CZ2001182A3

CZ2001182A3 - Nokathiacinová antibiotika

Info

Publication number: CZ2001182A3
Application number: CZ2001182A
Authority: CZ
Inventors: John E. Leet; Helen A. Ax; Donald R. Gustavson; Daniel M. Brown; Laura Turner; Kimberly Brown; Wenying Li; Kin S. Lam
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 1998-07-16
Filing date: 1999-07-13
Publication date: 2002-01-16
Also published as: CN1515674A; JP2002520365A; EP1096939A4; CA2337398A1; AU5098199A; TR200003587T2; NO20010250D0; EP1096939A1; CN1242052C; KR20010071913A; HUP0102903A2; CN1133437C; AU745333B2; BR9912042A; NO20010250L; NZ509306A; IL139650A0; ID27775A; US6218398B1; WO2000003722A1

Description

Nokathiacinová antibiotika

Oblast techniky

Tento vynález se týká nových thiazolylpeptidových antibiotik, včetně nokathiacinu I, II a III, farmaceutických prostředků obsahujících tyto sloučeniny a způsobu použití těchto sloučenin léčbě a/nebo prevenci mikrobiálních infekcí.

Dosavadní stav techniky

Hrozba bakteriální rezistence na řadu antimikrobiálních látek, jako jsou beta-laktamová antibiotika, makrolidy, chinolony a vankomycin se stává velkým celosvětovým zdravotnickým problémem (Cohen M.L., Antimicrobial resistence: prognosis for public health, Trends Microbiol. 2_, 422 až 425 (1994)). Nej významnějším problémem v klinické praxi je nárůst incidence kmenů Staphylococcus aureus resistentních na methicilin (MRSA). V současnosti je jedinou účinnou léčbou infekcí mnohočetně resistentních MRSA vankomycin. Na druhou stranu byla v poslední době hlášena nebezpečí izolace vankomycinové resistence v některých MRSA. Další skupinou klinicky významných bakterií polyresistentních na léky, která se v poslední dobou stala hrozbou jsou Enterococci. Hrozící resistence významného patogena vázaného na komunity Streptococcus pneumonie na penicilín a jiné antibakteriální látky se stává rovněž celosvětovým problémem. Polyresistentní kmeny Mycobacterium tuberculosis jsou rozšířeny v několika zemích včetně Spojených států. Hrozba a šíření nosokomiálních infekcí v komunitách získaných patogenů vytváří velkou hrozbu pro celosvětové veřejné zdraví. Existuje naléhavá potřeba nalezeni nových látek pro léčení pacientů infikovaných polyresistentními bakteriemi. Tento vynález vychází vstříc této potřebě.

Jsou popsána nová thiazolylpeptidová antibiotika (označovaná zde jako nokathiacin I, II, III, nebo souborně jako nokathiacin), která mají při nanomolárních hladinách inhibiční aktivitu na Gramm-pozitivní bakterie (například Enterococcus faecium polyresistentní na léky). Nová antibiotika zde popsaná byla izolována z bujónové kultury Nocardia sp. ATCC-202099. Uvádí se, že známý členové thiazolylpeptidové třídy antibiotik, jako je thiostrepton a nosiheptid glykothihexid-α, vykazují in vitro mocnou antimikrobiální aktivitu vůči Gramm-pozitivním bakteriím, bez hlášené aktivity in vivo. nová zde popsaná antibiotika vykazují in vivo účinnost na myším modelu systémové infekce Staphylococccus aureus.

Nokathiacin dříve popsal J.E. Leet a kol. (prozatímní US patentová přihláška sériové číslo 60/093 021 podaná 16. července 1998) obecně vlastněný zde uvedeným přihlašovatelem a Sasaki T. a kol., J. of Antibiotics 51(8), 715 až 721 (publikovaný 25. srpna 1998). Nová nokathiacinová antibiotika tohoto vynálezu jsou příbuzná, ale striktně odlišitelná, od nosiheptidu (Prange T. a kol., J. Am. Chem. Soc., 99, 6418 (1977); Benazet F. a kol., Experientia 36, 414 (1980); Flos H.G. a kol., J. Am. Chem. Soc., 115, 7557 (1993)), glykothiohexidů (Steinberg D.A. a kol., J. Antibiot. £7, 894 (1994); M.D. Lee a kol., J. Antibiot. 47, 894 (1994); US patent č. 5 451 581, 1995) a antibiotika S54832A (US patent č. 4 478 831, 1984).

Podstata vynálezu

Přehled vynálezu

Tento vynález se týká nových sloučenin thiazolylpeptidových antibiotik, nokathiacinu I, II a III. Antibiotika tohoto vynálezu mohou být izolována a čištěna z kmenů Nocardia sp. (kmen WW-12651, ATCC 202099), ze kterých se získávají antibiotika. Vynález zahrnuje všechny farmaceuticky přijatelné deriváty nokathiacinových antibiotik, jako jsou jejich farmaceuticky přijatelné soli a estery.

Využitelnost předmětné sloučeniny při léčbě bakteriálních infekcí je založena na očekávání, že sloučeniny, které inhibují Gramm-pozitivní bakterie in vitro a in vivo, mohou být použita jako antibiotika u savců, a zejména u lidí. Bylo zjištěno, že sloučeniny podle tohoto vynálezu mají antibiotickou aktivitu, zejména při inhibování růstu Gramm-pozitivních bakterií.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje spektrum ultrafialové (UV) absorpce u nokathiacinu I.

Obrázek 2 ukazuje spektrum infračervené (IR) absorpce u nokathiacinu I.

Obrázek 3 ukazuje ¹H-NMR spektrum (500 MHz) nokathiacinu I v deuterovaném dimethylsulfoxidu.

