CZ2001970A3 - Prostředky osobní péče obsahující subtilisinové enzymy vázané na substráty nerozpustné ve vodě - Google Patents

Abstract

Prostředky osobní péče obsahující ve vodě nerozpustný substrát, mnoho enzymů proteasy G a vazebné prostředky zahrnující polymerní spojku trvale připojující každý z enzymů k substrátu, kdy tento prostředek osobní péče obsahuje 0,01 mg/cm2 až 1000 mg/cm2 enzymu na substrátu.

Description

— ‘=«ζ\Γ5 1 « · • *

Prostředky osobní péče obsahující subtilisinové enzymy vázané na substráty nerozpustné ve vodě

Oblast techniky Předkládaný vynález se týká prostředků osobní péče obsahujících singulárně substituované subtilisinové enzymy vázané na ubrouskový substrát. Provedení prostředků osobní péče zahrnuje ubrousky osobní péče a pleťové masky. Prostředky poskytují zlepšené čištění a úpravu pokožky, kterého se dosahuje díky aktivitě aktivních proteinů s tím, že se u uživatele minimalizuje riziko alergické reakce na aktivní protein.

Dosavadní stav techniky V současné době jsou komerční produkty obsahující aktivní proteiny dostupnější. Většina těchto produktů využívá jako aktivní protein enzym. Enzymy jsou proteiny, které reagují se sloučeninou nebo substrátem tak, že dojde k rozštěpení sloučeniny. Enzymy se dělí do několika skupin na základě toho, se kterým substrátem reagují. Každá skupina enzymů obecně katalyzuje štěpení několika různých chemických vazeb, což vede ke konkrétní aktivitě. Lipasy jsou známy pro svou schopnost hydrolyzovat esterové vazby vzniklé mezi, tímto výčtem ovšem nejsou nijak omezeny, uhlovodíky a substráty s polyalkoholovým základním řetězcem. Příklady zahrnují mono-, di- a triglyceridové estery polyglycerolu. Proteasy jsou známé svou schopností hydrolyzovat proteiny. Přírodní proteasy a proteasy připravené bioinženýrsky se používají do domácích čisticích detergentů, aby hydrolyzovaly nečistoty a prach proteinového typu, do produktů osobní péče, aby odstraňovaly nečistoty a odumřelou pokožku, do produktů ústní hygieny, aby usnadnily a do léků, aby působily na odstranění plaku v ústech, nežádoucí proteiny v těle.

Je známo, že se účinnost současných komerčních čisticích produktů zvyšuje použitím proteas. U.S. patent číslo 4 261 868 (Hora a kol.), U.S. patent číslo 4 404 115 (Tai), U.S. patent číslo 4 318 818 (Letton a kol.), evropská patentová přihláška 130 756 (vydaná 9. ledna 1985) a U.S. patent číslo 5 030 378 (Venegas) všechny popisují použití proteasových enzymů v čisticích nebo detergentních produktech.

Také se ovšem ví, že mnoho aktivních proteinů, včetně enzymů, jsou možné antigeny a mohou za určitých podmínek u lidí způsobovat alergické reakce. Lidský imunitni systém po vystavení aktivním proteinům může produkovat konkrétní protilátky. Tento proces produkce konkrétních protilátek se označuje jako „imunizace" pokud se dosáhne klinicky prospěšné reakce. Pokud reakce vede k hypersenzitivitě, pak se označuje jako „senzitivizace". Alergická senzitivizace na aktivní proteiny byla pozorována v prostředí, kde jsou lidé pravidelně vystaveni působení proteinů. Taková prostředí zahrnující výrobní závody, ve kterých jsou pracovníci vystaveni působení nekontrolovaného prachu nebo aerosolu obsahujícího aktivní protein, nebo trh, kde spotřebitelé opakovaně používají produkty obsahující aktivní proteiny, příležitostně vedou k alergické reakci. V současné době se alergické reakce na aktivní proteiny minimalizují omezením volby proteinů používaných v produktech na proteiny lidského původu. I když tento přístup minimalizuje problémy s alergií, nejedná se o úplné řešení, protože často není možné nalézt takový aktivní protein, který má požadované vlastnosti.

Dalším způsobem potlačení alergické reakce bylo snížení velikosti molekul proteinu (vis JP patentová publikace číslo 4 112 753). Nicméně omezení velikosti také může vést ke znatelnému omezení biologické aktivity. • · ·«· ♦· · • · • ♦ · · · · · · ···· »··♦ · · * 3« · ♦·· « « · ···· · · * · • · « t f · · · · 4· ·· « · ♦ ♦♦ ♦· Třetím postupem pro snížení alergenicity je mapování epitopů a změna sekvence aminokyselin, čímž se získá protein se sníženou alergenicitou. Tento přístup obvykle vyžaduje velké investice peněz a času do vývoje. V oblasti medicíny byl pro omezení imunogenicity proteinů navržen další způsob. Tento způsob zahrnuje připojení nereaktivních polymerů k proteinu. U.S. patent č. 4 179 337 (Davis a kol.) se týká enzymů připojených k polyethylenglykolu nebo polypropylenglykolu s přímými řetězci. Ačkoliv bylo tímto spojením dosaženo oslabení alergenicity enzymu, bylo dosaženo pouze 15% fyziologické aktivity. PCT přihláška WO 96/17929 (Olsen a kol., publikovaná 13. června 1996) se týká úpravy enzymů jejich konjugací s vhodnými polymery. 01senová přihláška popisuje upravené enzymy, které vykazují snížení alergenicity o 25 % až 66 % ve srovnání s původním enzymem při udržení 39 % až 100 % aktivity původního enzymu. U.S. patentová přihláška sériového čísla 08/903 298 popisuje použití enzymů upravených přídavkem zdvojeného polyethylenglykolového polymeru, čímž se snížila alergenicita při udržení vysoké enzymatické aktivity. Takový upravený enzym se používá v kombinaci s vláknitým substrátem, jako je ubrousek. Upravené enzymy nejsou připojeny k substrátu. Snížení alergenicity se dosahuje úpravou enzymu. U.S. patentová přihláška sériového čísla 09/088 912 popisuje polymerní chemickou úpravu subtilisinových enzymů v jednom nebo více ze tří specifických epitopových oblastí, o kterých bylo zjištěno, že maskují imunogenní determinanty enzymu.

Dalším přístupem je snížení alergenicity aktivních proteinů je jejich granulování, potahování nebo rozpouštění aktivních proteinů tak, aby se zabránilo jejich přenášení vzduchem. U.S. patent 4 556 556 (Calvo) popisuje kosmetické prostředky, které obsahují enzymy, které byly imobilizovány připojením na částice polymerního nosiče. Částice • t ·* * * · ·* ···« · · » ♦ · ··«· ·#·· • · · · · · * ······« · • · · · · * · « ·· ·» ·» · «· * · • Μ s připojenými enzymy jsou dispergovány v kosmetickém nosiči.

Po aplikaci nosiče na pokožku se enzym uvolni z nosiče a tím se reaktivuje. Takové postupy ovšem vystavuji spotřebitele působeni proteinů přenášených vzduchem a tim i případným rizikům spojeným s kontaktem tkáně s uvolněným enzymem, který je nanesen na pokožku.

Kanadský patent 1 229 808, vydaný 1. prosince 1987, popisuje imobilizaci enzymů, konkrétně β-galaktosidasy a β-glukosidasy na celulosových substrátech, ve kterých je enzym imobilizován absorpcí do agarosového gelu pokrývajícího substrát. UK patentová přihláška GB 2 240 040, vydaná 24. července 1991, také popisuje imobilizované enzymy na substrátech. Takové enzymy jsou kovalentně vázány na substrát, čímž vzniká lékařský obvaz.

