CZ20013647A3

CZ20013647A3 - Chemická knihovna

Info

Publication number: CZ20013647A3
Application number: CZ20013647A
Authority: CZ
Inventors: H. Mario Geysen
Original assignee: Glaxo Group Limited
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-05
Publication date: 2002-04-17
Also published as: EP1169123A1; AU4202400A; CA2367541A1; JP2002541226A; HUP0200798A2; HUP0200798A3; WO2000061281A1

Description

Chemická knihovna

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká oboru kombinační chemie, a zvláště schémat kódování pro chemické knihovny na pevné fázi. Vynález se zvláště týká produkce konstruktů, které mají odlišné fyzikální vlastnosti a tím umožňují jejich fyzické rozdělení do různých skupin.

Dosavadní stav techniky

Poslední trendy v oblasti výzkumu nových chemických a zvláště farmakologických účinných látek se zaměřovaly na přípravu tzv. „chemických knihoven“ (Chemical libraries) jako možného zdroje nových přístupů k objevování léků. Chemické knihovny jsou záměrně vytvořené soubory odlišných molekul, které mohou být připraveny buď synteticky nebo biosynteticky, a které mohou být systematicky prozkoumávány na biologickou účinnost v řadě formátů. Mezi příklady chemických knihoven patří knihovny rozpustných molekul; knihovny součenin navázaných na kuličky pryskyřice, křemíkové čipy nebo jiné pevné nosiče; nebo knihovny rekombinantních peptidů předkládaných na bakteriofázích nebo jiných vektorech pro předkládání biologických materiálů (biological display).

Pro předkládaný vynález jsou zvláště zajímavé chemické knihovny, které jsou navázány na jednotlivé pevné nosiče, které mají typicky formu kuliček pryskyřice. Byla navrhována řada způsobů přípravy chemických knihoven, které využívají individuálních pevných nosičů, na které jsou sloučeniny navázány. Jednou takovou metodou je „diskrétní“ metoda, při které jsou pevné nosiče umístěny ve větším množství reakčních nádobek. Na těchto pevných nosičích se potom syntetizují různé chemické látky, přičemž pevné nosiče zůstávají uvnitř stejných reakčních nádobek. Po ukončení procesu syntézy může být chemická sloučenina na každém pevném nosiči jednoduše identifikována prostřednictvím identifikace reakční nádobky, ze které byl příslušný pevný nosič vyjmut. Protože je zapotřebí udržovat pevné nosiče uvnitř dané reakční nádobky, velikost získané chemické knihovny je omezena na počet použitých reakčních nádobek.

Při pokusech o podstatné zvýšení velikosti chemické knihovny byla vyvinuta technika míchání a dělení (mix and split technique). Při metodě míchání a dělení se pevné nosiče umístí do jednotlivých reakčních nádobek a na každém pevném nosiči se syntetizuje první stavební blok. Pevné nosiče se potom vzájemně smísí a znovu rozdělí do reakčních nádobek, kde se syntetizuje na pevných nosičích druhý stavební blok. Pevné nosiče mohou být znovu smíseny a znovu rozděleny, přičemž na pevných nosičích může být syntetizován další stavební blok. Tento proces může být opakován tolikrát, kolikrát je zapotřebí. Příklady technik míchání a dělení se obecně popisují v US patentu 5,503,805, jehož úplný obsah je zařazen odkazem.

Jako příklad syntézy s dělením (split synthesis) při syntéze peptidů na pevné fázi je možno rozdělit šarži nosičů pryskyřice (typicky malé kuličky pryskyřice) do n frakcí, na každý alikvot při oddělené reakci navázat jedinou monomerní aminokyselinu a potom opatrně smíchat všechny částice pryskyřice dohromady. Opakováním tohoto protokolu celkem pro x cyklů může poskytnout náhodný soubor s toeometrickou distribucí. Navíc by mělo být pro zajištění zastoupení většiny možných ligandů n^x různých molekul použito relativně velkého počtu kuliček. Typická hodnota může být přibližně desetinásobný počet kuliček, než je požadovaný počet ligandů.

Jakmile byla vytvořena chemická knihovna získaná mícháním a dělením (mix and split Chemical library), sloučeniny mohou být od pevných nosičů odštěpeny a testovány pro zjištění, zda sloučenina

poskytuje požadovaný účinek. Pokud ano, je zapotřebí identifikovat příslušnou sloučeninu. Jelikož však byl pevný nosič v průběhu syntézy míchán a dělen několikrát, identifikace sloučeniny na pevném nosiči může být značně náročná.

Jak bude podrobněji popisováno dále, někteří autoři navrhovali spojovat se sloučeninami značky, tak jak jsou získávány při kombinačních krocích. Například pokud jsou sloučeniny navázány na kuličky pryskyřice, řešení podle dosavadního stavu techniky zahrnovala navázání chemických identifikačních značek na kuličky v souladu s každým krokem navázání bloku při syntéze. Určené vlastnosti každé značky potom udávaly, který stavební blok byl navázán v určitém kroku syntézy. Celková struktura ligandu na jakékoli kuličce může být potom určena odečtením souboru značek na kuličce, čímž se vlastně dosáhne kódování kuličky.

Alternativní způsob produkce kombinačních knihoven chemických látek zahrnuje způsoby používané oběma těmito diskrétními metodami a metodou míchání a dělení. Podle této hybridní metody se pevné nosiče umístí na určitá místa a na každém z těchto pevných nosičů se syntetizuje soubor chemikálií, přičemž nosiče zůstávají na svých konkrétních místech. Na každý z pevných nosičů je také navázán kód ligandu, který může být použit pro identifikaci chemikálií syntetizovaných na svých pevných nosičích v určitých diskrétních umístěních. Pevné nosiče se potom smíchají a dělí, přičemž na každém pevném nosiči se syntetizuje ještě další chemická látka. Chemická sloučenina na každém z pevných nosičů může být potom identifikována pomocí známé polohy pevného nosiče, jestliže byl přidán poslední stavební blok, a odečtením kódu ligandu pro určení přidaných chemických sloučenin při umístění pevných nosičů ve svých diskrétních polohách. Tato technika se obecně popisuje v PCT mezinárodní přihlášce No. PCT/US97/05701 a v H. Mario Geysen, a další, Isotope or Mass Encoding of Combinatorial Libraries, Chem. &

Biol., díl III, No. 8, str. 679 - 688, srpen 1996, jejichž úplné obsahy jsou zařazeny odkazem.

