zažívací soustavy, jsou tedy užitečné pro způsoby léčby, při kterých účelem je omezení příjmu potravy, jako při léčbě obezity. Sloučeniny, které stimulují charakter hladovění nebo prodlužují nebo zamezují nástup charakteru nasycenosti mot ility zažívací soustavy, budou mít sklon k tomu, prodlužovat dobu jídla nebo krmení, protože tělu není signalizována přesycenost. Takové sloučeniny jsou zejména užitečné při způsobech zvyšování přírůstku na hmotnosti u zvířat, jako skotu a drůbeže pěstovaných jako komerční zdroje masa.

Způsoby léčby obezity podle vynálezu spočívají v podávání účinného množství trichothecenmykotoxinu nebo jeho derivátu, který stimuluje charakter nasycenosti motility zažívací soustavy. Podle výhodného provedení vynálezu spočívají způsoby léčby obezity v tom, že se jedinci podává trichothecen ze skupiny sloučenin strukturálně příbuzných s nivalenolem, za4 4 4 4 4 4 · · · · · • · 4 4 4 4 4 · · · ··· 44 44 44 ·· 4444 hrnující strukturálně příbuzné sloučeniny, sestávající z nivalenolu, 4-deoxynivalenolu (DONu, C15H20O6), trichothekolonu, trichothecinu, 3-acetyldeoxynivalenolu (3-acetyl-DONu, C17H22O7), 7-acetyldeoxynivalenolu, 3,15-diacetyldeoxynivalenolu, 4-acetylnivalenolu (fusarenonu-X), 4,15-diacetylnivalenolu. Pro výhodné způsoby podle vynálezu jsou také užitečné jiné deriváty na bázi DONu včetně karbonátu DONu (tj. 3-hydroxy-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát , C16H18O7), 3-acetyl-DON-karbonát (tj. 3-acetoxy-12,13epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát, C18H20O8), 3-acetyl1-DON-benzy1idenacetal (tj.3-acetoxy-7,15-benzyliden-12,13epoxy-9-trichothecin-8-on, C24H26O8), DON-benzy1 idenacetal (tj. 3-hydroxy-7,15-benzyliden-12, 13-epoxy-9-trichothecin-8-on, C22H24O7), isopropylidin-DON (tj. 3-hydroxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, C18H24O6), isopropy 1 idin-DON (tj. 3-hydroxy-7,15-i sopropy1idin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, C18H24O6) a isopropy1idin-3-acety1DON (tj. 3-acetoxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, (C20H26O7). Výhodněji spočívají způsoby léčby obezity v podávání trichothecenu, jako DONu nebo derivátu na bázi DONu, jedinci v dávce, která není toxická a nevyvolává zvracení, ale která stimuluje charakter nasycenosti motility zažívací soustavy jedince. Trichothecen nebo jeho derivát může být podáván libovolnou cestou včetně orální nebo parenterální cesty.

Alternativně spočívají způsoby léčby obezity v podávání analogu trichthecenu, což je sloučenina, která působí jako trichothecen na stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy. Analogy trichothecenu mohou být strukturálně příbuzná s trichotheceny nebo strukturálně odlišná od trichothecenů. Analogy trichothecenu mohou tedy být odvozeny od trichothecenu, jako je DON, nebo to může být libovolná z řady sloučenin včetně anorganických sloučenin, organických sloučenin, aminokyselin, peptidů, polypeptidů, proteinů, nukleotidů, nukleových kyselin, sacharidů, lipidů a jejich kombinací,

které mají schopnost stimulovat charakter nasycenosti motility zažívací soustavy..

Podle jiného provedení jsou předmětem vynálezu prostředky a způsoby pro regulaci motility zažívací soustavy a léčby obezity u jedince. Tyto způsoby podle vynálezu spočívají v tom, že se jedinci podává sloučenina, která se váže na a stimuluje receptory P2xi-purinu (purinoreceptory), které jsou přítomné v hladkém svalstvu tkání zažívací soustavy a zúčastňují se přímo regulace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy. Agonista receptoru P2xi~purinu je zejména purinergní sloučenina, která váže receptor za účelem stimulace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy. Stejně jako trichotheceny signalizuje stimulací charakteru nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy puringerní sloučenina nasycenost a tím zkracuje dobu krmení a snižuje přísun potravy. Agonista P2_x1-receptoru, který je užitečný pro léčbu obezity podle vynálezu, je s výhodou nesenzibi1 i zující agonista receptoru purinu, protože molekuly agonisty jsou schopné vázat P2x1-receptor a stimulovat charakter nasycenosti motility zažívací soustavy zprostředkovaný P2x1, aniž by blokovaly nebo inaktivovaly receptor. Podle výhodnějšího provedení je nedesenziblizující agonista P2_x1-receptoru strukturní analog ATP nebo 2·,3·-0-(2,4,6-trinitro fenyl)-ATP (TNP-ATP) pro použití při způsobech stimulace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy a pro léčbu obezity.

Podle jiného provedení jsou předmětem vynálezu prostředky a způsoby pro zvyšování hmotnosti jedince. Takové způsoby spočívají v tom, že se jedinci podává desenzibilizující agonista nebo antagonista, jako TNP-ATP, P2x1-receptoru. Desenzibilizující agonista nebo antagonista, užitečný při provádění způsobů podle vynálezu, váže a blokuje P2x1-receptor a tím potlačuje nebo předchází vzniku charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy nebo/a prodlužuje charakter hladovění motility zažívací soustavy, což zase prodlužuje dobu kr-

«· 4 4 4 4 · · · · « · 4 · * ·

4 4 4 * · · 4 · · • 4 4 4 44 4444 mění a příjem potravy. Tyto způsoby jsou zvláště užitečné pro chov skotu a drůbeže na trh.

Podle ještě dalšího význaku vynálezu jsou předmětem vynálezu způsoby pro identifikaci sloučeniny, která stimuluje nebo potlačuje (zamezuje) charakter nasycenosti motility zažívací soustavy přímým zaregistrováním charakteru motility zažívací soustavy in vivo u testovaného jedince během podání a metabolismu sloučeniny u jedince. Tyto způsoby mohou být použity k testování regulérní aktivity sloučeniny, jako známé nebo nové sloučeniny trichothecenu, derivátu trichothecenu, analogu trichothecenu, agonisty P2x1-receptoru nebo antagonisty P2x1-receptoru. Schopnost sloučeniny regulovat (stimulovat nebo potlačovat) charaktery motility zažívací soustavy může být změřena použitím testů in vitro, ex vivo nebo in vivo. Trichothecenní a purinergní sloučeniny a jejich deriváty a analogy, které jsou identifikovány těmito skriningovými metodami, jako schopné stimulovat charakter nasycenosti motility zažívací soustavy, mohou být použity k léčbě obezity způsoby podle vynálezu, zatímco sloučeniny, které potlačují charakter nasycenosti motility zažívací soustavy, mohou být použity ke zvýšení příjmu potravy, jako ke zvýšení přírůstku hmotnosti skotu a drůbeže pro komerční účely.

Vynález je ilustrován následujícími obrázky.

Obrázek 1 představuje schematický diagram uspořádání in vivo Krantise a spol. (Can. J. Physiol. Pharmacol., 74: 894 až 903 (1996), použité pro zaznamenání gastrointestinální motility u anestezovaných pokusných zvířat, jako krysy (1). V detailu (A), znázorňujícím ve zvětšení zažívací soustavu krysy, jsou vidět fóliové tenzometry (2), připojené (např. lepidlem) ke zvoleným místům gastrointestinálních orgánů, například k seróznímu povrchu žaludečního antra (3), k proximálnímu duodenu (4) nebo distálnímu ileu (5) podél podélné svalové vrstvy. Vodiče jsou připojeny k systému (6) pro sběr dat počítače IBM.

···· · · · · • · ♦ · · « • · 9 9 * • · W · · · • · ·· · · · 9

Obrázek 2 představuje schematické znázornění nervových cest regulujících charakter nasycenosti a charakter hladovění gastrointestinální motility v duodenu a ileu. Uspořádání cholinergních (ACh), nitrergních (NO) a purinergních (ATP) neuronů je znázorněno společně s různými úkoly nebo/a vstupy receptoru: mus. (cholinergně muskarinní), 5-HT3 (serotonergní, nic. (cholinergně nikotinický), P2x (purinergní). Plusové znaménko (+) označuje stimulační vstup mezi neurony a stimulaci a kontrakci na hladkém svalstvu gastrointestinální soustavy. Minusové znaménko (-) označuje inhibiční vstup. DON = deoxynivalenol, stimulátor hyperaktivity gastrointestinální soustavy (charakter nasycenosti) a přesycenost. NO = oxid dusnatý, který je nonadrenergní, noncholinergní (NANC) inhibiční snímač v proximálním duodenu a který je také inhibiční snímač propagačně P2x-purinergní a cholinergní (muskarinní, mus.) motorické aktivity v duodenu a ileu. Okružní cesta nitrergního interneuronu (NO) s cholinergním nikotinickým vstupem (nic.) (daleko vpravo) není v ileu přítomna. ATP = adenosintrifosfát, desenzibi1izující agonista purinergních receptorů, jako receptorů P2x. ACh = acetylcholin, cholinergní chemický signál, který navazuje na muskarinní (mus.) receptory k excitování motorických neuronů. 5-HT = 5-hydroxytryptamin (serotonin), váže se na 5-HTa (serotonické) receptory na neuronech a je hlavním snímačem střevních interneuronů zprostředkovávajících neurogenní stimulaci NANC relaxace a cholinergní kontrakce hladkého svalstva zažívací soustavy, nic. = cholinergní nikotinický receptor neuronů.

Obrázky 3A a 3B ukazují strukturní chemické vzorce 4-deoxynivanolu (DONu) a příbuzných derivátů. Obrázek 3A představuje strukturní chemické vzorce pro DON (C15H20O6), 3-acetyl-DON (C17H22O7), isopropylidin-DON (C18H24O6, označený EN139491) a isopropylidin-3-acetyl-D0N (C20H26O7, označený EN139492), Obrázek 3B ukazuje chemické strukturní vzorce pro DON-karbonát (C16H18O7, označený EN139494), 3-acetyl-DON-karbonát (C18H20O8, označený EN139495), 3-acetyl-DON-benzy4 4 · · · 4··· · · ·4 • · · · 4 · · · · 4 *

4·· 444 44 «

444 4 444 4 · lidenacetal (C24H26O8, označený EN139496) a DON-benzy1 idenacetal (C22H24O7, označený EN139497). Na obr. 3B představuje Ph fenylovou skupinu .

Obrázek 4 znázorňuje záznam spontánní motorické aktivity krysího žaludečního antra u kontrolního zvířete, na kterém je patrný oscilační vzhled kontraktiIních a relaxačních odpovědí. Vertikální značky označují čas (t) při 0 a 50 minutách po počátku záznamu. Podávání DONu (první šipka směrem napravo v t = 0 minut) v dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti i.v. prudce zeslabila motorickou aktivitu žaludečního antra. Během 40 minut se kontrolní motorický charakter zregeneroval, avšak bezprostřední nové podání DONu (druhá šipka) bylo bez účinku.

Obrázek 5 ukazuje příklad záznamu charakteru motílity kontrolní aktivity krysího duodena in vivo. Charakter spontánní motílity kontrolní aktivity duodena in vivo (žádný DON) sestává z periodické skupinové (G) a meziskupinové (I) aktivity. Vertikální značky označují čas (t) při 0, 30, 120 a 150 minutách po začátku záznamu. První šipka po t - 30 minut označuje systémově podávaný DON (šipka) v dávce 10 mg/kg tělesné hmotnost (i.v.), který vyvolal podporovanou hyperaktivitu (46 J; 15 minut). Po regeneraci motorické aktivity na kontrolní hodnotu, bylo nové podání DONu (šipka po t = 150 minut) bez účinku.

Obrázky 6A až 6D ukazují data z kvantitativní analýzy účinků L-NAME a alfa,beta-methylen-ATP na frekvenci a amplitudu DONem vyvolaných relaxací v krysím duodenu (obrázek 6A

- frekvence a obrázek 6B - amplituda) a ileu (obrázek 6C

- frekvence a obrázek 6D - amplituda). Skupinová motorická aktivita v přítomnosti L-NAME a DONu (široce diagonálně šrafované sloupky) byla ekvivalentní s aktivitou DONu samotného (úzce diagonálně šrafované sloupky). Alfa,beta-methylen-ATP významně snížil frekvenci a amplitudu DONem vyvolaných relaxací (vyplněné sloupky) na hladinu kontrolní meziskupinové aktivity (bez DONu, prázdné sloupky) v duodenu (n = 8) a ileu • ·« «· ··♦· ·· ·· ···· ·· · · · · ♦ • ·· · · ♦ · · · φφφφ·· φφφφ · ··· φφ φφ ·· ·· ···· (Π = 4).

Obrázky 7Α až 7D ukazují výsledky kvantitativní analýzy účinků antagonisty receptorů 5-HT3, granisetronu, na spotánní a DONem vyvolanou aktivitu v krysím duodenu. Granisetron (i.v. nebo i.a., široce diagonálně šrafované sloupky) selektivně zmenšily frekvenci a amplitudu skupinových relaxací (n = 6) (obrázek 7A - frekvence a obrázek 7B - amplituda) a kontrakcí (n = 3) (obrázek 7C - frekvence a obrázek 7D - amplituda), avšak nezměnil stereotypickou, DONem vyvolanou hyperaktivitu (srovnej úzce diagonálně šrafované sloupky (DON samotný) s vyplněnými sloupky (DON + granisetron)). Kontrolní skupinová aktivita (prázdné sloupky).

Obrázek 8 je sloupkový diagram představující účinky (jako procento kontroly) alfa,beta-methylen-ATP na DONem zvýšenou motorickou aktivitu pro kontrakce a relaxace duodena u prasátek. Kontrola představuje skupinu prasátek, která nedostala žádný DON a žádný alfa,beta-methylen-ATP. DON představuje skupinu prasátek, která dostala pouze DON (1 mg.kg^-1). Alfa,beta-methylen-ATP + DON představuje skupinu prasátek, která dostala intraarteriální injekci alfa,beta-methylen-ATP (300jig/kg, i.a) během DONem (1 mg/kg) zvýšené motorické aktivity duodena. Hodnoty kontrolní skupiny byly stanoveny jako 100 %. Všechny ostatní hodnoty představují procenta kontrolních hodnot. Prázdné sloupky představují průměrnou amplitudu relaxací (4 prasátek). - Vyplněné sloupky představují průměrnou frekvenci relaxací (5 prasátek). Široce křížem šrafované sloupky představují průměrnou amplitudu kontrakcí (3 prasátek). Úzce křížem šrafované sloupky představují průměrnou frekvenci kontrakcí (2 prasátek). TjT znamená p<0,05 ve srovnání s kontrolou, φ znamená p<0,05 ve srovnání s aktivitou zvýšenou DONem.

Obrázek 9 je sloupkový diagram ukazující účinky (jako procento kontroly) alfa,beta-methylen-ATP na DONem zvýšenou motorickou aktivitu (kontrakce a relaxace) ilea u prasátek.

φφ ·· * · « « · · · *··« • ·· φφφ «φ · • •ΦΦΦΦ φ · φ φ · ··· ··«· φφφ

Kontrola představuje skupinu prasátek, která nedostala žádný DON a žádný alfa,beta-methylen-ATP. DON představuje skupinu prasátek, která dostala pouze DON (10 mg/kg). Alfa, beta-methylen-ATP + DON představuje skupinu prasátek, která dostala intraarteriální injekci alfa,beta-methylen-ATP (300 ^/ug/kg, i.a.) během doby, kdy DON (10 mg/kg) zvýšil motorickou aktivitu ilea. Hodnoty kontrolní skupiny byly stanoveny jako 100 %. Všechny ostatní hodnoty jsou procenta kontrolních hodnot. Prázdné sloupky představují průměrnou amplitudu relaxací (4 prasátek). Vyplněné sloupky představují frekvenci relaxací (5 prasátek). Křížem široce šrafované sloupky představují průměrnou amplitudu kontrakcí (3 prasátek). Úzce křížem šrafované sloupky představují průměrnou frekvenci kontrakcí (2 prasátek). znamená p<0,05 ve srovnání s kontrolou.

znamená ρ^Ο,Οδ ve srovnání s DONem zvýšenou aktivitou.

Na obrázku 10 je schematicky znázorněno uspořádání cholinergních, nitrergních, GABAergních, purinergních a VlPergních neurálních prvků v navržených tonických a modulatorních cestách regulujících spontánní motorickou aktivitu v krysím duodenu a ileu. V ileu není přítomna okružní cesta, obsahující GABAergní a nitrergní interneurony (NO) s cholinergním nikotinickým vstupem (nic.) (daleko vpravo). VIP = vasoaktivní střevní peptid, který je aktivátorem nitrergní prejunkční inhibice motorických inervací.

Obrázek 11 ukazuje příklad záznamu kontrolní spontánní motorické aktivity krysího žaludečního antra (poloha Sl) a proximálního duodena (poloha Dl). DON (10 mg/kg tělesné hmotnosti (bw), podaný i.v.) prudce snížil antrální motorickou aktivitu a vyvolal podporovanou hyperaktivitu v duodenu (Dl). Během 60 minut se kontrolní motorický charakter navrátil do původního stavu.

Obrázek 12 ukazuje účinky 3-acety1-DONu na krysí gastrointestinální motorickou aktivitu in vivo. Typický charakter hladovění gastrointestnální motorické aktivity v duodenu • · · ·♦ 9 99 9 9» 99 •· « · 9 9 · · 9 9 9

99 9 9 9 99 9

999 9 999 9 ·

999 99* 9 9 99

999 99 99 99 99 9999 (zaznamenaný na duodenu v místě D2) a v žaludečním antru (Sl) je znázorněn před aplikací léčby 3-acety1-DONem. Po injekci (svislá šipka) 3-acetyl-DONu (10 mg/kg, i.v.) se motorická aktivita změnila na typický charakter nasycenosti motorické aktivity trvající přibližně 40 minut. MMC je podíl skupinové aktivity charakteru hladovění gastrointestinální motility.

Obrázek 13 ukazuje účinky intravenózně aplikovaného 3-acetyl-DONu v dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti na spontánní motorickou aktivitu v krysím žaludečním antru (Sl) a duodenu (D2). Během 60 minut se kontrolní motorický charakter navrátil do původního stavu (viz záznam po 130 minutách). MMC je podíl skupinové aktivity charakteru hladovění gastrointestinální motility.

Obrázek 14 ukazuje typické záznamy motorické aktivity v krysím duodenu (Dl) a žaludečním antru (Sl) in vivo, přičemž ilustruje působení sloučeniny EN139491 (10 mg/kg bw, i,v.) na charakter hladovění motorické aktivity. Horní panel ukazuje 20 minut normálního charakteru hladovění motorické aktivity před podáním sloučeniny. Záznam během tohoto období ukazuje, že u duodena se projevil typický charakter nízkofrekvenční spontánní motorické aktivity společně s šířením skupinové motorické aktivity (MMC) a že u žaludečního antra se projevila typická rytmická motorická aktivita. Druhý panel záznamu ukazuje čas injekce EN139491 'a vývin dlouhotrvající (40 až 60 minut) hyperaktivity v duodenu během 30 sekund injekce a současné a paralelní zeslabení motorické aktivity v žaludečním antru, charakteristické pro charakter nasycenosti motorické aktivity. Návrat charakteru hladovění motorické aktivity do původního stavu je ukázán ve spodním panelu jako prokázaný periodami skupinové MMC aktivity a méně aktivní meziskupinové aktivity.

Obrázek 15 znázorňuje účinek sloučeniny EN139491 na duodenální motorickou aktivitu zaznamenanou v poloze D2 (1,5 cm • · • · ·· distálně od Dl tenzometru). Zkratky mají stejné významy jako na předcházejících výkresech..

Obrázek 16 ukazuje sloupkové diagramy účinku na amplitudu relaxační komponenty gastrointestinální motorické aktivity podáním derivátu DONu EN139491 (10 mg.kg^-1 i.v.) během spontánního charakter hladovění motorické aktivity zaznamenané in vivo z proximálního duodena (Dl) a žaludečního antra Halothanem anestezovaných samčích krys rodu Sprague Dawley. Relaxační amplituda je vyjádřena jako procento regulace meziskupinové aktivity. Znázorněny jsou amplitudy ralaxační komponenty motorické aktivity skupinové motorické aktivity před podáním EN139491 (diagonálně šrafovaný sloupek), pro regulaci mez i skupí nové motorické aktivity před podáním EN139491 (prázdný sloupek, uvedeno jako 100 %) a pro hyperaktivitu po intravenózním podání. Každý sloupkový diagram je průměr + standardní chyba hodnot shrnutých ze záznamů in vivo získaných od 5 až 8 krys rodu Sprague Dawley.

Obrázek 17 ukazuje sloupkové diagramy popsané v obrázku 16 s tím rozdílem, že je znázorněn účinek podání EN139491 na motorickou aktivitu zažívací soustavy na frekvenci relaxační komponenty gastrointestinální motorické aktivity.

Obrázek 18 ukazuje sloupkové diagramy popsané v obrázku 16 s tím rozdílem, že je znázorněn účinek podání EN139491 na gastrointestinální motorickou aktivitu ha amplitudu kontrakční komponenty gastrointestinální motorické aktivity.

Obrázek 19 ukazuje sloupkové diagramy popsané v obrázku 16 s tím rozdílem, že je znázorněn účinek podání EN139491 na gastrointestinální motorickou aktivitu na frekvenci kontrakční komponenty gastrointestinální motorické aktivity.

Obrázek 20 ukazuje typický in vivo záznam motorické aktivity v krysím duodenu (duodenální záznamová místa Dl a D2) a žaludečním antru (antrální záznamové místo Sl) ilustrující

4444 • 4 4 4 · · · 4 4 4 4

44 4 4 · 44 4

444 4 444 4 4

444 4444 444

444 44 44 44 44 4444 působení derivátu DONu ΕΝ139492 (při 10 mg.kg^-1, i.v.) na charakter hladovění gastrointestinální motorické aktivity. Typický charakter hladovění motorické aktivity je zřejmý v záznamu před podáním EN139492. Během tohoto období charakteru hladovění mělo duodenum (Dl a D2) typický charakter nízkofrekvenční spontánní motorické aktivity společně s rozšiřováním skupinové motorické aktivity (MMCs) a žaludeční antrum mělo typicky rytmickou motorickou aktivitu. Během 30 sekund injekčního podání EN139492 (svislá šipka) se vyvinula v duodenu dlouhotrvající (40 až 60 minut) hyperaktivita a současné zeslabení motorické aktivity v žaludečním antru, což je charakteristické pro charakter nasycenosti gastrointestinální motorické aktivity, ačkoliv účinky na antrální motorickou aktivitu nebyly tak trvalé jako na duodenální motorickou aktivitu.

Obrázek 21 ukazuje typický in vivo záznam, ukazující účinky intravenózně podaného antagonisty P2x1-purinoceptoru TNP-ATP (3,5 mg.kg^-1) na spontánní motorickou aktivitu v duodenu (v místě Dl) Halothanem anestezované samčí krysy rodu Sprague Dawley. Záznam ukazuje, že TNP-ATP nevyvolal žádnou odpověď po okamžité injekci (svislá šipka), ale že během 1 minuty inječního podání se rozšiřující se motorická aktivita snížila. Meziskupinová motorická aktivita se významně nezměnila. K regeneraci motorické aktivity na 90 % kontrolní hladiny došlo během 20 minut.

Obrázek 22 představuje typický in vivo záznam, ukazující účinky intravenózně podaného TNP-ATP (3,5 mg/kg) na D0Nem vyvolaný (10 mg/kg bw, i.v., svislá šipka nad DONem) charakter nasycenosti motorické aktivity v krysím duodenu (poloha Dl). Inhibiční účinek TNP-ATP na DONem vyvolaný charakter nasycenosti se projevil během 1 minuty injekčního podání TNP-ATP (svislá šipka nad TNP-ATP).