Obrázek 4 ukazuje ¹³C-NMR spektrum (125 MHz) nokathiacinu I v deuterovaném dimethylsulfoxidu.

Obrázek 5 ukazuje spektrum ultrafialové (UV) absorpce u nokathiacinu II.

Obrázek 6 ukazuje spektrum infračervené (IR) absorpce u nokathiacinu II.

Obrázek 7 ukazuje ¹H-NMR spektrum (500 MHz) nokathiacinu II v deuterovaném dimethylsulfoxidu.

Obrázek 8 ukazuje ¹³C-NMR spektrum (125 MHz) nokathiacinu II v deuterovaném dimethylsulfoxidu.

Obrázek 9 ukazuje spektrum ultrafialové (UV) absorpce u nokathiacinu III.

Obrázek 10 ukazuje spektrum infračervené (IR) absorpce u nokathiacinu III.

Obrázek 11 ukazuje ¹H-NMR spektrum (500 MHz) nokathiacinu III v deuterovaném dimethylsulfoxidu.

Obrázek 12 ukazuje ¹³C-NMR spektrum (125 MHz) nokathiacinu III v deuterovaném dimethylsulfoxidu.

Podrobný popis vynálezu

Antibiotické sloučeniny nazvané nokathiacin I, II a III byly nalezeny v programu určeném k nalezeni nových sloučenin produkovaných při fermentaci. Předmětné sloučeniny nokathiacinu byly izolovány z kultivačního fermentačního bujónu Nocardia sp. kmene WW-12651 (ATCC 202099) a byly čištěny extrakcí a chromatografickými postupy, čímž se ······ · ·· · · • · · «« « · ♦ ♦ ♦ dosáhlo pevné látky amorfního charakteru.

Popis mikroorganismu

Mikroorganismem, který může být použit k produkci nokathiacinových antibiotik je kmen Nocardia sp. isolovaný ze vzorků půdy v Novém Mexiku. Kultura (kmen WW-12651) byla uložena 4. března 1998 ve Sbírce kultur amerického typu (ATCC) v Rockville, Maryland, s přístupovým číslem ATCC202099. Uložení v ATCC splňuje veškeré požadavky Budapešťské úmluvy. Zmrazená kultura je udržována rovněž ve sbírce kultur výzkumného institutu farmaceutického Bristol-Myers Squibb na adrese 5 Research Parkway, Wallingford, Connecticut 06492. Rozumí se, že kromě specifických mikroorganismů zde popsaných, mohou být k produkci nokathiacinových antibiotik kultivovány mutanty, jako jsou mutanty vytvořené za použití chemických nebo fyzikálních mutagenů, včetně rentgenového záření atd., a organismy, jejichž genetická podstata byla změněna technikami molekulární biologie.

Mikroskopické studie kmene WW-12651 se provádí na médiu typu ISP (ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 a ISP7) a pozorování se provádí 7., 14. a 21. den inkubace při 28 °C podle doporučení publikace International Streptomyces Project.

Pěstováním na ISP4 médiu se vyvíjí smetanově žlutě zabarvené kolonie. Vzdušná mycelia jsou bílá a mnohočetně fragmentují. Ve světelném mikroskopu, jsou ve vegetativním mycéliu pozorovány řetězce spor, zatímco v rozptýleném, síťovitém mycéliu je pozorováno málo, nebo žádné spory. Pozorovaná morfologie klasifikuje tento mikroorganismus jako typ non-Streptomyces. Světlá hnědooranžová reverzní barva je ····«· · ·· · · · • · · ···· · · · ♦ ····· · · · · · · ·· · · ····♦· · <· · · ······ ·· ··· ··· ·· ·· ··· pozorována na škrobovém agaru se solemi (ISP4). Na žádném z ISP médii se netvoři difúzni pigmenty. Melanoidni pigmenty nejsou tvořeny na tyrosinovém agaru (ISP7) a nejsou detekovány modifikovaným testem tvorby melaninu dle Arai a Mikami.

Aminokyselinovými složkami buněčné stěny jsou alanin, kyselina L-glutamová, kyselina aspartová, a meso-isomer kyseliny diaminopimelové. Sacharidovými složkami buněčné stěny jsou galaktosa, arabinóza a ribóza.

Studie využiti uhlíku ukazují, že glukóza, manitol, sacharóza, xylóza a fruktóza (slabé) jsou, pokud jsou přidány do agaru s anorganickými solemi (ISP9) jako výlučné zdroje uhlíku, využívány k růstu. Arabinosa, inositol, raffinosa a rhamosa nejsou využívány jako výlučné zdroje uhlíku v ISP9 k růstu k růstu. Na základě této charakteristiky a analýzy mykolových kyselin je tento organismus charakterizován jako člen rodu Nocardia.)

Fermentace Nocardia sp. (kmen WW-12651)

Produkce nokathiacinových antibiotik může být prováděna kultivací Nocardia sp. (kmen WW-12651) ve vhodném živném médiu za podmínek zde popsaných, výhodně za submerzních aerobních podmínek, přičemž se odebírají extrakcí aktivních složek vhodným rozpouštědlem z vypěstovaných mycélií, koncentrací roztoků obsahující požadované složky, poté chromatografickým rozdělením koncentrovaného materiálu, čímž se sloučeniny izolují od jiných metabolitů, přítomných rovněž v kultivačním médiu.

Produkce nokathiacinu může být dosaženo za teploty «···«· · · · ·· · ··· ···· · · · · ····· · · · · · · ·· · · ······ · • · · ······ ·· ··· ··· ·· ·· ··· vedoucí k uspokojivému růstu produkujícího organismu, například mezi 16 a 40 °C, avšak výhodné je provádět fermentaci při teplotě 22 až 32 °C. Vodné médium se po dobu nutnou k dovršení produkce nokathiacinu, jak je sledována vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC), obvykle po dobu asi 1 až 6 dnů, na rotační protřepávačce pracující při frekvenci 50 až 300 otáček za minutu, výhodně při frekvenci 150 až 250 otáček za minutu.