Jak bylo uvedeno výše, protože pevné nosiče se vzájemně kombinují a potom se znovu rozdělují do reakčních nádobek, je zapotřebí identifikovat složky ligandů, tak jak jsou syntetizovány na pevných nosičích. Tímto způsobem mohou být zjištěny kroky chemické syntézy, takže je možno určit hotovou sloučeninu syntetizovanou na pevných nosičích. Pro zaznamenávání postupu syntézy byla navrhována řada různých kódovacích schémat. Jednou takovou technikou je technika paralelního kódování, při které se spolu s konstrukcí ligandu provádí postupné uspořádávání značek. Značky se používají jako binární kód pro zaznamenávání reakční historie každé kuličky. Kód může potom být odečítán přímo z jednotlivé kuličky kapilární plynovou chromatografií s elektronovým záchytem. Tento způsob je obecně popsán v Michael H. J. Ohlmeyer, a další, Complex Synthetic Chemical Libraries Indexed with Molecular Tags, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, díl 90, str. 10922 - 10926, prosinec 1993, jehož úplný obsah je zařazen odkazem.

Další strategie kódování navrhuje použití mikroelektronického zařízení nazvaného radiofrekvenční paměťová značka (rádio frequency memory tag). Tato značka může být zapouzdřena do pevného nosiče a opatřena jedinečným binárním kódem. Pro odečítání tohoto kódu se čip umístí do blízkosti vysílače a přijímače jako počítačového rozhraní, které umožní napájení čipu, odečtení jeho identifikační značky a vyslání kódu do přijímače ve formě radiofrekvenčního pulsu. Tato technika se obecně popisuje v článku A. W. Czarnik, Encoding Strategies and Combinatorial Chemistry, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, díl 94, str. 12738 - 12739, listopad 1997, jehož úplný obsah je zařazen odkazem.

Komplexnost spojená s kombinačními knihovnami se často zvyšuje na základě požadavků různých chemiků, kteří často preferují

různé typy testů pro zjištění, které ligandy poskytují pozitivní výsledek. Podle požadavků chemika může být například nutné, aby byla kombinační knihovna kompatibilní s testy přímou vazbou, testy typu lawn assays (testy na nárůstu), testy v roztoku apod. Výsledkem je, že může být nutné vytvářet větší počet knihoven, kde každá obsahuje stejný soubor ligandů, ale které jsou konstruovány rozdílným způsobem tak, aby bylo možno s každou takovou knihovnou provádět různý typ testů. Použití různých typů testů pro vyhodnocování chemických knihoven se popisuje obecně v článku Daniolos, A., a další, Pigment Celíš Pes., 3, 38 - 43 (1990); Jayawickreme, C. K., Proč. Nati. Acad. Sci. 91, 1614 - 1618; a Lam, Kit S., a další, „The One-Bead-One-Compounď Combinatorial Library Method“, Chem. Rev., 1997, 97, 411 - 448, jehož úplný obsah se zařazuje odkazem.

Je zřejmé, že výstavba většího počtu knihoven s identickými ligandy je jak nákladná, tak i časově náročná. Proto by bylo žádoucí poskytnout způsoby pro konstrukci jediné knihovny, která může být rozdělena do skupin tak, že každá skupina je vhodná pro příslušný formát testu. Konkrétněji by bylo žádoucí poskytnout cestu, jak identifikovat způsob navázání propojující složky, aby bylo možno zjistit, který proces může být použit pro testování konkrétního konstruktu.

V jednom provedení by bylo žádoucí poskytnout další způsoby pro dělení skupin konstruktů pro zvýšení postu možností pro identifikaci různých hledisek konstruktů.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje příklady chemických knihoven, způsoby přípravy chemických knihoven a způsoby vyhodnocováni chemických knihoven. V jednom příkladu provedení obsahuje chemická knihovna větší počet konstruktů, které jsou oddělitelné do fyzikálně odlišných skupin. Konstrukty v každé skupině mají alespoň jednu společnou fyzikální vlastnost, která je fyzikálně odlišná od fyzikálních vlastností konstruktů ve všech dalších skupinách. Tímto způsobem mohou být konstrukty snadno rozděleny do různých skupin na základě svých společných fyzikálních vlastností.

Příklady fyzikálních vlastností, které mohou být použity, zahrnují velikost, hustotu, geometrický tvar, barvu, magnetizaci, náboj, refrakční index apod., stejně jako vlastnosti popisované v US patentu No. 5,708,153, jehož obsah se zařazuje odkazem. V jednom konkrétním provedení mohou být fyzikální vlastnosti tříděny do kategorií. Tímto způsobem může být kategorie alespoň jedné z těchto skupin odlišná od jiných skupin. Jako příklad může být jednou z kategorií velikost a druhou kategorií může být hustota. Chemická knihovna tedy může obsahovat konstrukty, které mají různé fyzikální vlastnosti v rámci stejného typu a/nebo fyzikální vlastnosti různých typů. Tímto způsobem je možno značně zvýšit počet možností odlišných fyzikálních vlastností.

V dalším konkrétním provedení obsahuje každý konstrukt pevný nosič, na který je navázán větší počet složek. Tyto složky mohou zahrnovat například složku ligandů a alespoň jednu propojující složku (linking component). V některých případech může konstrukt také obsahovat jednu nebo více složek kódujících ligand. S výhodou obsahují konstrukty v každé skupině propojující složky, které byly uspořádány v podstatě stejným způsobem. Tímto způsobem jsou společné fyzikální vlastnosti každé skupiny reprezentativní pro způsob, jakým je skupina testovatelná, tj. znalostí způsobu uspořádání propojujících složek je možno zjistit konkrétní typ testu, který by měl být použit pro vyhodnocení vlastností ligandů.