Obrázek 23 ukazuje účinky intravenózně podaného TNP-ATP (3,5 mg/kg) na DONem vyvolaný charakter nasycenosti mo• 444 ·· 44

4*44 · · · · 4 · ·

44 ♦ 4 · · · · · 4 4 4 4 4 · 4 4 · • •4 4444 444

444 44 44 44 »· 4444 torické aktivity v krysím žaludečním antru (Sl) a duodenu (D2). Během 60 minut kontrolní motorický charakter regeneroval. Části záznamu, které jsou v rámečku, ukazují počáteční působení TNP-ATP v každém místě.

Obrázek 24 ukazuje sloupkové diagramy amplitudy relaxační komponenty gastrointestinální motorické aktivity zaznmenané in vivo na proximálním duodenu (poloha Dl) v Halothanem anestezovaných samčích krysách rodu Sprague Dawley. Je znázorněna amplituda relaxační komponenty DONem vyvolané (10 mg/kg, i.v.) gastrointestinální hyperaktivity za nepřítomnosti TNP-ATP (prázdný sloupek) a v přítomnosti TNP-ATP (3,5 mg/kg, i.v.) (šachovnicovítě šrafovaný sloupek). Znázorněna je též amplituda relaxační komponenty skupinové MMC (diagonálně šrafovaný sloupek) a kontrolní meziskupinová aktivita (vyplněný sloupek). Amplituda relaxační komponenty je vyjádřena jako procento kontrolní meziskupinové relaxační amplitudy, která byla stanovena jako 100 %. Hvězdička označuje význačný (p<0,05) rozdíl ve srovnání s kontrolní meziskupinovou motorickou aktivitou. Každý sloupkový diagram znamená průměr_+ stadardní chyba hodnot shrnutých z in vivo záznamů, získaných od 5 až 8 krys rodu Sprague Dawley. Každé zvíře bylo svou vlastní kontrolou. Dl představuje záznam získaný z tenzometru umístěného v 10 mm vzdálenosti od pylorického sf inkteru.

Obrázek 25 ukazuje sloupkové diagramý frekvence relaxační komponenty gastrointestinální motorické aktivity zaznamenané in vivo na proximálním duodenu (poloha Dl) v Halothanem anestezovaných samčích krysách rodu Sprague Dawley. Je znázorněna frekvence relaxační komponenty DONem vyvolané (10 mg/kg, i.v.) hyperaktivity za nepřítomnosti TNP-ATP (prázdný sloupek) a v přítomnosti TNP-ATP (3,5 mg/kg, i.v.) (křížově šrafovaný sloupek). Také je znázorněna frekvence relaxační komponenty skupinové MMC (diagonálně šrafovaný sloupek) a kontrolní meziskupinové (vyplněný sloupek) aktivity. Frekvence relaxační komponenty je vyjádřena jako procento

·> ··· ·

« • · »· ·· »· » · · * • · · • · t · • · · ·· ··· · kontrolní meziskupinové relaxační frekvence, která je stanovena jako 100 %. Hvězdička, statistiky a podmínky záznamu pokusu jako na obrázku 24.

Obrázek 26 ukazuje sloupkové diagramy amplitudy kontrakční komponenty gastrointestinální aktivity zaznamenané in vivo v proximálním duodenu (místo Dl) v Halothanem anestezovaných samčích krysách rodu Sprague Dawley. Amplituda kontrakční komponenty DONem vyvolané (10 mg/kg, i.v.) gastrointestinální hyperaktivity za nepřítomnosti TNP-ATP (prázdný sloupek) a za přítomnosti TNP-ATP (3,5 mg/kg, i.v.) (křížově šrafovaný sloupek). Také je znázorněna amplituda kontrakční komponenty skupinové MMC (diagonálně šrafovaný sloupek) a kontrolní meziskupinové aktivity (vyplněný sloupek). Amplituda kontrakční komponenty je vyjádřena jako procento kontrolní meziskupinové kontrakční amplitudy, která je stanovena jako 100 %. Hvězdička, statistiky a podmínky záznamu pokusu jako na obrázku 24.

Obrázek 27 ukazuje sloupkové diagramy frekvence kontrakční komponenty gastrointestinální motorické aktivity zaznamenané in vivo v proximálním duodenu (místo Dl) v Halothanem anestezovaných samčích krysách rodu Sprague Dawley. Je znázorněna frekvence kontrakční komponenty DONem vyvolané (10 mg/kg, i.v.) hyperaktivity za nepřítomnosti TNP-ATP (prázdný sloupek) a v přítomnosti TNP-ATP (3,5 mg/kg, i.v.) a přítomnosti TNP-ATP (3,5 mg.kg^-1) (křížově šrafovaný sloupek). Také je znázorněna frekvence kontrakční komponenty skupinové MMC (diagonálně šrafovaný sloupek) a kontrolní meziskupinové aktivity (vyplněný sloupek). Frekvence kontrakční komponenty je vyjádřena jako procento kontrolní meziskupinové kontrakční frekvence, která je stanovena jako 100 %. Hvězdička, statistiky a podmínky záznamu pokusu jako na obrázku 24.

Předmětem vynálezu jsou prostředky a způsoby léčby obezity a regulace příjmu potravy modulací motorické aktivity *9 9999 «9 9

9< . ·

9 ··

gastrointestinálních orgánů u lidí a jiných obratlovců. Tyto způsoby jsou založeny na zjištění, že trichothecenové sloučeniny, jako 4-deoxyvalenol (DON) stimulují charakter kontrakcí a relaxací v orgánech zažívací soustavy, ke kterým normálně dochází, když je potrava trávena. Stimulace tohoto charakteru nasycenosti gastrointestinální motility signalizuje přejedenost, to znamená pocit plnosti, což je důležitý faktor, který ovlivňuje dobu, kterou jednotlivec tráví jídlem. Trichotheceny, jako DON, působí na místě vně orgánů zažívací soustavy a vysílají signál, který je poslán dolů nevovými cestami vedoucími k hladkému svalstvu gastrointestinálních orgánů. Zjistili jsme, že specifický receptor, purinergní receptor P2x1, přítomný na buňkách hladkého svalstva tenkého střeva, se zúčastňuje regulace specifických aspektů gastrointestinální motorické aktivity. Sloučeniny, které působí jako agonisté nebo antagonisté receptorů P2xi , jsou také užitečné při regulaci gastrointestinální motility a ovládání přejedenosti a doby strávené jídlem.

Za účelem přesného popsání vynálezu jsou následující výrazy definovány takto:

Ve smyslu zde používaném se zažívací soustava týká gastrointestinálního traktu, sestávajícího z žaludku, tenkého střeva a tlustého střeva.

Ve smyslu zde používaném se výrazy motilita zažívací soustavy nebo motorická aktivita zažívací soustavy týkají motorického chování hladkého svalstva v gastrointestinálních orgánech (žaludku, tenkém střevě a tlustém střevě) lidí a jiných živočichů, kterážto činost sestává z období střídavých svalových kontrakcí a relaxací, jakož i z období klidu nebo poměrně malé aktivity. Například u normálních, zdravých lidí a jiných živočichů se frekvence a amplituda svalových kontrakcí a relaxací tenkého střeva zvyšuje, když je strava trávena, aby tato byla tlačena dopředu do střev za účelem extrakce a absorpce živin (viz níže charakter nasycenosti mo*4 ·»*·

9

9 9 9 • 99 *4 • 9 · 9 ·

9 « tility zažívací soustavy). Mohou vzniknout jiné charaktery motílity zažívací soustavy v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti potravy v různých částech orgánů zažívací soustavy. Dále může proximální část příslušného gastrointestnálního orgánu mít motorické chování, které se liší od aktivity v distální části tohoto orgánu, jako v případě duodena (počáteční část tenkého střeva) a ilea (konečná část tenkého střeva) .

Ve smyslu zde používaném jsou výrazy charakter nasycenosti, aktivita charakteru nasycenosti a segmentace synonymní a týkají se kontinuálního charakteru kontrakcí a relaxací tenkého střeva zažívací soustavy u žvočichů včetně lidí, ke kterým normálně dochází jako výsledek trávení potravy. Při charakteru nasycenosti motílity zažívací soustavy je strávená potrava protlačována zažívací soustavou za účelem extrakce a absorpce živin a nakonec dojde k vyměšení neabsorbovaného materiálu jako odpadu. Charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy začíná typicky během minut trávení potravy a zodpovídá za signalizaci přesycení, to znamená pocitu plnosti. Tedy přesycenost od charakteru nasycenosti motílity zažívací soustavy normálně informuje jednotlivce, že jídlo může být ukončeno. Přesycenost pociťuje jednotilovec prostřednictvím charakteru nasycenosti motílity zažívací soustavy dlouho před tím, než je mozek schopen analyzovat obsah živin v krvi (oddělený proces, ke kterému dochází několik hodin po té, co byla potrava zkonzumována a který zodpovídá za signalizaci nedostatku specifických živin, jako bílkovin, sacharidů, soli a tuků, které jsou udržovány na specifických hladinách pro udržení zdraví).

Charakter nasycenosti je charakteristický a rozdílný pro každý orgán a dokonce pro různá místa v tomtéž orgánu zažívací soustavy. V tenkém střevě se charakter nasycenosti vyznačuje kontinuální sérií kontrakcí a relaxací hladkého svalstva, které promíchává střevní obsah, tlačí ho dopředu do střev a zabraňuje předčasnému protlačení, aby se zvýšila ab• · · · · · sorpce susbstrátu (Lundgren a spol., Dig. Dis. Sci., 34: 264-283 (1989)). Při měření a záznamu in vivo metodou Krantise a spol. (Can. J. Physiol. Pharmacol., 74: 894-903 (1996)) je charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy v duodenu charakterizován intenzivním charakterem hyperaktivity, zatímco se současně v žaludečním antru charakter nasycenosti vyznačuje měřitelným potlačením nebo snížením zaznamenané tkáňové motorické aktivity. Tento charakter nasycenosti nahrazuje charakter hladovění motorické aktivity zažívací soustavy (viz níže), ke kterému dochází po té, co byla potrava protlačena zažívací soustavou za účelem extrakce potravy. Charakter nasycenosti motility je aktivována primárně periferními autonomními gangliemi cestou primárně vagálních přívodů, ale v menším rozsahu je regulován centrální nervovou soustavou (CNS) (viz Yoshida a spol., J. Pharmacol. Exp. Therap., 256: 272-278 (1991), Tanaka a spol., J. Surg. Res., 53: 588-595 (1996), Chung a spol., Can. J. Physiol. Pharmacol., 70: 1148-1153 (1992)). Přeaktivace autonomních nervů urychluje nástup a zvýšení doby charakteru nasycenosti, přičemž se současně zvyšuje frekvence a amplituda rozšiřující se motorické aktivity zažívací soustavy (Halí a spol., Am. J. Physiol., 250: G501-G510 (1986), Johnson a spol., Am. J. Surg., 167: 80-88 (1994), viz též níže Příklady). Jak je uvedeno výše, trichothecenové mykotoxiny, jako DON, mohou být nyní použity v správných množstvích ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy.

Charakter hladovění nebo charakter cyklického motorického hladovění motorické aktivity zažívací soustavy se týká motorického chování zažívací soustavy v nepřítomnosti strávené potravy nebo před strávením potravy, když žádný strávený materiál není přítomen pro protlačení ze žaludku do střev. V duodenu (začátek tenkého střeva) je charakter hladovění motorické aktivity zažívací soustavy charakterizován střídáním období spontánních, nepravidelných kontrakcí a relaxací (skupinová aktivita) a relativně klidných období (meziskupinová aktivita). Příklad duodenálního charakteru • ·

hladovění s jeho střídavými skupinovými a meziskupinovými aktivitami je znázorněn v rané části (mezi t=0 a t=30 minut) záznamu motility zažívací soustavy v obr. 5. V ileu (koncová část tenkého střeva) je charakter hladovění charakterizován nepravidelnou kontraktilní nebo/a relaxační motorickou aktivitou nebo všeobecně klidovým stavem. Trávení potravy přerušuje charakter hladovění motility zažívací soustavy a stimuluje kontinuální aktivitu charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy.

Donedávna nebyly k dispozici metody pro přesné měření a charakterizování motility zažívací soustavy, protože za experimentálních podmínek mohla být měřena pouze jedna komponenta, bučf kontrakce nebo relaxace. Nedávno však Krantis a spolupracovníci vyvinuli metodu současného měření kontrakční a relaxační komponenty motility zažívací soustavy pro různé orgány gastrointestinálního traktu použitím miniaturizovaných, ohebných, fóliových tenzometrů, které mohou být připojeny in vivo k různým místům na orgánech zažívací soustavy (viz Krantis a spol., Can. J. Physiol. Pharmacol., 74: 894-903 (1996)). Při této metodě jsou vodiče od měřidel, připojené k orgánům, spojeny s počítačovým systémem pro analýzu dat (viz obr. 1). Metoda Krantise a spol. (1996) může být použita pro farmakologické, neurologické a fyziologické studie zažívací soustavy postupy in vivo, ex vivo (orgány umístěné mimo tělesnou dutinu) a in vitro (tkáň odebraná z orgánů zažívací soustavy) (viz Příklady, níže). Schopnost současně zaznamenávat kontrakce a relaxace v orgánech zažívací soustavy a na řadě míst v těchto orgánech poskytuje přesnější charakterizaci motility zažívací soustavy včetně rozdílných charakterů motility zažívací soustavy a účinku stravy a různých chemických sloučenin na takové charaktery.

Ve stavu hladovění se zažívací soustava vyznačuje cyklickýn motorickým chováním známým jako MMC, migrační motorický komplex nebo migrační myoelektrický komplex. MMC mají spojitost s interdigestivní propulzí střevních obsahů • ·

·· ·· ·· · ··· a zahrnují postupnou aktivaci excitačních a inhibičních neuronů za účelem propagace cyklů kontrakcí a relaxací, které vznikají v žaludku a končí v ileu. Jeden cyklus MMC sestává ze tří rozdílných fází: fáze I je klidová fáze, fáze II je období nepravidelného přerušení aktivity a fáze III je krátké období rychlých nástupů aktivity. MMC zajištují základní vnitřní motorický charakter, který funguje jako vrátný tenkého střeva. Například vysoce propulzivní fáze III motorické aktivity každého cyklu MMC zametá lumen střeva, čímž ho zbavuje zbytků, aby se zamezilo nadměrnému růstu bakterií, zpětnému toku a akumulaci střevních sekretů (Caenepeel a spol., Dig. Dis. Sci., 34: 1180-1184 (1989)). Vzhledem k použití metody Krantise a spol. (1996) je ted“ jasno, že motilita zažívací soustavy může sestávat jak z kontrakcí, tak z relaxací hladkého svalstva. Zdá se, že v nepřítomnosti potravy skupinová aktivita charakteru hladovění motility střevní části zažívací soustavy odpovídá stejnému typu motorické aktivity, klasicky připisované fázi III MMC. Přítomnost potravy v lumenu střeva vyvolává přeměnu charakteru hladovění na charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy.

Metoda Krantise a spol. (1996) také umožnila objevení způsobu působení sloučenin nazývaných trichotheceny nebo trichothecenmykotoxiny na motilitu zažívací soustavy. Jak je zřejmé z příkladů 1 a 2 (níže), trichothecen-4-deoxynivalenol (DON) působí na místech mimo zažívací soustavu za účelem stimulace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy, což charakteristicky nastává po strávení jídla a což signalizuje přesycenost, to znamená pocit plnosti. Tato zjištění poskytují mechanismus, který umožňuje vysvětlit dobře dokumentované anorektické nebo potravu odmítající chování lidí a jiných živočichů, kteří požili plodiny kontaminované fungálními druhy, které produkují DON nebo jiné trichotheceny. Vynález poskytuje způsob léčby obezity, která využívá schopnosti trichothecenových sloučenin k vyvolání charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy a přesycení. Zde popsané způsoby léčby obezity spočívají v podávání trichothecenu nebo podobně působící

sloučeniny, která stimuluje charakter nasycenosti motility zažívací soustavy a tím pocit přesycení. Při pocitu plnosti dostává jedinec signál, aby přestal jíst. Když se periodicky se opakující hladiny podané sloučeniny sníží, přesycenost je menší a jedinec může pokračovat jíst nebo žrát.

Předmětem vynálezu jsou také způsoby regulace příjmu potravy podáváním agonisty nebo antagonisty receptoru P2xi purinu (purinoreceptoru), který zprostředovává skupinové relaxace tkáně zažívací soustavy. Podle vynálezu trichothecen, jako DON a jeho deriváty a analogy, který stimuluje charakter nasycenosti motility zažívací soustavy, ve skutečnosti působí na místě vně zažívací soustavy. Od tohoto vzdáleného místa působení putuje signál dolů po nervových cestách k buňkám hladkého svalstva zažívací soustavy, které exprimují receptory P2xi-purinu, které se zúčastňují regulace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy (viz obr. 2). Sloučenina, která váže a ovlivňuje purinoreceptor P2xi, působí tedy na koncové části nervové cesty, kdežto DON nebo jiné takové trichotheceny působí výše. Podle vynálezu sestává jedna skupina sloučenin užitečných při způsobech zde popsaných z analogů adenosintrifosfátu (ATP), které mohou působit jako agonisté nebo jako antagonisté P2_x1-purinoceptoru. Jak je vysvětleno níže, váží určité typy agonistů P2x1-purinoreceptoru receptor a stimulují charakter nasycenosti motility zažívací soustavy. Takoví agonisté P2x1-purinoceptoru mohou být použity při způsobech léčby obezity místo trichothecenů. Antagonista P2x1-purinoceptoru je sloučenina, která váže a blokuje receptor, čímž vyřadí nebo zeslabí charakter nasycenosti. Takoví antagonisté P2x1-receptoru potlačují nebo zamezují vzniku charakteru nasycenosti a přesycenosti a tak mohou být použity k prodloužení doby jídla nebo krmení a k podpoření přírůstku na hmotnosti.

Trichotheceny použitelné podle vynálezu

Historicky byly trichothecenové sloučeniny identifiko22 ft 9* 99 99·· ·· ·♦ « · « 9 9 · · · · · · ··· .«· · · · • * · · · · β·· · · «·· ·· ·· ·· ·· ···· vány jako jedny z toxických sekundárních metabolitů produkovaných různými houbami, které mohou kontaminovat plodiny, proto označení trichothecenmykotoxiny. Živočichové včetně lidí, kteří pozřou takto kontaminované plodiny, mohou zaznamenat různé patologické symptomy mykotoxikosy, jako zvracení, průjem, hemoragické leze ve vnitřních orgánech, alimentární toxickou aleukii (ATA), agranolocytózu, aplastickou anémii, nekrotickou angínu, zánět slizničních membrán, odpor k jídlu, křeče, sepsi a v některých případech smrt (viz například Ueno, Trichothecene Mycotoxins: Mycology, Chemistry, and Toxicology v Advances in Nutritional Research 1980, 3: 301-353 (1980) ) .

Ve smyslu zde používaném se výraz trichothecenmykotoxin nebo trichothen týká zástupce ze sesquiterpenoidní skupiny chemických sloučenin na bázi neolefinické výchozí nebo základní sloučeniny trichothekanu. Všechny trichotheceny jsou modifikované seskviterpeny a obsahují olefinickou (dvojnou) vazbu (proto trichothecen) mezi atomy uhlíku v poloze 9 a 10 (C-9, C-10) a epoxykruh vytvořený mezi atomy uhlíku t

v poloze 12 a 13 (C-12, C-13). Trichotheceny jsou tedy také charakterizovány jako 12,13-epoxytrichothecenové sloučeniny. Ueno zatřídil přírodně se vyskytující trichothecenové mykotoxiny do čtyř skupin na bázi strukturálních a také fungálních charakteristik (viz například Ueno, 1980, viz shora). Podle tohoto klasifikačního schématu jsou zástupci skupiny trichothecenů, reprezentovaných nivalenolem, nemakrocyklické sloučeniny, které mají uhlík-8 (C-8) substituovaný ketoskupinou (oxo-). Kromě nivalenolu obsahuje skupina trichothecenů zpřízněných s nivalenolem takové přírodně se vyskytující trichothecenmykotoxiny jako 4-deoxynivalenol (DON), trichothekolon, trichothecin, 3-acetyldeoxynivalenol (3-acetyl-DON), 7-acetyldeoxynivalenol, 3,15-diacetyldeoxynivalenol, 4-acetylnivalenol (fusarenon-X) a 4,15-diacetylnivalenol. Ve významu zde používaném se DON, 4-DON, deoxynivalenol, 4-deoxynivalenol a vomitoxin všechny týkají téže trichothecenové sloučeniny, která má chemickou strukturu znázorněnou • ·

na obrázku 3. Nivalenol se tedy liší od DONu v tom, že nivalenol obsahuje hydroxylovou skupinu v poloze C-4, zatímco DON neobsahuje hydroxylovou skupinu (4-deoxy) v poloze 4.

Akoliv je DON bez pochyby schopen způsobovat závažné a široce rozšířené výskyty toxikózy při požití v dostatečně vysokých množstvích, je přesto považován za jednoho z nejméně účinných trichothecenů s ohledem na subletální toxikózu (viz například Prelusky a spol., Arch. Environ. Contam. Toxicol., 22: 36-40 (1992), Friend a spol., Can. J. Anim. Sci., 66: 765-775 (1986), Ueno v Developments in Food Science IV, Trichothecenes, Chemical, biological and toxicological aspects (Elsevier, Amsterdam, 1983), str. 135-146).

DON je také nemutagenní, jak bylo zjištěno použitím hepatocyty zprostředkovaného mutagenního testu s plicními buňkami čínského křečka VT79 (Rogers a Heroux-Metcalf, Cancer Lett., 20: 29-35 (1983) nebo na modelu vzniku kožního tumoru u myši rodu Sencar (Lambert a spol., Food Chem. Toxicol., 33: 217-222 (1995)). Buněčná toxicita není ovlivněna změnou v syntéze nebo opravě deoxyribonukleové kyseliny (DNA) (Bradlaw a spol., Food Chem. Toxicol., 23 :1063-1067 (1985), Robbana-Barnat a spol., Toxicology, 48: 155-166 (1988)).

Zdá se, že DON neprochází žádným rozsáhlým metabolismem jater a je rychle a převážně vylučován močí. V moči byly též nalezeny deriváty glukuranidu deoxynivalenolu a deepoxidu DONu, zřejmě jako výsledek metabolismu pomocí mikrobů v zažívací soustavě zvířat, kterým byl podán DON (viz například Worrel a spol., Xenobiotica, 19, 25-32 (1989), Lake a spol.,

Food Chem. Toxicol., 25: 589-592 (1987)). Dále, jak jsme zjistili, působí DON a ostatní trichotheceny stimulací odpovědí vně zažívací soustavy, které mají výrazný účinek na svalovou aktivitu zažívací soustavy. To znamená, že DON nepůsobí přímo na hladké svalstvo nebo jiné struktury tkání zažívací soustavy a nezúčastňuje se žádnými škodlivými účinky na tkáně zažívací soustavy za účelem dosažení svých účinků na motilitu

zažívací soustavy. Proto jsou DON a ostatní trichothecenové sloučeniny příbuzné s nivalenolem zvláště vhodné pro použití při zde popsaných způsobech pro léčbu obezity. Trichotheceny, které nejsou strukturálně příbuzné s DONem a ostatními sloučeninami příbuznými s nivalenolem, mohou být též použity při způsobech léčby obezity s výhradou, že také stimulují charakter nasycenostri motility zažívací soustavy a to v dávkách, které nemají za následek žádné nežádoucí nebo závažné symptomy klinické mykotoxikózy.

jako sekundární metaboliFusarium, Trichothecium, kultur Fusaria by1171-1178 (1983), (1986), Greenhalgh

Trichotheceny a jejich deriváty, které jsou užitečné podle vynálezu, mohou být vyrobeny biologicky z kultur hub nebo chemickou syntézou. Řada hub v půdě, o nichž bylo zjištěno, že kontaminují a rostou na obilních zrnech a jiných plodinách, produkují trichotheceny ty. Tyto houby zahrnují druhy

Trichoderma, Myrothecium, Cy1indrocarpon a Stachybotrys (viz Ueno, 1980). Způsoby výroby a čištění DONu a acetylesterů DONu (jako 3-acetyl-DONu a 15-acetyl-D0Nu) z ly popsány (viz Can. J. Microbiol., 29:

Miller a Blackwell, Can, J. Bot., 64: 1-5 a spol., Proceedings of the 6th IUPAC International Symposium on Mycotoxins and Phycotoxins: 137-152 (Steyn, P.S., vyd.) (Elsevier Press, Amsterdam, 1986), Miller a Arnison (Can. J. Plant Path., 8: 147-150 (1986)). Různé trichotheceny, užitečné při provádění způsobů podle vynálezu, mohou tedy být produkovány a extrahovány z kultur hub použitím standardních technik kultivace a produkce (viz například Ehrlich a spol., 206-213 (1987), Ueno, 1980 (výJak bylo shora uvedeno, je DON hojně se vyskytující kontaminant žita a pšenice. DON a jiné trichotheceny mohou tedy být izolovány z kontaminovaných plodin. Alternativně mohou být izolovány z brazilských keřů Baccharis magapotomica a cordfolia (Kupchan a spol., J. Org. Chem., 42: 4221-4225 (1977)). Kromě toho poskytuje vynález nové deriváty DONu, které mohou být syntetizovány z DONu nebo z 3-acetyl-DONu, jak popsáno níže v příkladech.