Aktivita enzymů použitých v biologických zařízeních jako jsou biosenzory, bioseparátory a bioreaktory byly zlepšeny použitím místně specifického připojení enzymů na povrchy zařízení. Viz Huang a kol. „Improving the Activity og Immobilized Subtilisin by Site-specific Attachment to Surface", Analytical Chemistry, 69(22), 15. listopadu 1997.

Huang popisuje imobilizaci subtilisinových enzymů mutací šeřinu 249 nebo šeřinu 145 na cystein a navázání na silikagelové kuličky funkcionalizované aminoskupinami.

Je velmi potřebné vyvinout prostředek, který by poskytoval zlepšenou úroveň aktivity proteinu při uchování nízkých alergických reakcí po vystavení aktivním proteinům. Pokud se toho dosáhne, uživatelé získají bezpečný způsob využití prospěchu z proteinových technologii. Předmětem předkládaném vynálezu je poskytnutí ubrouskového prostředku, který má takovou zlepšenou aktivitu, ale má sníženou stimulaci a tím i aktivaci imunitního systému. 5 5 *· ♦ · • ·· • · ♦ ♦ · · φ · · * • I « * · * ♦ ♦ · · • # ··· Φ « · ··»« · « · • · · · · · · ·

Podstata vynálezu

Shrnutí vynálezu Předkládaný vynález popisuje prostředky osobní péče obsahující ve vodě nerozpustný substrát, mnoho singulárně substituovaných variantů subtilisinového BPN' enzymu a vazebné prostředky, trvale připojující každý z enzymů k substrátu, kdy prostředky osobní péče obsahují 0,01 pg/cirh až 1000 pg/cm2 enzymu na substrátu.

Podrobný popis vynálezu

Prostředky osobní péče podle předkládaného vynálezu obsahují subtilisinové BPN' enzymy a deriváty upravené jednoduchou substitucí cysteinové aminokyselinové skupiny trvale vázané k substrátu nerozpustnému ve vodě. Prostředky poskytují vhodné využití specializované aktivity subtilisinového BPN' enzymu a jeho derivátů, kdy jsou enzymy vázány k substrátu, čímž se minimalizuje riziko alergické reakce. Preferovaná provedení prostředků jsou velmi účinná při čištění potu, kožního mazu, odumřelých kožních buněk, mastnoty a olejů z pokožky a pro zvlhčení pokožky.

Bez vazby na nějakou konkrétní teorii se předpokládá, že trvalou vazbou enzymů k substrátu je možno uvést mnoho proteinů do kontaktu s pokožkou, čímž se jim umožní působit na povrchu. Jakmile se ubrousek nebo maska odebere, všechny enzymy se odstraní z povrchu pokožky a odstraní spolu s použitým ubrouskem, čímž se eliminuje riziko aerosolizace a prodlouženého působení na pokožku. Aktivní proteiny reagují se sloučeninami, ke kterým mají specifickou reaktivitu, v okamžiku kontaktu s pokožkou a žádné nezůstávají po použití na pokožce čímž by stimulovaly imunitní systém a následně vedly k tvorbě protilátek odpovědných za alergickou reakci.

Tak jak se používá v předkládaném vynálezu fráze „aminokyselinová sekvence" označuje konkrétní konfiguraci 6 I ΨΨ • « ♦ • ♦ ♦♦ ψ · ► #· aminokyselin tvořících protein. Dále je uveden seznam zkratek použitých v předkládaném vynálezu pro popis aminokyselin:

Aminokyselina Třípísmenná zkratka Jednopísmenný symbol

Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Kyselina asparagová Asp D Cystein Cys C Glutamin Gin Q Kyselina glutamová Glu Q Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Fenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptofan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V Žádná aminokyselina Xaa * Tak jak se používá v předkládaném vynálezu pojem „mutace" označuje genetickou mutaci organismu, která vede ke změně aminokyselinové sekvence enzymu produkovaného tímto organismem. 0 mutaci organismu bylo zjištěno, že často mění vlastnosti enzymu.

Tak jak se používá v předkládaném vynálezu pojem „standardní typ" označuje enzym produkovaný nemutovanými hosty. t I « ♦ I · · · f · ·♦· *· t * « · • · ·

Tak jak se používá v předkládaném vynálezu pojem „variant" označuje enzym, který má aminokyselinovou sekvenci, která se liší od enzymu standardního typu díky genetické mutaci hosta produkujícího takový enzym. Všechna procenta a poměry použité v předkládaném vynálezu, pokud není uvedeno jinak, jsou hmotnostní a všechna měření byla prováděna při teplotě 25 °C, pokud není uvedeno jinak. Předkládaný vynález zahrnuje, sestává nebo nezbytně sestává z nezbytných a nepovinných složek, které jsou v předkládaném vynálezu popsány.

Nezbytné složky prostředků osobní péče podle předkládaného vynálezu stejně jako neúplný seznam preferovaných a nepovinných složek je podrobněji popsán dále.

Substrát nerozpustný ve vodě

Produkty podle předkládaného vynálezu obsahují substrát nerozpustný ve vodě. „Nerozpustný ve vodě" znamená, že substrát se nerozpouští ani se snadno nerozpadá po ponoření do vody. Substrát nerozpustný ve vodě je nástroj nebo nosič pro dopravu aktivních proteinů podle předkládaného vynálezu na pokožku, kterou je potřeba čistit a zvlhčit, a pro odstranění prakticky všech proteinů z pokožky.

Jako substrát lze použít širokou škálu materiálů. Žádoucí jsou následující nikterak neomezující charakteristiky: (i) stálost za mokra, (ii) dostatečná drsnost, (iii) dostatečná vzdušnost a poréznost, (iv) dostatečná tloušťka a (v) vhodná velikost.

Nikterak neomezující příklady vhodných nerozpustných substrátů, které splňují uvedená kritéria, zahrnují netkané substráty, tkané substráty, hydropletené substráty, vzduchem pletené substráty, přírodní houby, syntetické houby, polymerní mřížkovitá pletiva a podobně. Preferovaná provedení zahrnují netkané substráty, protože jsou ekonomické a snadno dostupné při široké škále materiálů. Netkaný znamená, že vrstva obsahuje vlákna, která nejsou tkána do tkaniny, ale spíše tvoří list, rohož nebo podložku. Vlákna jsou buď náhodná (tj. náhodně orientovaná) nebo jsou mykaná (tj. česaná tak, aby byla primárně orientovaná v jednom směru). Navíc mohou být netkané substráty složeny z kombinace vrstev náhodných a mykaných vláken.

Netkané substráty jsou z různých materiálů včetně přírodních a syntetických. Přírodní znamená, že materiály jsou odvozeny z rostlin, živočichů, hmyzu nebo vedlejší produkty rostlin, živočichů a hmyzu. Syntetický znamená, že materiály se primárně získávají z různých umělých materiálů nebo z přírodních materiálů, které se dále mění. Běžný základní výchozí materiál je obvykle vláknitá tkanina obsahující jakákoliv syntetická nebo přírodní vlákna textilní délky nebo jejich směsi.

Nikterak neomezující příklady přírodních materiálů použitelných v předkládaném vynálezu jsou hedvábná vlákna, keratinová vlákna a celulosová vlákna. Nikterak neomezující příklady keratinových vláken zahrnují ty, které jsou vybrány ze skupiny sestávající z vlněných vláken, vláken z velbloudí srsti a podobně. Nikterak neomezující příklady celulosových vláken zahrnují ty, které jsou vybrány ze skupiny sestávající z celulózových vláken, bavlněných vláken, konopných vláken, jutových vláken, lněných vláken a jejich směsí.