V jednom konkrétním provedení je složka ligandů složena ze tří různých stavebních bloků. Navíc je možno každou složku ligandů odečítat pro určení dvou ze tří stavebních bloků na každém pevném ·

99

9 · · «

nosiči. Tímto způsobem může být použit kód ligandu pro určení prvních dvou vazebných bloků, které byly syntetizovány, přičemž pevné nosiče se nacházely v diskrétních místech. Pevné nosiče mohou být potom smíchány a rozděleny, jestliže se na pevných nosičích syntetizuje třetí stavební blok. Jako takový je třetí stavební blok známý. Stavební bloky použité pro výrobu chemické směsi mohou být tedy snadno zjištěny vyhodnocením složky kódu ligandu, zatímco způsob navázání složek ligandu může být určen na základě fyzikálních vlastností konstruktu.

io Vynález dále poskytuje příklad způsobu výroby chemické knihovny. Tento způsob využívá větší počet skupin pevných nosičů, kde každá skupina obsahuje větší počet pevných nosičů, které mají alespoň jednu společnou fyzikální vlastnost, která je odlišná od fyzikálních vlastností pevných nosičů v jiných skupinách. Způsob pokračuje navázáním alespoň jedné propojující složky na každý z pevných nosičů. Způsob navázání propojujících složek je pro každou skupinu jedinečný ve srovnání s jinými skupinami. Dále je syntetizován na každý pevný nosič ligand, takže každá skupina pevných nosičů obdrží stejné ligandy. Tímto způsobem se vytvoří chemická knihovna, ve které může být snadno identifikován způsob navázání vazebných složek. Identifikace způsobu navázání vazebných složek je výhodná v tom, že je možno snadno určit způsob, jakým je skupina testovatelná pro vyhodnocení ligandu, jednoduchou znalostí společných fyzikálních vlastnosti skupiny, které přísluší tento pevný nosič. Může být také popřípadě navázána jedna nebo více složek kódujících ligand. V takovém případě může být určitý ligand identifikován dekódováním ligandové složky, typicky po poskytnutí pozitivního výsledku testovaným konstruktem.

Fyzikální vlastnosti, kterými je možno identifikovat testovatelný proces, mohou zahrnovat velikost, geometrický tvar, hustotu, barvu, magnetizaci, náboj, index lomu apod. Jak bylo popsáno výše, fyzikální vlastnosti je možno třídit do kategorii, takže fyzikální vlastnosti se • ·

mohou v rámci dané kategorie nebo napříč určitými kategoriemi lišit. V jednom konkrétním provedení zahrnují způsoby, kterými je možno skupiny testovat, testy přímou vazbou, testy typu lawn assays, testy v roztoku apod.

V jednom konkrétním kroku se vloží větší počet pevných nosičů do fyzikálně diskrétních umístění před krokem syntézy. Každé z umístění je opatřeno alespoň jedním pevným nosičem z každé z těchto skupin. Tímto uspořádáním je možno syntetizovat na každém pevném nosiči jeden nebo více stavebních bloků, přičemž pevné nosiče jsou v těchto diskrétních umístěních. V tomto uspořádání je složka kódující ligand s výhodou reprezentativní pro vazebný blok nebo vazebné bloky. Po syntéze vazebného bloku nebo vazebných bloků se pevné nosiče s výhodou míchají a rozmístí do většího počtu nádobek, kde se na každém z těchto pevných nosičů syntetizuje další vazebný blok. Tímto způsobem může být ligand identifikován použitím kódu ligandu pro zjištění počátečního stavebního bloku nebo bloků. Dále může být jednoduše určen způsob, kterým je možno každou skupinu testovat, zjištěním společných fyzikálních vlastností každé z těchto skupin. Tímto způsobem mohou být pevné nosiče rozděleny do skupin, přičemž každá skupina se testuje použitím odlišného testu. Jestliže se získá pozitivní výsledek, může být zjištěn ligand odečtením kódu ligandu.

Předkládaný vynález dále poskytuje příklad způsobu pro vyhodnocování chemické knihovny. Podle tohoto způsobu se poskytuje větší počet konstruktů, které jsou rozděleny podle typů na základě alespoň jedné společné fyzikální vlastnosti. Tyto konstrukty byly rozděleny do skupin na základě jejich typu. Po rozdělení je možno každou ze skupin vyhodnocovat, přičemž každá skupina obsahuje informace, které budou napomáhat procesu vyhodnocování. Například každá skupina může vyžadovat provedení odlišného testu pro vyhodnocení ligandu. Konkrétněji mohou mít konstrukty jedné skupiny ·· » » «. ., , • · ·· ·· · · · *. .J ···.

* · · · 9···· «··· ··· »·Φ «99· *··* propojující složky, které byly uspořádány v podstatě stejným způsobem, takže společná fyzikální vlastnost každé skupiny je reprezentativní pro způsob, kterým je možno skupinu testovat.

V jednom konkrétním provedení je fyzikální vlastností hustota. Tímto způsobem je možno oddělit konstrukty postupným umístěním konstruktů v kapalinách s rozdílnými hustotami a oddělením konstruktů, které vystoupí na povrch každé kapaliny. Jako další příklad může být alespoň jedna z fyzikálních vlastností velikost. Při tomto uspořádání mohou být konstrukty prosáty nebo míchány, aby se umožnilo vystoupení konstruktů s větší velikostí na povrch zbývajících konstruktů. Konstrukty s větší velikostí mohou být potom odděleny ze souboru, s výhodou použitím vybíracího zařízení, které může rozlišovat na základě velikosti.

V dalším provedení poskytuje vynález příklad chemické knihovny, která obsahuje alespoň dvě různé chemické knihovny. Každá chemická knihovna obsahuje větší počet pevných nosičů, na které jsou navázány alespoň dva stavební bloky. Pevné nosiče z každé knihovny mají jedinečné fyzikální vlastnosti společné pro knihovnu, které umožní identifikaci knihovny, do které každý pevný nosič náleží. Tímto způsobem mohou být knihovny kombinovány pro usnadnění testování. V případě potřeby může být knihovna, ze které konkrétní pevný nosič pochází, jednoduše zjištěna vyhodnocením jeho fyzikálních vlastností. Fyzikální vlastnosti pevných nosičů se s výhodou volí ze skupiny zahrnující velikost, geometrii, hustotu, barvu, magnetizaci, náboj a index lomu.