Biochem. Biophys. Acta, 932: še) a odkazy tam citované).

·· ·· • ♦ · 1 • 9 <

♦ · · ♦

Kromě toho mohou být též použity houby, které produkují trichotheceny, pro modifikaci preexistujících trichothecenů. Taková biotransformace DONu a jeho derivátů byla provedena v různých laboratořích použitím bakterií (Shima a spol., Appl. Environ. Microbiol., 63: 3825-3830 (1997)) nebo kmenů Fusaria. Například F.roseum, udržované v peptonem suplementovaném médiu, mění 3-acetyldeoxynivalenol na DON (Yoshizawa a spol., Appl. Microbiol., 29: 54-58 (1975)). F. nivale je schopno acetylovat DON na uhlíku v poloze 3, čímž se získá 3-acetyl-DON. Dále jsou tyto kmeny schopny deacetylovat 7, 15-diacetyl-DON na 7-acety1-DON.

Chemie trichothecenů je dobře známá, takže různé trichothecenové sloučeniny mohou být syntetizovány chemickými nebo biochemickými procesy. Trichotheceny jsou seskviterpenové alkoholy nebo estery chemicky příbuzné s tetracyklickým 12,13-epoxytrichothek-9-enovým skeletem (Williams, Arch. Environ Contam. Toxicol., 18 :374-387 (1989)). Bylo uvedeno, že určité trichotheceny příbuzné s 4-DONem mohou též být připraveny použitím T-2-toxinu trichothecenů (4beta,15-diacetoxy-3alfa-hydroxy-8alfa-(3-methylbutyryloxy)-12,13-epoxytrichothek-9-enu) jako výchozího materiálu, protože je produkován v hojné míře Fusariem tricinctum a je snadno modifikován v polohách C-3 a C-8 (Ehrlich a spol., Appl. Environ. Microbiol., 50: 914-919 (1985), Udell a spol., Z. Naturforsch, 44: 660-668 (1989)). Odstranění C-3-hydroxylove ·skupiny z T-2 zahrnuje počáteční konverzi T-2 na 3-fenylthionokarbonát a pak redukci tohoto meziproduktu tri-n-butylcínhydridem na 3-deoxy-T-2. Tento přístup byl použit jinými pro přípravu 3-deoxyanguidinu a 4-deoxyverukarolu (Schuda a spol., J. Nat. Prod., 47: 514-519 (1984)).

Bylo též prokázáno, že za účelem vytvoření funkční skupiny C-8-oxo- (to znamená trichothecenů příbuzných s DONem), se T-2 a deoxy-T-2 oxidují dioxidem selenu (Bamburg a spol., Tetrahedron, 24: 2329-3336 (1968). Další deriváty, jako

THP-7-D0N (tetrahydropyranyl-7-DON) a DIDON (3,7-dideoxynivalenol) byly připraveny zavedením C-8-ketonu do T-2-toxinu (Bamburg a spol., 1968). To se dosáhne tím, že se nejprve připraví 3-THP-T-2-triol a 3-deoxy-T-2-triol a pak se tyto oxidují oxidem manganičitým (MnOž) (Warpehoski a spol., J. Org. Chem., 47: 2897-2900 (1982)). Pro přípravu 7-DONu z T-2-tetraolu není možná oxidace vzhledem ke konkurenci reakcí spojených s rozštěpením kruhu a k nízké rozpustnosti T-2-tetraolu v methylenchloridu, který se používá jako rozpouštědlo pro reakci. Pro přípravu THP-7-DONu z THP-T-2-triolu je oxidace pomocí Mno2 jedinou možnou metodou, protože kyselina octová použitá jako rozpouštědlo pro oxidaci oxidem seleničitým by odstranila tetrahydropyranylovou skupinu. Vedlejšími produkty při oxidacích pomocí Mn02 jsou trichotheceny s 15-karboxaldehydovou funkční skupinou

Identifikace sloučenin příbuzných s DONem

Trichothecenové sloučeniny příbuzné s DONem mohou být identifikovány pomocí hmotnostního spektra, NMR (nukleární magnetické rezonance) spektroskopie, infračervené spektroskopie, barvením anisaldehydem a TLC (chromatografie na tenké vrstvě), aby byla odhalena přítomnost jednoho nebo více různých strukturálních znaků DONu nebo jiných trichothecenů.

Všechny trichotheceny příbuzné s DONem by měly mít NMR spektra ukazující očekávaný AB kondenzační - charakter od protonů C-13a a C-13b a proton při 6,5 ppm pro C-10 (Cole a Cox, Handbook of Toxic Fungal Metabolites (Academie Press, New York, 1981), str. 152-263).

Při barvení anisaldehydem tvoří 8-oxo-substituované (keto)trichotheceny citrónově žlutý adukt, kdežto sloučeniny bez ketoskupiny v poloze 8 tvoří červeně nebo hnědě zbarvený adukt.

V infračerveném spektru absorbuje karbonylová skupina v + ·· ·· ··«· ·· ·· • · ♦ · «· · · · · » • ·· ··· ·· * ···«·· 9 9 9 9 9 ·»· 99 »* *· 9· 9999 poloze 8 při 1660 až 1680 cm¹. To potvrzuje, že trichothecen si zachovává alfa,beta-nenasycenou ketonovou funkční skupinu.

Hodnoty hmotnostní spektroskopie pro acetylované analogy DONu by měly ukazovat výchozí ion a fragmentové ionty předpokládané ztrátou acetylu nebo octové kyseliny během procesu .

Každý trichothecen, používaný při způsobech zde popsaných, je s výhodou čištěn tak dlouho, až migruje jako diskrétní tečka na chromatografií na tenké vrstvě (TLC). Homogenity může být dále dosaženo použitím vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC), při které by příslušný trichothecen měl eluovat jako jediný pík. Analýza GC-MS (plynová chromatografie a hmotnostní spektroskopie) byla rovněž užitečná k hodnocení čistoty, jak například znázoňuje jediný pík pro každý typ druhu vyčištěného acetylovaného trichothecenu (Cole a Cox, 1981, viz výše).

Jak je pojednáno níže, zahrnuje vynález také sloučeniny, při kterých jeden nebo více shora popsaných strukturálních znaků DONu nebo jiný trichothecen byl modifikován nebo dokonce eleminován tak, aby byla vytvořena sloučenina, která může být též použita v prostředcích a způsobech podle vynálezu .

Deriváty a analogy trichothecenu muluje charakter aniž by způsobil zvracení, což je

DON může být použit u způsobů podle vynálezu, jako je léčba obezity, ale musí být použit v takové dávce, která stinasycenosti motility žaludeční soustavy, nějaké nežádoucí vedlejší účinky, včetně jeden z klinických symptomů mykotoxikózy.

I když farmaceuticky přijatelná dávka trichothecenu, jako DONu, může být stanovena použitím standardních metod, bylo by žádoucí vytvořit modifikaci v trichothecenové chemické struktuře, aby se získala strukturálně příbuzná sloučenina, která

Φ φφ ·» ··♦· 0Φ 0 0 • · φ Φ ΦΦ 0 Φ·*Φ

ΦΦΦ ΦΦΦ Φ Φ ·

ΦΦ ΦΦΦ φ ΦΦΦ Φ ·

ΦΦΦ ΦΦΦΦ «ΦΦ

ΦΦΦ ΦΦ »· ·· ·· ···· by byla dokonce benignější, pokud se týká možných nežádoucích vedlejších účinků. Takový benigní trichothecen (například benigní DON) je derivát původního trichothecenu a očekává se, že bude srovnatelně účinný nebo účinnější než původní trichothecen, pokud se týká stimulace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy, ale s menšími nebo s žádnými nežádoucími vedlejšími účinky. Výhodný derivát trichothecenu (např. derivát DONu) bude tedy mít jednu nebo více lepších vlastností a bude výhodnější než známý trichothecen, jako DON, pro způsoby léčby obezity.

Různé strukturní znaky DONu zajišťují například na sloučenině místa, která jsou zvláště atraktivními kandidáty pro modifikaci k vytvoření derivátů DONu. DON je s výhodou relativně malá molekula a má omezený počet míst vhodných pro modifikaci ke změně této sloučeniny. Taková místa zahrnují nenasycenou vazbu mezi C-9 a C-10, přítomnost 12,13-epoxidodového kruhu, přítomnost hydroxylové nebo jiné skupiny na strukturním jádru trichothecenu a výskyt hydroxylu nebo jiných substituentů na C-3, C-4 a C-15 (viz obrázek 3A) . Kromě toho prostorové molekulární modely odhalují řadu znaků trichothecenového jádra, které poskytují dodatečnou informaci pro úvahu, které místo(místa) by měla být modifikována pro získání derivátu DONu. Kyslíkové substituenty na A-kruhu (C-8-ketoskupina a C-7-hydroxylová skupina) způsobují, že se tato strana molekuly stane hydrofilnější, než když není přítomen žádný substituent nebo když v T-2-toxinu je přítomen postranní řetězec isovaleroxy. Přítomnost hydroxylových skupin ve vhodných polohách na jádru mění biologickou aktivitu. Například rozdíl mezi 4-deoxynivalenolem (DONem) a nivalenolem spočívá v přítomnosti hydroxylové skupiny na C-4 v DONu.

Studie vztahu mezi trichothecenovou strukturou a charakteristickou schopností trichothecenů potlačovat syntézu proteinů odhalily také řadu zajímavých rysů, které mohou být brány v úvahu při přípravě derivátů DONu nebo jiných trichothecenů, které mohou být použity při způsobech podle vynálezu «· 4 4 ···· ·· 4* • 4 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 4 *99 9 999 9 · • 9 9994 449

44 + 9 99 44 9494 (viz Erlich a spol., Biochim. Biophys. Acta, 923: 206-213 (1987), Rotter a spol., Env. Health, 48: 1-34 (1996)). Vzhledem k inhibici syntézy proteinů nemají nejúčinnější trichotheceny substituci v A-kruhu obsahujícím 8-oxo-substituent nebo mají esterifikované hydroxylové skupiny. Když je přítomna C-7-hydroxylová skupina, může dojít k vazbě vodíku (H) na C-8-ketoskupinu, to však činí kruh stéricky napnutější. K H-vazbě může také dojít mezi C-15 a C-7-hydroxylovými skupinami. Odstranění C-7-hydroxylové skupiny odkryje C-15-substituent na straně trichothecenu od 12,13-epoxidu. Kromě toho musí C-7-hydroxylová skupina přispívat k účinosti trichothecenu, protože nivalenol, který obsahuje C-7-hydroxylovou skupinu, je účinnější než 7-DON, který neobsahuje hydroxylovou skupinu. Je tedy zřejmé, že srovnatelná nebo odpovídající místa v DONu a jiných trichothecenech, zejména v trichothecenech příbuzných s nevalenolem mohou být považována za potenciální místa pro modifkaci za účelem přípravy derivátu DONu nebo jiného trichothecenu, který je užitečný v prostředcích a způsobech podle vynálezu.

Příklady derivátů trichothecenu DONu, užitečných v prostředcích a způsobech podle vynálezu, zahrnují sloučeniny zde uvedené, jako 3-acetyl-DON (C17H22O7), isopropylidin-DON (3-hydroxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, C18H24O6, označený EN 139491), isopropylidin-3-acetyl-D0N (3-acetoxy-7,15-i sopropy1idin-12, 13-epoxy-9~trichothecin-8~ on, C20H26O7, označený jako EN 139492), DON-karbonát(3-hydroxy-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát, C1 βΗι β O7 , označený jako EN 139494), 3-acetyl-D0N-karbonát (3-acetoxy-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát, C18H20O8, označený jako EN 139495), DON-benzylidenacetal (3-hydroxy-7, 15-benzy1 iden-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, C22H24O7, označený EN 139497) a 3-acetyl-DON-benzy1 iden-acetal (3-acetoxy-7,15-benzyliden-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, C2 4 H2 β Oa, označený jako EN 139496) (viz obrázky 3A a 3B). Tyto sloučeniny mohou též sloužit jako základní nebo výchozí materiály, které mohou být dále modifikovány, aby se získaly další • *· ·» ··♦♦ ·« *· 99 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9·9 99 9· 99 99 999 nové deriváty DONu, které mají s výhodou jednu nebo více lepších vlastností, pro které se stanou výhodnější než základní sloučenina nebo jiné známé trichotheceny pro použití v prostředcích a způsobech pro zde popsané způsoby regulace motility zažívací soustavy.

Je třeba také vědět, že alternativa k DONu nebo jinému trichothecenu nemusí být strukturálně příbuzná sloučenina, protože libovolná sloučenina, která reguluje motilitu zažívací soustavy v dávce, která má minimální nebo žádné vedlejší účinky, může být užitečná pro zde popsané způsoby.

Podle vynálezu analogem trichothecenu je libovolná sloučenina, která imituje jednu nebo více charakteristických a žádoucích biochemických aktivit trichothecenu, ať již tato sloučenina má nebo nemá strukturální charakteristiky trichothecenu. Jako DON regulují analogy trichothecenu, použitelné u způsobů podle vynálezu, motilitu zažívací soustavy působením vně této soustavy, na jejím obvodu. Zejména působí analogy trichothecenů, které jsou použitelné u způsobů podle vynálezu pro léčbu obezity, vně zažívací soustavy za účelem stimulace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy a tím signalizují přesycenost, aby zastavily jedení. Takové analogy trichothecenů mohou být strukturálně příbuzné nebo chemicky odvozené od DONu nebo jiného trichothecenu (viz výše), anorganická molekula, organická molekula, která není příbuzná s trichotheceny, biomolekuly, jako jsou nukleotidy, nukleové kyseliny, peptidy, polypeptidy, proteiny, sacharidy, lipidy nebo jejich kombinace. Jestli určitá sloučenina je analogem trichothecenu podle vynálezu, může být určeno použitím jedné nebo více metod skríningu na zde popsané trichothecenové aktivity.

Agonisté a antagonisté receptorů P2x 1 -purinu (receptorů neurotransmiteru zažívací soustavy)

Sloučeniny, které váží P2x1-podtyp purinoceptoru nale31 ·· 9999

9 9 9 9 * 9 9 · · 9

99 · · · 9 9 9

999 9 9 9 9 9 9

999 9999 »99

999 99 9 9 99 99 9999 zený ve tkáni zažívací soustavy, mohou být též použity při metodách zde popsaných. P2x1-purinoceptor je receptor neurotransmiteru přítomný v hladkém svalstvu žaludeční soustavy a zúčastňuje se regulace motility zažívací soustavy (viz příklady, obr. 2). Adenosintrifosfát (ATP) je přírodně se vyskytující ligand receptorů P2x 1 . V duodenu a ileu tenkého střeva stimulace purinergních motorických neuronů uvolňuje ATP. ATP zpočátku působí jako agonista P2_x1-purinoceptoru tím, že nejdříve molekula ATP, která se má vázat na purinoceptor-P2x1 na hladkém svalstvu, signalizuje inhibici hladkého svalstva, které pak relaxuje. Jak bylo poznamenáno výše, taková relaxace je součástí motility zažívací soustavy, která může být detekována a změřena použitím metody podle Krantise a spol. (1996). Zdá se však, že molekula ATP zůstává vázána na P2_x1-purinoceptor a tím desenzibilizuje sval na dodatečnou relaxaci pomocí ATP, protože jiné molekuly ATP nemohou vázat receptor tak, aby signalizoval dodatečné relaxační příhody (Smits a spol. Br. J. Pharmacol., 303: 695-703 (1996). Cesta pro motorickou aktivitu zažívací soustavy, zprostředkovaná P2x1-receptorem, je tedy blokovaná, což má za následek zřetelné zeslabení celkové motorické aktivity zažívací soustavy, které nemůže být ovlivněno dodatečným ATP (vývoj tachyfylaxe). ATP je proto desenzibi1 izujícím agonistou, zabraňujícím dalším relaxacím, které jsou kritické jak pro charakter nasycenosti, tak pro charakter hladovění motility zažívací soustavy. ATP je schopen vazby na všechny typy prurigerních receptorů. Syntetický analog ATP, alfa, beta-methylen-ATP, je také desenzibi1 i zujícím agonistou, ale je specifický pro P2xi-druhy purinoceptorů. Dále, protože P2xi-subtyp purinoceptoru je P2x-druh receptorů, který spolupůsobí v relaxační komponentě motility žaludeční soustavy, studie používající alfa,beta-methylen-ATP poskytují údaje, které odhalují přesně specifické neurofyziologické znaky relaxace v motilitě žaludeční soustavy (viz příklady).

Na rozdíl od desenzibi1 i zujícího agonisty receptorů P2x 1 , jako ATP nebo alfa,beta-methylen-ATP, má nesenzibili32 • φφ φφ φφφφ φφ φφ φφφφ φ · » φφφφ φφφ φφφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φ φφφ φφφφ φφφ zující agonista Ρ2_χ1-receptorů schopnosti vázat receptor, které jsou nutné k dosažení kontinuální stimulace relaxací pro motorickou aktivitu zažívací soustavy. Zejména nesenzibilizující agonista P2x 1 -receptorů je sloučenina, která se váže na receptor, ale neblokuje ho. Každá molekula nedesenzihilizujícího agonisty je schopna vázat P2x1-receptor, vyvolat relaxaci a pak disociovat a být nahražena jinou svého druhu, která opět signalizuje jinou relaxaci a tak dále. Nedesenzibilizující agonisté P2_x1-receptorů jsou tedy s to stimulovat relaxační příhody tak dlouho, jak jsou molekuly nedesenzibilizujícího agonisty k dispozici pro vazbu na P2_x1-receptor. Nedesenzibilizující agonisté P2_x 1-receptorů stimulují charakter nasycenosti motility zažívací soustavy. Nedesenzibi1izující agonisté P2_x1-receptorů jsou tedy chemické alternativy pro použití DONu, jiných trichothecenů nebo analogů trichothecenu u zde popsaných způsobů léčby obezity.

Desenzibi1 i zujíci agonista (viz výše) nebo antagonista P2_x1-receptorů blokuje receptor a zeslabuje motilitu zažívací soustavy. Takové sloučeniny mohou být použity k zabránění nebo k potlačení charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy a tím k potlačení přesycenosti. Potlačením přesycenosti se prodlouží doba jídla nebo krmení, protože se nevyvolá pocit plnosti. Podle vynálezu je antagonista, jako 2· ,3>-0-(2, 4,6-trinitrofeny1)adenosin-5-trifosfát (TNP-ATP), nebo desenzibi1izující agonista, jako alfa,beta-methylen-ATP, který působí na P2_x1-receptory v tkáni žaludeční soustavy, užitečný při způsobech prodlužování doby jídla a zvyšování přírůstku hmotnosti. Takový cíl je zvláště užitečný v průmyslu masném a drůbežářském, kde je zvyšování hmotnosti dobytka nebo snižování doby potřebné k tomu, aby se zvíře přivedlo na tržní hmotnost, komerčně žádoucí a výhodné.

Rada strukturních analogů ATP a některé jejich farmakologické vlastnosti a schopnosti vázat se na receptory jsou známé (viz přehled Hardena a spol. v Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 35: 541-579 (1995)). Takové sloučeniny mohou sloužit «

49

4 4 4 4

9· · · 9 9 9

4«9

49 9944 jako kandidátské sloučeniny, které mohou být dále podrobeny skríningu na jejich schopnost vázat P2x1-podtyp purinoceptoru a ovlivnit motilitu zažívací soustavy. Nebo mohou být chemické struktury těchto známých analogů ATP dále modifikovány, aby byly vytvořeny jiné analogy ATP, které mohou pak být podrobeny skríningu na schopnost působit jako nedesenzibi1 i zující agonisté nebo antagonisté P2x1-receptoru, které mohou být použity při různých zde popsaných způsobech.

ATP-analog TNP-ATP je antagonista P2x-purinoceptoru, který byl použit in vitro jako selektivní antagonista P2x-podtypu (celistvá tkáň IC50 v rozsahu.^M) za účelem stanovení úlohy homomerních P2x1 a P2x3i homomerních a Pzx2/3 heteromerních purinoceptorů (viz Lewis a spol., . Br. J.Pharmacol., 124: 1463-1466 (1998), Virginio a spol., Mol. Pharmacol., 53: 969-973 (1998)). Uvádí se, že P2x3 receptory jsou exprimovány pouze na senzorních neuronech (Evans a spol., Semin. Neurosci., 8: 217-223 (1996). Jak je zde ukázáno, antagonista TNP-ATP je užitečný pro znázornění přímého zapojení podtypu P2x1-purinoceptoru do regulace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy in vivo. Protože TNP-ATP je schopen zabránit nebo potlačitt charakter nasycenosti motility zažívací soustavy vyvolané DONem, jinými trichothecenovými sloučeninami a jejich deriváty, může tento antagonista P2xi být sám použit u způsobů podle vynálezu pro prodloužení nástupu přesycenosti a pro zvýšení příjmu potravy. Tyto způsoby jsou zvláště užitečné pro přípravu dobytka a drůbeže na trh. Dále může být TNP-ATP použit jako výchozí molekula pro přípravu derivátů se zlepšenými vlastnostmi ovlivňujícími motilitu zažívací soustavy.

Jinou třídou sloučenin, které mohou sloužit jako zdroj agonistů nebo antagonistů P2x1-receptoru, použitelných podle vynálezu, jsou deriváty anthrachinonsulfonové kyseliny, které původně popsali Bohme a spol. (Chromatogr., 69: 209-213 (1972)) a které mohou být pokládány za analogy ATP. Obsahují triazinylovou část, o které bylo bylo prokázáno, že an• 4

I fl »» 444«

I 4 4 · ► · * > 4 4 » 4 4

4444 tagonizuje určité činnosti zpostředkované ATP v morčeti (viz Kerr a Krantis, Proč. Austr. Physiol. Soc., 10: 156P (1979)). Lze očekávat, že ty deriváty sulfochinonsulfonové kyseliny, které jsou schopné vázat P2x1-receptor a regulovat (to znamená buď stimulovat nebo potlačovat) charaktery motility zažívací soustavy, mohou být užitečné při různých zde popsaných způsobech.