Nikterak neomezující příklady syntetických materiálů použitelných v předkládaném vynálezu zahrnují ty, které jsou vybrány ze skupiny sestávající z acetátových vláken, vláken celulosových esterů, modakrylových vláken, polyamidových vláken, polyesterových vláken, polyolefinových vláken, polyvinylalkoholových vláken, viskózových vláken, polyurethanové pěny a jejich směsí. Příklady některých z těchto syntetických materiálů zahrnují akryláty, jako je acrilan, creslan a vlákna na bázi akrylonitrilu, orion, vlákna celulosových esterů, jako je acetát celulosy, arnel a acele, 9 «« ♦* ♦ · · * · · • · · · · ♦ • ··«·«· * • t ♦ I f ♦t I* *· ♦ • • · #* • * • t • • ·· t t 1 · • • • « ♦ • ♦ ♦ t·· polyamidy, jako je nylon (např. nylon 6. nylon 66, nylon 610 a podobně), polyestery jako je fortrel, kodel a polyethylentereftalátová vlákna, dacron, polyolefiny, jako je polypropylen, polyethylen, polyvinylacetátová vlákna, polyurethanové pěny a jejich směsi. Tato a další vhodná vlákna a z nich připravené netkané materiály jsou obecně popsány v Riedel, „Nonwoven Bonding Methods and Materials," Nonwoven World (1987), The Encyclopedia Američana, sv. 11, str. 147-153, a sv. 26, str. 566-581 (1984), U.S. patent č. 4 891 227, Tharman a kol., vydaný 2. ledna 1990 a U.S. patent č. 4 891 228, které jsou zde všechny uvedeny jako reference.

Netkané substráty vyrobené z přírodních materiálů sestávají z pletiv nebo listů nejběžněji tvořených na sítu z jemného drátu z tekuté suspenze vláken. Viz C.A. Hampel a kol., The Encyclopedia of Chemistry, třetí vydání, 1973, str. 793-795 (1973), The Encyclopedia Američana, sv. 21, str. 376-383 (1984) a G.A. Smook, Handbook of Pulp and Paper Technologies, Technical Association for the Pulp and Paper Industry (1986), které jsou zde uvedeny jako reference.

Substráty vyrobené z přírodních materiálů použitelné v předkládaném vynálezu lze získat z mnoha komerčních zdrojů. Nikterak neomezující příklady vhodných komerčně dostupných papírových vrstev použitelných v předkládaném vynálezu zahrnují Airtex®, raženou vzduchem kladenou celulosovou vrstvu, která má základní hmotnost 84,92 g/m2, dostupný od James River, Green Bay, WI, a Walkisoft®, raženou vzduchem kladenou celulosu, která má základní hmotnost 89,70 g/m2, dostupnou od Walkisoft USA, Mount Holly, NC.

Způsoby výroby netkaných substrátů jsou v dané problematice dobře známy. Obecně lze tyto netkané substráty vyrobit kladením vzduchem, kladením vodou, nadouváním nebo mykáním, kdy se vlákna nebo elementární vlákna nejprve z dlouhých pruhů nakrájí na požadovanou délku, projdou vodou ► · ♦ · ř t · # I t *·· »· * * 10 • · «·« nebo proudem vzduchu a pak se uloží na síto, skrz které prochází vzduch nebo voda. Výsledná vrstva, bez ohledu na způsob výroby nebo její složení, se pak podrobí alespoň jednomu z několika typů vazby, aby se jednotlivá vlákna ukotvila k sobě do formy samodržicího pletiva. V předkládaném vynálezu se netkaná vlákna připravují různými postupy, včetně hydropletení, tepelného vázání nebo termovazby a kombinací těchto postupů. Navíc substráty podle předkládaného vynálezu případně sestávají z jediné vrstvy nebo z několika vrstev.

Navíc substráty z více vrstev případně zahrnují filmy a další nevláknité materiály.

Netkané substráty vyrobené ze syntetických materiálů použitelné v předkládaném vynálezu lze také získat z mnoha komerčních zdrojů. Nikterak neomezující příklady vhodných netkaných materiálů použitelných v předkládaném vynálezu zahrnují HEF 40-047, děrovaný hydropletený materiál obsahující 50 % hmotnostních viskózy a 50 % hmotnostních polyesteru, který má základní hmotnost 51,43 g/rtr, dostupný od Veratec, lne., Walpole, MA, HEF 140-102, děrovaný hydropletený materiál obsahující 50 % hmotnostních viskózy a 50 % hmotnostních polyesteru, který má základní hmotnost 66,98 g/m2, dostupný od Veratec, lne., Walpole, MA, No vonět®1 149-616, termovázaný mřížkový materiál obsahující 100 % hmotnostních polypropylenu, který má základní hmotnost 59,80 g/m2, dostupný od Veratec, lne., Walpole, MA, Novonet® 149-801, termovázaný mřížkový materiál obsahující 69 % hmotnostních viskózy, 25 % hmotnostních polypropylenu a 6 % hmotnostních bavlny, který má základní hmotnost 89,70 g/m-, dostupný od Veratec, lne., Walpole, MA, Novonet® 149-191, termovázaný mřížkový materiál obsahující 69 % hmotnostních viskózy, 25 % hmotnostních polypropylenu a 6 % hmotnostních bavlny, který má základní hmotnost 119,60 g/irr, dostupný od Veratec, lne., Walpole, MA, HEF Nubtex® 149-801, termovázaný mřížkový materiál obsahující 100 % hmotnostních polyesteru, který má základní hmotnost 83,72 g/m , dostupný od Veratec, lne., Walpole, MA, Keybak® 951V, suchým způsobem vytvořený děrovaný materiál obsahující 75 % hmotnostních viskózy, 25 I hmotnostních akrylových vláken, který má základní hmotnost 51,43 g/m2, dostupný od Chicopee, New Brunswick, NJ, Keybak® 1368, děrovaný materiál obsahující 75 % hmotnostních viskózy, 25 % hmotnostních akrylových vláken, který má základní hmotnost 46,65 g/m2, dostupný od Chicopee, New Brunswick, NJ, Duralace® 1236, děrovaný hydropletený materiál obsahující 100 % hmotnostních viskózy, který má základní hmotnost 47,84 g/m2 až 137,54 g/m2, dostupný od Chicopee, New Brunswick, NJ, Duralace® 5904, děrovaný hydropletený materiál obsahující 100 % hmotnostních polyesteru, který má základní hmotnost 47,84 g/m2 až 137,54 g/m2, dostupný od Chicopee, New Brunswick, NJ, Sontaro 8868, hydropletený materiál obsahující 50 % hmotnostních celulosy a 50 % polyesteru, který má základní hmotnost 71,76 g/m2, dostupný od DuPont Chemical Corp.

Alternativně je ve vodě nerozpustný substrát polymerní síťovinová houba, která je popsána v evropském patentu č. EP 702550 AI, vydaném 27. března 1996, který je zde uveden jako reference. Polymerní síťovinová houba obsahuje mnoho pramenů protlačovaného dutého mřížkovitého pletiva připraveného z velmi ohebného polymeru, jako jsou polymery vzniklé adicí olefinových monomerů a polyamidy polykarboxylových kyselin. Ačkoliv jsou tyto polymerní houby navrženy pro použití s tekutým čističem, lze tyto typy hub použít jako ve vodě nerozpustný substrát v předkládaném vynálezu.

Substráty lze vyrobit v široké škále tvarů a forem zahrnujících ploché podložky, silné podložky, tenké listy, kulovité prostředky, nepravidelně tvarované prostředky a ve velikostech povrchu od pěti čtverečních centimetrů až po stovky čtverečních centimetrů. Přesná velikost bude záviset na požadovaném použití a charakteristikách produktu. Zejména jsou běžné čtvercové, kruhové, pravoúhlé nebo oválné podložky, 12

které mají povrch 6,5 cnr až 930 cm", s výhodou 64,5 cm2 až 774 cnr a ještě výhodněji 193,5 cm" až 516 cm2 a tloušťku 0,0254 mm až 12,7 mm, s výhodou 0,127 mm až 6,35 mm a ještě výhodněji 0,254 mm až 2,54 mm.