Vynález dále poskytuje příklad způsobu pro vyhodnocování dvou nebo většího počtu různých chemických knihoven. Podle tohoto způsobu se poskytují alespoň dvě různé chemické knihovny, kde každá knihovna obsahuje větší počet pevných nosičů, na které jsou navázány alespoň dva stavební bloky. Pevné nosiče v každé knihovně mají dále jedinečnou fyzikální vlastnost, která je pro tuto knihovnu

- 10 - ····

	•	*·
	• ·	• 99	«	• ·
	•	• ·	9
• ·	•	4 · ·	9
• ·	•	• ·	9	• 9

společná. Tyto dvě knihovny se vzájemně kombinují za vytvoření kombinované knihovny a kombinovaná knihovna se testuje na pozitivní výsledky. Jestliže jsou pozorovány pozitivní výsledky, knihovna nebo knihovny, ke kterým tyto pevné nosiče náležejí, se identifikují na základě fyzikálních vlastností pevných nosičů.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A je schematické znázornění čtyř skupin konstruktů podle vynálezu, které se liší velikostí.

Obr. 1B znázorňuje čtyři skupiny konstruktů podle vynálezu, které se liší hustotou.

Obr. 1C znázorňuje čtyři skupiny konstruktů podle vynálezu, z nichž alespoň některé se liší hustotou, tvarem a velikostí.

Obr. 2A je schematické znázornění příkladu konstruktu podle vynálezu.

Obr. 2B je schematické znázornění alternativního konstruktu podle vynálezu.

Obr. 3 je schéma příkladu metody pro vyhodnocování chemické knihovny podle vynálezu.

Obr. 4 je schematické znázornění způsobu výroby chemické knihovny podle vynálezu.

Obr. 4A je zvětšený pohled na diskrétní jamku z obr. 4, označenou čarou A-A.

Obr. 4B je zvětšený pohled na reakční nádobku z obr. 4, označenou čarou B-B.

Obr. 5 je schematický diagram ilustrující kombinaci a následné vyhodnocení dvou nebo více různých knihoven podle vynálezu.

	• 99	*«
	99 9 9	•	9	9 *
	• ·	* 9
• ·	9 9	9 9	•
	9 9	9	9
• ·	999 99*9	9 9	* 9

Příklady provedení vynálezu „Konstrukt“, jak se zde používá, je kovalentně navázaná jednotka, obsahující v jakékoli kombinaci nějaký typ pevného nosiče, jednu nebo více propojujících složek, jeden nebo více ligandů a popřípadě jednu nebo více složek kódujících ligand.

„Složka kódující ligand“ je složka, která může být navázána na pevný nosič, a která obsahuje informaci o alespoň jedné z chemických látek použitých při konstrukci ligandu, který je také navázán na pevný nosič.

„Ligand“ je sledovaný produkt chemické reakce. Ligand může být část většího konstruktu, kde konečným cílem bude identifikovat a/nebo odštěpit ligand od zbytku konstruktu.

„Propojující složka“ je kovalentní vazba nebo molekulární skupina, která je vhodná pro vzájemné propojení dvou částí konstruktu.

„Pevný nosič“ je jeden nebo více materiálů, na nichž může být prováděna syntéza kombinační chemií, včetně kuliček, pevných povrchů, pevných substrátů, částic, pelet, disků, kapilár, dutých vláken, jehel, plných vláken, celulózových kuliček, kuliček z pórovitého skla, silikagelu, polystyrénových kuliček popřípadě zesítěných divinylbenzenem, kuliček z roubovaných kopolymerů, kuliček z polyakrylamidu, latexových kuliček, dimethylakrylamidových kuliček, popřípadě zesítěných Ν,Ν’-bis-akryloylethylendiaminem, skleněných částic potažených hydrofobním polymerem, fulerenů a rozpustných nosičů, jako je nezesítěný polystyren s nízkou molekulovou hmotností. Vynález poskytuje příklady konstruktů s odlišnými fyzikálními vlastnostmi, které umožňují separaci konstruktů do odlišných skupin. Fyzikální vlastnosti, na základě kterých mohou být skupiny rozděleny, umožňují identifikaci konkrétní vlastnosti nebo provedení konstruktů v rámci dané skupiny. Společné fyzikální vlastnosti mohou být například použity pro identifikaci způsobu, kterým je při screeningu »*·44<4 »· · • · «4 • 4 • 4 . _ · 4

- 12 - ···· ···

• · • 44 ligandů tato skupina testovatelná. Jako další příklad mohou být společné fyzikální vlastnosti skupiny použity pro identifikaci konkrétního vazebného bloku použitého při procesu syntézy. V ještě dalším příkladu může být společná fyzikální vlastnost použita pro identifikaci konkrétní knihovny, do které konstrukt náleží, po kombinaci dvou nebo více knihoven.

Konstrukty podle vynálezu mohou být sestaveny tak, aby měly široké rozmezí fyzikálních vlastností, které umožňují separaci konstruktů do skupin, které mají alespoň jednu společnou fyzikální io vlastnost. Mezi použitelné fyzikální vlastnosti patří například velikost, hustota, geometrický tvar, barva, magnetizace, náboj, index lomu apod. Fyzikální vlastnosti mohou být vhodně kategorizovány do typů. Například jeden typ může být velikost a další typ může být hustota. Vynález může využívat rozdílů uvnitř každého typu nebo napříč různými typy. Konstrukty mohou být například sestaveny tak, aby měly různé velikosti, takže konstrukty mohou být separovány do odlišných skupin na základě jejich velikosti. Jako další příklad mohou mít některé konstrukty odlišnou velikost, zatímco jiné konstrukty mohou mít odlišný geometrický tvar. Proto může vzniknout řada kombinací

2o fyzikálních vlastností na základě rozdílů v rámci daného typu a/nebo napříč různými typy.

Příklady různých fyzikálních vlastností, které mohou být v rámci vynálezu využity, jsou ilustrovány na obr. 1A až 1C. Na obr. 1A jsou pevné nosiče uspořádány do čtyř skupin, přičemž každá skupina obsahuje částice s různou velikostí. Pro separaci konstruktů do různých skupin může být potom použita řada způsobů. Pro filtraci konstruktů s odlišnou velikostí mohou být například použita síta s různou velikostí. Jako další alternativa mohou být konstrukty míchány tak, že konstrukty s větší velikostí stoupají vzhůru. Pro

3o oddělení největších konstruktů mohou být použita zařízení pro vybírání kuliček, jako je zařízení popsané v US patentové přihlášce No.