Jiný přístup k vývoji nedesenzibilujících agonistů P2x1-receptorů, které jsou použitelné pro léčbu obezity, spočívá ve vývoji sloučenin ze sulfonylmočovin, například náhradou trifosfátové části výchozí sloučeniny (adenosin-5·-tetrahydrogentrifosfátu) specifickými, inovativními kyselými funkčními skupinami, o nichž je známo, že imitují rozdělení náboje v difosfátu nebo trifosfátu, ale které nebyly nikdy dříve kombinovány s adenosinovou molekulou. Důležité je, že funkční skupina adenosin-S02-NH-CO je k dispozici pro kombinatorní chemii na polymerní bázi (Chiron Technologies). Sloučeniny, které váží P2_x1-receptor a stimulují charakter nasycenosti motility zažívací soustavy, jsou užitečné pro způsoby léčby obezity podle vynálezu.

Pro identifikaci těch trichothecenů, analogů trichothecenů, nedesenzibilujících agonistů P2_x1-receptorů, antagonistů P2x1-receptorů a jiných sloučenin regulujících motilitu zažívací soustavy, které jsou užitečné pro způsoby a prostředky podle vynálezu, mohou být použity různé metody.

Byly připraveny specifické protilátky pro detekci DONu a 15-acetyl-DONu a použity v testech ELISA (pokusy s enzymem vázaným na imunosorbentu) (viz Sinha a spol., J. Agric. Food Chem., 43: 1740-1744 (1995)). Protilátky vůči DONu a jiným trichothecenům mohou tedy být použity v různých imunologických procesech, jako je ELISA, k rychlému skríningu derivátů nebo příbuzných trichothecenů, které mohou být též použity při způsobech zde popsaných.

*0 • · 0 0 • · « • 00

0 0

0000

0 ····

• a

Vztahy struktura-funkce byly stanoveny pro velký počet 12,13-epoxytrichothecenů in vitro za použití buněčných kultur buněk Věro (ledviny opice), myších buněk erytroleukemie (MEL) a lymfocytů z krysí sleziny. Takové systémy buněčných kultur byly například použity pro testování schopnosti různých 12, 13-epoxytrichothecenů potlačovat aktivitu peptidyltransferázy a tedy syntézu proteinu (viz například Erlich a Daigle, Biochem. Biophys. Acta, 923: 206-213 (1987), Rotter a spol., J. Toxicol. Env. Health, 48: 1-34 (1996). Zejména trichotheceny se váží na 60S-podjednotku eukaryotického ribosomu a tím se střetávají s peptidyltransferázou. Stupeň strukturální substituce na trichothecenseskviterpenu ovlivňuje schopnosti vazby na peptidyltransferázu a tedy stupeň potlačení tohoto enzymu (Erlich a spol., 1987, Rotter a spol., 1996).

Shora popsané buněčné kultury mohou být použity pro testování nebo skríning sloučenin neznámé aktivity jako možných kandidátních sloučenin použitelných pro prostředky a způsoby léčby zde popsané. Takové testovací a skríningové metody na bázi buněk jsou zvláště užitečné pro testování a charakterizování různých trichothecenů nebo jejich derivátů meznámé aktivity, jako nově syntetizovaných nebo objevených sloučenin, které mají strukturální vlastnosti známých trichothecenů, jako DONu nebo jiných trichothecenů příbuzných s nivalenolem. Použitím těchto buněčných kultur mohou být podrobeny skríningu také jiné sloučeniny, které nejsou strukurálně příbuzné se známými trichotheceny.

Při skríningových metodách na bázi buněk může být každá testovaná sloučenina porovnána s jednou nebo několika standardními přípravky známého trichothecenů, jako DONu, který je typicky přípraven v zásobních roztocích (10 ug/ml) v dimethylsulfoxidu. Koncentrace dimethylsulfoxidu se upraví tak, aby byla během inkubací buňkami vždy %-ní (objem/objem) nebo nižší. Trichotheceny jsou obvykle stabilní až do jednoho roku při teplotě místnosti (27 °C).

• Φ

ΦΦ

Φ ·

Φ· • · • · »Φ

ΦΦ * · • Φ • · « • · · ΦΦ • ΦΦΦ «Φ · Φ • Φ • Φ • Φ • ΦΦΦ

Kandidátské sloučeniny mohou být s výhodou také podrobeny skríningu a charakterizovány použitím metody podle Krantise a spol. (1996), která používá miniaturizovaná fóliové tenzometry a počítačový systému analýzy dat pro přesný a současný záznam relaxací a kontrakcí hladkého svalu zažívací soustavy. To je prostředek pro přímý skríning sloučenin na jejich účinky na motilitu zažívací soustavy. Jak je shora uvedeno, je metoda podle Krantise a spol. (1996) schopna zajistit aktuální záznam účinku sloučeniny na charaktery nasycenosti a hladovění zažívací soustavy in vivo, ex vivo nebo in vitro (viz příklady 1 a 2). Tyto metody skríningu nebo identifikace nové sloučeniny pro použití v prostředcích a způsobech podle vynálezu mohou zahrnovat také porovnání účinku, jaký má kandidátská sloučenina na motorickou aktivitu zažívací soustavy s účinkem, jaký má známý triichothecen, jako DON, na motorickou aktivitu zažívací soustavy.

Testy na vázání a skríning na P2x1-agoni sty nebo antagonisty

Kandidátské sloučeniny (také nazývané vedoucí nebo testované sloučeniny) mohou též být testovány nebo podrobeny skríningu na schopnost vázat se na nebo blokovat P2 x 1 -podtyp receptorů purinu, což je purinergní receptor exprimovaný na hladkém svalu a který je zejména zapojen do kontroly relaxační komponenty motility zažívací soustavy v tenkém střevě. Hodně je nyní známo o struktuře P2-purinoceptorů (viz například Virginio a spol., Mol. Pharmacol., 53: 969-973 (1998), Humphrey a spol., Naunyn Schmiedeberg·s Arch. Pharmacol., 352: 585-596 (1995), Bo a spol., Br. J. Pharmacol., 112: 1151-1159 (1994) a přehledy v Burnstock, G., Ciba Found. Symp., 198: 1-28 (1996) (klasifikace P2-receptorů) a v Surprenant, A., Ciba Found. Symp., 198: 208-219 (1996)(funkční vlastnosti nativních a klonovaných P2x-receptorů)). Schopnost sloučeniny vázat P2x1-purinoceptor může být také porovnána se schopností známého ligandu, jako ATP nebo analogu ATP, jako alfa,beta-methylen-ATP nebo TNT-ATP.

• · • · · ·

β · · · · · · ··· ·· ·· ··

Úspěšné radioznačení receptorú buněčného povrchu pro extracelulární stimuly závisí na tom, jsou-li dostupné ligandy o vysoké afinitě, stabilitě a specifičnosti vazby proteinů. Do nedávná neexistovaly žádné selektivní látky s antagonistickým účinkem pro specifické podtypy P2-purinoceptorů a mnohé sloučeniny, o nichž bylo prokázáno, že potlačují konkurenčně P2-purinoceptory (například suramin, reaktivní modř 2), tak činily pouze s mikromolární afinitou a postrádaly specifičnost tím, že reagovaly s mnoha jinými proteiny. Zásadní problém spočíval v tom, že testy na vazbu byly prováděny za podmínek, například s membránami, které jsou velmi odlišné od podmínek, při kterých mohou být měřeny odpovědi na receptor. Z toho důvodu bylo obtížné vyvodit přímé závislosti mezi vazebnými konstantami a konstantami aktivity receptoru. Agonisté P2-purinoreceptorů také představují problémy, protože jejich vazebné afinity jsou jen o málo vyšší než jejich afinity k jiným proteinům vázajícím ATP a podléhají hydrolýze enzymy hydrolyzujícími nukleotidy.

(³H)-značený alfa,beta-methylen-ATP byl použit jao radioligand pro P2x-purinoreceptory v přípravcích pro močový měchýř a hladký sval vas deferens. Zpravidla afinity vázající agonisty kopírují ty, které byly pozorovány v intaktních tkáních. Například rozdíly v zřejmé vazební afinitě alfa, beta-methylen-ATP a 2-methyl-S-ATP pro konkurenci na vazebním místě vas deferens byly pouze 30-ti násobné a mnohé nukleotidy, o kterých se má za to, že nejsou P2x-agonisty, také plně potlačují vázání radioligandu. Hustota vazebných míst značených (³H)-alfa,beta-methylen-ATP daleko přesahuje hustotu pozorovanou u jiných receptorú neurotransmiterů.

Hladký střevní sval exprimující P2x1-receptory může být disociován a izolované buňky hladkého svalu udržovány v primární kultuře. Tyto kultury mohou být použity v testu na vázání pro vedoucí nebo kandidátské sloučeniny, které jsou schopné působit jako agonisté nebo antagonisté P2x1-receptoru. Alternativně mohou být použity embryonální ledvinové buň38 • ·

ky 293, které exprimují P2x1-receptory, (Virginio a spol,, Mol. Pharmacol., 53: 969-973 (1998)). Tento podtyp receptoru je také exprimován v destičkách a megakaryoblastických buněčných liniích (Vial a spol., Thromh. Haemost., 78: 1500-1504 (1997)), jakož i v buňkách HL60 (Buell a spol., Blood, 87:

2659-2664 (1996). Kterákoliv buňka, včetně rekombinantně modifikovaných buněk, které exprimují P2_x1-receptory v kultuře, mohou tedy být užitečné v skríningu na agonisty nebo antagonisty P2x1-receptoru.

P2x1-receptor purinu byl čištěn (Valera a spol., Nátuře, 371: 516-519 (1994) a klonován (Sun a spol., J. Biol. Chem., 273: 11544-11547 (1998)). Vazební vlastnosti pro rekombinantní P2x1-receptory byly popsány (Michel a spol., Br. J. Pharmacol., 118: 1806-1812 (1996)). Čištěný P2x1-receptor může být připojen kterýmkoliv z řady různých vazebních činidel k pevnému substrátu, jako je povrch jamky v mikrotitrační destičce, pryskyřičná částice nebo povrch testovacího čipu. Taková uspořádání umožňují, aby byla testována velmi malá množství sloučenin na schopnost vazby na receptor. Kromě toho robotová technologie, která je k dispozici pro skríningové vzorky v mikrotitračních destičkách a testovacích čipech, dovoluje provedení přesného a kontinuálního skríningu stovky nebo tisíce sloučenin za hodiny při minimálnm dohledu odborným pracovníkem.

Základní nebo kandidátské sloučeniny,- které byly identifikované, že mají aktivitu v jedné ze shora uvedených skríningových metod, mohou být dále vyhodnoceny použitím testu in vitro, testru ex vivo orgánu zažívací soustavy nebo/a in vivo testu na motilitu zažívací soustavy například metodou podle Krantise a spol.(1996) (viz příklad 1). Při testu in vitro orgánové lázně zažívací soustavy se excidují ze zvířete části orgánu zažívací soustavy, například segmenty z duodena, jejuna a ilea z tenkého střeva, a umístí se do fyziologického udržovacího média, jako je Krebsův roztok, při tělesné fyziologické teplotě. Jednotlivé segmenty zažívací soustavy se ob39 • « · · · · • · · · · · vykle instalují za účelem záznamu aktivity cirkulárně probíhajícího svalstva, s výhodou na dvou bodech připojení. Sloučenina může být injektována, smíšena nebo aplikována na oddělené segmenty orgánů zažívací soustavy a může být změřen účinek na motilitu orgánu. Při testu orgánu zažívací soustavy ex vivo se orgány zažívací soustavy anestezovaného zvířete odkryjí, ale udržují se intaktní a za fyziologických podmínek. Testovaná nebo hlavní sloučenina pak může být vhodně aplikována (topicky) přímo na orgán a účinek na motilitu orgánu monitorován. Při testu in vivo může být sloučenina injektována do nebo strávena zvířetem a účinek na motilitu zažívací soustavy přímo zněřen.

Zdroje sloučenin, které mají být testovány nebo podrobeny skríningu na použití v prostředcích a způsobech zde popsaných, zahrnují bez omezení, malé kolekce molekul, kombinatoriální série, růstová média nebo buněčné extrakty z fungálních, bakteriálních a různých eukaryotických buněčných kultur nebo fermentací a biologických tekutin, tkání a vzorků séra od lidí a jiných živočichů.

Způsoby léčby, farmaceutické prostředky, způsoby aplikace

Předmětem vynálezu jsou farmaceutické prostředky, které se používají při způsobech léčby obezity. Jiné prostředky podle vynálezu jsou zpracovány pro podání zvířatům za účelem zvýšení přírůstu hmotnosti, což je zejména · užitečné při komerčním chovu dobytka a drůbeže na trh. Lidé a jiní obratlovci mají stejnou základní neurofyziologii zažívací soustavy, pokud se týká regulace motility zažívací soustavy. Živočichové, kteří mohou být léčeni zde popsanými způsoby, tedy zahrnují bez omezení lidi a jiné primáty, vepře, skot, obce, ptáky (drůbež a jiné ptáky), koně, kočky, psi a hlodavce včetně křečků, morčat a myší. Jak farmaceutické prostředky, tak prostředky pro podávání jiným živočichům zde popsaným, obsahují účinné množství sloučeniny pro dosažení požadovaného účinku na motilitu zažívací soustavy bez významných nebo ne40 «· ·· ···· · · • · · · « · ·· · · · · · ··· · · · · φ žádoucích vedlejších účinků.

Podle vynálezu se obezita léčí podáváním člověku nebo jinému živočichovi účinného množství DONu nebo jiného trichothecenu, derivátu trichothecenu, analogu trichothecenu nebo nedesenzibilizujícího agonisty P2x 1 -purinoceptoru za účelem stimulace nebo aktivace charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy a tím signalizace přesycenosti. Naproti tomu může být antagonista P2x1-purinoceptoru, jako TNP-ATP, nebo desenzibilizující agonista, jako alfa,beta-methylen-ATP, podán člověku nebo jinému živočichovi k zamezení nebo potlačení charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy a tím prodloužení doby jídla a zvýšení přírůstek hmotnosti.

Takové prostředky mohou být v libovolné z různých možných forem zvláště vhodných pro předpokládaný způsob podávání, zahrnujících tuhé, polotuhé nebo kapalné dávkovači formy, například ve formě tablet, pastilek, prášků, tobolek, čípků, kapalin, vodných nebo olejových suspenzí, sirupů, elixírů a vodných roztoků. Farmaceutický prostředek je s výhodou v jednotkové dávkovači formě vhodné pro jediné podání přesné dávky, která může představovat zlomek nebo násobek dávky, která je vypočítaná k vytvoření žádoucího účinku na motilitu zažívací soustavy. Tyto prostředky budou obsahovat, jak shora uvedeno, účinné množství zvolené sloučeniny v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo/a pufrem a dále mohou obsahovat jiné léčebné prostředky nebo farmaceutické prostředky, nosiče, ředidla, plnidla a jiné pomocné látky nebo jejich kombinace , které jsou netoxické, inertní a farmaceuticky přijatelné. V kapalných směsích nebo přípravcích může být použit farmaceuticky přijatelný pufr, jako fosfátem pufrovaný fyziologický roztok. Pod výrazem farmaceuticky přijatelný se rozumí materiál, který není biologicky, chemicky nebo jakýmkoliv jiným způsobem inkompatibilni s chemií a metabolismem těla a neovlivňuje také nepříznivě jakoukoliv jinou komponentu, která by mohla být přítomna ve farmaceutickém prostředku.

Pevné prostředky mohou obsahovat běžné netoxické nosiče farmaceutické kvality, jako například manitol, laktosu, škrob, stearát hořečnatý, sodnou sůl sacharinu, talek, celulosu, glukosu, sacharosu, uhličitan hořečnatý a podobně. Farmaceuticky přijatelné kapalné prostředky mohou být například připraveny rozpuštěním nebo dispergováním aktivní sloučeniny, která reguluje motilitu zažívací soustavy, jak zde popsáno, a optimálních farmaceutických přísad v pomocné látce, jako ve vodě, fyziologickém roztoku, vodné dextrose, glycerolu, ethanolu a podobně, aby se tím vytvořil roztok nebo suspenze. Farmaceutický prostředek, který má být podáván, může popřípadě také obsahovat malá množství netoxických pomocných látek, jako smáčedel nebo emulgátorů, pufrů a podobně, například octan sodný, triethanolaminoleát.

Standardní metody přípravy dávkovačích forem jsou známé nebo budou zřejmé odborníkům v oboru (viz například Remington· s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W. (vyd.) poslední vydání Mack Publishing Co., Easton, PA). V případe DONu a jiných trichothecenů se připraví dávka, která nemá za následek zvracení. Takové subemetické dávky se snadno stanoví, jak bylo demonstrováno ve studiích na zvířatech (vz příklady 1 a 2) .

Primární aktivní složka prostředku podle vynálezu je sloučenina, což je trichothecen, analog trichothecenu, agonista P2x1-receptorů nebo antagonista P2x1-receptorů, která ovlivňuje (zprostředkuje) motilitu zažívací soustavy. Trichotheceny, jako DON, jsou 'nepochybně schopné působit po požití na motilitu zažívací soustavy. Výhodný prostředek podle vynálezu je tedy zpracován pro orální podání. Tyto sloučeniny mohou být také aplikovány parenterální, například intravenózní, intramuskulární nebo intraperitoneální injekcí.

Pro orální podávání, kterému se dává přednost, jsou pro středky podle vynálezu zpracovány ve formě jemných prášků ne42 • · k <

·· ·bo granulí obsahujícch sloučeninu, která ovlivňuje motilitu zažívací soustavy a která může také obsahovat ředidlo, dispergátor nebo/a povrchově aktivní činidlo. Prostředky pro orální podávání mohou být také připraveny ve formě roztoku nebo suspenze ve vodě nebo v sirupu, jako pilulky, tablety, tobolky nebo sáčky v suchém stavu nebo v nevodném roztoku nebo v suspenzi, ve kterém mohou být přidány suspenzační činidla. V prostředcích pro orální podání mohou být také použita pojidla a lubrikanty. Po případě v nich mohou být obsažena ochucovadla, konzervační činidla, suspenzační činidla, zahušťovadla nebo emulgátory. Jako orálním aplikačním formám se dává přednost tabletám a granulím, které mohou být opatřeny povlakem.

Pokud se použije parenterální forma podání, jedná se obvykle o formu injekce. Injekční přípravky mohou být připraveny v obvyklých formách, buď ve formě kapalných roztoků nebo suspenzí, v tuhých formách vhodných k rozpuštění nebo suspendování v kapalině před injekcí, nebo jako emulze. Pro většinu účelů může být sloučenina použitelná pro regulaci motility zažívací soustavy aplikována intravenózní injekcí ve farmaceuticky přijatelném pufru. V rámci vynálezu však může být taková sloučenina alternativně připravena jako bolus, který může obsahovat fixační prostředek pro postupné uvolňování z místa injekce. Jeden přístup k parenterální aplikaci spočívá v systému pomalého uvolňování nebo podporovaného uvolňování tak, že je udržována konstantní hladina dávkování (viz například US patent č. 3,710.795).

Přesné, účinné množství sloučeniny užitečné pro regulaci motility zažívací soustavy v prostředcích a způsobech zde popsaných se bude lišit od jedince k jedinci v závislosti na věku, hmotnosti a celkovém stavu jedince, stupně léčené obezity, příslušné použité sloučenině, způsobu jejího podání a podobně. Není proto možno specifikovat přesné množství pro ideální dávku použitelnou pro všechny jedince. Je však možno očekávat, že trichothecen, jako DON, bude použit nebo těsto43 ·· • · « · ván v rozmezí 0,01 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti. Dále bude užitečné dávkování zvolené pro příslušného jedince subemetická dávka, to znamená dávka, která nevyvolá u jedince zvracení. Je samozřejmé, že pro komerční farmaceutické prostředky bude farmaceuticky účinná dávka a vhodné množství trichothecenu, derivátu trichothecenu, analogu trichothecenu, agonisty P2xi-receptorů nebo antagonisty P2x1-receptorů stanovena v případě použití pro lidi zdravotnickým profesionálem ve studiích odpovídajících normám United States Food and Drug Administration (nebo srovnatelné instituce). Pro použití u zvířat bude vhodný prostředek určen a sestaven podle norem a praxe pro krmení komerčního dobytka nebo veterinární medicínu.

Další provedení a znaky vynálezu budou zřejmé z následujících příkladů, které neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Následující příklad ukazuje, že DON působí na místech vně zažívací soustavy a zasahuje do specifických vnitřních nervových cest žaludku a tenkého střeva, čímž dává vznik změněným charakterům motorické aktivity. Tato zjištění ukazují na to, že DON vyvolává ztrátu chuti (jak je ilustrováno odmítáním krmě u zvířat) a podporují způsob vyvolání takové ztráty chuti.

Normální gastrointestinální motilita je závislá na vnitřních (střevních) nervových systémech stěny zažívací soustavy s modulatorními vstupy z periferiferního a centrálního nervového systému (CNS). Vnitřní soustava koordinuje reflexní aktivitu, jako peristaltický reflex, nebo komplexem ovládanou motorickou aktivitu, jako interdigestivně migrující myoelektrické komplexy (MMC), které se vyskytují v rámci charakteru hladovění a charakteru nasycenosti poháněného segmen44

tací .

Byly zkoumány účinky DONu na cesty regulující inter digestivní spontánní motorickou aktivitu krysího žaludku a střev. I když krysy nemají emetický reflex, pocitují nevolnost a nauzeu spojenou se zvracením (Andrews, Br. J. Anaest., 69: 2s-19s (1992), Rapley, W.A. a Hirst, M.,Abstract v Lab. Anim. Sci., 38: 504 (1988). Byly studovány účinky nízkoprahových hladin DONu na interdigestivní motorický charakter in vivo. Byla získána dodatečná informace z pokusů in vitro s lázní zažívací soustavy za účelem získání doplňující farmakologické informace.

Byly provedeny pokusy na samčích krysách rodu Sprague-Dawley (Charles River) o hmotnosti 250 až 350 gramů. Všechny experimentální protokoly byly provedeny podle směrnic Animal Care Commitee při University of Ottawa.

Jednotlivé krysy, které byly ponechány hladovět při volném přístupu k vodě, byly anestezovány použitím Halothanu (4%-ního) ve směsi s kyslíkem. Krysy byly ponechány pod Halothanovou anestezií (2%-ní) na zahřívaném stole pro udržení tělesné teploty na 37 °C. Pravá arteria carotis byla vypreprována a kanylována s použitím kanyly PE 50 za účelem monitorování krevního tlaku pomocí snímače tlaku (P23ID, Gould Statham, OH), připojeného k počítačovému systému IBM pro sběr dat. Jugulární žíla byla kanylována (kanyla PE 50), aby byly umožněny intravenózní injekce. Avšak vzhledem ke krátkému poločasu různých léků a aby se zamezilo metabolismu prvního průchodu játry, je často zapotřebí použít intraarteriální cestu podávání. U zvířat, kde léky měly být podány brzo za sebou intraarteriálními injekcemi (i.a.), byla zavedena kanyla (kanyla PE 10) z femorální arterie a vedena v retrográdním směru za účelem umístění špičky v hladině horní mezenterní arterie.

Středovou laparatomií byly vypreparovány požadované ga45 strointestinální segmenty. Postupně byly připojeny fóliové tenzometry (Showa typ Nil, Durham Instruments, Pickering, ON) použitím lepidla Vet Bond k žaludečnímu antru (2 cm proximálně k sfinkteru pyloru), k antimezenternímu okraji duodena (1 až 2 cm distálně k gastroduodenálnímu spojení) a laterálně k antimezenternímu okraji ilea (právě proximálně k ileo-cekálnímu spojení). Všechny fóliové tenzometry byla orientovány paralelně k longitudinální svalové vrstvě, protože to vyžaduje nejcitlivější uspořádání pro záznam obvodové motorické aktivity. Vodiče od fóliových měřičů byly vyjmuty z dutiny břišní a připojeny k počítačovému systému IBM pro sběr dat cestou 3-kanálového styčného boxu. Detailní metoda pro zaznamenávání a analýzu motility in vivo použitím fóliového tenzometru, připojeného k systému pro sběr dat na bázi počítače, byl popsán Krantisem a spol. (1966). Schématický diagram této metody pro zaznamenání motility zažívací soustavy je znázorněn na obrázku 1. Po dokončení operace byly krysy obráceny do polohy na břiše a Hallothan byl udržován na 1% po zbývající dobu pokusu.