Růstu organismů může být odborníkem v oboru dosaženo při použití příslušného média. Zdroje uhlíku zahrnují obecně flukózu, fruktózu, mannosu, maltózu, galaktózu, mannitol a glycerol, jiné sacharidy a cukerné alkoholy, škroby a jiné sacharidy, nebo deriváty sacharidů, jako je dextran, cerelóza, stejně jako komplex živin, jako je ovesná mouka, kukuřičná mouka, proso, kukuřice apod. Přesné množství zdroje uhlíku, který se použije do média, bude záviset z části na ostatních složkách média, ale obvykle se zjišťuje, že množství sacharidů mezi 0,5 až 10 % hmotnostními média je dostačující. Tyto zdroje uhlíku mohou být použity jednotlivě, nebo může být několik takových zdrojů uhlíku kombinováno ve stejném médiu.

Zdroje dusíku zahrnují aminokyseliny, jako jsou arginin, threonin, methionin apod., amonné soli, stejně jako komplexní zdroje, jako jsou kvasničný extrakt, výluh z kukuřice, destilované rozpustné látky (cituji distiller solubles), sójová moučka, moučka ze semen bavlníku, rybí moučka a pod. Různé druhy dusíku mohou být použity samotné nebo v kombinaci v množství od 0,05 do 5 % hmotnostních média.

Mezi živnými anorganickými solemi, které mohou být přidány do živného média jsou obvyklé soli schopné uvolňovat sodíkové, draslíkové, hořčíkové, vápníkové, fosfátové, síranové a uhličitanové ionty a podobně. Zahrnuty jsou rovněž stopové kovy jako je kobalt, mangan, železo, molybden, zinek, kadmium a podobně.

Nocardia sp. (kmen WW-12651) se typicky pěstuje v 500ml baňkách obsahujících 100 ml růstového média sestávajícího z následujících množství látek na 1 L deionizované vody: 20 g škrobu, 5 g glukózy, 3 g N-Z čase, 2 g kvasničného extraktu, 5 g extraktu z rybího masa, 3 g uhličitanu vápenatého. Kultura se nechá tři dny inkubovat při 32 °C na rotační třepačce pracující při frekvenci 250 otáček za minutu. Růstové médium se smíchá se stejným množstvím kryoprotektivního roztoku skládajícího se ze 100 g sacharózy a 200 g glycerolu na 1 L deionizované vody. 4ml části této směsi se převedou do sterilní kryogenní zkumavky (o objemu 5 ml) a zmrazí se v suché lázni ledového acetonu. Takto získané zmrazené růstové kultury se uchovávají při -80 °C.

Očkovací kultury pro produkci nokathiacinových antibiotik se připraví převedení 4 ml zmrazené kultury do 500ml baňky obsahující 100 ml sterilního růstového média se stejným složením jak bylo uvedeno výše. Očkovací kultura se inkubuje tři dny při teplotě 28 až 32 °C v rotační třepačce pracující při 250 otáčkách za minutu. 4 ml této očkovací kultury se naočkuje do 500ml baňky obsahující 100 ml produkčního média, které se skládá z následujících množství látek na 1 L deionizované vody: 10 g HY Yest 412, 20 g glukózy, 10 g Nutrisoy. Toto je výhodné produkční médium, produkční kultura se inkubuje při teplotě 24 až 32 °C v rotační třepačce pracující při frekvenci 180 až 250 otáček za minutu. Optimální produkce nokathiacinových antibiotik se ·· ···· · ·· ·· · • · · · · · · · · · · • · · ·· · · · · · · • · ·· ······ · ·· · ······ • · ·♦ · · ·· ·· · · · · · obvykle dosáhne při 4 až 5 dnech fermentace.

Pokud se sloučeniny nokathiacinu I, II nebo III využívají jako farmaceutické prostředky k léčbě bakteriálních infekcí, mohou být kombinována s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, například rozpouštědly, ředidly a podobně a mohou být podávána orálně ve formách jako tablety, kapsle, disperzibilní prášky, granule nebo suspenze obsahující například od asi 0,05 do 5 % suspendující látky, sirupů obsahující například od asi 10 do 50 % cukru a elixíry obsahující například od asi 20 do 50 % ethanolu a podobně, nebo parenterálně ve formách sterilních injekčních roztoků nebo suspenzí obsahujících například od asi 0,05 do 5 % suspendující látky v izotonickém médiu. Takové farmaceutické přípravky mohou obsahovat například od asi 0,05 do asi 90 % aktivní složky v kombinaci s nosičem, obvykleji mezi 5 až 60 % hmotnostními.

Účinná dávka použité aktivní složky může být různá v závislosti na určité použité sloučenině, způsobu podání a intenzitě léčených stavů. Obecně však je dosaženo uspokojivých výsledků, pokud se sloučeniny podle tohoto vynálezu podávají v denní dávce od asi 0,5 do asi 500 mg/kg hmotnosti živočicha, výhodně se podávají v rozdělených dávkách dvakrát až čtyřikrát denně, nebo ve formě s pozvolným uvolňováním. U většiny velkých savců je denní dávka od asi 1 do 100 mg, výhodně od 2 do 80 mg. Formy dávek vhodné pro vnitřní použití obsahují od asi 0,5 do 500 mg aktivní sloučeniny v těsné příměsi s pevným nebo kapalným farmaceuticky přijatelným nosičem. Tento dávkovači režim může být upraven, aby se zajistila optimální terapeutická odpověď. Denně může být například podáváno několik

	• ·	··· ·	•	··			• ·
•	•	•	• · ·		•	•	•	• ·
•	•	• ··	• ·		•	•	•
•	•	•	• ·		•	•	•
	• ·	···	• · ·	··			• ·	• 9

rozdělených dávek, nebo může být dávka proporcionálně redukována, jak je indikováno naléhavosti terapeutické situace.