; . · · · · · ;· · · « · · · * 4 · · a a ··· «·· ·<· «« úplný obsah je zařazen • 4 < «

- 13 - ·*·*

09/240,758, podané 29. ledna 1999, jejíž odkazem.

Konstrukty mohou být potom opět míchány a postup může být opakován pro každou skupinu. Mezi další možné separační techniky patří použití magnetů, třídičů buněk aktivovaných fluorescencí a další separační techniky známé v oboru.

Alternativní schéma oddělování konstruktů je ukázáno na obr. 1B. Podle tohoto schématu má každá skupina konstruktů pevný nosič s rozdílnou hustotou, jak je znázorněno referenčními symboly pi-p4io Pro oddělení konstruktů do skupin mohou být konstrukty vloženy do roztoku o určité hustotě, takže skupina s nejnižší hustotou vystoupí k povrchu roztoku. Tyto konstrukty mohou potom být z roztoku sbírány. Hustota roztoku se potom zvyšuje, dokud nevystoupí k povrchu roztoku skupina s další nejvyšší hustotou. Tento postup se potom opakuje, dokud nejsou odděleny všechny skupiny.

Obr. 1C ilustruje další alternativu pro separaci konstruktů do odlišných skupin. V obr. 1C jsou konstrukty zařazovány do různých typů. Například skupiny 1 a 2 jsou tříděny podle hustoty, skupina 3 je klasifikována podle tvaru a skupina 4 je zatříděna na základě velikosti.

Navíc se konstrukty ve skupinách 1 a 2 liší v rámci stejného typu. Konkrétněji, skupina 1 má hustotu různou od hustoty skupiny 2. Pro separaci konstruktů do příslušných skupin potom může být použita řada způsobů. Pro určení odlišností ve velikosti a tvaru může být použit například optický detektor. Rozdíly v hustotě mohou být detekovány použitím různé hustoty roztoků, jak bylo popsáno výše. Mohou být také použity výše popsané metody míchání.

Jednou výhodou kategorizace pevných nosičů do skupin je to, že každá skupina může být testována použitím odlišného testu. Tímto způsobem je možno vyrobit knihovnu, která může být využita pro řadu testů, takže není třeba vytvářet větší množství knihoven. To se nejlépe provádí přiřazením fyzikální vlastnosti každé skupině, která je

reprezentantem způsobu, kterým jsou na pevném nosiči uspořádány propojující složky konstruktu. Pro ilustraci tohoto principu je schematicky v obr. 2A ukázán typický konstrukt 10. Konstrukt 10 obsahuje pevný nosič 12, na který je navázána propojovací složka 14, složka kódující ligand 16 a složka ligandu 18. I když je na obr. ukázána pouze jedna propojující složka 14, bude zřejmé, že mohou být poskytnuty jiné počty i uspořádání propojujících složek. Například propojující složka může být poskytnuta mezi složkou kódující ligand 16 a složkou ligandu 18. Takový konstrukt se například popisuje v mezinárodní PCT přihlášce No. PCT/US97/05701, jejíž úplný obsah se zařazuje odkazem. Další příklad konstruktu 11 je ukázán na obr. 2B a obsahuje pevný nosič 12’ a pár propojujících složek 13, které jsou použity pro navázání složky kódující ligand 15 a ligandu 17. Takový konstrukt se popisuje například v US patentu No. 5,770,358, jehož úplný obsah je zařazen odkazem. Dále bude zřejmé, že existují jiné typy konstruktů, které mohou být použity v rámci vynálezu. Pro usnadnění diskuse bude dále odkazováno na konstrukt 10.

V závislosti na způsobu uspořádání konstruktů 10 a zvláště v závislosti na počtu, typu a uspořádání propojujících složek, bude muset být použit odlišný test pro provedení screeningu složky ligandu 18 po syntéze. Například testy typu přímé vazby, typu lawn assays, testy v roztoku apod., všechny používají odlišných typů a/nebo uspořádání propojujících složek, jak se obecně popisuje v Daniolos, A., a další, Pigment Celis Res., 3, 38 - 43 (1990); Jayawickreme, C.

K., Proč. Nati. Acad. Sci. 91, 1614 - 1618; a Lam, Kit S., a další, „The One-Bead-One-Compound’ Combinatorial Library Method“, Chem. Rev., 1997, 97, 411 - 448, které již byly dříve zařazeny odkazem. U testů typu lawn assays se typicky syntetizované kuličky v agarózovém roztoku nalijí na plotny s nárůstem buněk, jako jsou melanoforové buňky. Po ztuhnutí agarózy se destičky vystaví UV záření a skenují se. Jednotlivé kuličky nad odpovídajícími oblastmi mohou být potom identifikovány použitím stereomikroskopu a vyjmuty.

- 15*2· *··

V testech přímo vazby se navázaný cíl detekuje buď přímou vizualizací, například barevnou cílovou sloučeninou, nebo nepřímo použitím reportérové skupiny jako je enzym, radionuklid, fluorescenční sonda nebo barvivo, kovalentně navázaných na cílovou sloučeninu. Pro testy v roztoku se ligandy odštěpí z pevných nosičů do fáze roztoku, kde mohou probíhat biologické testy. Mezi tyto testy mohou patřit například testy s vazbou kompetitivního receptoru s radioaktivně značenými ligandy, různé enzymatické testy, testy přenosu signálu založené na buňkách, antibakteriální testy, antivirové testy a antirakovinné testy.

Typicky se propojovací složky a složky kódující ligand navazují na pevný nosič 12 před procesem syntézy. Tak může být pevný nosič 12 opatřen jedinečnou fyzikální charakteristikou, která může být použita pro identifikaci způsobu navázání propojujících složek. Jakmile byl pevný nosič opatřen vhodnou složkou kódující ligand a propojující složkou, postup syntézy pokračuje pro dosažení syntézy složky ligandu 18 na pevném nosiči. Jak bude podrobněji popsáno dále, je výhodné syntetizovat stejný soubor složek ligandů na každou skupinu pevných nosičů, takže každá skupina může být vyhodnocována nezávisle.