Orgánové přípravky ex vivo byly připraveny s použitím těchže chirurgických postupů, popsaných shora s tím rozdílem, že krysy byly uloženy v poloze na zádech, aby se místa připojení fóliového měřidla udržela odkryta. To umožnilo lokální aplikaci léčiv přímo na serózní povrch zažívací soustavy. Pravidelná aplikace ohřátého fyziologického roztoku udržovala odkryté segmenty zažívací soustavy vlhké.

Orgány zažívací soustavy pro použití v in vitro lázních orgánů zažívací soustavy byly připraveny podle McKaye a Krantise (Can. J. Physiol. Pharmacol., 69: 199-204 (1991)). Krysy byly euthanázovany a rychle bylo odebráno 4-5 cm segmentů proximálního duodena, jejuna a ilea, které byly zbaveny jejich obsahů, mezenterní napojení bylo odpreparováno a takto uvolněné segmenty pak byly umístěny do orgánové lázně obsahující Krebsův roztok následujícího složení (mM): Na⁺(151,0), K⁺(4,6), Mg²⁺(0,6), Ca²⁺(2,8), Cl(134,9), HC0₃‘(24,9), «·«< 9 ♦ · ♦ » * · • ·· ··· « · · • ••«·· * · · · * • 9* 9999 9·· •99 9« ·· ·· ·· ·*«·

IÍ2 Ρ04 ‘ (1,3 ) , S04^z(0,6) a glukosa (7,7). Tento roztok byl udržován na 37 °C a podroben účinku plynu tvořeného 95 % O2 a 5 % CO2, čímž bylo dosaženo pH 7,4.

Jednotlivé segmenty zažívací soustavy pak byly uloženy horizontálně, aby bylo možno zaznamenat cirkulární svalovou aktivitu na dvou místech připojení na okraji mezenteria, vzdálených 25 mm od sebe, přičemž se segmenty připevnily ke dnu orgánové lázně a každý segment se spojil s Grassovými snímači izometrické síly tenkou polyesterovou strunou. Mechanická aktivita, detektovaná snímači byla monitorována přímo MacLabMacintoshovým systémem pro sběr dat (Apple Corp., Toronto , Ontario).

Každé místo připojení bylo umístěno pod klidové napětí 1 gram a segment se nechal přivést do rovnovážného stavu po dobu 60 minut před aplikací léku. Preparáty z orgánové lázně byly oplachovány vždy novými lázněmi Krebsova roztoku každých 15 minut a mezi stimulacemi léky. Následující stimulace léky byly testovány pouze po rovnovážném období nejméně 5 minut nebo když došlo k 90% regeneraci základního klidového napětí.

Motorická aktivita, zaznamenaná v pokusech in vivo a ex vivo, byla shromážděna, digitalizována a uložena v systému IBM pro sběr dat, který vypočetl kromě jiných proměnných amplitudu a frekvenci motorických odpovědí (Krantis a spol, 1996). Kvalifikované odpovědi byly zaznamenány v závislosti na jejich schopnosti vyhovovat souboru šesti numerických parametrů (odděleně pro kontrakci a relaxaci) na bázi uživatelem definovaných prahových hodnot, které musí být uspokojeny během omezených časových období. Tyto parametry byly trvale monitorovány v průběhu postupných dvouminutových období a přizpůsobeny podle toho, co bylo považováno za potřebné, aby byly účinně zaznamenány motorické odpovědi s 95 až 100%-ní přesností. Došlo pak k výstupu dat a ta byla zpracována do tabulkové formy za účelem statistické analýzy.

• · 4

4 4· ··«· 44 «4 4· 4 4»4·

444 « 444 4 4

4404 444

4 · 44 44 4444

Pro porovnání středních hodnot byla použita jednocestná ANOVA s testem Tukeyovy vícenásobné analýzy za použití programového vybavení počítače Statgraphics Plus 5,0 (Statistical Graphics Corp.). Pravděpodobnost menší než 0,05 (p<0,05) byla považována za významnou. Všechny hodnoty v pokusech jsou vyjádřeny jako střední + standardní chyba pokusů.

-argininu (L-NAME, mg/kg), pentolinium

Všechny léky použité při pokusech in vivo a ex vivo, včetně DONu, byly rozpuštěny ve fyziologickém roztoku (0,9¾). Infuzní koncentrace (podávané rychlostí 0,5 ml/minuta) byly: alfa,beta-methylenadenosintrifosfát (alfa, beta-methylen-ATP, 300 mg/kg), methylester N-omega-nitro-L10 mg/kg), BRL 43694 (granisetron, 80 (5 x 10⁵ M) a hexamethonium (18 mg/kg,

s.c.). Všechny léky byly zakoupeny od firmy Sigma Chemical Company, Toronto, ON až na alfa,beta-methylen-ATP, který byl získán od firmy RBI, Natick, MA, a DON byl dodán Dr. Davem Millerem, Agriculture Canada, Ottawa, ON, kde byl vyroben biosyntézou a vyčištěn metodami podle Millera a spol. (Can. J.

29: 1171-1178 (1983), Millera a Blackwella (Can.

Millera a Arnisona (Can. J. Plant Výraz mg/kg (nebo mg.kg^-1) znatělesné hmotnosti jednotlivého čloMicrobiol,

J. Bot., 64: 1-5 (1986), Path., 8: 147-150 (1986)) mená miligramy na kg věka/zvířete.

Koncentrace léků použitých v přípravcích orgánové lázně (in vitro) nebo topicky při pokusech ex vivo byly: karbachol (0,5 mM), papaverin (10 mM), ATP (0,5 mM), DMPP (50 mM), 3-APS (0,5 mM) (Sigma Chemical Company, Toronto, ON) a DON (20 mM). Objemy léků nečinily nikdy víc než 1 % objemu lázně.

Za regulovaných podmínek vykazovaly žaludek a tenké střevo u anestezovaných krys typickou spontánní motorickou aktivitu. V žaludečním antru spočívala tato aktivita v oscilačních kontrakti lnich a relaxačních motorických odpovědích. V proximálním duodenu se spontánní motorická aktivita vyznačovala obdobími intenzivní skupinové aktivity (trvajícími • 9· 99 999* ·9 *9

9« · 9 9 · * ·99·

99 99* »· ♦

9··· ♦ 999 9 9

999 9999 999 • 99 *· 99 99 *· *999 až 5 minut), tvořená primárně relaxacemi a kontrakcemi o vysoké amplitudě a vysoké frekvenci. Období skupinové motorické aktivity byla oddělena meziskupinovou aktivitou (trvající 3 i 10 minut), tvořená primárně relaxacemi a kontrakcemi o nízké amplitudě a nízké frekvenci. Na rozdíl od meziskupinové aktivity, se skupinová aktivita šíří rychlostí 3,4 + 0,6 cm.min^-1 aborálním směrem. Regulace spontánní motorické aktivity distálního ilea spočívala primárně v nepravidelně se vyskytujících kontrakcích nebo/a relaxacích o relativně vysoké amplitudě a nízké frekvenci.

DON, podávaný systémově v 1 nebo 2 mg.kg^-1 bolusu, neovlivnil regulaci motorické aktivity. Avšak při 10 mg.kg'¹ přerušil DON spontánní motorické aktivity, jak popsáno níže. Léčba s 20 mg.kg^-1 DONu neposkytla významně větší účinky.

Žaludeční antrum

Během 2 minut po intravenózní injekci potlačil DON (10 mg.kg^-1, i.v., n=7) antrální motorickou aktivitu (obrázek 4) tím, že zeslabil (p<05) jak spontánní kontrakce (na 20+6 % kontroly), tak relaxace (na 27 _+ 11% kontroly). Tento účinek byl přechodný, protože motorická aktivita se vrátila na 90 % kontrolní hladiny během 18 + 3 minut. Bezprostřední nová aplikace DONu byla typicky bez účinku.

Proximální duodenum

Během 2 minut systémové injekce DONu (10 mg.kg^-1, n =

12) se spontánní duodenální motorická aktivita přeměnila z kontrolního charakteru střídající se skupinové a meziskupinové aktivity na období (46 ± 15 minut) podporované aktivity podobné skupinové aktivitě (obr. 5). Tato hyperaktivita nebyla významně odlišná v amplitudě nebo frekvenci od kontrolní skupinové motorické aktivity. Během 60 minut následujících po podání DONu se kontrolní charakter střídající se skupinové a meziskupinové aktivity vrátil. Následující · ·♦· »· « · 4 · 4 4444

949 444 44 *

4·4 4 44 4 4 4

944 444 4 444

4 4 ·4 44 · · 44 4444 injekce DONu (η = 6) nezměnila významně motorický charakter, což ukazovalo na rozvíjení tachyfylaxe. Tato tachyfylaxe na DON měla relativně krátkou životnost a to takovou, že po novém testování DONu (n = 5) za dalších 30 minut došlo znovu k hyperaktivitě (p<O,05). Avšak trvání této aktivity (24 +. 14 minut) bylo značně kratší ve srovnání s trváním původní hyperaktivity vyvolané DONem.

Distální ileum

Systémová injekce DONu (10 mg.kg^-1, n = 9) vyvolala během 2 minut hyperaktivitu ilea. Frekvence a amplituda kontraktilní a relaxantní motorické odpovědi byly významně (p 0,5) zvýšené. Charakter motility zažívací soustavy v ileu za přítomnosti DONu se tedy podobal charakteristickému charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy, který vzniká, když byl stráven pokrm a má být protlačen zažívací soustavou. Tento účinek trval 63 _+ 22 minut. Potom se motorická aktivita postupně vrátila na kontrolní hladiny. Paralelně s duodenem se tachyfylaxe po novém podání DONu (n = 6) také vyvinula v ileu. Tato tachyfylaxe trvala až 90 minut, načež bylo možno znovu vyvolat hyperaktivitu novým podáním DONu (n = 6).

Účinky lokálně podaného DONu

Preparáty ex vivo vykazovaly typickou motorickou aktivitu podobnou aktivitě preparátů in vivo. Přímá (topická) aplikace 20 mM DONu (koncentrace značně vyšší než dávka in vivo) seróze žaludečního antra (n = 3), proximálnímu duodenu (n = 3) nebo distálnímu ileu (n = 3) nevyvolala žádné srovnatelné motorické odpovědi s těmi, které byly pozorovány in vivo. Vitalita zkoumaných oblastí zažívací soustavy byla verifikována pozorováním předvídatelných odpovědí na farmakologické stimuly, o nichž je známo, že působí přímo na hladké svalstvo, jako papaverin (10 mM), který uvolňuje hladké svalstvo, a karbachol (0,5 mM), který vyvolává kontrakce ovlivňované cholinergním muskarinním receptorem. Topicky aplikovaný φφφφ φφ φ φ · φ · φ φ β Φ· • Φ ν Φ • ··

Φ Φ Φ

•« · ·· · φ φφ φφφφ

DON nerušil působení těchto léků.

Izolované gastrointestinální lázftové preparáty (n = 5) duodena, jejuna a ilea reagovaly buď kontrakcí nebo relaxací na aplikaci karbacholu (0,5 mM) nebo papaverinu (10 mM). Dále segmenty zažívací soustavy projevovaly relaxační odpovědi na předpokládaný neandrenergní, necholinergní (NANC) inhibiční přenašeč ATP (0,5 mM) a na nervovou stimulaci použitím agonisty GABAa-receptoru 3-APS (0,5 mM) nebo agonisty DMPP nikotinového receptoru (50 mM). Avšak v těchže preparátech byl DON (20 mM) neúčinný. DON dále nerušil odpovědi těchto gastrointest inálních segmentů na testovaná farmakologické činidla .

Farmakologie DONem vyvolané hyperaktivity

L-NAME: U anestezovaných krys, které se vyznačují spontánní motorickou aktivitou, zeslabuje inhibitor syntézy oxid dusnatý (NO), L-NAME, meziskupinové relaxace, zprostředkované pomocí NO, a zvyšuje skupinovou aktivitu duodena (nepublikovaná pozorování). Proto byl zkoumán účinek L-NAMe na působení DONu. Systémově aplikovaný L-NAME (10 mg.kg^-1, n = 5) nezmírnil (p_>0,05) DONem vyvolanou hyperakt ivi tu frekvence a amplitudy> relaxací v duodenu (viz obrázek 6A, frekvence a obrázek 6B, amplituda). V ileu L-NAME vždy zvýšil jak frekvenci, tak amplitudu relaxací spontánní motorické aktivity na stejnou hladinu jako při přítomnosti DONu samotného (viz obrázek 6C, frekvence a obrázek 6D, amplituda).

Purinoceptor tachyphylaxe: Spontánní duodenální skupinové relaxace jsou specificky ovlivňovány purinergní transmisí související s P2x-receptorem (nepublikovaná pozorování). To zde bylo potvrzeno po desenzibi1 izaci P2x-purinoceptorů s prodlouženým vystavením působení specifického agonisty, alfa, beta-methylen-ATP. Počáteční injekce alfa,beta-methylen-ATP (300 mg.kg^-1, i.a., n = 3) vyvolala markantní relaxaci. Po návratu na základní úroveň se nové působení s alfa,be• * ·· ·»·« • · *· ·· ··

• · ta-methylen-ATP minulo účinkem, což ukazuje na rozvíjení tachyphylaxe. Za těchto podmínek byly spontánní duodenální skupinové relaxace a ileální relaxace specificky blokovány. Kromě toho byla DONem vyvolaná hyperaktivita také odstraněna během tachyphylaxe vyvolané alfa,beta-methylen-ATP jak v duodenu (n = 8), tak v ileu (n = 4).

Nikotinové receptory: Cholinergní nikotinové mechanismy jsou fundamentálně zapojeny do regulace gastrointestinální motility (viz Furness a Costa, Neurosci., 5: 1-20 (1980),

Gershon, Ann. Rev. Neurosci., 4: 227-272 (1981)). Při působení ganglionovými nikotinovými antagonisty in vivo snížilo pentolinium (50 mM topické aplikace, n = 2) nebo hexamethonium (18 mg.Kg, s.c.,n = 2, neznázorněno) významně frekvenci a amplitudu DONem vyvolané hyperaktivity v duodenu a ileu.

Granisetron: Systémově podávaný antagonista 5-HT3~receptoru, granisetron (80 mg.kg^-1, n = 8) zeslabil (p<0,05) v duodenu frekvenci a amplitudu spontánních kontrakcí a relaxací skupinové aktivity (porovnej široce diagonálně šrafované sloupky (samotný granisetron)) s prázdnými sloupky kontrolní skupinové aktivity v obrázcích 7A až 7D). Tento účinek granisetronu trval až 30 minut. Protože však duodenum neprojevovalo desenzibilizaci vůči působení tohoto léku, byl granisetron opakovaně znovu podáván za účelem udržení blokády skupinové aktivity. Za těchto podmínek DON (10 mg.kg^-1, n = 5) důsledně vyvolával (p<0,05) hyperaktivitu (porovnej úzce diagonálně šrafované sloupky (DON samotný) s vyplněnými sloupky (granisetron + DON) v obrázcích 7A až 7D).

Podobně zeslabil (p<0,05) granisetron (80 mg.kg^-1, i.a.) motilitu v ileu, a to jak spontánní kontraktilní motorické odpovědi na 40+18 % (n = 4), tak relaxační motorické odpovědi na 27 10 % (n = 3) kontrolních hladin. Neantagonizoval však DONem vyvolanou hyperaktivitu (neznázorněno).

Tyto pokusy charakterizovaly motorické charaktery

444· • 4 44

4 4 4

4 4

4 4

4 · •4 4444 v úrovni žaludku a tenkého střeva u anestezovaných krys vystavených působení mykotoxinuu DONu. Systémová injekce DONu přerušila oscilačně motorickou aktivitu žaludečního antra a nahradila ho klidovým charakterem. A v duodenu vyvolal DON hyperaktivitu místo spontánního cyklického charakteru rošiřující se a nerozšiřující se motorické aktivity. DON způsobil také hyperaktivitu existujícího motorického charakteru v ileu. Charakteristická aktivita vyvolaná DONem připomínala typický charakter nasycenosti motorické aktivity. Použity byly nízké hladiny DONu, t.j. hladiny, které nevyvolaly zvracení nebo nauzeu. Působení DONu bylo maximální s 10 mg/kg DONu. Tato dávka je srovnatelná s jinými studiemi, používajícími hlodavce, kdy bylo použito až 40 mg/kg (i.v.) DONu k vyvolání změn v krmení (Rapely a spol., Lab. Anim. Sci., 38: 5041 (1988)).

Progresivní tolerance na DON byla evidentní u zkoumaných krys. DONem vyvolaná hyperaktivita v tenkém střevě trvala až 60 minut, načež následovala plná regenerace kontrolních motorických charakterů. Pak byla udržována vnímavost na rutinně podávané farmakologické stimuly, kromě DONu, který byl neúčinný po blízko po sobě následujících podáních, což je charakteristické pro rozvoj tachyfylaxe na DON. Tato tachyfylaxe však nepřetrvávala, možná vzhledem k vysokému stupni detoxikace DONu u krys (Prelusky a spol., Fund. Appl. Toxicol., 10: 276-286 (1988)).

Mnoho léků, zejména emetické prostředky, mění motilitu v úrovni zažívací soustavy, kde aktivují vagová aferentní nervová vlákna, působící na autonomní ganglia nebo/a centra pro zvracení centrálního nervového systému (CNS), které pak reflexivně stimulují zažívací soustavu (Castex a spol., Brain Res., 688: 149-160 (1995), Cuheddu a spol., Sem. Oncol., 19: 2-13 (1992)). Avšak výsledky z pokusů ex vivo a in vitro, které byly zde uvedeny, naznačují, že zatímco izolované segmenty zažívací soustavy byly citlivé na řadu farmakologických stimulů, byl přímo aplikovaný DON bez účinku. DON tedy musí

00·· >00 »00

0·00 působit nepřímo, z míst vně zažívací soustavy. Toto zjištění se shoduje s některými zprávami v literatuře o opožděném časovém nástupu DONem vyvolaných účinků, následujících po intragastrické oproti intravenózní injekční aplikaci (30 minut oproti 15 minutám) (Coppock a spol., Am. J. Vet. Res., 46:

169-174 (1985), Forsyth a spol., Appl. Environ. Microbiol., 34: 547-552 (1977), Prelusky a spol., Natural. Toxins, 1: 296-302 (1993).

Za normálních okolností přerušuje krmení cyklický motorický charakter hladovění ve všech úsecích zažívací soustavy, přičemž jej nahrazuje kontinuální, nepravidelnou nízkohladinovou aktivitou (segmentace, charakter nasycenosti). Jak shora uvedeno, segmentace se vyznačuje úzkými prstencovítými kontrakcemi, vloženými mezi relaxace v tenkém střevě, a sníženou motilitu v žaludečním antru. Charakter nasycenosti funguje tak, že se míchá střevní obsah míchá a zdržuje se jeho pohyb dopředu, aby se urychlila absorpce substrátu (Lundgren a spol., Dig. Dis. Sci., 34 :264-283 (1989)). Motilita charakteru nasycenosti je aktivována periferními autonomními gangliemi cestou primárně vagových podnětů a je regulována v menším rozsahu pomocí CNS (centrálního nervového systému) (Chung a spol., Can. J. Physiol. Pharmacol., 70: 1148-1153 (1992), Tanaka a spol., J. Surg. Res., 53: 588-595 (1996), Yoshida a spol., J. Pharmacol. Exp. Therap., 256: 272-278 (1991)). Přeaktivace autonomních nervů urychluje nástup a zvyšuje trvání charakteru nasycenosti, . přičemž současně zvyšuje frekvenci a amplitudu rozšiřující se motorické aktivity (Halí a spol., Am. J. Physio., 250: G501-G510 (1986), Johnson a spol., Am. J. Surg., 167: 80-88 (1994)). Tato motorická aktivita je podobná DONem vyvolané hyperaktivitě v tenkém střevěš, pozorované výše. Kromě toho DONem vyvolaná inhibice antrální motorické aktivity a opožděné vyprázdňování žaludku (Fioramonti a spol., J. Pharmacol. Exp. Therap., 266: 1255-1260 (1993)) je také charakteristické pro charakter nasycenosti (Halí a spol., 1986). Tyto výsledky dohromady naznačují, že DON stimuluje z vnějších míst cesty ovládající φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ

ΦΦ φφφ· ·» φ φ · φ ·· · · • φφφ φ • φ φ φ φφ φφ φ φ φ φ φφφ φ φ charakter nasycenosti bud cestou periferních autonomních ganglií nebo vagových podnětů.

Motilita charakteru nasycenosti může být částečně aktivována potlačením inhibičních nervových vlivů (Lundgren a spol., 1989). DON by tedy mohl tím, že působí vně zažívací soustavy, stimulovat hyperaktivitu eliminováním tonického potlačení střevních nervových obvodů regulujících moti 1 itu zažívací soustavy. NO (oxid dusnatý) je navrhován jako tonicky uvolněný inhihičný mediátor, který ovlivňuje gastrointestinální motilitu (Daniel a spol., Am. J. Physio., 266: G31-G39 (1994), Gustafsson a spol., J. Aut. Nerv. Sys., 44: 179-187 (1993), Hryhorenko a spol., J. Pharmacol. Exp. Therap., 271: 918-926 (1994)). Při pokusech in vivo působení inhibitorem syntézy NO, L-NAME (10 mg/kg, i.v.), napodobovalo do určité míry účinky DONu tím, že zesilovalo specifickou motorickou aktivitu duodena a ilea. Působení L-NAMEm však neovlivnilo účinky DONu v zažívací soustavě.

Tyto pokusy poskytují hodnotné porozumnění cest ovládajících účinky DONu v gastrointestinální soustavě. Zatímco inhibitor syntázy NO, L-NAME, blokoval selektivně spontánní meziskupinové duodenální relaxace a potencoval skupinovou motorickou aktivitu, neovlivnil DONem vyvolanou hyperaktivitu. Naproti tomu pomocí alfa-methylen-ATP vyvolaná tachyfylaxe, která zeslabovala selektivně skupinové relaxace, také zabránila DONem vyvolané hyperaktivitě v .duodenu. Existuje silný důkaz pro předpoklad, že ATP a NO jsou inhibiční neurotransmitery v krysím duodenu (Katsuragi a spol., J. Pharmacol. Exp. Therap., 259: 513-518 (1991), Manzini a spol., Eur. J. Pharmacol., 123: 229-236 (1986), Pastorino a spol., J. Auton. Pharmacol., 15: 65-71 (1995), Windschief a spol., Br. J. Pharmacol., 115: 1509-1517 (1995)). Toto zaměření DONu na purinergní relaxace bylo také zřejmé v ileu, kde DONem vyvolaná hyperaktivita byla blokována pomocí alfa, beta-methylen-ATP tachyfylaxí. Doposud nebyla zkoumána in vivo u krysy identita transmiteru zprostředkovávajícího spontánní

ΦΦ φφφφ φ · φ • · φ • φ · • φ φ · • Φ »· ·· φφ φ φ φ φ • · φ • · φ φφφ •Φ φφφφ ileální relaxace. Existuje však velké množství funkčních důkazů in vitro jak pro ATP, tak pro NO, že zprostředkovávají NANC relaxace v krysím ileu (Belai a spol., Cell. Tiss. Res, 278: 197-200 (1994), Fargeas a spol., Gastroenterol., 102: 157-162 (1992), Mahmod a Huddart, Comp. Biochem. Physiol., 106C: 79-85 (1993), Smits a spol., Br. J. Pharmacol., 118: 695-703 (1996).