Tyto aktivní sloučeniny mohou být podávány orální, stejně jako intravenózní, intramuskulární nebo subkutánní cestou. Pevné nosiče zahrnují škrob, laktózu, fosforečnan vápenatý, mikrokrystalickou celulózu, sacharózu a kaolin, zatímco kapalné nosiče zahrnují sterilní vodu, polyethylenglykoly, neionizující surfaktanty a jedlé oleje, jako je kukuřičný olej, olej s podzemnice olejně a sezamový olej, jak to odpovídá povaze aktivní složky a požadované určité cestě podání. Výhodně mohou být zahrnuty pomocné látky obvykle používané při přípravě farmaceutických prostředků, jako jsou příchutě, barviva, konzervační činidla a antioxydanty, například vitamin E, kyselina askorbová, BHT a BHA.

Tyto aktivní sloučeniny mohou být také podávány parenterálně nebo intraperitoneálně. Roztoky nebo suspenze těchto aktivních sloučenin, jako volných baží nebo farmakologicky přijatelných solí mohou být připraveny ve vodě, vhodně smíchané se surfaktantem, jako je hydroxypropylcelulóza. Disperzní roztoky mohou být připraveny rovněž v glycerolu, kapalných polyethylenglykolech a jejich směsí v olejích. Za běžných podmínek uchovávání a používání obsahují tyto přípravky konzervační látku, aby se zabránilo růstu mikroorganismů.

Farmaceutické formy vhodné pro injekční použití zahrnují sterilní vodné roztoky a disperzní roztoky. Ve všech případech musí být forma sterilní a musí být natolik tekutá, aby byla snadno ovladatelná injekční stříkačkou.

······ · ·· »· ··* ···· ··· ····· ··· · · • · · ······ ·· ··· ··· ·· ·· ···

Musí být stabilní za podmínek výroby a uchovávání a musí být chráněna proti kontaminačnímu působení mikroorganismů jako jsou baktérie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní médium obsahující například vodu, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalné polyethylenglykoly), jejich vhodné směsi a rostlinné oleje.

Pojem farmaceuticky přijatelná sůl zahrnuje solváty, hydráty, adiční soli s kyselinou a kvartérní soli. Adiční soli s kyselinou se vytvoří ze sloučenin nokathiacinu I, II nebo III majících bazický dusík a z farmaceuticky přijatelných anorganických nebo organických kyselin, zahrnujících kyselinu chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, fosforečnou, methansulfonovou, octovou, citrónovou, jablečnou, jantarovou, fumarovou, maleovou, sulfamovou nebo vinnou. Kvartérní soli se tvoří z bazických sloučenin nokathiacinu I, II nebo III a alkyl- nebo arylalkylhalidu, výhodně z methyl- nebo benzylbromidu.

Rozumí se, sloučeniny nokathiacinu podle tohoto vynálezu zde zahrnují různé stereoisomery, které mohou existovat.

Popis postupů testu MREF

Biologická aktivita antibiotických sloučenin nokathiacinu byla zjištěna, když byl surový extrakt připravený s produkující Nocardia sp. (ATCC 202099) testován ve vysokoprůtokovém screeningovém testu. Test je založen na inhibici Enterococcus faecium kmene A28152, naočkovaného na agarovém růstovém médiu. Tento kmen E. faecium je rezistentní vůči mnoha antibiotikům včetně penicilinu G, vankomycinu, ciprofloxacinu, teicoplaninu, tetracyklinu,

	* a	·
a	•		• · «	•	4 9>	• ·
•	e	• »4	• ·	•	• «
•	•	•	• ·	•	t ·
	• ·	···	U« »·		• ·	• 4

streptomycinu, gentamycinu, erythromycinu, klindamycinu a rifampinu. Je citlivý na chloramfenikol a v menším rozsahu na imipen. Odtud název MREF který pochází ze slov Multi-drug Resístant E. faecium.

E. faecium kmene A28152 se naočkuje na živné médium infuzního bujónu z mozku a srdce a kultivuje se až do logaritmické fáze růstu při 37 °C za protřepávání. Periodicky se odebírají 0,2ml alikvoty kultury a pipetují se do jamky 96-jamkové plastické čiré plotny s plochým dnem. Poté se měří optická hustota při 595 nm. Když je optická hustota v rozmezí 0,2 až 0,4, bakterie se odeberou desetiminutovým odstředěním při 1000 x g. Buněčné pelety se resuspendují v růstovém médiu Mueller-Hinton II. Poté se buněčná suspenze naočkuje při teplotě 48 °C do tekutého růstového média Mueller-Hinton II obsahujícího 1 % agaru Difco, tak že naočkovaná buněčná hustota je 1 x 10⁷buněk/ml. 25 ml buněčné suspenze se nalije do sterilní pravoúhlé plotny. Dokud je médium ještě tekuté, umístí se na vršek plotny speciální sterilní plastikové víčko, které pasuje na plotnu. Toto víčko obsahuje speciální plastikové čepy nastavené na formát 8 x 12. Médium se nechá 15 minut gelovatět za teploty místnosti, poté se víčko s čepy odstraní. Tam, kde se čepy dotýkaly povrchu tekutého média, zůstávají ve zgelovatělém médiu malé konkávní otisky. Ty slouží jako zóny pro uložení vzorků.