Na obr. 3 bude popsán příklad způsobu zpracování konstruktů. Jak je ukázáno v kroku 20, podobným způsobem jak bylo právě popsáno se vytvoří větší počet typů konstruktů, kde každý z nich nese stejný soubor ligandů. V kroku 22 se konstrukty fyzikálně dělí do skupin na základě typu, tj. na základě společné fyzikální vlastnosti, která je pro tuto skupinu jedinečná. Jakmile byly konstrukty fyzicky odděleny, zvolí se pro každou skupinu vhodný test. Typ testu může být určen na základě fyzikální vlastnosti, která je společná pro skupinu, jak je ukázáno v kroku 24. V kroku 26 se pro každou skupinu konstruktů provedou zvolené testy pro screening ligandů. Konstrukty, které poskytnou pozitivní výsledky, mohou být popřípadě dekódovány pro identifikaci ligandu, jak je ukázáno v kroku 27.

Jak je znázorněno na obr. 4, bude popsán jeden příklad konstrukce chemické knihovny, která obsahuje skupiny konstruktů definovaných rozdílnými fyzikálními vlastnostmi. Jak však bylo popsáno výše, bude zřejmé, že techniky separace podle vynálezu mohou být použity s širokou řadou konstruktů. Způsob ukázaný na obr. 4 se poněkud podobá způsobům popsaným v PCT mezinárodní patentové přihlášce No. PCT/US97/05701, která již byla zařazena odkazem, a způsobu uvedenému v H. Mario Geysen, a další, Isotope or Mass Encoding of Combinatorial Libraries, Chem. & Biol., díl III, No. io 8, str. 679 - 688, srpen 1996, který byl rovněž již dříve zařazen odkazem. Způsob ukázaný na obr. 4 využívá destičky 28, která obsahuje větší počet jamek 30. Jak je ukázáno, jamky 30 jsou uspořádány do deseti řad a deseti sloupců, které tvoří celkem 100 jamek. Jak je nejlépe vidět na obr. 4A, v každé z jamek je umístěn větší počet pevných nosičů 32. Každý z pevných nosičů 32 již s výhodou obsahuje jednu nebo více propojovacích složek a jednu nebo více složek kódujících ligand. Způsob navázání propojovacích složek je identifikován fyzikálními vlastnostmi pevného nosiče. Jak je ukázáno na obr. 4A, jamka 30 obsahuje pevné nosiče 32 o čtyřech různých hustotách, jak je identifikováno referenčními symboly pi-p4. Další skupina pevných nosičů má velikost, která je podstatně větší než velikost jiných pevných nosičů.

Velikost pevných nosičů 32 se může lišit v závislosti na konkrétním použití a může se pohybovat v rozmezí od přibližně 1 pm do přibližně 500 pm. Každá jamka 30 s výhodou obsahuje dostatečné množství pevných nosičů z každé skupiny, aby bylo zajištěno, že v každé ze skupin se vytvoří úplný soubor ligandů.

Pokud se vrátíme zpět k obr 4, každý sloupec jamek 30 je označen referenčními čísly Ai-A₁₀, a každá z deseti řad je označena referenčními čísly B-i-B₁₀. Tato referenční čísla jsou schematicky uspořádána tak, aby ukazovala konkrétní chemické látky, které se přidávají do každé z jamek. Například v první jamce bude každý

-15··· · z pevných nosičů přijímat složky Ai a B10 jako první dva stavební bloky. V praxi bude tabulka s výhodou upravena tak, aby ukazovala, které chemické látky se přidávají do každé z jamek.

Po provedení syntézy prvních dvou stavebních bloků na pevném 5 nosiči se pevné nosiče převedou do zásobníku 34, kde se důkladně smíchají. Po smíchání se pevné nosiče přítomné v zásobníku 34 obecně stejnoměrně rozdělí do deseti reakčních nádobek 36. Každá reakční nádobka 36 je schematicky označena referenčními čísly Ci až Cw· Tato referenční čísla udávají třetí stavební blok, který se přidá do io společné reakční nádobky 36. Jak je ukázáno v obr. 4B, protože počet reakčních nádobek 36 je roven jedné desetině počtu jamek 30, každá reakční nádobka přijme přibližně desetinásobný počet pevných nosičů 32. I když je příklad ukázán na výchozí matrici 10 x 10, a konečné matrici 1x10, bude zřejmé, že může být použita celá řada matric jiné velikosti. Například koncová matrice může být rovněž rozměru 10x10.

Po syntéze třetího stavebního bloku na každém z pevných nosičů jsou pevné nosiče připravené pro provedení screeningu pro zjištění případných pozitivních výsledků. Typ prováděného screeningu bude záviset na tom, do které skupiny konstrukt patří. Proto budou před screeningem pevné nosiče v rámci každé z reakčních nádobek 36 fyzikálně odděleny do skupin na základě společné fyzikální vlastnosti každé skupiny. Při dělení pevných nosičů 32 do příslušných skupin bude zachováno přiřazení pevných nosičů 32 vzhledem k jejich reakční nádobce 36, takže poslední stavební blok stále zůstává identifikovatelný.

Jako jeden z příkladů pro oddělování pevných nosičů 32 do různých skupin je možno nejprve uvést míchání reakčních nádobek 36 a potom použít zařízení pro vybírání kuliček pro oddělení pevných nosičů větší velikosti, které vystoupí na povrch zbývajících kosntruktů.

Potom může být do každé z reakčních jamek 36 přidán roztok, který způsobí vystoupení konstruktů s nejnižší hustotou k povrchu kapaliny.

Tyto konstrukty mohou být sbírány s povrchu a hustota roztoku může být zvýšena, aby mohly k povrchu vystoupit další konstrukty. Tento postup se opakuje, dokud nejsou všechny konstrukty rozděleny do skupin.

Potom může být proveden screening každé skupiny s použitím testů, které jsou vhodné pro tuto určitou skupinu. Jestliže se získá pozitivní výsledek, může být použita složka kódující ligand na pevném nosiči pro identifikaci prvních dvou stavebních bloků, přičemž třetí stavební blok se zjistí na základě reakční nádobky 36, ze které byl vyjmut. V takovém případě je možno ligand použitím v oboru známých způsobů snadno identifikovat.