Ve vodě nerozpustné substráty podle předkládaného vynálezu případně zahrnují dvě nebo více vrstev z nichž každá má jinou texturu a drsnost. Různé textury jsou důsledkem použití různých kombinací materiálů nebo použití různých způsobů zpracování nebo jejich kombinace. Duálně texturované substráty lze vyrobit, aby měly drsnější stranu pro exfoliaci a měkči stranu pro jemné čištění. Navíc lze oddělené vrstvy substrátu zpracovat v různých barvách, čímž se napomůže uživateli v odlišení obou povrchů.

Singulárně substituovaný subtilisinový BPN' enzym „Protease G"

Nezbytnou složkou podle předkládaného vynálezu je mnoho singulárně substituovaných subtilisinových BPN' enzymů (dále označovaných jako proteasa G). Proteasa G je přítomna na povrchu substrátu nerozpustného ve vodě v množství 0,01 pg/cm2 až 1000 pg/cm2, s výhodou 0,05 pg/cm2 až 100 pg/cm2 a nejvýhodněji 0,1 pg/cm2 až 10 pg/cm".

Obecně jsou proteasové enzymy klasifikovány pod enzymovým klasifikačním číslem E.C. 3.4 (hydrolasy karboxylových esterů) podle doporučení (1992) Mezinárodního svazu biochemie a molekulární biologie (IUBMB). Příbuzné proteasy jsou také popsány v PCT publikacích: WO 95/30010 vydaném 9. listopadu 1995, The Procter & Gamble Company, WO 95/30011 vydaném 9. listopadu 1995, The Procter & Gamble Company, WO 95/29979 vydaném 9. listopadu 1995, The Procter & Gamble Company.

Subtilisinové enzymy jsou proteasové enzymy, které jsou v přírodě produkovány mikroorganismy Bacillus alcalophilus,

Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amylosaccharicus ·♦ ·· *· * ·* · • « · * 9 td I » 99 • 99 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 999 9 9 9 9999 99 9 9 ΊΟ ·#····♦## 1 J ·<9 ·· * ·· ··«

Bacillus lícheniformis, Bacillus lentus a Bacillus subtilis. Jedním ze známých subtilisinových enzymů je BPN'. Standardní typ BPN' z Bacillus amyloliquefaciens má aminokyselinovou sekvenci: 1 10

Ala Gin Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gin Ile Lys Ala Pro 20 Ala Leu His Ser Gin Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val 30 40 Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu 50 Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn 60 70 Pro Phe Gin Asp Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala Gly 80 Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val 90 Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 100 110 Asp Gly Ser Gly Gin Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 120 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu 130 140 Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp 150 Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly 160 Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro 170 180 Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser 190 Ser Asn Gin Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu 200 210 Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gin Ser Thr Leu Pro ·* • · 14 220 • • · • · • · • · • · ♦ • Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 230 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His 240 250 Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gin Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn 260 Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Lys 270 275 Gly Leu Ile Asn Asn Val Gin Ala Ala Ala Gin

Také jsou známy některé varianty BPN'. Několik příbuzných variantů, které se všechny označují jako „Proteasa A", je popsáno v U.S. patentu 5 030 378 (vydaném 9. června 1991, Venegas), kde jsou charakterizovány aminokyselinovou sekvencí BPN' s následujícími mutacemi: a) Gly v pozici Glyl66 je nahrazen Asn, Ser, Lys, Arg,

His, Gin, Ale nebo Glu; Gly v pozici Glyl69 je nahrazen Ser; Met v pozici Met222 je nahrazen Gin, Phe, Cys, His, Ans, Glu, Ala nebo Thr; nebo b) Gly v pozici Glyl66 je nahrazen Lys a Met v pozici

Met222 je nahrazen Cys; nebo c) Gly v pozici Glyl60 je nahrazen Ala a Met v pozici

Met222 je nahrazen Ala.

Další varianty BPN', dále označované jako „Proteasa B", jsou popsány firmou Genencor International, lne. (San Francisco, Kalifornie), Evropský patent EP-B-251 446 (uznáno 28. prosince 1994 a vydáno 7. ledna 1988), kde jsou charakterizovány aminokyselinovou sekvencí standardního typu BPN' s mutacemi na jedné nebo více z následujících aminokyselin: Tyr21, Thr22, Ser24, Asp36, Ala45, Ala48, Ser49, Met50, His67, Ser87, Lys94, Val95, Gly97, SerlOl, Glyl02, Glyl03, Ilel07, GlyllO, Metl24, Glyl27, Glyl28, Prol29,

Leul35, Lysl70, Tyrl71, Prol72, Aspl97, Metl99, Ser204, ·· »· ·· · ·« * ···· ♦ · * I I ·· • « · · · * * · · · « • r ··* · · · ι»·ι · · * « Ί c ·····*♦< * -L ♦# ·· **· « ·· ··»

Lys213, Tyr214, Gly215 a Ser221; nebo dvou nebo více z uvedených aminokyselin a Asp32, Ser33, Tyrl04, Alal52,

Asnl55, Glul56, Glyl66, Glyl69, Phel89, Tyr217 a Met222, přičemž obě mutace nelze provést na aminokyselinách Asp32, Ser33, Tyrl04, Alal52, Asnl55, Glul56, Glyl66, Glyl69, Phel89, Tyr217 a Met222.

Další preferovaný variant BPN' proteasy, dále označovaný jako „Proteasa D" , je popsán ve WO 95/10615, vydaném 20. dubna 1995, Genencor International, kde jsou charakterizovány aminokyselinovou sekvencí standardního typu BPN' s mutací na pozici Asn76 v kombinaci s mutacemi na jedné nebo více dalších pozic aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z Asp99, SerlOl, Glnl03, Tyrl04, Serl05, Ilel07, Ansl09, Ansl23, Leul2 6, Glyl27, Glyl28, Leul35, Glul56, Glyl66, Glul95, Aspl97, Ser204, Gln206, Pro210, Ala216, Tyr217, Ans218,

Met222, Ser260, Lys265 a/nebo Ala274.

Další preferovaný variant BPN' proteasy, dále označovaný jako „Proteasa F", je popsán v U.S. patentu číslo 4 760 025, vydaném 26. července 1988, Estell a kol., kde jsou charakterizovány aminokyselinovou sekvencí standardního typu BPN' s mutací na jedné nebo více pozic aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z Asp32, Ser33, His64, Tyrl04, Asnl55, Glul56, Glyl66, Glyl69, Phel89, Tyr217 a Met222.

Enzym použitý v prostředcích osobní péče podle předkládaného vynálezu, Proteasa G, zahrnuje jakékoliv z enzymů BPN' a jejich varianty vypsané výše se singulární substitucí nebo inzercí cysteinu do aminokyselinové sekvence. Cystein je nejpreferovanější substituující aminokyselina pro substituci v požadované epitopní oblasti, protože se neobjevuje ve standardním typu substilisinu BPN' ani v jeho derivátech. Substituovaná nebo vložená aminokyselina poskytuje skupinu vhodnou pro připojení k substrátu podle předkládaného vynálezu v konkrétním místě enzymu. S výhodou se substituce nebo vloženi provádí v pozici v epitopní oblasti, která spadá do bodu v proteinu, který je mimo aktivní centrum proteinu. V subtilisinu BPN' a jeho derivátech je toto aktivní centrum definováno trojicí Asn32, His64 a Ser221. V enzymu protease G je cystein nahrazen nebo vložen v místě mimo tuto trojici. Preferované epitopní oblasti pro substituci jsou oblast Aspl40-Vall50 a oblast

Ala230-Leu250. Nikterak neomezující příklady možných substitucí cysteinu jsou na místě Serl45, Asn240 nebo Ser249. Cystein je nejpreferovanější substituující aminokyselina pro substituci v požadované epitopní oblasti, protože se neobjevuje ve standardním typu substilisinu BPN' ani v jeho derivátech.