Blokáda nikotinového receptorů zrušila jak spontánní, tak DONem vyvolanou motorickou aktivitu v tenkém střevě, což vysvětluje výsledky z řady dřívějších studií. Je známo, že nikotinové ganglionové transmise zprostředkovávají cholinergní stimulaci jak excitačních, tak inhibičních intramurálních neuronů, které modulují a zpracovávají střevní nervové signály (Bornstein a spol., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 21: 441-445 (1994), Gershon, Ann. Rev. Neurosci., 4: 227-272 (1981). De facto ovládají cholinergní nervové buňky všechny stavy motility gastrontestinálního traktu včetně peristaltického reflexu a MMC. Proto by léčba nikotinovými antagonisty účinně blokovala většinu, ne-li všechny,střevní nervové obvody.

Je nepravděpodobné, že by 5-HT3-místa na vagových aferentních nervových vláknech byla zahrnuta do působení DONu, týkajících se motorické aktivity zažívací soustavy, protože DON byl neúčinný, když byl aplikován přímo na excidovanou zažívací soustavu celého zvířete. 5-HT3-receptory jsou také lokalizovány na myenterické nervové buňky, které jsou zapojeny do střevních obvodů regulujících interdigestivní motorický charakter (Neuropsychopharmacol., 3: 371-383 (1990, Yoshida a spol., 1991), a tyto nervové buňky se mohou vyskytovat ve střevní(ch) cestě (cestách), na které je zaměřen DON. Léčba granisetronem, silným a specifickým antagonistou S-HTa-receptoru, v dostatečně vysoké dávce, která zničila spontánní skupinovou aktivitu v duodenu a ileu, neovlivnila DONem vyvolanou hyperaktivitu. Proto DON a 5-HT působí různými cestami, které jsou zaměřeny na společné střevní prvky v tenkém • Φ ΦΦ • Φ Φ * φφ » 1 ··

Φ* «φφφ

Φ • ΦΦΦ střevě. Avšak jak DONem aktivovaná cesta, tak cesta závislá na 5-HT3-receptorů směřují ke stejné populaci inhibičních purinergních motorických nervových buněk.

Tato zjištění poskytují vysvětlení pro odmítání potravy. Účinky nízkých prahových

DONem vyvolané hladin DONu se projevuj i motorická v prerusenx aktivita je střeva je intenzivnější motility zažívací soustavy. Antrální snížena a motorická aktivita tenkého

Společně tyto motorické stavy ilustrují stav nasycenosti, tj. stav normálně spojovaný s přesyceností. Za těchto okolností tává přijímat potravu. Tento člověk nebo jiný živočich přesDONem vyvolaný stav nasycenosti je přechodný a interdigestivní cyklický charakter se brzy vrátí, pravděpodobně protože hladiny plasmy se sníží pod prahovou hodnotu.

Logickým znakem této studie bylo zaměření DONem na střevní P2_x-purinoceptorem zprostředkovanou motorickou inervaci. Tato inervace také zahrnuje nikotinové receptory, avšak, jak popsáno výše, všudypřítomné rozmístění a zapojení nikotinových míst v rámci střevních nervových okruhů vylučuje použití nikotinových antagonistů, aby působily proti účinkům DONu. Slibnější však je specifičnost DONu při aktivaci s P2x-purinoceptorem spojené aktivity. P2_x-purinogerní místa představují vysoce omezenou složku střevních cest a tudíž zaměření se na tato místa může představovat jednoduchý přístup pro neutralizování účinků DONu zažívací soustavě.

Příklad 2

Účinky DONu na spontánní motorickou aktivitu gastrointestinálního traktu u prasete in vivo: zapojení střevních P2x-purinoreceptorů

Tento příklad demonstruje, že trichothecen DON ovlivňuje motilitu zažívací soustavy tím, že působí na jednom místě v periferní nervové soustavě a že proti vlivu DONu může půso57 • ··

AA 4» A • *·

A A ·

A A · ··· ·· »· ·

A · A • A 9

A A A A ·· AA

AA AA

A A A A

A A A • A A A AAA

AA AAAA bit desenzibilizující agonista purinoceptorů P2xi, alfa, beta-methylen-ATP, který se váže vysokou afinitou na purinoceptor P2xi na tkáni zažívací soustavy. Intenzivní vazba tímto purinergním analogem ATP nejen desenzibi1izuje regulaci motility zažívací soustavy P2xi purinoceptorem DONem, ale také může účinně uzavřít cestu regulace zažívací soustavy jako antagonista P2x1-purinoceptorů.

Samci yorkširských prasat (10 až 15 kg živé hmotnosti), kteří byli jeden týden odstaveni, se nechali hladovět 12 hodin přes noc, při volném přístupu k vodě. Ráno v den operace bylo zvířatům podáno sedativum Ketamine (8 mg/kg) intramuskulární injekcí. Ketamine je disociativní anestetikum, které způsobuje zvýšení krevního tlaku a skeletálního tonusu, a trachea ztuhne. Dojde ke kataleptickému útlumu se ztrátou vnímání okolí. Sekrece slin je však zvýšená a tedy existuje nebezpečí obstrukce dýchacích cest. Atropin však nemůže být použit. Byla zavedena anestezie použitím směsi Halothanu s kyslíkem aplikací obličejové masky. Byla provedena topická faryngeální anestezie použitím 1 až 2 dávek 1idokainového aerosolu (10 mg na dávku, Xylocain, Sigma). Zvířata pak byla intubována, bylo dosaženo chirurgické úrovně anestezie použitím Halothanu (3-4%) v kyslíku (200 ml/min) cestou uzavřeného nevratně dýchacího okruhu. Do povrchové žíly ucha byl zaveden katétr pro náhradu elektrolytu (0,9%-ní fyziologický roztok) a intravenózní injekční aplikace léku. Femorální arterie byla rovněž kanylována pro aplikaci léku intrarteriálními injekcemi. Kanyla PE 205 byla vedena retrográdním směrem tak, aby konec kanyly byl umístěn v úrovni horní mezenterní arterie. Tímto arteriálním katétrem byl také monitorován krevní tlak pomocí snímače tlaku (P23ID, Gould Statham, OH, USA) připojeného k spřaženému systému IBM pro sběr dat. Zvířata byla podrobena laparatomii a byly připevněny fóliové tenzometry (typ Showa Nil, Durham Instruments, Pickering, ON) použitím lepidla Vet Bond, jak popsáno v příkladu 1, na serózu gastrointestinálního traktu. Jeden tenzometr byl umístěn na žaludeční antrum (ve vzdálenosti 5 až 10 cm od pyloru). Druhý tenzometr ·· ·· • · · · • ·

byl umístěn na antimezenterní okraj proximálního duodena (2 až 10 cm od pyloru) a poslední tenzometr byl připojen na serosu distálního ilea (ve vzdálenosti 2 až 10 cm od ceká). Všechny tři tenzometry byly orientovány paralelně s osou podélného svalu. Vodiče od tenzometrů byly vyňaty z dutiny břišní a připojeny k systému pro sběr dat IBM přes propojovací krabici. Po dokončení operace byla prasata obrácena na stranu a po zbytek pokusu byl udržován lehký stupeň anestezie pomocí 1 až 2 % Halothanu.

Motorická aktivita byla kontinuálně zaznamenávána ze všech fóliových tenzometrů současně za použití programových prostředků pro sběr dat (AD1000 analog k digitálnímu konverznímu štítku, Reál Time Devices., Dr. Frank Johnson, Institute of Medical Engineering, University of Ottawa) a kompatibilního počítače IBM. Kvalifikované motorické odpovědi byly vybrány na základě jejich kapacity vyhovovat dvěma sadám (pro kontrakce a relaxace) šesti numerických hodnot. Tyto hodnoty definovaly prahové parametry trvání a velikosti, které účinně označovaly motorickou aktivitu založenou na vizuálním hodnocení záznamů uživatelem. Uživatel je schopen kontinuálně monitorovat tyto parametry po období následujících dvou minut a upravit hodnoty tak, jak je považováno za potřebné, aby se účinně zaznamenaly motorické odpovědi s přesností 95 až 100 %. Programové vybavení počítače pro sběr dat provádí výstup frekvence, amplitudy, plochy, doby do píku a trvání jak kontraktilních, tak relaxantních motorických odpovědí.

Pro porovnání mezi středními hodnotami při použití programu Statgraphics Plus, byla použita jednocestná ANOVA s Turkeyovou vícenásobnou analýzou. Za významnou byla považována pravděpodobnost menší než 0,05 (p<0,05). Všechny hodnoty byly vyjádřeny jako střední * standardní chyba pokusů.

Všechny léky, použité v in vivo a ex vivo pokusech, včetně DONu, byly rozpuštěny ve fyziologickém roztoku (0,9 %). Koncentrace infuzních roztoků (podávané rychlostí 0,5 ml/min) byly: alfa,beta-methylen-ATP (300 jug/kg), L-NAME (10 mg/kg), granisetron (80 jig/kg), pentolinium (5 χ ΙΟ^-5 M) a hexamethonium (18 mg/kg, s.c.). Všechny léky byly zakoupeny od firmy Sigma Chemical Company, Toronto, ON až na alfa, beta-methylen-ATP a methylthio-ATP, které byly získány od firmy RBI, Natick, MA, a DON byl získán od Dr. Dave Millera, Agriculture Canada, Ottawa, kde byl vyroben biosynteticky podle metod Millera a Arnisona, 1986.

Spontánní motorická aktivita gastrointestinálního traktu

Žaludek: Motorická aktivita v žaludečním antru obvykle sestávala z oscilačních kontrakcí a relaxací. Tyto byly buď přítomné po celou dobu kontrolního záznamu nebo se vyskytovaly náhodně. V žaludečních záznamech nebyl patrný motorický charakter analogický s MMC. Souhrn spontánní motorické aktivity je znázorněn v tabulce I.

Duodenum: Spontánní motorická aktivita sestávala z nepravidelného charakteru kontraktilní nebo/a relaxantní motorické aktivity (tabulka 1). Příležitostně byla patrná aktivita připomínající MMC, sestávající z fáze III rozšiřujícího se typu aktivity (skupinová aktivita) a klidových období. Skupinová aktivita trvala přibližně 5 minut, avšak délka cyklu nemohla být přesně stanovena, protože skupinová aktivita se nevyskytla více než 2 nebo 3 krát během kontrolního období, které při našich pokusech trvalo až -2 hodiny. Je známo, že MMC mají u hladovějících prasat cyklus o délce 70 až 115 minut. U našich prasat sestávala skupinová aktivita z relativně vysoké amplitudy, vysokých frekvencí relaxací a kontrakcí: frekvence kontrakcí: 11,9 ± 0,5 příhod/min, amplituda kontrakcí: 0,08 + 0,01 g, frekvence relaxací: 12,9 + 0,8 příhod/min, amplituda relaxací: 0,07 + 0,01 g.

Ileum: Ileum obvykle vykazovalo náhodnou kontraktilní nebo/a relaxantní motorickou aktivitu (tabulka 1). Aktivita podobná MMC byla pozorována zřídka. U jedné třetiny (n = 5) • · · prasat byla motorická aktivita ilea v klidovém stavu. Při těchto pokusech však bylo prokázáno, že ileum odpovídalo na léčbu DONem.

Tabulka 1

Charakteristiky spontánních interdigestivních motorických aktivit u anestezovaných prasat

Parametry	Žaludek	Duodenum	Ileum
Amplituda kontrakcí	0,16+0,04	0,07+0,01	0,05+0,01
Amplituda relaxací	0,19+0,03	0,07+0,01	0,05+0,01
Frekvence kontrakcí	4,8+0,5	6,7+0,6	3,2+0,5
Frekvence relaxací	5,5+0,3	0/8+0,5	3,6+0,5

Hodnoty představují průměr ± standardní chyba hodnot získaných od 12 prasat Amplituda (napětí v gramech),

Frekvence (příhody/min),

Trvání (sekundy)

DON byl podáván v dávce 0,1 mg/kg (n = 3), 0,7 mg/kg (n = 2) a 1,0 mg/kg (n = 10) buď intravenózní (i.v.) nebo intraarteriální (i.a.) cestou. Během 5 minut po injekci snížil (p<0,05) DON (n = 6) frekvenci a amplitudu spontánních kontraktilních a relaxačních motorických odpovědí. Doba této DONem vyvolané inhibice trvala od 10 minut až do neomezeného časového období. Na rozdíl od toho zvýšil (p<0,05) DON u tří prasat frekvenci o 182 ± 40 % a amplitudu spontánní motorické aktivity o 206 J; 38 %. Tento účinek trval až 30 minut před

návratem na kontrolní charakter. Tento rozdílný účinek DONu nebyl zřejmě závislý ani na dávce, ani na cestě podání. Kromě toho ani dávka injekčně podaná, ani cesta podání nevyvolala žádné změny v středním arteriálním krevním tlaku, který měl stále stejnou hodnotu během doby kontroly a léčby DONem.

Účinky DONu byly důslednější v duodenu (n = 21), kde vždy zesilovaly (p<0,05) spontánní motorickou aktivitu. Systémově podávaná dávka DONu větší než nebo rovná 1 mg/kg, vyvolala důsledně významné zesílení účinku. Představuje také dávku, která zvýšila frekvenci jakož i amplitudu duodenální motorické aktivity. Frekvence DONem vyvolané hyperaktivity zůstala typicky zvýšená po celou dobu pokusu, zatímco amplituda motorických odpovědí se vrátila postupně na kontrolní hladiny.

Účinky dávky DONu na parametry frekvence a amplitudy kontraktilní a relaxační motorické aktivity byly zkoumány pro dávky 0,1 mg/kg, n - 3, 1,0 mg/kg, n = 12, 10 mg/kg, n = 3. Jasný účinek vlivu dávky na odpověď byl evidentní pouze pro amplitudu motorické aktivity. Kromě toho zvýšená motorická aktivita díky DONu při 10 mg/kg nebyla významně odlišná od účinků DONu při 1 mg/kg.

torické při dávce amplituda kontraktilní a

Systémově podávaný DON vyvolával zvýšení ileální motorické aktivity závislé na dávce. DON byl podáván v dávkách 0,1 mg/kg ( n= 3), 0,7 mg/kg (n = 3), 1,0 mg/kg (n = 12) a 10 mg/kg (n = 4). V ileu byl účinek odpovědi v závislosti na dávce evidentní u obou parametrů frekvence a amplituda moaktivity. Avšak maximální účinky DONu se dostavily nebo větší, kde jak frekvence, tak relaxační spontánní motorické aktivity byly významně zvýšené (p<0,05). Třicet až šedesát minut následujících po DONem zvýšené aktivitě začínala frekvence a amplituda přítomné motorické aktivity klesat, avšak dvě hodiny po počáteční injekci DONu byla motorická aktivita stále významně vyšší než kontrolní aktivita.

rovné 1 mg/kg • · ··· ·

9 · · ····

Účinky alfa,beta-methylen-ATP proti DONem vyvolané hyperaktivitě

Alfa,beta-methylen-ATP byl vždy podáván během DONem vyvolané hyperaktivitě. To poskytovalo interní kontrolu účinku DONu. Při dávce SOO^g/kg, podané intraarteriálně, vyvolal alfa,beta-methylen-ATP pouze přechodné (menší než 1 minutu trvající) zvýšení středního arteriálního krevního tlaku.

Podávání alf a, beta-methylen-ATP (300 j/ig/kg, i.a.) vždy vyvolalo počáteční relaxační odpověď v žaludku, avšak nepůsobilo proti účinkům DONu na žaludeční motorickou aktivitu.

Po injekci alfa,beta-methylen-ATP (175 jigkg,i.a.) obvykle vyvolal malou fázovou relaxaci duodena. Nezdá se však, že by DONem vyvolaná hyperaktivita byla ovlivněna. Vyšší dávka alfa,beta-methylen-ATP (300 jug/kg,i.a.) důsledněji vyvolala počáteční fázovou relaxaci (0,5 _+ 0,1 g, n = 10) s následujícím přechodným (3 až 10 minut trvajícím) zmenšením DONem vyvolané hyperaktivity. Alfa,beta-methylen-ATP významně snížil amplitudu, nikoliv však frekvenci DONem vyvolaných relaxací a kontrakcí (viz obr. 8). Když byl alfa,beta-methylen-ATP (300 /ig/kg, n = 3) znovu podán 10 až 20 minut po počáteční injekci, duodenum znovu relaxovalo. Zdálo se však, že se neprojevil žádný další účinek na DONem vyvolanou hyperaktivitu.

Analogické výsledky byly pozorovány v ileu, kde vyvolal alfa,beta-methylen-ATP (300 jug/kg, i.a.) velkou fázovou relaxaci (1,2.+ 0,2 g, n = 6) po injekci a redukovaný DON vyvolal hyperaktivitu. Účinnost alfa,beta-methylen-ATP při zmenšování amplitudy, jakož i frekvence DONem vyvolaných relaxací a kontrakcí v ileu je představena v obrázku 9. Ve třech pokusech byl po 10 minutách po počáteční dávce znovu podán alfa, beta-methylen-ATP (300 jug/kg), aby byl proveden test na rozvoj tachyfylaxe. Amplituda relaxace po alfa, beta-methylen63 • · > · · « • · ·♦

-ATP byla zmenšena o 68 + 18 % ve srovnání s počátečním podáním tohoto činidla.

Příklad 3

Neadrenergní, neoholinergní (NANC) regulace interdigestivní motorické aktivity v krysím tenkém střevě in vivo.

Tento příklad se týká studie nervových cest regulujících interdigestivní motorickou aktivitu v různých oblastech krysího tenkého střeva in vivo. Data v tomto příkladu společně s daty v příkladech 1 a 2 shora naznačují, že tlumení motility zažívací soustavy je regulováno nervovou soustavou, jak naznačeno schematicky v znázorněních na obrázcích 2 a 10.

Migrační motorický komplex (MMC) je spojen s interdigestivní propulzí střevního obsahu a podobně jako peristaltika zahrnuje postupnou aktivaci excitačních a inhibičních cest. Nervová soustava, které podléhá peristaltika, obsahuje excitační (primárně cholinergní) a inhibiční neadrenergní, necholinergní (NANC) motorické neurony inervující gastrointestinální hladké svalstvo, jakož i excitační a inhibiční interneurony (Costa a Brookes, Am. Gastroenterol, 89:

S129-S137 (1994)). Dříve však bylo málo známo o intramurálních neuronech, regulujících interdigestivní motilitu, hlavně protože MMC se nedají snadno stanovit in vitro. Kromě toho byla analýza MMC in vivo většinou zaměřena pouze na kontraktilní aktivitu. Studie motility in vivo, jako ty, které zde byly popsány, ukázaly, že rozšiřující se střevní aktivita, charakteristická pro MMC, sestává z kontrakcí jakož i relaxac i .

Stanovili jsme rozsah cholinergního a 5-HT-zapojení, jakož i úlohu ATP, VIP a NO, v spontánní motorické aktivitě duodena a ilea.

• · • ·· · ·· ··

Samci krys rodu Sprague-Sawley (250-350 g) byli ponecháni hladovět 24 hodin s volným přístupem k vodě. Za účelem operace byla zavedena anestezie s 2%-ním Halothanem v 500 ml/min kyslíku a tělesná teplota byla udržována trvale na 37 °C použitím termostaticky ohřívaného stolu a termálního prostěradla. Pravá a. carotis byla excidována a kanylována za účelem monitorování krevního tlaku pomocí snímače tlaku pravé jugulární cévy byla zapodávání léku. Často byla dá(i.a.) cestě podávání léku (P23ID, Gouod Statham, OH). Do vedena kanyla pro intravenózní vána přednost intraarteriální vzhledem ke krátkému poločasu mnoha léků a aby se předešlo hepatickému metabolismu první cesty. Z tohoto důvodu byla kanyla zavedena z pravé femorální artérie a byla vedena ve zpětném směru, aby byla špička umístěna na úrovni mezenterní arterie.

Zvířata byla připravena pro stanovení motility in vivo, jak popsáno výše. Fóliové tenzometry byly postupně připojeny za použití lepidla Vet Bond na antimezenterní okraj duodena, ve vzdálenosti 1-2 cm od gastroduálního spojení, a laterálně k antimezenternímu okraji ilea, právě proximálně k ileocekálnímu spojení. U 6 krys byly připojeny 2 nebo 3 fóliové tenzometry v dvoucentimetrové vzdálenosti od proximálního duodena. Z těchto pokusů jsme extrapolovali rozšiřování rychlosti skupinové” aktivity. Všechny fóliové tenzometry byly orientovány paralelně k podélné vrstvě svalu, protože to vyžaduje nejcitlivější uspořádání pro zaznamenání obvodové motorické aktivity. Krysy byly ponechány, aby se zotavily po operaci po dobu jedné hodiny, načež se zaznamenávala regulovaná motorická aktivita během další hodiny před podáním jakéhokoliv léku. Všechny operační a pokusné protokoly byly provedeny podle směrnic Canadian Council on Animal Care, uplatňovaných komisí Animal Care Commitee při University of Ottawa.

Sběr dat a statistická analýza byly provedeny, jak shora popsáno.

«·· · • 4 «· • ♦ 4 * · · · · • » · 9 ·

4 4 9 ♦ 9 · · 4444

Všechny léky byly rozpuštěny v 0,5 ml fyziologického roztoku (0,9¾). Dávky (podané během 1 minuty) byly: alfa, beta-methylen-ATP (300 ./ig/kg), methyl-S-ATP (360 jug/kg), methylester-N-omega-nitro-L-argininu (L-NAME, 10 mg/kg), vasoaktivní střevní peptid (VIP 4 až 10./ig/kg), BRL 43694 (granisetron, 80 mg/kg), atropin (4 až 6 mg/kg) a hexamethonium (18 mg/kg s.c.). Všechny byly zakoupeny od Sigmy až na alfa, beta-methylen-ATP a methyl-S-ATP, které byly získány od RBI, a granisetron, což byl dar od Dr. R.K.Hardinga.

Specifické oblastní charakteristiky spontánní motorické aktivity byly snadno charakterizovány v krysím tenkém střevě. V duodenu (n = 8) toto sestávalo ze znovu se opakujících cyklů rozšiřujících se skupinových a nerozšiřujících se mezi skupinových motorických aktivit s cyklem o délce 5,4 + 0,4 min. Skupinová aktivita se vyznačovala intenzívním obdobím (přibližně 2 až 4 minut) kontraktilní nebo/a relaxační motorické aktivity, která se rozšiřovala kaudálně rychlostí 3,4 + 0,6 cm.min^-1 způsobem připomínajícím MMC. Meziskupinová aktivita byla tvořena náhodně se vyskytujícími relaxacemi nebo/a kontrakcemi o nízké amplitudě a nízké frekvenci.

Spontánní motorická aktivita ilea sestávala buď pouze z relaxací (50 % všech testovaných zvířat) nebo pouze z kontrakcí (30 % všech testovaných zvířat). U zbývajících pokusů se kontraktilní a relaxační motorická aktivita vyskytovala současně. Převaha jednoho typu motorické odpovědi (kontrakce oproti relaxaci) je považována za indikativní pro vnitřní tonus hladkého svalstva, tkáň s vysokým tonusem vykazuje převážně relaxační aktivitu, kdežto tkáň s nízkým tonusem častěji vykazuje kontrakce. Obvykle se spontánní ileálni relaxace a kontrakce vyskytovaly s poměrně nízkou frekvencí a měly poměrně vysokou amplitudu. V 10 % pokusů vykazovalo ileum perivzniklé vysokofrekvenční motorické odpovědi fází III MMC aktivity.

odicky náhle srovnatelné s

Substituované deriváty ATP, alfa,beta-methylen-ATP a me

- 66 r · ·· · • » * ♦ ·· ·· • ♦ · · • · ♦ thyl-S-ATP mají diferencované afinity pro P2x- a P2y-purinoceptory (Burnstock a Kennedy, Gen. Pharmacol, 16: 433-440 (1985)). V tkáních se rozvíjí tachyphylaxe po prodlouženém vystavení těmto činidlům a tímto způsobem bylo možno rozlišovat mezi odpověďmi ovládanými P2x- a P2_y-receptory. Po injekci vyvolal alfa,beta-methylen-ATP (300 jdg/kg, i.a.) v duodenu fázovou relaxaci (1,0 ± 0,1 g, n = 5), načež selektivně zeslabil (p<0,5) frekvenci o 75 + 7 % a amplitudu skupinových” relaxací o 48 .+ 5 %. Účinky alfa,beta-methylen-ATP na spontánní duodenální kontrakce byly proměnlivé a nemohly být analyzovány .