Další použití vynálezu je schopnost kombinovat dvě nebo více různých knihoven pro vytvoření dalšího kroku při účinnějším způsobu, přičemž se stále zachovává schopnost identifikovat knihovny, ze kterých jakýkoli daný konstrukt pochází. Například dvě nebo více knihoven může být zkombinováno před krokem screeningu pro dosažení větší účinnosti postupu screeningu, jak je ukázána na obr. 5.

Způsob začíná poskytnutím dvou nebo většího počtu různých knihoven, přičemž pro pohodlí na ilustraci jsou ukázány knihovny A a

N. Způsob, kterým se knihovny odlišují, může být značně rozdílný. Knihovny se například mohou lišit v tom, že všechny stavební bloky a/nebo chemické reakce v jedné knihovně jsou odlišné od další knihovny. Jako další příklad se mohou knihovny odlišovat v tom, že byly vytvořeny v různých časech. Jako ještě další příklad se mohou mezi knihovnami odlišovat přiřazení kódujícího ligandu. V ještě dalším příkladu se mohou knihovny lišit s výjimkou společných podskupin ligandů v rámci knihoven.

Jak je ukázáno v kroku 50, všechny knihovny se spojí a smíchají. Jak je ukázáno v kroku 52, celá knihovna se potom prohledává na pozitivní výsledky. Jestliže se pozoruje jeden nebo více pozitivních výsledků, vyhodnotí se fyzikální vlastnosti pozitivně

testovaných konstruktů pro zjištění knihovny, ze které konstrukty pocházely, jak je ukázáno v kroku 54. Konkrétní knihovna může být potom testována jednotlivě. Tímto způsobem může být proveden jeden počáteční screening s větším počtem knihoven pro snížení času a nezbytné práce nutných pro screening větších počtů konstruktů.

Vynález byl nyní podrobně popsán pro účely jasnosti a snazšího porozumění. Bude však zřejmé, že je v rámci přiložených nároků možno provést i určité změny a modifikace.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Chemická knihovna, vyznačující se tím, že

2. Knihovna podle nároku 1, vyznačující se tím,

15 že fyzikální vlastnosti konstruktů jsou zvoleny ze skupiny velikost, hustota, geometrický tvar, barva, magnetizace, náboj a refrakční index.

3. Knihovna podle nároku 1, vyznačující se tím,

20 že fyzikální vlastnosti je možno roztřídit do kategorií, kde kategorie alespoň jedné ze skupin je odlišná od jiných skupin.

4. Knihovna podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e jednou z kategorií je velikost a druhou kategorií je

25 hustota.

5 že fyzikální vlastností je hustota, přičemž krok oddělení zahrnuje postupné umístění konstruktů do kapalin s různými hustotami a oddělení konstruktů, které vystoupí k povrchu každé kapaliny.

io

38. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, ž e alespoň jednou fyzikální vlastností je velikost, a dále se provede míchání konstruktů pro umožnění konstruktům větší velikosti vystoupin na povrch zbývajících konstruktů.

15

39. Systém chemické knihovny, vyznačující se tím, ž e zahrnuje:

alespoň dvě chemické knihovny, kde každá chemická knihovna obsahuje větší počet pevných nosičů, na které jsou navázány alespoň dva stavební bloky;

20 přičemž pevné nosiče každé knihovny mají jedinečné fyzikální vlastnosti společné pro knihovnu, které umožní identifikaci knihovny, do které každý pevný nosič náleží.

40. Systém podle nároku 39, vyznačující se tím,

25 že fyzikální vlastnosti pevných nosičů jsou zvoleny ze skupiny velikost, geometrický tvar, hustota, barva, magnetizace, náboj a index lomu.

41. Způsob vyhodnocení dvou nebo více odlišných chemických knihoven, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

poskytnou se alespoň dvě odlišné chemické knihovny, kde 5 každá knihovna obsahuje větší počet pevných nosičů, na které jsou navázány alespoň dva stevební bloky, přičemž pevné nosiče každé knihovny mají jedinečné fyzikální vlastnosti společné pro tuto knihovnu;

tyto dvě knihovny se vzájemně spojí za vytvoření kombinované io knihovny;

kombinovaná knihovna se testuje na pozitivní výsledky; a na základě fyzikálních vlastností se identifikuje, do které knihovny nebo knihoven případné pozitivní výsledky patří.

5 pevných nosičů do většího počtu nádobek.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že se dále v těchto jamkách provede syntéza třetího stavebního bloku na každém z pevných nosičů.

28. Způsob vyhodnocování chemické knihovny, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

poskytne se větší počet konstruktů, které lze rozdělit podle 15 typů na základě alespoň jedné společné fyzikální vlastnosti:

konstrukty se na základě svých typů rozdělí do skupin; a pro každou skupinu konstruktů se provede odlišný test.

29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím,

20 že fyzikální vlastností je hustota, přičemž krok dělení se provádí umístěním konstruktů postupně do kapalin s různými hustotami a oddělováním konstruktů, které vystoupí k hladině každé kapaliny.

25

30. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, ž e alespoň jednou fyzikální vlastností je velikost, a dále se provádí míchání konstruktů, aby se umožnilo konstruktům s větší velikostí vystoupit na povrch zbývajících konstruktů.

i

- 26·²*

31. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, ž e každý konstrukt obsahuje větší počet složek včetně propojující složky, složky kódující ligand a složky ligandu.

32. Knihovna podle nároku 31, vyznačující se tím, ž e konstrukty z každé skupiny mají propojující složky, které byly uspořádány v podstatě stejným způsobem, takže společná fyzikální vlastnost každé skupiny je reprezentativní pro způsob, io kterým je možno skupinu testovat.

33. Knihovna podle nároku 32, vyznačující se tím, ž e způsob uspořádání propojujících složek každé skupiny je pro každou skupinu jedinečný.

34. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, ž e každá skupina konstruktů obsahuje v podstatě stejné složky ligandu.

2o

35. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, ž e testy se volí ze skupiny zahrnující testy přímou vazbou, testy na nárůstu a testy v roztoku.