Vazebné prostředky

Aktivní proteiny jsou vázány k substrátu nerozpustnému ve vodě jakýmikoliv vhodnými vazebnými prostředky. Vazebné prostředky zahrnují jakékoliv fyzické nebo chemické způsoby trvalé vazby aktivního proteinu k substrátu. V dané problematice je známo mnoho takových prostředků.

Fyzikální zachycení

Jedním z prostředků vazby aktivního proteinu podle předkládaného vynálezu k substrátu je fyzikální zachycení proteinu na substrát. Preferované prostředky zachycení je těsné zachycení proteinu v povlaku na povrchu substrátu. Jakékoliv adhesivum nebo polymer známý v dané problematice lze použít pro těsné přichycení proteinu k substrátu. Preferovaný povlak je poly-2-hydroxyethylakrylát, který vzniká oddělenou aplikací 2-hydroxyethylakrylátového monomeru a iniciátoru heptahydrátu síranu železnatého.

Roztok a) aktivního proteinu a adhesiva nebo b) aktivního proteinu a kombinace monomeru/iniciátoru se jednotně nanese na povrch substrátu. Pro dosažení dostatečné vazby může být potřebný druhý povlak adhesiva nebo monomeru/iniciátoru nebo ·· ·« ·· · ··# • ·* · · · * ·«» • ·· · * ♦ · · · · • · 4P9 ♦ · · ··*· · · · • · » · t · · · Μ »· ·· · ·· · zvláštní dávka iniciátoru. Substrát se pak suší, aby se polymer usadil. Substrát se pak dostatečně propláchne, aby se odstranil jakýkoliv volný protein.

Protein připojený k polymernímu gelu nanesenému na substrát

Protein lze vázat k substrátu polymerní spojkou vázanou k polymernímu povlaku na substrátu. Protein se váže k polymerní spojce, která je kovalentně připojena k polymernímu povlaku. Jedno z provedení polymerní spojky je polyethylenglykol (PEG) - maleinimid, prodávaný Shearwater Polymers lne. PEG - maleinimid musí být použit s cysteinem, proto jej lze použít pokud je aktivním proteinem proteasa G. PEG - maleinimid lze také použít ve spojení s poly-2- hydroxyethylakrylátovým povlakem. Generická struktura preferované akrylát - PEG - maleinmidové spojky je:

ProteasftG

X I CH— CH2- R- CH—CH2 CH—CH2—CH—CH2

I

CH—CH2>-R I

X

Další provedení proteinu obsahujícího cystein připojeného k polymernímu povlaku na substrátu ubrousku obsahujícím PEG -maleinimid kovalentně vázaný k polyethyleniminovému povlaku přes N-hydroxysukcinimid: ·· «· ·<0 · ·· · ··«· ··· ····

• · · · · · · λ · · I • · ··· · · · ···· · · · · ·· · · · · ··· «· Μ ·· · Μ Μ·

Proteas^G

2 L ΝΗ-, I ' CH·.—CHv

Vazebné prostředky obsahující proteiny připojené přes spojku jsou preferovány oproti fyzickému zakotvení a přímému kovalentnímu připojení, protože proteiny připojené přes spojku jsou mobilnější a jsou méně kryty polymerním povlakem, což oboje způsobuje větší aktivitu proteinů.

Protein kovalentně připojený k aktivovanému povrchu Dalšími prostředky pro vazbu proteinu podle předkládaného vynálezu je kovalentní vazba k aktivovanému centru na povrchu substrátu. K tomuto způsobu vazby se preferuje celulosový materiál. Chemická spojka je jakákoliv difunkční sloučenina, která bude reagovat se substrátem a proteinem. Preferovaná chemická spojka je ethylendiamin / ester ΛΓ-γ-maleinimido-butyryloxysukcinimidu (GMBS).

Generická struktura preferovaného ethylendiamin / GMBS spojení je:

Protein kovalentně připojený k aktivovanému povrchu přes polymerní spojku

Dalšími prostředky pro vazbu aktivního proteinu k substrátu ubrousku osobní péče podle předkládaného vynálezu je polymerní spojka kovalentně vázána k aktivovanému centru na povrchu substrátu. Preferovaná spojka je ethylendiamin / polyethylenglykol - maleinimid. Generická struktura přímo vázané ethylendiamin / PEG - maleinimidové spojky je: [proteastyG j \

vynálezu případně obsahují širokou škálu nepovinných složek. CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary, 6. vydání 1995, který je zde uveden jako reference, popisuje širokou škálu nikterak neomezujících kosmetických a farmaceutických složek běžně používaných v průmyslu péče o pokožku, které jsou vhodné pro použití v prostředcích podle předkládaného vynálezu, nikterak neomezující příklady funkčních skupin složek jsou popsány na straně 537 této reference. Příklady těchto funkčních skupin zahrnují: abrasiva, činidla proti akné, činidla proti spékání, protimikrobiální činidla, antioxidanty, pojivá, biologická aditiva, objemová činidla, chelatační činidla, chemická aditiva, barviva, kosmetická adstringens, kosmetické biocidy, denaturanty, léková adstringens, emulgátory, povrchová anestetika, látky tvořící film, vonné složky, zvlhčovadla, zjemňující látky (kationtové a aniontové polymery, kotenzidy, lipidová zvlhčovadla, uhlovodíkové oleje, silikonové oleje, vosky), zakalující činidla, plastifikátory, ochranné látky, hnací látky, redukující činidla, činidla bělící pokožku, činidla upravující pokožku (změkčovadla, zvlhčovadla a pohlcovadla) , látky chránící pokožku, rozpouštědla, aktivátory pěny, hydrotropy, solubilizátory, stabilizátory, suspendátory, ochranné látky proti slunci, tenzidy (aniontové, kationtové, amfoterní, zwitteriontové), adsorbéry ultrafialového záření a činidla zvyšující viskozitu (vodná a nevodná). Příklady dalších funkčních skupin materiálů použitelných v předkládaném vynálezu, které jsou odborníkům dobře známé zahrnují solubilizující činidla, sekvestranty a keratolytika a podobně.

Způsoby použiti

Prostředky osobní péče podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro osobní očistu, kosmetickou úpravu pokožky a/nebo úpravu pokožky. Předkládaný vynález je ve formě ubrousků osobní péče nebo pleťové masky osobní péče. Typicky se ubrousek používá tak, že se oblast, která má být vyčištěna, vystaví působení aktivních enzymů po relativně krátkou dobu. Pro použití se ubrousek uvede do kontaktu s pokožkou tam, kde 21 21

• · · • · • t · · · · • · · · · · • ·*·· · · · · • · · · · ·· · ·· ♦·· je to potřeba a pak se odstraní. Typická množství předkládaných ubrousků pro čištění jsou jeden až čtyři ubrousky na uživatele, s výhodou jeden až dva ubrousky na uživatele. Pleťová maska se používá tak, že se oblast, která má být vyčištěna, vystaví působení aktivních enzymů po relativně delší dobu. Typická množství předkládaných pleťových masek pro čištění jsou jeden až dvě masky na uživatele, s výhodou jedna maska na uživatele. Příklady provedení vynálezu Následující příklady dále popisují a ukazují provedení v rámci předkládaného vynálezu. V následujících příkladech jsou všechny složky vypsány v aktivním množství. Příklady jsou uvedeny pouze pro ilustrační účely a nelze je pokládat za omezení předkládaného vynálezu, protože jsou možné mnohé variace bez odchýlení se od rámce předkládaného vynálezu. Složky jsou identifikovány chemickým názvem nebo CTFA jménem. Následující příklady jsou nikterak neomezující příklady ubrousků s vázanými aktivními proteiny podle předkládaného vynálezu. Příklad 1 - Proteasa G připojená k polymernímu povlaku