V ileu vyvolal alfa,beta-methylen-ATP (300_c«g/kg, i.a., n = 8) počáteční fázovou relaxaci. Bezprostřední nová stimulace pomocí alfa,beta-methylen-ATP nevyvolala další odpověď ukazující na rozvoj tachyfylaxe. Během tohoto období byly spontánní ileální relaxace zeslabeny (pZ 0,05, n = 8) až na 30 minut. Spontánní kontrakce nebyly ovlivněny působením alf a, beta-methylen-ATP. Methyl-S-ATP (360 i.a., n = 4) rovněž zmírňoval (pz'0, 05) ileální relaxace, avšak methyl-S-ATP nevyvolával počáteční fázovo relaxaci.

L-NAME (10 mg/kg, i.v., n = 8) selektivně zeslaboval frekvenci (44 + 8 %) a amplitudu (66 + 1 %) spontánních mezi skupinových relaxací duodena. V ileu potencoval L-NAME jak kontraktilní (n = 6), tak relaxační (n = 8) motorickou aktivitu. Tento účinek často přetrvával po celou dobu trvání pokusu. Relaxace, potencované L-NAMem, byly zeslabeny (pZ 0,05, n = 4-6) působením buď alfa,beta-methylen-ATP (o 59 + 12 %) nebo methyl-S-ATP (o 70 + 3 %).

Spontánní kontrakce a relaxace skupinové a meziskupinové motorické aktivity, jakož i motorické aktivity ilea, byly všechny zeslabeny (p<0,05, n = 4) až do 20 minut antagonistou nikotinového receptoru hexamethoniem. L-NAMem zvýšená aktivita byla rovněž zeslabena (p4o,O5, n = 6) hexamethoniem. Atropin (4-6 mg/kg, i.a., n = 4) zeslabil spontánní kon «· ···· ·· ·· • · · · · · • » · · · • · 4 ♦ · · ·· · · · · ··· ··' ·· ·· ·» ···· trakce ilea o 87 ± 3 % a 89 + 7 %. Duodenální kontrakce byly podobně ovlivněny.

VIP (4-10 jjg/kg, i.a.) vyvolal fázovou relaxaci (n = 8) v duodenu. Poté VIP přechodně potlačil (p<0,05) duodenální meziskupinovou motorickou aktivitu a potencoval (p<0, 05) skupinovou aktivitu. V ileu vyvolával VIP důsledně pouze pomalou kontrakci, která se vrátila na kontrolní hladinu během 6 minut. Současně s touto kontrakcí byly spontánní (n = 4) a L-NAMEm zvýšené (n = 6) relaxace zeslabeny (p< 0, 05) až na 8 minut. Frekvence a amplituda spontánních relaxací byly sníženy na 33 + 8 % a 21 + 5 % kontroly. Frekvence a amplituda pomocí L-NAME vyvolaných relaxací byly sníženy na 32 + 12 a 14 + 3 % kontroly.

Během 5 minut zeslabil (p<0,05) granisetron (eo^ug. kg^-1, i.v. nebo i.a.) spontánní skupinové duodenální relaxace (n = 9) a kontrakce (n = 4), ale neovlivnil meziskupinovou motorickou aktivitu. Skupinová motorická aktivita byla snížena až na 40 minut, načež se postupně vrátil kontrolní charakter interdigestivní motility. Léčba granisetronem také vedla k zeslabení (p <0,05, n = 4) spontánních ileálních kontrakcí a relaxací. Interdigestivní motorický charakter ilea se postupně asi během 60 minut vrátil na kontrolní hladiny. Amplituda L-NANEm zvýšené motorické aktivity ilea byla v přítomnosti granisetronu také zeslabena (p<f 0,05, n = 6) o 7 6 J; 8 %.

Skupinové relaxace byly citlivé na léčbu pomocí alfa, beta-methylen-ATP, zatímco meziskupinové relaxace byly potlačeny v přítomnosti inhibitoru NO-syntázy L-NAME. Naproti tomu ukazují naše výsledky, že NO není mediátorem spontánních relaxací ilea. Jiní prokázali, že v izolovaných preparátech krysího ilea vyvolává aplikace ATP relaxace a desenzibi1 izace ATP zeslabuje tyto relaxace (Smits a spol., Br. J. Pharmacol., 118: 695-703 (1996)). V této studii vyvolala systémová injekce agonisty P2x-purinoceptoru, alfa,beta-methylen-ATP, • ·· 99 9999 • 9 * 9 » 9 ·

99 9 9 9 • 9 999 9 99 • 99 99 99 ·9

99

9 9 9

9 9 · · •9 9999 počáteční relaxaci ilea. Bezprostřední nové podání alfa, beta-methylen-ATP nevyvolala odpověď, která by ukazovala na vývoj tachyfylaxe. Současně s vyvolanou tachyfylaxí byly potlačeny spontánní relaxace ilea. ATP je tedy cestou P2x-míst přenašečem zprostředkujícím spontánní relaxace NANC v krysím ileu.

ATP má řadu střevních nervových funkcí, protože kromě toho, že zprostředkovává na P2x-purinoceptoru závislé relaxace v duodenu a ileu, může ATP stimulovat v duodenu cestou P2y-purinoceptorů nerozšiřující se meziskupinové relaxace zprostředkovávané NO (Glasgow a spol., Am. J. Physiol., 276 (Gastrointest. Liver Physiol., 38): G889-G896 (1998)). V přítomném příkladu potlačoval agonista P2y-purinoceptoru, methyl-S-ATP, spontánní relaxace ilea. Avšak na rozdíl od alfa, beta-methylen-ATP nevyvolal methyl-S-ATP po injekci relaxaci ilea. To naznačuje, že P2y-purinoceptory nejsou přítomny na hladkém svalstvu nebo nejsou jinak aktivní v inhibiční motorické inervaci (cích) ilea. Data podporují hledisko, že v krysím ileu spolupůsobí P2y-purinoceptory při aktivaci cest ovlivňujících tonickou inhibici purinergních NANC motorických neuronů zacílených na P2x-purinoceptory. P2y-purinoceptory mohou být přítomny na nitrergních interneuronech, sloužících tonické inhibici, nebo na jiných interneuronech v tomto předspojovacím přívodu. Nitrergní a purinergní interneurony mohou též představovat tutéž populaci, protože ATP a NO-syntáza jsou společně umístěny v myenterních neuronech v krysím ileu (Belai a Burnstock, Cell. Tiss. Res., 278: 197-200 (1994)).

VIP je NANC inhibiční přenášeč v řadě oblastí zažívací soustavy (Bojo a spol., Eur. J. Pharmacol., 236: 443-448 (1993), Mule a spol., J. Auton. Pharmacol, 12: 81-88 (1992). Při těchto pokusech vyvolal VIP přechodnou relaxaci v krysím duodenu. Následující rozvoj tachyfylaxe na VIP potlačil kontraktilní a relaxační meziskupinovou aktivitu a zvýšil skupinovou motorickou aktivitu. Data naznačují, že počáteční VlPem vyvolané relaxace jsou závislé na NO a citlivé na de- 69 • φφ φφ φφφφ Φ· ·* φ · φφφφ

senzibi1izaci VIP. VlPergní interneurony musí tedy být zaměřeny přímo na motorické inervace (nitrergní a cholinergní motorické neurony) meziskupinové aktivity, jakož i na nitrergní předspojovací modulační přívody skupinové aktivity.

Při těchto pokusech působení VlPem potlačovalo spontánní relaxace ilea. Protože VIP nevyvolal po injekci relaxaci, je nepravděpodobné, že by VlPergní neurony ovlivňovaly přímo inhibiční přívod do ileálního hladkého svalstva (Smith a spol., Br. J. Pharmacol, 118: 695-703 (1996)). Pokusy na králičím ileu in vivo naznačují, že VIP hraje hlavní úlohu při tonické inhibici motorické inhibice cirkulárního svalu cestou inhibičního nervového působení (Fox-Threlkeld a spol.,Peptides, 12: 1039-1045 (1991)). Data podpírají hledisko, že VIP je zacílen na NO-závislou přejunkční modulaci purinergních inhibičních motorických inervací jak v duodenu, tak v ileu. Tyto purinergní motorické cesty vytvářejí specificky propagační motorickou aktivitu tenkého střeva. VIP dále potlačuje specificky fázi III aktivity MMC a antagonisté VIP iniciují fázi III aktivity (Hellstrom a Jung, Neurogastroenterol. Motil., 8: 299-306 (1996). Závěr je ten, že VIP současně stimuluje excitační motorické přívody a inhibiční nitrergní prejunkční přívody prurinergních motorických neuronů v krysím ileu.

Všechny komponenty interdigestivního motorického komplexu jsou závislé na vagosympatetické integritě (Chung a spol., Am. J. Physio., 267: G800-G809 (1994), Galligan a spol., J. Pharmacol. Exp. Therap., 238: 1114-1125 (1986)). Cholinergní interneurony regulující gastrointestinální motilitu působí cestou nikotinových synapsů, zatmco ACh (acetylcholin) působí na hladké svalstvo cestou muskarinových receptorů. Atropin potlačoval všechny spontánní kontrakce tenkého střeva. Výsledky této studie naznačují, že každá ze spontánních interdigestivních motorických aktivit duodena a ilea je ovládána tonicky a je senzitivní na blokádu nikotinového receptoru .

Μ · 0 0 · ukazují, že neuronálně odvozený 5-HT relaxace NANC (Briejer a spol..

Studie in vitro stimuluje purinergní Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 531: 126-135 (1995), Briejer a spol., J. Pharmacol. Exp. Therap., 274: 641-648 (1995)) a cholinergní kontrakce (Briejer a spol., Eur. J.Pharmacol, 308: 173-180 (1996)). Výsledky in vivo v této studii ukazují na to, že receptory 5-HT3 se účastňují v motorických cestách zprostředkování spontánních cholinergních kontrakcí a purinergních relaxací v duodenu a ileu.

Uspořádání cholinergních, nitrergních, GABAergních, purinergních a VlPergních neurálních prvků v navržených tonických a modulačních cestách, regulujících spontánní motorickou aktivitu v krysím duodenu a ileu, je znázorněno schematicky v zjednodušeném schématu propojení na obrázku, který také ukazuje klíčové umístění pro receptory P2x a P2_y na cestě. Stereotypní charaktery motility jsou vyvolány, když hnací obvody aktivují excitační a inhibiční motorické cesty, jak určno střevními nervovými programy. Avšak kontinuální řízení inhibičními interneurony udržuje myogenní aktivitu klidnou. Tato koordinovaná inhibice a desinhibice je ovládána nitrergními přívody a je to přesně regulace těchto předvstupních neuronálních cest společně s tonicky aktivními motorickými cestami, která generuje cyklické (interdigestivní) charaktery motility na existující základně motorické aktivity. GABAergní/nitrergní kombinační okružní cesta není přítomna v ileu.

Příklad 4

Účinky DONu a derivátů na bázi DONu na spontánní gastrointestinální motorickou aktivitu

Tento příklad demonstruje schopnost derivátů na bázi DONu vyvolat charakter nasycenosti motility zažívací soustavy podobným způsobem jako DON.

4 44 4 ·· ··

4 · · 4 4 · « · 4 · · ( • · 4 4 4 4 4 4 • 4 4 · 0 4 4 • 4 44 44 4444

Deriváty DONu byly zvoleny pro srovnávací studii s D0Nem u krys použitím metod popsaných v předcházejících příkladech pro testování DONu a zaznamenání jeho účinku na motilitu zažívací soustavy. Jedním z reprezentantů derivátů DONu byl 3-acetyl-DON (C17H22O7). Pro studii byly také zvoleny jiné nové deriváty na bázi DONu: isopropylidin-DON (t.j. 3-hydroxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-trichothecin-8-on, který má vzorec ΟιβΗ24θβ, označený EN139491), isopropylidin-3-acetyl-DON (tj. 3-acetoxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, který má vzorec C20H26O7, označený EN139492), DON-karbonát (t.j. 3-hydroxy-12, 13-epoxy-9-trichothecin-8on-7,15-karbonát, který má vzorec C16H18O7, označený EN139494), 3-acety1-DON-karbonát (tj. 3-acetoxy-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát, který má vzorec C18H2OO8, označený EN139495), 3-acety1-DON-benzylidenacetal (tj. 3-atoxy-7,15- benzyliden-12, 13-epoxy-9-trichothecin-8-on, který má vzorec C24H26O8, označený EN139496) a DON-benzy lidenacetal (tj. 3-hydroxy-7,15-benzyliden-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, který má vzorec C22H24O, označený EN139497). Chemické struktury DONu a tyto reprezentativní deriváty DONu jsou znázorněny na obrázcích 3A a 3B.

Syntéza nových derivátů DONu

Isopropylidin-DON (EN13491):

K roztoku 50 mg (0,168 mmol) deoxynjvalenolu (DONu) a 70 mg 2,2-dimethoxypropanu v 2,0 ml bezvodého acetonu se při 0 °C přidal přibližně 1 mg p-toluensulfonové kyseliny. Reakční směs se míchala a nechala se ohřát na teplotu místnosti. Postup reakce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a bylo usouzeno, žw reakce byla dokončena po 5 hodinách. Rozpouštědlo se nechalo odpařit a surový produkt se rozdělil mezi 2 ml vody a 5 ml ethylacetátu. Organická vrstva se promyla s 2 ml nasyceného NaHC03, po němž následovaly 2 ml nasycené solanky a pak se vysušila bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odpařilo a zbytek byl chromatografován

na silikagelu s použitím směsi ethylacetátu s hexanem v poměru 6 : 4. Výtěžek hyl 38 mg (67 %) bílého prášku.

Analýza ¹H NMR (CDCI3, 200 MHz): :6,81 (m, 1H), 4, 82 (m, 1H), 4,45 (s, 1H), 4,40 (m, 1H), 3,85 (bs, 2H), 3,61 (d,J = 8,0 Hz, 1H), 2,91 (d,J = 8,0 Hz, 1H), 1,91 - 2,10 (m, 2H), 1,99 (s, 3H), 1,49 (s,3H), 1,26 (s, 3H), 0,99 (s, 3H). Pík pro OH skupinu se nepodařilo lokalizovat v tomto spektru.

Data hmotnostní spektroskopie potvrdila strukturu isopropyl idin-DONu (EN139491), jak je znázorněno na obrázku 3A.

Isopropylidin-3-acetyl-D0N (EN139492):

Tato sloučenina byla připravena v 62%-ním výtěžku, přičemž se vycházelo ze 70 mg 3-acetyl-DONu a 87 mg 2, 2-dimethoxypropanu. Produkt byl získán ve formě bílého prášku po chromatografi na silkagelu s použitím směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 1 : 5 jako eluentu.

Analýza ¹H NMR (aceton-d6, 200 MHz): : 6,67 (d,J = 8, 0 Hz, 1 H), 5,09 (m, 1H), 4,81 (m, 2H), 3,85 (d,J = 8,0 Hz, 1H), 3,51 (bis, 2H), 3,12 (m, 2H), 2,61 (dd, J = 8,0 Hz, 16, 0 Hz, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,99 (dd, J = 8,0 Hz, 1H, 16,0 Hz), 1,82 s, 3H), 1,25 (s, 6H), 1,15 (s, 3H).

Data hmotnostní spektroskopie potvrdila strukturu isopropyl idin-3-acetyl-D0Nu (EN139492), jak znázorněno v obrázku 3A.

DON-7,15-karbonát (EN139494)

K roztoku 10 mg (0,033 mmol) DONu a 0,015 ml pyridinu v 1 ml bezvodého dichlormethanu se přidal při -78 °C po kapkách trifosgen (5 mg, 0,016 mmol) v 1 ml CH2CI2. Reakční směs se ohřála na teplotu místnosti a míchala se dalších 6 hodin. Rozpouštědlo a zbývající těkavé reakční složky se odpařily • φ • φ • φ • · φ φ · φφ • φφ φ φφ «φ φ φ φ φ • φ φ • · φ φφφ φφ φφφφ a zbytek se vyčistil si1ikagelovou kolonovou chromatografií za použití ethylacetátu jako eluentu. Výtěžek DON-7,15-karbonátu ve formě bílého prášku byl 10 mg (99 %~) .

Analýza ¹H NMR (aceton-d6, 200 MHz): :6,71 (d,J = 8,0 Hz, 1H), 5,49 (s, 1H), 4,81 (d,J = 8,0 Hz, 1H), 4,51 (m, 3H), 4,31 (d,J = 16,0 Hz, 1H), 3,51 (d,J = 4,0 Hz, 1H), 3,21 (m, 2H), 1,90 - 2,21 (m, 2H), 1,86 (s, 3H), 1,01 (s, 3H).

Data hmotnostní spektroskopie potvrdila strukturu DON-7,15-karbonátu (EN139494), jak znázorněno v obrázku 3B.

3-acetyl-DON-7,15-karbonát (EN-139495):

Tato sloučenina byla připravena v 99%-ním výtěžku z 20 mg 3-acetyl-DONu, 0,023 ml pyridinu a 10 mg trifosgenu. Produkt byl získán ve formě bílého prášku po silikagelové chromatrografii s použitím směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 7 : 3 jako eluentu.

Analýza ¹H NMR (CDC13, 200 MHz): :6,61 (d,J = 8,0 Hz,

1H), 5,36 (m, 1H), 5,29 (s, 1H), 4,49 (d,J = 8,0 Hz, 1H), 4, (d,J = 16,0 Hz, 1H), 4,19 (d,J = 16,0 Hz, 1H), 3,95 (d,

J = 4,0 Hz, 1H), 3,20 (m, 2H), 2,39 (s, 1H), 2,12 (s, 3H), 1, (m, 1H), 1,92 (s, 3H), 1,12 (s, 3H).

Data hmotnostní spektroskopie potvrdila strukturu 3-acetyl-DON-7,15-karbonátu (EN139495), jak znázorněno v obrázku 3B.

7,15-benzyliden-3-acetyl-D0N-acetal (EN-139496):

Tato sloučenina byla připravena v 95%-ním výtěžku z 20 mg 3-acetyl-DONu a 13 mg benzaldehyddimethylacetalu. Produkt byl získán ve formě bílého prášku po silikagelové chromatografii s použitím směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 4 : 6 jako eluentu.

9 99 9

9« 99*9

I Λ > 9 9 4

9« 99

Analýza ¹Η NMR (CDC13, 200 MHz): :7,45 (m, 5H), 6,81 (d,J = 8,0 Hz, 1 H), 5,39 (s, ÍH), 5,10 (m, ÍH), 4,90 (s,

ÍH), 4,35 (d,J = 8,0 Hz, ÍH), 4,31 (d,J = 16,0 Hz, ÍH), 3, 81 (d,J =16 Hz), 3,81 (d,J = 16 Hz, ÍH), 3,21 (m, 2H), 2, 20 - 2,45 (m, 2H), 2,01 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,31 (s, 3H)

Data hmotnostní spektroskopie potvrdila strukturu isopropyl idin-3-acetyl-D0Nu (EN139496), jak znázorněno v obrázku 3B.

7,15-benzyliden~D0N-acetal (EN-139497):

K roztoku 25 mg (0,084 mmol) DONu a 20 mg (0,126 mmol) benzaldehyddimethylacetalu (20 mg, 0,126 mmol) v 2 ml bezvodého acetonitrilu se přidal přibližně 1 mg p-toluensulfonové kyseliny. Reakční směs se míchala 2 hodiny při teplotě místnosti a rozpouštědlo se odpařilo. Surový zbytek se vyjmul do 5 ml ethylacetátu a promyl se nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2 ml), následovaného vodou (2 ml). Organická vrstva se oddělila, vysušila se nad bezvodým síranem hořečnatým a zkoncentrovala se, čímž se získal surový produkt, který se vyčistil kolonovou chromatografií (ethylacetát - hexan 7:3). Získalo se tak 27 mg (87 %) sloučeniny uvedené v nadpisu ve formě bílého prášku.

Analýza¹ H NMR (aceton-d6, 200 MHz): 7,45 (m, 5H),

6,75 (d,J = 8,0 Hz, 1 H), 5,35 (s, ÍH), 4,95 (s, ÍH), 4,51 (d,J = 8,0 Hz, ÍH), 4,49 (m, ÍH), 4,25 (d,J = 16,0 Hz, 1 H), 3,85 (d,J = 16,0 Hz, ÍH), 3,45 (d,J = 5,0 Hz, ÍH), 3,11 (m, 2H), 2,10 (m, 2H), 1,85 (s, 3H), 1,25 (s, 3H). Pík pro OH skupinu se nepodařilo lokalizovat v tomto spektru.

Data hmotnostní spektroskopie potvrdila strukturu isopropyl idin-3-acetyl-DONu (EN139497), jak znázorněno v obrázku 3B.

«· ·* • · » # ·* *· • · * « · · ·

99 9 9 9 9 9 · ······ 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 »< *· ·* ·♦··

DON, podaný systémově (10 mg/kg, i.v.), vyvolal typický charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy v krysím gastroduodenu (viz obrázek 11). DON prudce zeslabil žaludeční antrální (místo Sl) motorickou aktivitu a vyvolal trvalou hyperaktivitu v duodenu (proximální duodenální místo Dl). Během 60 minut kontrolní motorický charakter regeneroval. Příležitostně byla trikothecenem vyvolaná hyperaktivita charakterizována počáteční vysokou frekvencí motorické aktivity, kde amplituda, ačkoliv byla větší než meziskupinové odpovědi, byla menší než motorická aktivita MMC. To je znázorněno na obrázku 11, kde počáteční období trvalo 3 až 10 minut. Poté se amplituda zvětšila na úrovně MMC.

3-Acetyl-DON (10 mg/kg tělesné hmotnosti (bw), i.v.) vyvolal typický charakter nasycenosti motorické aktivity v krysím gastroduodenu (n = 4) k zahájení působení (1 minuta) byly podobné jako ty pro DON.

intravenózně podávaného 3-acetyl-DONu na spontánní motorickou aktivitu v krysím žaludečním antru (Sl) a proximálním duodenu (D2). Během 60 minut kontrolní motorický charakter zregeneroObrázek 12 ukazuje, že doba a trvání (40 + 1,75) účinků Obrázek 13 znázorňuje účinky val.

Během 30 sekund intravenózní injekce EN139491 (10 mg/kg hmotnosti) se vyvinula dlouhotrvající (40,+ 1,75 min, n = 6) hyperaktivita v duodenu a současné a paralelní zeslabení motorické aktivity v žaludečním antru, což je typické pro účinek pozorovaný s DONem. Obrázek 14 ukazuje typické záznamy motorické aktivity in vivo v krysím duodenu (Dl) a žaludečním antru (Sl), ilustrující působení sloučeniny EN139491 na charakter hladovění motorické aktivity zažívací soustavy. Vrchní panel záznamu ukazuje 20 minut normálního charakteru hladovění motorické aktivity bez podání jakéhokoliv léku. Během tohoto období vykazovalo duodenum typický charakter nízkofrekvenční spontánní motorické aktivity společně s rozšiřující se motorickou aktivitou (MMC). Žaludeční antrum se vyznačovalo typickou rytmickou motorickou aktivi• · · ·

tou. Druhý panel záznamu ukazuje aktivitu v době injekce EN139491. Během 30 sekund injekce se vyvinula dlouhotrvající (40 až 60 minut) hyperaktivita v duodenu a současné paralelní zeslabení motorické aktivity v žaludečním antru. Tato pomocí EN139491 vyvolaná motorická aktivita byla typická pro charakter nasycenosti motorické aktivity. Regenerace charakteru hladovění motorické aktivity je znázorněna na spodním panelu záznamu na obrázku 14. Obrázek 15 ukazuje záznam účinků, které měl EN139491 na duodenální motorickou aktivitu zaznamenanou u D2 (tj. ve vzdálenosti 1,5 cm k tenzometru Dl). Záznam zavedení a trvání charakteru nasycenosti u D2 pomocí EN139491, jak znázorněno na obrázku 15, bylo podobné výsledkům zaznamenaným u duodenálního místa Dl, jak znázorněno na obrázku 14.