Vzorky, které mají být v testu testovány se rozpustí na koncentraci 300 μιη ve 100% dimethylsulfoxidu (DMSO) . Do jednotlivých zón pro uložení vzorků na plotnách se aplikuje objem 6 μΐ od každého vzorku. Po uložení vzorků se plotna inkubuje 24 hodin při 37 °C. Inhibice růstu se detekuje jako jasná cirkulární zóna obklopující zónu vzorku. Na vnější ······ ? ·· ·♦ * ··· · · 9 · ···· • · · ·· · 9 · · · · straně této zóny, kde je růst baktérií nedotčen je agarové médium kvůli růstu bakterií zakalené. Samotný dimethylsulfoxid nezpůsobuje za těchto podmínek žádnou detekovatelnou inhibici růstu. V každé plotně jsou přítomny vzorky chloramfenikolu a dimethylsulfoxidu jako pozitivní a negativní kontrola.

Materiály použité pro biogramy chromatografie na tenké vrstvě (TLC) se pro použití k identifikaci aktivní(ch) látky(ek). přítomné(ých) v produkující kultuře Nocardia sp. (ATCC 202099) zahrnují misky pro biologické testování od společnosti Nunc Nalge International používané pro testy agarové difúze. Misky měří 243 x 243 x 18 mm a poskytují 530 cm² plochy pro mikrobiální kulturu. Plotny pro chromatografii na tenké vrstvě se připojí k misce pro biologické testování a poté se pomalu nalije překrývající vrstva agaru tak, že pokrývá celou plotnu pro chromatografii na tenké vrstvě a dno misky pro biologické testování. Agarová překrývající vrstva se skládá z 200 ml agarového média Mueller-Hinton II- doplněného o 0,5 % defibrinované ovčí krve a kmen A 28152, kmen Enterococcus faecium resistentní na léky, v hustotě 1 x 10⁶ buněk/ml. Jakmile se ochladí, inkubuje se biogram chromatografie na tenké vrstvě přibližně po 18 hodin při teplotě místnosti. Po inkubaci se krevní agar zbarví do rezavě hnědé barvy působením ahemolytické aktivity kmene Enterococcus. Pokud sloučenina inhibuje růst tohoto kmene, lokalizuje se dobře viditelná červená zóna vyvolaná inhibici hemolýzy. Tento postup umožňuje korelaci žádoucí biologické aktivity s odpovídajícími chromatografickými frakcemi, což urychluje jak identifikaci aktivních látek tak jejich isolaci.

Obměna tohoto postupu pro použití v MREF testu zahrnuje ······ * <* · · · • · · · · e · ··· • · · · · ·♦ · · · testování dvou odlišných kontrastních činidel. Jedním je 2,3, 5-trifenyl-2H-tetrazolyumchlorid OR (0,003% konečné ředění) dodané do 200 ml Todd-Hewittova agarového média. Druhým je 0,5% ovčí krev dodaná do 200 ml agarového média Mueller-Hinton II. Oba postupy zobrazují určité zóny inhibice růstu, avšak u krevního agarového média je rozlišitelnost lepší a inkubační doba kratší. Byly testovány různé buněčné inolkuláty avšak nejlepčí výsledky dávala hustota 1 x 10⁶ buněk/ml.

Izolace a strukturální vlastnosti

Čištění nokathiacinových antibiotik z fermentací Nocardia sp. se sleduje za použití testu agarové difúze s Enterococcus faecium polyrezistentním na léky (MREF). Provádí se extrakce ethylacetátem s následnou frakcionací rozpouštědla chromatografií na Sephadex LH 20 a/nebo silikagelu. Těmito kroky se získá komplex nokathiacinových antibiotik, který vykazuje aktivitu v testu agarové difúze MREF. Výsledné čištění jednotlivých nokathiacinových antibiotik se provede preparativní HPLC na normální nebo reverzní fázi. Spektrální data naznačují, že sloučeniny náleží do thiazolylpeptidové třídy antibiotik. Struktury nokathiacinu I, II a III byly zjištěny za použití studií 2D NMR a dat pozitivní elekrosprejové ionizace HRMS a MS/MS.

♦ ··· • · ·· • · ·· • · ·· • ·· ·

• · · · • · ·· hydroxylová skupina (u nokathiacinu II) ;

R je vodíku (u nokathiacinu I) nebo atom nebo je atom vodíku; a je hydroxylová skupina (u nokathiacinu III).

Obecné metody

Materiály

Hexany, chloroform (bezvodý ACS stupeň) a methanol, acetonitril (bezvodý HPLC stupeň) se získají od společnosti Fisher Scientific Company. Tato rozpouštědla se nečistí ani neredestiluji. Voda použitá v chromatografických experimentech odpovídá domácí dejonizované vodě filtrované přes reagentí stupňový systém s náplní Millipor 4 (10 ΜΩ 16 *····· · ·· · · ··· · · · · · ····♦ · · · ·

Milli-Q water). Sephadex LH-20 byl z Pharmacia LKB, Uppsala, Švédsko. Dicalite (rozsivková zemina) byla vyrobena společnosti Grefco Minerals, Torrance, Kalifornie.

LiChroprep Si 60, 25-40 μιη byl od EM Separations, New Jersey, a pobočky E. Měrek, Německo v USA.

Analytická chromatografie na tenké vrstvě (TLC)

Silikagelový GHLF o jedné plotně, kde chromatochrafické plotny jsou předem potažené tenkou vrstvou (značené 10 x 20 cm, 250 pm), byly zakoupeny od Analtech, lne., Newark, Deleware. Frakce se označí za použití mikrolitrových Microcaps (jednorázových pipet) velikosti 2 a plotny se vyvolají v nádobě ekvilibrované směsí chloroformu a methanolu v objemovém poměru 9:1. Komponenty výsledného chromatogramu se zviditelní ultrafialovým zářením o dlouhé vlnové délce a/nebo sprej ováním síranu ceřičitého v kyselině sírové a následným dlouhým zahříváním.