Proteasa G byla vyčištěna a koncentrována na 3 mg/ml v 10 mM KH;:PO<j pufru, pH 5,5. Pak byl přidán 2-hydroxyethyl-akrylát tak, že jeho výsledná molární koncentrace byla 1,3 M. Dále byl přidán 50 mM roztok peroxidu vodíku (H2O2) tak, že výsledná molární koncentrace byla 2,5 mM H2O2. Roztok Proteasa G / HEA / H2O2 byl jednotně nastříkán na list viskóza / PET tak, aby byl list nasycen. Odděleně byl na list nastříkán roztok heptahydrátu síranu železnatého (FeS04*7H20) . List byl ponechán ležet po dobu 5 minut. Pak byl list propláchnut v lázni 0,01 Μ KH2PO4 tak, aby se odstranil veškerý volný protein. List byl vysušen. 22 22 • ♦ · «♦ • Μ·» » · Přiklad 2 - Proteasa G připojená k polymernímu povlaku Proteasa G byla vyčištěna a koncentrována na 2,5 mg/ml v 10 mM KH-PO4 pufru, pH 5,5. Pak byl přidán akrylát - PEG3400 -N-hydroxysukcinimid (Shearwater Polymers, lne.) v molárním přebytku 15 : 1. pH roztoku bylo pomoci zředěného hydroxidu sodného (NaOH) zvýšeno na hodnotu 7. Pak byla Proteasa G a akrylát - PEG3400 - N-hydroxysukcinimid ponechány reagovat po dobu jedné až dvou hodin za laboratorní teploty. Pak bylo pH roztoku sníženo na hodnotu 5,5 pomocí zředěné kyseliny fosforečné (H3PO4) . Pak byl do roztoku Proteasa G - akrylát -PEG3400 - N-hydroxysukcinimid přidán 2-hydroxyethylakrylát (HEA) tak, aby výsledná koncentrace byla 1,3 M. Dále byl přidán k roztoku Proteasa F - PEG / HEA 50 mM roztok H202 tak, že výsledná molární koncentrace byla 2,5 mM H202. Roztok byl nastříkán na list viskóza / PET tak, aby byl list nasycen. Odděleně byl na list nastříkán 50 mM heptahydrát síranu železnatého (FeSC>4*7H20) tak, aby byl rovnoměrně nastříkán celý povrch listu. List byl ponechán ležet po dobu 5 minut. Pak byl list propláchnut v lázni 0,01 Μ KH2PO4 tak, aby se odstranila veškerá volná Proteasa G. List byl vysušen. Příklad 3 - Proteasa G přímo kovalentně připojená k aktivovanému povrchu

Listy viskóza / PET byly za třepání v automatické třepačce ponechány nasáknout ve vodném roztoku 10% hydroxidu sodného (vyjádřeno jako hmotnost na objem) po dobu 10 minut až 15 minut za použití 1 ml roztoku na 1 citr listu. Pak byly listy za sání třikrát propláchnuty deionizovanou vodou (1 ml/cm2 na jedno promytí). Listy byly za sání pětkrát propláchnuty acetonem. Mezi jednotlivými promytími byly listy ponechány 1 minutu nasáknout acetonem. Listy pak byly ponechány reagovat v 10% roztoku p-toluensulfonylchloridu (vyjádřeno jako hmotnost na objem) v acetonu za třepání po dobu 25 minut až 30 minut (1 ml/cm2) . Listy byly za sání třikrát propláchnuty acetonem, aby byl odstraněn přebytek p-toluensulfonylchloridu. Listy pak byly ponechány reagovat ve 2,2 M roztoku ethylendiaminu v acetonu, pH 13 až 14, po dobu 2 hodin za třepáni. Listy byly za sáni třikrát propláchnuty acetonem, aby byl odstraněn přebytek EDA. Listy byly za sáni pětkrát propláchnuty N, N-dimethylformamidem (DMF) . Listy byly ponechány mezi promytími nasáknout DMF po dobu 1 minuty. Pak byly listy ponechány reagovat s 10% roztokem (vyjádřeno jako hmotnost na objem) s esterem N-y-maleinimidobutyryloxysukcin-imidu (GMBS) za třepáni přes noc (1 ml/cm2) . Listy byly za sáni třikrát propláchnuty suchým DMF. Pak byly listy za sání pětkrát propláchnuty 0,01 M KH:P04 pufrem, pH 7. Mezi propláchnutími byly listy ponechány po dobu 1 minuty nasáknout v pufru. Listy pak byly ponechány reagovat se 3 mg/ml proteasy G v 10 mM KH2P04 pufru, pH 7 (1 ml/cm2) po dobu 1 hodiny až 2 hodin. Listy byly třikrát propláchnuty 0,01 M ΚΗ:>Ρ04 pufrem, pH 5,5. Nakonec byly listy vysušeny. Příklad 4 - Proteasa G kovalentně připojená k aktivovanému povrchu přes polymerní spojku

Listy viskóza / PET byly za třepání v automatické třepačce ponechány nasáknout ve vodném roztoku 10% hydroxidu sodného (vyjádřeno jako hmotnost na objem) po dobu 10 minut až 15 minut za použití 1 ml roztoku na 1 cm2 listu. Pak byly listy za sání třikrát propláchnuty deionizovanou vodou (1 ml/cm2 na jedno promytí). Listy byly za sání pětkrát propláchnuty acetonem. Mezi jednotlivými promytími byly listy ponechány 1 minutu nasáknout acetonem. Listy pak byly ponechány reagovat v 10% roztoku p-toluensulfonylchloridu (vyjádřeno jako hmotnost na objem) v acetonu za třepání po dobu 25 minut až 30 minut. Listy byly za sání třikrát propláchnuty acetonem, aby byl odstraněn přebytek p-toluensulfonylchloridu. Listy pak byly ponechány reagovat ve 2,2 M roztoku ethylendiaminu v acetonu, pH 13 až 14, po dobu 2 hodin za třepání. Listy byly za sání třikrát propláchnuty acetonem, aby byl odstraněn přebytek EDA. Listy byly za sání pětkrát propláchnuty 0,2 M tetraboritanosodným pufrem, pH 8,5. Listy byly mezi propláchnutími ponechány po dobu 1 minuty nasáknout v pufru. Pak byly listy ponechány reagovat v 3% až 5% maleinimid -PEG34 - NHS (Shearwater Polymers, lne.) (vyjádřeno jako hmotnost na objem) v 0,2 M tetraboritanosodném pufru, pH 8,5, po dobu 1 hodiny až 2 hodin za třepání (1 ml/citř) . Listy byly za sání pětkrát propláchnuty 10 mM KH2P04 pufrem, pH 7, aby byl odstraněn přebytek PEG. Listy pak byly ponechány reagovat se 3 mg/ml proteasy G v 10 mM KH2P04 pufru, pH 7 (1 ml/cm2) po dobu 1 hodiny až 2 hodin. Listy byly třikrát propláchnuty 0,01 M KH2P04 pufrem, pH 5,5. Nakonec byly listy vysušeny. Příklad 5 - Proteasa G kovalentně připojená k potaženému povrchu přes polymerní spojku