36. Způsob zpracování chemické knihovny, vyznačující 25 s e t í m , ž e zahrnuje následující kroky:

poskytne se větší počet konstruktů, které je možno rozdělit podle typů na základě alespoň jedné společné fyzikální vlastnosti, kde každý typ obsahuje stejný soubor ligandu;

5 ž e se dále volí fyzikální vlastnosti ze skupiny velikost, geometrický tvar, hustota, barva, magnetizace, náboj a index lomu.

22. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, io že fyzikální vlastnosti je možno roztřídit do kategorií, přičemž kategorie jedné ze skupin je odlišná od kategorie ostatních skupin.

23. Systém podle nároku 22, vyznačující se tím,

15 že jednou z kategorií je velikost a druhá kategorie je hustota.

24. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že se dále před krokem syntézy vloží větší počet pevných

20 nosičů do fyzikálně diskrétních umístění takovým způsobem, že každé umístění obsahuje alespoň jeden pevný nosič z každé ze skupin.

25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, 25 že při kroku syntézy se syntetizují dva stavební bloky na každém pevném nosiči, přičemž pevné nosiče jsou v diskrétních umístěních, a dále se provede navázání alespoň jedné složky kódující ligand na pevné nosiče, kde složka kódující ligand je reprezentativní pro tyto dva stavební bloky.

- 29·

26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že se dále po syntéze dvou stavebních bloků provede kombinace pevných nosičů, míšení pevných nosičů a umístění

5 náboj a index lomu.

5 že konstrukty z každé skupiny mají propojující složky, které byly uspořádány v podstatě stejným způsobem.

5. Knihovna podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e každý konstrukt obsahuje pevný nosič, na který je

- 2l· navázán větší počet složek, včetně složky ligandu, alespoň jedné propojující složky a alespoň jedné složky kódující ligand.

5 obsahuje:

větší množství konstruktů, které je možno rozdělit do fyzikálně odlišných skupin, kde konstrukty v každé skupině mají alespoň jednu společnou fyzikální vlastnost, která je fyzikálně odlišná od fyzikálních vlastností konstruktů ve všech ostatních io skupinách, a kde společná fyzikální vlaastnost každé skupiny je reprezentativní pro způsob, kterým je možno skupinu testovat.

6. Knihovna podle nároku 5, vyznačující se tím,

7. Knihovna podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e způsob uspořádání propojujících složek každé skupiny je io pro každou skupinu jedinečný.

8. Knihovna podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e složka ligandu je složena z alespoň dvou stavebních bloků, přičemž každá složka kódující ligand je odečitatelná pro

15 určení jednoho nebo více stavebních bloků na každém pevném nosiči.

9 9 «99 • 9 9 9 »9 · ·· 999 konstrukty se rozdělí na základě svého typu do skupin; a pro každou skupinu konstruktů se provede odlišný test.

37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím,

9 · 9 9 9 ·

9 · 9 · 9

9 99 ·9 · «9 9 9 9 999

9 9 • · ~ 2?^ · · * *

9 9 99

9. Systém pevných nosičů, vyznačující se tím, ž e obsahuje:

20 větší počet pevných nosičů;

chemickou sloučeninu obsahující alespoň dva stavební bloky syntetizované na každém pevném nosiči;

kde pevné nosiče jsou rozdělitelné do fyzikálně odlišných skupin, kde pevné nosiče v každé skupině mají alespoň jednu

25 společnou fyzikální vlastnost, která je fyzikálně odlišná od fyzikálních vlastností pevných nosičů ve všech ostatních skupinách, přičemž společná fyzikální vlastnost každé skupiny je reprezentativní pro způsob, kterým je možno skupinu testovat.

- 22·-’ ·

10. Systém podle nároku 9, vyznačující se tím, ž e fyzikální vlastnosti pevných nosičů jsou zvoleny ze skupiny velikost, geometrie, hustota, barva, magnetizace,

11. Systém podle nároku 9, vyznačující se tím, ž e fyzikální vlastnosti je možno třídit do kategorií, přičemž kategorie jedné ze skupin je odlišná od kategorie ostatních io skupin.

12. Systém podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e jedna z kategorií je velikost a druhá kategorie je hustota.

15

13. Systém podle nároku 9, vyznačující se tím, ž e dále obsahuje alespoň jeden kód založený na ligandu navázaný na každý pevný nosič, který je odečitatelný pro identifikaci alespoň jednoho ze stavebních bloků.

20

14. Systém podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e každá chemická sloučenina obsahuje první, druhý a třetí stavební blok, kde každý kód založený na ligandu je odečitatelný pro identifikaci prvního a druhého stavebního bloku.

15. Systém podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e dále obsahuje alespoň jednu propojující skupinu pro propojení kódu založeného na ligandu s pevným nosičem.

16. Systém podle nároku 15, vyznačující se tím, ž e pevné nosiče každé skupiny mají propojující skupiny, které byly uspořádány v podstatě stejným způsobem.

17. Systém podle nároku 16, vyznačující se tím, ž e způsob uspořádání propojovacích skupin v každé skupině je pro každou skupinu jedinečný.

io

18. Způsob vytvoření chemické knihovny, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

poskytne se větší počet skupin pevných nosičů, kde každá skupina obsahuje větší počet pevných nosičů, které mají alespoň jednu společnou fyzikální vlastnost, která je odlišná od

15 fyzikálních vlastností pevných nosičů v ostatních skupinách;

na každý pevný nosič se naváže alespoň jedna propojující složka, přičemž způsob navázání propojujících složek je jedinečný pro každou skupinu ve srovnání s ostatními skupinami; a

20 na každém pevném nosiči se syntetizuje ligand, takže každá skupina pevných nosičů obdrží stejný soubor ligandů.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, ž e společná fyzikální vlastnost každé skupiny je

25 reprezentativní pro způsob, kterým je možno skupinu testovat.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, ž e způsoby, kterými je možno skupiny testovat, se volí ze skupiny testů přímou vazbou, testů na nárůstu a testů v roztoku.

21. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím,

15 42. Systém podle nároku 41, vyznačující se tím, ž e fyzikální vlastnosti pevných nosičů jsou zvoleny ze skupiny velikost, geometrický tvar, hustota, barva, magnetizace, náboj a index lomu.