Byla též provedena podrobnější analýza znaků jednotlivých relaxačních a kontrakčních komponent charakteru nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy vyvolané pomocí EN139491. Při této analýze byly amplituda a frekvence relaxační nebo kontrakční komponenty MMC a charakter nasycenosti, vyvolaný pomocí EN139491 na duodenálním místě Dl, vyjádřeny jako procento příslušné frekvence a amplitudy relaxační nebo kontrakční komponenty, pozorované při normální mez i skupinové aktivitě charakteru hladovění, která slouží jako vnitřní kontrola pro každé zvíře. Výsledky analýzy naznačily, že jak amplituda (obrázek 16), tak frekvence (obrázek 17), relaxační komponenty charakteru nasycenosti vyvolané pomocí EN139491 byly srovnatelné s těmi, které bylo vidět v spontánní skupinové aktivitě MMC zažívací soustavy. Tyto výsledky naznačovaly, že charakter nasycenosti, vyvolaný pomocí EN139491, měl stejné znaky jako charakter nasycenosti vyvolaný DONem.

Stejně jako v případu ΞΝ139491 byla během 30 sekund intravenózní injekce derivátu DONu EN139492 (10 mg/kg hmotnosti) vyvolána douhotrvající (48,5 + 2 min, n = 6) hyperaktivita v duodenálních místech Dl a D2 a došlo k současnému a paralelnímu zeslabení motorické aktivity v místě SI žaludečního • · antra. Příklad těchto účinků na motorickou aktivitu zažívací soustavy in vivo je uveden na obrázku 20. Obrázek 20 představuje typický záznam motorické aktivity in vivo v místech Dl a D2 krysího duodena a v místě SI žaludečního antra, ilustrující působení EN139492 na charakter hladovění žaludeční motorické aktivity. Vrchní panel záznamu ukazuje více než 40 minut normálního charakteru hladovění motorické aktivity v nepřítomnosti DONu nebo derivátu DONu. Během této doby duodenum ukazovalo typický charakter nízkofrekvenční spontánní motorické meziskupinové aktivity spolu s rozšiřující se skupinovou motorickou aktivitou (tj. MMC). Žaludeční antrum vykazovalo typicky rytmickou motorickou aktivitu. Během 30 sekund injekce byla v duodenu iniciována dlouhodobá hyperaktivita a vyvinulo se současné a paralelní zeslabení motorické aktivity v žaludečním antru.

Podrobnější analýza charakteru nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy, vyvolaného pomocí EN13492, odhalila, že frekvence a amplituda relaxačních a kontrakčních komponent byly při nejmenším srovnatelné s frekvencí a amplitudou relaxačních a kontrakčních komponent aktivity MMC zažívací soustavy (data nejsou uvedena). Tak, jako s EN139491, je tedy derivát DONu EN139492 schopen vyvolat charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy, který je srovnatelný s charakterem nasycenosti vyvolaným DONem, strukturální výchozí látkou EN139491 a EN139492.

Stejnými metodami, EN139491 a EN139492 výše, uváděné jako DON-karbonát (EN139495) (viz obrázek jaké byly použity při studiu byly také testovány deriváty DONu, (EN139494) a 3-acetyl-DON-karbonát 3B) a bylo ukázáno, že tyto látky jsou schopné vyvolat charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy v hladinách, které jsou při nejmenším srovnatelné s hladinami vyvolanými strukturální

DONu. Intravenózní injekce EN139495, což je trichothecenu (10 mg.kg^-1), vyvolala in vivo typický charakter nasycenosti motorické aktivity v zažívací soustavě zaznavýchozí látkou derivát na bázi • · · · menaný z proximálního duodena (Di ) a žaludečního antra (Si ) halothanem anestezovaného krysího samců rodu Sprague-Dawley, n = 4. Účinek EN139495 byl zřejmý během 40 sekund injekce a působení trvalo 40 až 60 minut. Při Si byla kontrakční amplituda snížena na 59 + 8,7 % standardní chyby a kontrakční frekvence byla snížena na 64,25 + 12,0 % standarní chyby kontrolní motorické aktivity. Rovněž byla snížena žaludeční antrální relaxační amplituda na 28,4 + 3,4 % standardní chyby a 48,0 + 10,5 % standardní chyby. Ve střevě (Di) byla hluboká hyperaktivita: kontrakční amplituda byla zvýšena na 119 + 12 % standardní chyby a kontrakční frekvence byla zvýšena na 1598,8 _+ 421,9 % standardní chyby kontrolní motorické aktivity. Také byla zvýšena relaxační amplituda na 331,0 + 39,8 % standardní chyby a relaxační frekvence na 724,4 + 180,75 % standardní chyby.

Asi v 20 % pokusů 3-acety1-DONem a pomocí EN139491 vyvolaná hyperaktivita nevykazovala okamžitou velkou amplitudu aktivity. Příklad toho je znázorněn na obrázku 15. Ačkoliv tam byla počáteční vysoká ferkvence motorické aktivity, velká amplituda motorické aktivity byla opožděná, nahražená odpovědmi většími, než jsou meziskupinové odpovědi, ale menšími než je motorická aktivita MMC. Když toto zpoždění v amplitudě nastalo, trvalo obvykle 3 až 10 minut. Potom se amplituda vyvolané hyperaktivity zvýšila na hladiny MMC, jak znázorněno v obrázcích 16 až 19. Počáteční diferencované působení těchto derivátů DONu neovlivnilo trvání vyvolaného charakteru nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy.

Bezprostřední nové podání DONu nebo jeho derivátů během 90 minut od první injekce bylo typicky bez účinku. Po 120 minutách byly DON a jeho deriváty znovu účinné a mohly vyvolat charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy.

Předcházející výsledky demonstrují účinnost DONu a příbuzného derivátu DONu, 3-acetylovaného DONu (o němž se píše, že má nejnižší toxicitu ze všech trichothecenů), vyvolat • · · ·

charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy. Kromě toho byly syntetizovány dva nové deriváty na bázi DONu (EN139491 a EN139492) a bylo prokázáno, že jsou schopné vyvolat charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy způsobem při nejmenším srovnatelným s DONem. Všechny deriváty (testované intravenózně jako jediný 1 ml bolus v dávce 10 mg.kg^-1) se vyznačovaly podobným profilem působení, jaký má jediný bolus i.v. injekce DONu: během jediné minuty intraveózní injekce u anestezovaných krys rodu Sprague Dawley se změnil spontánní charakter hladovění gastroduodena na typický charakter nasycenosti motorické aktivity. V žaludečním antru byla oscilační motorická aktivita nahrazena klidovým charakterem a v duodenu vyvolal DON podporovanou hyperaktivitu místo cyklického skupinového MMC charakteru. Tento účinek trval 40 až 60 minut a spontánní motorická aktivita se pak změnila na charakter hladovění motorické aktivity. Ani DON, ani jeho deriváty nezpůsobily žádné zřejmé účinky na krevní tlak, srdeční tep nebo rychlost dýchání.

Příklad 5

Účinky selektivního antagonisty P2x1 - 2x3-purinoceptoru 2·,3>-0-(2,4,6-trinitrofeny1)adenosintrifosfátu (TNP-ATP)

Tento příklad demonstruje přímé zapojení P2xi-purinoceptoru, přítomného na hladkém svalstvu tkáně zažívací soustavy, do regulace motorické aktivity zažívací soustavy a schopnost antagonisty P2_x1 - 2x3-purinoceptoru TNP-ATP blokovat P2x 1-purinoceptor a tím potlačovat charakter nasycenosti motorické aktivity vyvolaný DONem nebo deriváty na bázi DONu.

V předcházejících příkladech byla farmakologie vnitřní motorické inhibiční inervace krysího a prasečího gastroduodena charakterizována použitím specifických inhibitorů syntézy oxidu dusičnatého (NO) a inhibitorů purinoceptorem ovlivňovaných odpovědí, jako obecného antagonisty P2-receptorů, suraminu, a obecného agonisty P2x, alfa,beta-methylen-ATP, a ago80

nisty P2y, methyl-thiol-ATP. Bezprostřední nový stimul pro každý z těchto agonistů purinoceptoru se vyznačoval hlubokou tachyfylaxí tkáně, což bylo využito k blokování příslušného purinoceptoru. Výsledky ukázaly, že relaxace v charakteristické spontánní motorické aktivitě krysího proximálního duodena byly závislé diferenciálně buď na NO nebo na ATP: duodenální skupinové relaxace MMC byly senzitivní na působení alfa,beta-methylen-ATP, zatímco meziskupinové relaxace byly potlačeny působením inhibitoru syntézy NO, L-NAME. Kromě toho získaná data ukázala, že NO nebyl zprostředkovatelem spontánních ilelálních relaxací. Tyto ileální relaxace byly závislé na ATP působícím prostřednictvím P2x-purinoceptorů podobně jako relaxace příbuzné s MMC.

Předcházející příklady také ukázaly, že zásah kterékoliv motorické komponenty účinně zabránil DONem vyvolanému charakteru motorické aktivity. V tomto příkladu podrobujeme dále zkoumání hypotézu, že relaxace, ke kterým dochází v DONem vyvolaném charakteru nasycenosti motorické aktivity ve střevě jsou ovlivněny subtypem P2χ1-purinoceptoru. Tato studie použila nového antagonistu purinoceptoru, TNP-ATP (Lewis a spol., Br. J. Pharmacol., 124: 1463-1466 (1998), který byl použit in vitro jako subtyp selektivního antagonisty (celková tkáň IC50 v rozmezí /iM) pro stanovení úlohy homomerních P2xi- a P2x3 - a heteromerních P2x2/3-purinoceptorů (Virginio a spol., Mol. Pharmacol, 53: 969-973 (1998)). 0 P2x3-receptorech se uvádí, že jsou exprimovány pouze- na senzorických neuronech (Evans a Suprenant, Semin. Neurosci., 8: 217-223 (1996)). Tato studie představuje první použití P2xi-selektivního antagonisty TNP-ATP in vivo. Účelem bylo stanovit úlohu P2x1-receptorů při regulaci řízeného gastrointestinálního motorického chování a otestovat přímo hypotézu, že podtyp P2χ1-purinoceptoru ovládá DONem vyvolanou hyperaktivitu v zažívací soustavě.

Čtyři dávky TNP-ATP byly testovány in vivo na krysím modelu, jak popsáno shora. Krysy rodu Sprague Dawley byly

kontinuálně monitorovány pokud se týká krevního tlaku, rychlosti dýchání, bledosti a celkového zdravotního stavu. TNP-ATP neměl žádné znatelné účinky na tyto parametry během celého pokusu, který často trval až 6 hodin.

TNP-ATP neměl žádný účinek na spontánní žaludeční motorickou aktivitu (data neukázána). Naproti tomu, když TNP-ATP byl podán intravenózně jako jediný bolus, ovlivnil významně a specificky spontánní duodenální relaxace. Při 2,5 mg/kg byly účinky TNP-ATP sotva pozorovatelné. Naproti tomu dávky 4,5 a 5 mg/kg se jevily jako supramaximální a účinnost rozporuplná. Příležitostně bylo též možno pozorovat při těchto vyšších dávkách určité nespecifické účinky na motorickou aktivitu zažívací soustavy

Bylo zjištěno, že TNP-ATP, podaný v dáce 3,5 mg/kg, je reprodukčně účinný a specifický ve svých účincích. Ten byl zvolen pro následující vyhodnocení na modelu. Typické záznamy in vivo, ukazující účinky intravenózně podaného TNP-ATP (3,5 mg.kg^-1) na spontánní motorickou aktivitu v krysím duodenu (v místě duodena Di ) , jsou znázorněy na obrázku 21. TNP-ATP nevyvolal žádnou odpověď po injekci. Avšak během 1 minuty injekce byly relaxace spojené s MMC omezeny. Mez i skupinová motorická aktivita nebyla významně ovlivněna. Relaxační motorická aktivita související s MMC regenerovala na 92 % kontrolní hladiny během 30 minut po injekci TNP-ATP.

Záznamy in vivo ukazující účinky intravenózně podaného TNP-ATP (3,5 mg.kg^-1) na DONem vyvolaný charakteru nasycenosti motorické aktivity v krysím žaludku a duodenu jsou uvedeny na obrázcích 22 (záznam duodenálního místa Dl) a 23 (záznam duodenálního místa D2 a žaludečního antrálního místa Sl). V souladu se všemi ostatními pokusy TNP-ATP nevyvolal žádnou odpověď po injekci. Avšak v průběhu 1 minuty po injekci byly účinky DONu (10 mg.kg*¹, i.v.) významně snížené. Toto inhibiční působení TNP-ATP spočívalo v počátečním hlubokém účinku (až do 80%-ní inhibice) trvajícím přibližně 5 minut, následo• · • ·

váném delším obdobím méně hlubokého (až do 40%-ní inhibice), ale významného antagonismu účinků DONu.

Schopnost TNP-ATP působit proti účinkům DONu je znázorněna graficky na obrázcích 24 až 27. Sloupkové diagramy z obrázků 24 až 27 ukazují účinky intravenózního působení s TNP-ATP na DONem vyvolané relaxace a kontrakce zaznamenané od proximálního duodena (Dl). Účinky TNP-ATP na amplitudu (obrázek 24) a frekvenci (obrázek 25) DONem vyvolaných relaxací byly porovnány s amplitudou a frekvencí relaxační komponenty skupinové MMC a kontrolní meziskupinové motorické aktivity, která byla stanovena jako 100 %. Podobně byly porovnány účinky TNP-ATP na amplitudu (obrázek 26) a frekvenci (obrázek 27) DONem vyvolaných kontrakcí s amplitudou a frekvencí kontrakční komponenty skupinové MMC a kontrolní meziskupinové motorické aktivity. Shodným znakem účinku TNP-ATP bylo specifické zeslabení amplitudy, ale nikoliv frekvence, DONem vyvolané duodenální hyperaktivity (porovnej prázdné sloupky se sloupky s šachovnicovým vzorem na obrázcích 24 až 27). Účinek TNP-ATP na frekvenci relaxační komponenty DONem vyvolané hyperaktivity v duodenu byl zřejmý v průběhu 20 sekund podávání TNP-ATP a maximálního zeslabení frekvence relaxační komponenty bylo dosaženo během 2 minut. DONem vyvolaná hyperaktivita se vrátila během 35 minutách po podání TNP-ATP a regenerovala na 90 % hladiny před podáním TNP-ATP.

Byla vyhodnocena účinnost selektivního antagonisty P2χ 1 -purinoceptoru TNP-ATP. Intravenózní injekce jediného bolusu tohoto antagonisty rychle a specificky zeslabila relaxace související s MMC, což ukazuje na zapojení P2xi-purinoceptorů do motorické aktivity zažívací soustavy. Intravenózní aplikace jediného bolusu TNP-ATP snížila (přechodně) DONem vyvolaný charakter nasycenosti způsobem závislým na dávce. Tyto výsledky potvrzují trend dat používajících obecného antagonistu P2χ-receptoru. P2x-purinergní místa představují vysoce omezenou komponentu střevních cest. Výsledky jasně uka83

zují, že podtyp P2x1-receptoru ovládá vnitřní purinergní inhibiční inervaci duodena a že blokování těchto receptorů může představovat jednoduchý přístup pro paralyzování účinků DONu v zažívací soustavě. Tato data dále podporují poznatek, že tato místa receptoru jsou potenciálními cíly vývoje prostředků modifikujících stravovací chování.

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití trichothecenů nebo jeho derivátu k přípravě léčiva pro léčení obezity u obratlovce.
2. 2. Použití trichothecenů nebo jeho derivátu k přípravě léčiva pro léčení obezity u obratlovce podle nároku 1, při němž se trichothecen nebo jeho derivát zvolí ze skupiny zahrnující deoxynivalenol, nivalenol, trichothekolon, trichothecin, 3-acetyldeoxynivalenol, 7-acetyldeoxynivalenol, 3,15-diacetyldeoxynivalenol, 4-acetylnivalenol, 4,15-diacetylnivalenol, isopropylidin-deoxynivalenol, isopropylidin-3-acetyldeoxynivalenol, deoxynivalenol-karbonát, 3-acetyldeoxynivalenol-karbonát, 3-acetyldeoxynivalenol-benzylidenacetal a deoxynivalenol-benzylidenacetal.
3. 3. Použití trichothecenů nebo jeho derivátu k přípravě léčiva pro léčení obezity u obratlovce podle nároku 2, při němž je trichothecenem deoxynivalenol.
4. 4. Použití trichothecenů nebo jeho derivátu k přípravě léčiva pro léčení obezity u obratlovce podle nároku 1, přičemž léčivo lze podávávat orálně, parenterálně, intravenózně, intramuskulárně nebo intraarteriálně.
5. 5. Použití trichothecenů nebo jeho derivátu k přípravě léčiva pro léčení obezity u obratlovce podle nároku 4, přičemž léčivo lze podávat orálně.
6. 6. Použití trichothecenů nebo jeho derivátu k přípravě léčiva pro léčení obezity u obratlovce podle nároku 1, při němž se obratlovec zvolí ze skupiny zahrnující primáty, vepře, skot, ovce, ptáky, koně, kočky, psi a hlodavce.
7. 7. Použití trichothecenů nebo jeho derivátu k přípravě léčiva pro léčení obezity u obratlovce podle nároku 1, přičemž »4 · 4 4 4

   44 4444 • *

   4 4 4 4 obratlovcem je člověk.
8. 8. Použití trichothecenu nebo jeho derivátu, analogu trichothecenu nebo nedesenzibilizujícího agonisty P2xi~receptoru k přípravě léčiva ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce.
9. 9. Použití trichothecenu nebo jeho derivátu k přípravě léčiva ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce podle nároku 8, při němž se trichothecen nebo jeho derivát zvolí ze skupiny zahrnující deoxynivalenol, nivalenol, trichothekolon, trichothecin, 3-acetyldeoxynivalenol, 7-acetyldeoxynivalenol, 3,15-diacetyldeoxynivalenol, 4-acetylnivalenol, 4,15-diacetylnivalenol, isopropylidin-deoxynivalenol, isopropylidin-3-acetyldeoxynivalenol, deoxynivalenol-karbonát, 3-acetyldeoxynivalenol-karbonát, 3-acetyldeoxynivalenol-benzylidenacetal a deoxynivalenol-benzylidenacetal.
10. 10. Použití trichothecenu nebo jeho derivátu k přípravě léčiva ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce podle nároku 8, při němž je trichothecenem deoxynivalenol.
11. 11. Použití trichothecenu nebo jeho derivátu, analogu trichothecenu nebo nedesenzibilizujícího agonisty P2xi~receptoru k přípravě léčiva ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce podle nároku 8, přičemž toto léčivo lze podávat orálně, parenterálně, intravenózně, intramuskulárně nebo intraarteriálně.
12. 12. Použití trichothecenu nebo jeho derivátu, analogu trichothecenu nebo nedesenzibilizujícího agonisty P₂xi-receptoru k přípravě léčiva ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce podle nároku 8, přičemž toto léčivo lze podávat orálně.

    99 9*99 • 9

    9 9 99 ·· 9 9*9
13. 13. Použití trichothecenu nebo jeho derivátu, analogu trichothecenu nebo nedesenzibilizujícího agonisty P₂xi-receptoru k přípravě léčiva ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce podle nároku 8, při němž se obratlovec zvolí ze skupiny zahrnující primáty, vepře, skot, ovce, ptáky, koně, kočky, psi a hlodavce.
14. 14. Použití trichothecenu nebo jeho derivátu, analogu trichothecenu nebo nedesenzibilizujícího agonisty P₂xi-receptoru k přípravě léčiva ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce podle nároku 8, při němž je obratlovcem člověk.
15. 15. Použití trichothecenu nebo jeho derivátu, analogu trichothecenu nebo nedesenzibilizujícího agonisty P₂xi~receptoru k přípravě léčiva ke stimulaci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce podle nároku 8, při němž je nedesenzibilizujícím agonistou P2xl~ -receptoru analog ATP.
16. 16. Použití analogu ATP k přípravě léčiva ke zvýšení hmotnosti obratlovce, přičemž množství tohoto analogu je postačující pro potlačení charakteru nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy.
17. 17. Použití analogu ATP k přípravě léčiva ke zvýšení hmotnosti obratlovce podle nároku 16, při němž je analogem ATP desenzibilizující agonista nebo antagonista P₂xi-purinoceptoru.
18. 18. Použití analogu ATP k přípravě léčiva ke zvýšení hmotnosti obratlovce podle nároku 17, při němž je desenzibilizujícím agonistou P₂xi~purinoceptoru a,β-methylen-ATP a antagonistou P₂xi-purinoceptoru je 2', 3'-0-(2,4,6-trinitrofenyl)ATP.

    ·· 0000 00 000« 0« ·· » 0 0 00· «00«

    0 0 00··· * · ·

    - 87 - 0 0 0 0 • 0 0 0·· • 0 0 • ·· · · 0 • · « 0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 19. Použití analogu ATP k přípravě léčiva k prevenci charakteru nasycenosti obratlovce. motility zažívací soustavy u 20. Použití analogu ATP k přípravě léčiva k prevenci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u obratlovce podle nároku 19, při němž je analogem ATP desenzibilizuj ící ceptoru. agonista nebo antagonista P₂xi-purino- 21. Použití analogu ATP k přípravě léčiva k prevenci charakteru nasycenosti motility zažívací soustavy u

    obratlovce podle nároku 20, při němž je desenzibilizujícím agonistou P₂xi-purinoceptoru a,β-methylen-ATP a antagonistou P₂xi-purinoceptoru je 2',3'-O-(2,4,6-trinitrofenyl)-ATP.
19. 22. Způsob identifikace sloučeniny pro léčení obezity, vyznačující se tím, že se stanoví, je-li sloučenina schopna vyvolat charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy.
20. 23. Způsob identifikace sloučeniny pro léčení obezity podle nároku 22, vyznačující se tím, že se sloučenina testuje na schopnost vyvolat charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy použitím pokusu s orgánovou lázní zažívací soustavy in vitro, pokusu s orgánovou lázní zažívací soustavy ex vivo nebo pokusu in vivo na motorickou aktivitu orgánu zažívací soustavy.
21. 24. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že charakter nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy vyvolaný sloučeninou se porovná s ♦ · ···· charakterem nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy vyvolaným deoxynivalenolem.
22. 25. Farmaceutická kompozice pro vyvolání charakteru nasycenosti motorické aktivity zažívací soustavy, vyznačující se tím, že obsahuje:

    (a) sloučeninu zvolenou ze skupiny zahrnující nivalenol, 4-deoxynivalenol, trichothekolon, trichothecin, 3-acetyideoxynivalenol, 7-acetyldeoxynivalenol, 3,15-diacetyldeoxynivalenol, 4-acetylnivalenol, 4,15-diacetyl-nivalenol, 3-hydroxy-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát, 3-acetoxy-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát, 3-acetoxy-7,15-benzyliden-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, 3-hydroxy-7,15-benzyliden-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, 3-hydroxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, 3-acetoxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on, a jejich kombinace, a (b) farmaceuticky přijatelný nosič.
23. 26. Sloučenina 3-hydroxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on.
24. 27. Sloučenina 3-acetoxy-7,15-isopropylidin-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on.
25. 28. Sloučenina 3-hydroxy-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát.
26. 29. Sloučenina 3-acetoxy-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on-7,15-karbonát.
27. 30. Sloučenina 3-acetoxy-7,15-benzyliden-12,13-epoxy~9-trichothecin-8-on.
28. 31. Sloučenina 3-hydroxy-7,15-benzyliden-12,13-epoxy-9-trichothecin-8-on.