Listy viskóza / PET byly za třepání v automatické třepačce ponechány nasáknout v 500 ppm lázni polyethyleniminu po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty (1 ml/cm2 až 2 ml/cm2 listu). Pak byly listy propláchnuty ve dvou lázních 0,2 M tetraboritanosodného pufru, pH 8,5. Listy byly ponechány reagovat v 5 mg/ml NHS - PEG3400 - Maleinimid v 0,2 M tetraboritanosodném pufru, pH 8,5, po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty. Listy byly čtyřikrát propláchnuty v lázni deionizované vody (5 ml/cm2 až 10 ml/cm2) . Pak byly listy dvakrát propláchnuty propláchnuty 0,01 M KH2P04 pufrem, pH 7 až 7,5. Zvlášť byla proteasa G vyčištěna a koncentrována na 1 mg/ml až 2 mg/ml 0,01 M KH2P04 pufru, pH 7 až 7,5. „PEGylované" listy byly ponechány reagovat s roztokem proteasy G, pH 7 až 7,5, po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě za třepání. Pak byly listy pětkrát propláchnuty 0,01 M KH2P04 pufrem, pH 5,5, aby byly odstraněny nezreagované a tedy nenavázané podíly proteasy G. Nakonec byly listy vysušeny. 25 • · · · • · · · • * · · • · Μ· · • · * • · · · • *

osobní péče byl připraven Hmotnostní procenta Příklad Příklad Příklad Příklad 6 7 8 9 zbytek zbytek zbytek zbytek do 100 do 100 do 100 do 100 10, 00 10, 00 10, 00 10, 00 4,00 4,00 — — — — 2,40 2,40 O o 4, 00 — — — — 4,20 4,20 — — 1,40 1,40 0, 25 0, 25 0,25 0, 25 0, 10 0, 10 0,10 0,10 3, 00 3, 00 3, 00 3, 00 — 1,50 — — — — — 2, 00 2, 00 2,00 2,00 2, 00 0, 20 0,20 0, 20 0,20 Příklady 6 až 9 Ubrouskový prostředek následujícím způsobem:

Složky

Fáze A

Voda

Glycerin

Lauroamfodiacetát disodný (a) tridecethsulfát sodný Lauroamfoacetát sodný Laurolysarkosinát sodný Laurethsulfát amonný Laurylsulfát amonný Polykvarternium-10 EDTA disodný Fáze B

Ester sacharosy s mastnými kyselinami z bavlny Petrolatum Cetyldimethikon Fáze C

Butylenglykol DMDM Hydantoin (a) jodpropynylkarbamát

Ve vodě nerozpustný substrát

Hydroděrovaný, netkaný substrát, který má základní hmotnost 71,76 g/m2 obsahující 50 % hmotnostních viskózy a 50 % hmotnostních polyesteru o velikosti 15,240 cm krát 19,304 cm a tloušťce 0,508 mm má navázaný aktivní protein z příkladů 1 až 7 . 26 26 m ·

• t * • · ♦ · • *

Ve vhodné nádobě byly složky fáze A smíchány za laboratorní teploty tak, že vznikla disperze a byly za míchání zahřány na teplotu 65 °C. Složky fáze B byly smíchány v jiné vhodné nádobě a zahřány na teplotu 65 °C. Jakmile byly obě teploty stejné složky fáze B byly vmíchány do nádoby obsahující složky fáze A a pak ochlazeny na 45 °C. Složky fáze C byly smíchány za laboratorní teploty v jiné vhodné nádobě. Pak byla směs fáze C přidána do nádoby obsahující spojené fáze A a B za laboratorní teploty. 1,5 gramu výsledného roztoku bylo nastříkáno na každý substrát.

Alternativně lze substrát ponořit do výsledného roztoku. Upravený substrát pak byl sušen v pícce do konstantní hmotnosti. Alternativně se upravený substrát suší v konvekční peci při teplotě 45 °C do konstantní hmotnosti. V alternativních provedeních byly i další substráty, jako jsou tkané substráty, hydropletené substráty, přírodní houby, syntetické houby nebo polymerní mřížkovitá pletiva.

Alternativní provedení jsou případně ve formě pleťových masek osobní péče. Příklady 10 až 13

Ubrousek osobní péče byl připraven následujícím způsobem:

Složky Hmotnostní procenta Příklad Příklad Příklad Příklad 10 11 12 13 Fáze A Voda zbytek zbytek zbytek zbytek do 100 do 100 do 100 do 100 Glycerin 10, 00 10, 00 10, 00 10, 00 Panthenol 0, 50 — 0, 50 0, 50 Lauroamfoacetát sodný 2, 40 2,40 2, 40 2, 40 Laurysulfát amonný 1,40 1,40 1,40 1,40 Polykvarternium-10 0, 25 0, 25 0, 25 0,25 EDTA disodný 0, 10 0, 10 0, 10 0,10

Ester sacharosy s mastnými kyselinami z bavlny 3, 00 3, 00 3, 00 3, 00 Petrolatum — — — 0, 50 Cetyldimethikon — — — 0, 50 Cetylricioleát Fáze C 2, 00 2, 00 1,00 Butylenglykol 2, 00 2, 00 2,00 2,00 DMDM Hydantoin (a) 0, 20 0, 20 0, 20 0,20 jodpropynylkarbamát

Ve vodě nerozpustný substrát

Hydroděrovaný, netkaný substrát, který má základní hmotnost 71,76 g/m2 obsahující 50 % hmotnostních viskózy a 50 % hmotnostních polyesteru o velikosti 15,240 cm krát 19,304 cm a tloušťce 0,508 mm má navázaný aktivní protein z příkladů 1 až 7 .

Ve vhodné nádobě byly složky fáze A smíchány za laboratorní teploty tak, že vznikla disperze a byly za míchání zahřány na teplotu 65 °C. Složky fáze B byly smíchány v jiné vhodné nádobě a zahřány na teplotu 65 °C. Jakmile byly obě teploty stejné složky fáze B byly vmíchány do nádoby obsahující složky fáze A a pak ochlazeny na 45 °C. Složky fáze C byly smíchány za laboratorní teploty v jiné vhodné nádobě. Pak byla směs fáze C přidána do nádoby obsahující spojené fáze A a B za laboratorní teploty. 1,5 gramu výsledného roztoku bylo nastříkáno na každý substrát.

Alternativně lze substrát ponořit do výsledného roztoku. Upravený substrát pak byl sušen v pícce do konstantní hmotnosti. Alternativně se upravený substrát suší v konvekční peci při teplotě 45 °C do konstantní hmotnosti. V alternativních provedeních byly i další substráty, jako jsou tkané substráty, hydropletené substráty, přírodní houby, syntetické houby nebo polymerní mřížkovitá pletiva.

Alternativní provedení jsou případně ve formě pleťových masek osobní péče. Příklady 14 až 17

Složky Hmotnostní procenta Příklad Příklad Příklad Příklad 14 15 16 17 Fáze A Voda zbytek zbytek zbytek zbytek do 100 do 100 do 100 do 100 Lauroamfodiacetát disodný 4,00 4,00 — — (a) tridecethsulfát sodný Lauroamfoacetát sodný — — 2,40 2, 40 Lauroylsarkosinát sodný 4,00 4,00 — — Laurethsulfát amonný — — 4,20 4, 20 Laurysulfát amonný — — 1,40 1,40 EDTA disodný 0, 10 0, 10 0, 10 0, 10 Fáze B Ester sacharosy s mastnými 3, 00 3, 00 3, 00 3, 00 kyselinami z bavlny Petrolatum — 1,50 — — Cetyldimethikon — — — 2, 00 Fáze C DMDM Hydantoin (a) 0,20 0, 20 0, 20 0, 20 jodpropynylkarbamát

Ve vodě nerozpustný substrát

Hydroděrovaný, netkaný substrát, který má základní hmotnost 71,76 g/nů obsahující 50 % hmotnostních viskózy a 50 % hmotnostních polyesteru o velikosti 15,240 cm krát 19,304 cm a tloušťce 0,508 mm má navázaný aktivní protein z příkladů 1 až 7.