Analytická HPLC

Čištění nokathiacinových antibiotik se pozoruje HPLC analýzou na koloně APEX 5 μ ODS, o vnitřním průměru 4,6 mm a délce 15 cm (výrobek Jones Chromatography lne., Lakewood, Colorado). Analýzy se provádí na kapalinovém chromatografu Hewlett Packard série 1100, s detekcí v ultrafialovém světle při 254 nm. Používá se gradientový systém acetonitrilu a 0,01M pufr fosforečnanu draselného o pH 3,5, podle metody kterou popsali D.J. Hook a kol. (J. Chromatogr. 385, 99 (1987). Eluační činidlo se prohání rychlostí 1,2 ml/min.

Preparativní HPLC

Pro sestavení systému preparativní HPLC se použijí následující komponenty: Beckman Instruments lne. (Somerset; New Jersey); Beckman Systém Gold 123 Programmable Modul; Beckman 166 Programmable Detector Modul; software Beckman Systém Gold Version 711U; IBM PS/2 55SX Systém Controller; YMC lne. (Wilmington; Severní Karolina). Kolona preparativní HPLC (normální fáze) : PVA-Sil o velikosti zrna 5 μπι, velikosti póru 12 nm, vnitřním průměru 20 mm, délce 150 mm, zaplněná Diol o velikosti zrna 25 μπι, velikosti póru 12 nm, vnitřním průměru 10 mm, délce 10 mm, zasazeným v ochranném modulu); mobilní fází je směs chloroformu a methanolu v gradientu, rychlost průtoku 10 ml/min. Detekce ultrafialovým zářením při 360 nm. Alternativní kolona (reverzní fáze): YMC lne. ODS-AQ o velikosti zrna 5 μιη, velikosti póru 12 nm, vnitřním průměru 20 mm, délce 150 mm, zaplněná ODS-A o velikosti zrna 25 μιη, velikosti póru 12 nm, vnitřním průměru 10 mm, délce 10 mm, zasazeným v ochranném modulu); mobilní fází je 0,lM směs octanu amonného a acetonitrilu v gradientu; rychlost průtoku 10 ml/min. Detekce ultrafialovým zářením při 360 nm.

Analytické přístroje

Měření nízko rozlišovací hmotnostní spektrometrie se provádí na jednoduchém čtyřpólovém hmotnostním spektrometru Finnigan SSQ 7000, za použití módu positivní elektrosprejové ionizace. Měření MS/MS se provádí v módu positivní elektrosprejové ionizace na tandemovém čtyřpólovém hmotnostním spektrometru Finnigan TSQ 7000, za použití argonu jako kolizního plynu nebo na ionty lapajícím hmotnostním spektrometru Finnigan LCQ. Vysoce rozlišené data ······ · ·· · · • · · · · · · · ♦ · • · ··· · ♦ · · · * · ♦ ····· ·· ··· ··· «· ·· ··· hmotnostní spektrometrie se získají pomocí magneticko sektorového hmotnostního spektrometru Finnigan MAT 900, v módu positivní elektrosprejové ionizace, ppg reference. Ultrafialová spektra se získají za použití diodového (array) spektrofotometru Hewlett Packard 8452 A. Měření infračervené absorpce se provádí na spektrometru Perkin Elmer 2000 Fourier Transform. Spektra ¹H-NMR a ¹³C-NMR se získají na přístroji Bruker DRX-500 pracujícím při 500,13 a 125,76 MHz za použití mikrosondy Nalorac. Chemické posuny jsou uváděny v částicích na 1 milion (ppm) ve vztahu k rozpouštědle (DMSO-dc δ_Η 2,49; 5_C 39,6). CD data byla zaznamenána na spektropolarimetru Jasco J-720.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady popisují přípravu nokathiacinových antibiotik a jejich biologické vlastnosti. Mohou být uskutečněny jejich rozumné obměny, jako jsou obměny, které by napadly odborníka v oboru, aniž by tím byl opuštěn rozsah tohoto vynálezu.

Fermentace a čištění nokathiacinu I a II

Příprava nokathiacinu I a II fermentací

Ze zmrazené zásobní vegetativní kultury Nocardia sp.

ATCC 202099 se naočkují 4 ml do 100 ml očkovacího média sestávajícího se z následujících látek na 1 litr deionizované vody: 20 g škrobu, 5 g glukózy, 3 g N-Z čase, 2 g kvasničného extraktu, 5 g extraktu z rybího masa a 3 g uhličitanu vápenatého, do 500ml baňky. Kultura se inkubuje 3 dny při 32 °C v rotační třepačce pracující při frekvenci 250 otáček za minutu. 4 ml výsledné kultury se použijí

k naočkování každé ze dvou set 500ml baněk obsahujících 100 ml produkčního média sestávajícího se z následujících látek na 1 litr deionizované vody: 20 g glukózy, 5 g peptonu, 10 kvasinek Red Star a 5 g allophositu. Produkční kultury se inkubují 5 dní při 32 °C v rotační třepačce pracující při frekvenci 250 otáček za minutu. Poté se kultury zpracují k získání nokathiacinu I a II.

Příklad 1

Příprava surového extraktu A

L fermentačního bujónu Nocardia sp. ATCC 202099 (celý bujón včetně mycelií) se za mohutného míchání extrahuje po dobu 1/2 h asi 8 L ethylacetatu. Bifázní směs se smíchá s asi 3 L (1 kg) dicalitu^R a vakuovou filtrací se filtruje za použití velké nálevky Coors Buchner (vnitřní průměr 27 cm, vnější průměr 28,5 cm, hloubka 9 cm). Odebere se světle žlutá ethylacetatová vrstva a odpaří se ve vakuu do sucha v rotační sušičce, čím se získá přibližně 7,2 g odparku A.