Ve vhodné nádobě byly složky fáze A smíchány za laboratorní teploty tak, že vznikla disperze a byly za míchání 29 ·· ·· ·· • · ♦ ♦ * · • · · · · * • · ♦♦· · ♦ · * 9 · · · ·· ·· · ♦ • ·♦ ♦ • • ♦ • · • ♦ ♦ « * • • • · • • ♦ ♦ zahřány na teplotu 65 °C. Složky fáze B byly smíchány v jiné vhodné nádobě a zahřány na teplotu 65 °C. Jakmile byly obě teploty stejné složky fáze B byly vmíchány do nádoby obsahující složky fáze A a pak ochlazeny na 45 °C. Složky fáze C byly smíchány za laboratorní teploty v jiné vhodné nádobě. Pak byla směs fáze C přidána do nádoby obsahující spojené fáze A a B za laboratorní teploty. 1,5 gramu výsledného roztoku bylo nastříkáno na každý substrát.

Alternativně lze substrát ponořit do výsledného roztoku. Upravený substrát pak byl sušen v pícce do konstantní hmotnosti. Alternativně se upravený substrát suší v konvekční peci při teplotě 45 °C do konstantní hmotnosti. V alternativních provedeních byly i další substráty, jako jsou tkané substráty, hydropletené substráty, přírodní houby, syntetické houby nebo polymerní mřížkovitá pletiva.

Alternativní provedení jsou ve formě pleťových masek osobní péče. Příklady 18 až 21

Složky Hmotnostní procenta Příklad Příklad Příklad Příklad 18 19 20 21 Fáze A Voda zbytek zbytek zbytek zbytek do 100 do 100 do 100 do 100 Lauroamfoacetát sodný 2,40 2,40 2,40 2, 40 Laurethsulfát amonný 4,20 4,20 4,20 4,20 Laurysulfát amonný 1,40 1,40 1,40 1,40 EDTA disodný 0, 10 0,10 0, 10 0,10 Fáze B Ester sacharosy s mastnými 3, 00 3, 00 3, 00 3, 00 kyselinami z bavlny Petrolatum — 0, 50 1,00 — Cetyldimethikon — 0, 50 — 1,00

Cetylricinoleát Fáze C 2,00 0, 50 1, 00 1,00 DMDM Hydantoin (a) 0,20 0, 20 0,20 0, 20 jodpropynylkarbamát

Ve vodě nerozpustný substrát

Hydroděrovaný, netkaný substrát, který má základní hmotnost 71,76 g/nť obsahující 50 % hmotnostních viskózy a 50 % hmotnostních polyesteru o velikosti 15,240 cm krát 19,304 cm a tloušťce 0,508 mm má navázaný aktivní protein z příkladů 1 až 7.

Ve vhodné nádobě byly složky fáze A smíchány za laboratorní teploty tak, že vznikla disperze a byly za míchání zahřány na teplotu 65 °C. Složky fáze B byly smíchány v jiné vhodné nádobě a zahřány na teplotu 65 °C. Jakmile byly obě teploty stejné složky fáze B byly vmíchány do nádoby obsahující složky fáze A a pak ochlazeny na 45 °C. Složky fáze C byly smíchány za laboratorní teploty v jiné vhodné nádobě. Pak byla směs fáze C přidána do nádoby obsahující spojené fáze A a B za laboratorní teploty. 1,5 gramu výsledného roztoku bylo nastříkáno na každý substrát.

Alternativně lze substrát ponořit do výsledného roztoku. Upravený substrát pak byl sušen v pícce do konstantní hmotnosti. Alternativně se upravený substrát suší v konvekční peci při teplotě 45 °C do konstantní hmotnosti. V alternativních provedeních byly i další substráty, jako jsou tkané substráty, hydropletené substráty, přírodní houby, syntetické houby nebo polymerní mřížkovitá pletiva.

Alternativní provedení jsou ve formě pleťových masek osobní 31 • · • · ·· • « #·· ♦ · • ·

«· « • · · · • · · «· ··♦

Průmyslová využitelnost

Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově využitelné pro výrobu ubrousků a pleťových masek osobní péče obsahujících aktivní proteiny vázané na substrát nerozpustný ve vodě pomocí polymerní spojky.

Claims (16)

1. 32 JjooA - .. • 1 · · · · » J » »··· · · ··· · * * · · * ♦· · · PATENTOVÉ NÁROKY 1. Ubrouskový prostředek osobní pece, vyznačující se tím, že obsahuje: a) ve vodě nerozpustný substrát, b) mnoho enzymů proteasy G a c) vazebné prostředky trvale připojující každý z enzymů k substrátu, ve kterém ubrouskový prostředek osobní péče obsahuje 0,01 pg/crrr až 1000 pg/cirr enzymu na substrátu.
2. 2. Prostředek pleťové masky osobní péče, vyznačující se tím, že obsahuje: a) ve vodě nerozpustný substrát, b) mnoho enzymů proteasy G a c) vazebné prostředky trvale připojující každý z enzymů k substrátu, ve kterém ubrouskový prostředek osobní péče obsahuje 0,01 pg/cm" až 1000 pg/cnr enzymu na substrátu.
3. 3. Prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že ve vodě nerozpustný substrát obsahuje jeden nebo více materiálů vybraných ze skupiny sestávající z hedvábí, keratinů, celulos, acetátů, akrylátů, esterů celulosy, modakrylátů, polyamidů, polyesterů, polyolefinů, polyvinylalkoholů, buničiny, bavlny, sisalu, juty, lnu, akrylátů, nylonů, polyesterů, polypropylenů, polyethylenů, polyvinylacetátů, polyurethanů, viskózy a jejich směsí.
4. 4. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že ve vodě nerozpustný substrát obsahuje netkaný list vláken vybraných ze skupiny sestávající z viskózových vláken, celulosových vláken, polyesterových vláken a jejich směsí.
5. 5. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, 33 » · • · • ♦ · • · ·

   • · · ♦ · ·· ·· · • ·

   že ve vodě nerozpustný substrát obsahuje dva nebo více listů vláken, které mají každý jinou texturu.
6. 6. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že vazebné prostředky jsou vybrány ze skupiny sestávající z fyzického zachycení, připojení k polymernímu gelu, kovalentní vazby k aktivovanému povrchu, kovalentně vázané spojky k aktivovanému povrchu a kovalentně vázané spojky k potaženému povrchu.
7. 7. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že vazebný prostředek je fyzické zachycení v polymerním povlaku.
8. 8. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že polymerní povlak je poly-2-hydroxyethylakrylát.
9. 9. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že vazebný prostředek je spojka k polymernímu povlaku.
10. 10. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že spojka je polyethylenglykol-maleinimid a polymerní povlak obsahuje poly-2-hydroxyethylakrylát.
11. 11. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že spojka je polyethylenglykol-maleinimid a polymerní povlak obsahuje polyethylenimin.
12. 12. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že vazebný prostředek je kovalentní připojení k aktivovanému místu na substrátu.
13. 13. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, 34 ♦ ♦ ·# • · · · • · ··· + 9 · » · t • · · · • · ···· • · « ♦ • · • · že kovalentní spojka je ester Ν-γ-maleinimidobutyryloxysukcin-imidu.
14. 14. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že vazebný prostředek zahrnuje polymerní spojku kovalentně vázanou k aktivovanému místu na povrchu substrátu.
15. 15. Ubrouskový prostředek osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že polymerní spojka zahrnuje polyethylenglykol - maleinimid.
16. 16. Způsob zvlhčení pokožky, vyznačující se t í m, že zahrnuje uvedení pokožky, která potřebuje takovou úpravu, do kontaktu s ubrouskovým prostředkem osobní péče podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.