Frakce odparku A kapalina-kapalina.

7,2 g odparku A se rozpustí ve 100 ml 10% roztoku vody v methanolu. Roztok se převede do dělicí nálevky a čtyřikrát se extrahuje stejným objemem hexanu, hexanová vrstva se odstraní. Vodná methanolová fáze se zředí přidáním 38 ml vody na 35% roztok vody v methanolu a třikrát se extrahuje stejným objemem chloroformu. Chloroform se předem nasytí 35% roztokem vody v methanolu. Hexan, chloroform a vodné methanolové extrakty se ve vakuu v rotační sušičce odpaří do sucha. Nokathiacinová antibiotika se primárně koncentrují ·*···· · ·♦ · · « * · ··· · · ·· ·· · ······ ·· ··· ·ύ· *· ·· «·· v chloroformové frakci, 1,3 g odparku B.

Chromatografie odparku B na Sephadexu LH-20

1,3 g se rozpustí v 10 ml směsi chloroformu a methanolu v poměru 1:1a přidá se do kolony Glenco 3 x 1000 cm naplněné 100 g Sephadexu LH-20 ve směsi chloroformu a methanolu v poměru 1 : 1. Po uběhnutí 75 ml, frakce z nichž každá měří 8 až 10 ml se odeberou při rychlosti průtoku 2 až 3 ml/min. Frakce se konsolidují na základě profilů kapalinové chromatografie na tenké vrstvě na silikagelu (směs chloroformu a methanolu v poměru 9:1, ultrafialové záření o dlouhých vlnových délkách a/nebo sprej síranu ceřičitého). Tímto způsobem se detekuje žlutě fluoreskující komplex nokathiacinových antibiotik ve frakcích 10 až 15. Frakce se kombinují a odpaří se do sucha, 284 mg odparku C.

Vakuová kapalinová chromatografie odparku C na silikagelu

Frakce obohacená nokathiacinovými antibiotiky (odparek C) se předem naadsorbuje na 2 g Měrek LiChroprep Silika Gel 60 (25 až 40 μιη) a přidá se do fritted filtrační nálevky o rozměrech 2,5 x 15 cm naplněné z poloviny tímto adsorbentem. Eluování za pomocí domácího vakua se zpočátku provádí 100 ml směsi hexanu a chloroformu v poměru 1:1, poté chloroformem a poté směsmi methanolu a chloroformu, se zvyšujícím se procentuálním zastoupením methanolu v chloroformu (například 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5 15 a 25 % methanolu v chloroformu) o objemu každé 100 ml. Frakce se konsolidují na základě profilů kapalinové chromatografie na tenké vrstvě na silikagelu (směs chloroformu a methanolu v poměru 9 : 1, ultrafialové záření o dlouhých vlnových délkách a/nebo sprej síranu ceřičitého). Tímto je nokathiacin II detekován ve _ 91 — ♦· ♦··· · ·· ♦· zi · · · ····♦· ····· ····· • · · ♦ ······ • · · · · · · · • · · · · ····· · · frakcích s 15 až 25 % methanolu v chloroformu. Tyto frakce se kombinují a odpaří se do sucha (230 mg odparku D nokathiacin I, 49 mg odparku E - nokathiacin II).

Izolace nokathiacinu I a II

Odparek D a E se dále čistí za použití specifikovaného preparátivního HPLC systému Beckman Systém Gold. Typická velikost injekce vzorku je 25 až 50 mg/50 až 100 μΐ dimethylsulfoxidu. Eluování se započne s chloroformem s předprogramovaným konkávním gradientem ke směsi chloroformu a methanolu v poměru 8 : 2 po 30-minutovém intervalu. Rychlost toku při eluování činí 10 ml/min.

Detekce (UV) se provádí při 290 nm. Tímto způsobem získáme nokathiacin I (pík v 17 minutě, celkový výtěžek 56 mg) a nokathiacin II (pík v 19,5 minutě, celkový výtěžek 6,7 mg).

Schéma čištění

Následující schéma zobrazuje čištění nokathiacinových antibiotik.

Čištění nokathiacinů I a II (Přiklad 1, z fermentace ve třepačce)

Fermentační bujón (Nocardia sp.) voda ethyl

Celý bujónový extrakt Filtr acetát (zbytek A)

Frakce kapalná-kapalná

Hexan

CHCI ₃ (zbytek B)

Methanol : voda 9

Methanol vodný r. methanolu voda 65 : 35

Kolona Sephadex LH-20 eluováni CHCL₃ : methanol 1 : 1 zbytek C

Silikagel VLC (Měrek LiChronoprep 25-40 μ) krokový gradient CHCL₃ : methanol zbytky D, E

Prep. HPLC (YMC PVA-sil 5μ, 20 x 150 mm)

CHCL₃ —> 20% methanol v CHCL₃konkávni aradient

Nokathiacin I a II

Fyzikálně chemické vlastnosti nokathiacinu I

Popis:

světle žlutá amorfní pevná látka

Molekulární vzorec:	C61H60N14O18S5
Molekulová hmotnost:	1436
Hmotnostní spektrum:	HR-ESIMS [M+H]⁺ m/z 1437,285

ESI-MS/MS fragmentace iontů: m/z

1266, 1248, 1221, 1204, 1186, 788	1154,
Infračervené spektrum: Hlavní	. infračervený pás	(cm^-1)	3392
3108,	2932,	1740,	1721,	1694,	1670,
1640,	1533,	1478,	1420,	1384,	1320,
1250,	1207,	1128,	1091,	1037,	1014,

751

Ultrafialové spektrum:

Xmax (MeOH) 222, 290, 364 nm (log ε

4,89, 4,52, 4,17)

Cirkulární dichroismus:

CD Inm (Δε) (MeOH) 212 (+34,1), 239 (-50,5), 267 (+20,8), 307 (-8,7),

364 (+5, 5)

HPLC (Rt):

25,6 min; (C18; acetonitril - 0.01M pufr fosforečnanu draselného o pH

3,5 gradient (J. Chromatogr. 385, (1997)) ^XH-NMR:

Zjištěné chemické posuny (ve vztahu • · · · · ·

k signálu DMS0-d6 δ 2,49):

δ 10,05 (1H, s), 9,07 (1H, s), 8,57

(1H,	d, J = 8,0 Hz) , 8,51	(1H, s),
8,50	(1H, s), 8,24 (1H, s)	, 8,07
(1H,	široký s), 7,89 (1H,	d, J =
11,2	Hz), 7,86 (2H, s), 7,	70 (1H,
d, J	=8,4 Hz), 7,61 (1H,	široký
s) ,	7,34 (2H, m), 7,16 (1H	:, d, J =
8,9	Hz), 6,40 (1H, s), 5,9	8 (1H, d,
J =	12,0 Hz), 5,77 (1H, s)	, 5,73
(1H,	dd, J = 10,9, 4,4 Hz)	, 5,70
(1H,	d, J = 8,7 Hz), 5,22	(1H, m),
5,02	(1H, d, J = 11,4 Hz),	4, 94
(1H,	d, J = 3,7 Hz), 4,75	(1H, d, J
= 10	,2 Hz), 4,51 (1H, d, 0	’ = 11,0.
Hz) ,	4,29 (1H, d, J = 9,6	Hz), 4,19
(1H,	m), 4,13 (1H, d, J =	10,1 Hz),
4,00	(1H, d, J = 9,5 Hz) ,	3,88 (3H,

s) , 3,78 (1H, široký d, J = 5,9

Hz) ,	2,52	(6H, s), 2,49	(1	H, m),
2,11	(1H,	široký s), 1,2	>9	(3H, s),
1, 95	(1H,	m) , 1,95 (1H,	m)	, 1,81
(1H,	d, J	= 13, 9 Hz) , 1,	43	(3H, s),
1,21	(1H,	m) , 1,16 (3H,	s,	široký),
0,59	(3H,	d, J = 6,3 Hz)

¹³c

-NMR:

Zjištěné chemické posuny (ve vztahu k signálu DMSO-d6 δ 39,6):

δ 171,8, 168,1, 167,7, 167,4,

167,0, 165,2, 164,0, 163,1, 161,5,

161	,1, 160,	5,	160,3,	159,1,	158,	6,
154	,6, 151,	9,	149,7,	149,6,	148,	8,
145	,8, 142,	5,	135,3,	135,0,	134,	5,
129	,9, 128,	1,	127,0,	126,3,	125,	5,
124	,0, 123,	1,	119,8,	119,4,	112,	7,
111	,2, 109,	7,	103,7,	95,1,	79,3,
70,	6, 68,4,	67	,5, 66,	1, 65,	1, 64	,5,
63,	3, 56,1,	55	,5, 50,	2, 49,	8, 44	,4,
40,	0, 30,5,	18	,0, 13,	1

Fyzikálně chemické vlastnosti nokathiacinu II

Popis:	světle žlutá amorfní pevná látka
Molekulární vzorec:	C61H60N14O17S5
Molekulová hmotnost:	1420
Hmotnostní spektrum:	HR-ESIMS [M+H]⁺ m/z 1421,297 ESI-MS/MS fragmentace iontů: m/z 1250, 1206, 1188, 1170, 1156, 1138, 788
Infračervené spektrum:	Hlavní infračervený pás (cm^-1) 3387, 1725, 1656, 1534, 1478, 1423, 1318, 1249, 1192, 1087, 1014, 886, 793, 751
Ultrafialové spektrum:	Xmax (MeOH) 220, 295, 364 nm (log ε 5,01, 4,67, 4,36)

Cirkulárni dichroismus: CD Xnm (Δε) (MeOH) 211 (+41,5), 235 ·· ···» · 9« ·· • · · · · · · 9 · ····· · · · · · • · · · · · · · ·· »♦· ··· «· ·· (-56,1), 258 (+21,0), 277 (+13,4),

307 (-10,0), 364 (+5, 6)

HPLC (Rt):

¹H-NMR:

21,1 min; (C18; acetonitril - 0.01M pufr fosforečnanu draselného o pH

3,5 gradient (J. Chromatogr. 385, (1997))

Zjištěné chemické posuny (ve vztahu k signálu DMSO-d6 δ 2,49):

δ 9,10 (1H, s), 8,59 (1H, d, J =

8,5 Hz), 8,51 (1H, s), 8,45 (1H, s), 8,22 (1H, s), 8,15 (1H, s), 8,05 (1H, široký s), 7,69 (1H, široký s), 7,66 (1H, s) , 7,51 (1H,

d, J	=8,3 Hz), 7,47 (1H, s), 7	,30
(1H,	s), 7,25 (1H, dd, J = 8,0,	7,2
Hz) ,	7,12 (1H, d, J = 7,1 Hz),	7,02
(1H,	d, J = 8,4 Hz), 6,49 (1H,	s) ,
6,03	(1H, d, J = 12,1 Hz) , 5,78
(1H,	m), 5,70 (1H, d, J = 8,6),
5,66	(1H, s) , 5,30 (1H, d, J =	7,7
Hz) ,	5,00 (1H, d, J = 13,0 Hz) ,
4,98	(1H, d, J = 4,8 Hz), 4,83	(1H,
d, J	= 11,2 Hz), 4,72 (1H, m),	4,37
(1H,	d, J = 9,6 Hz), 4,23 (1H,	m) ,
4,11	(1H, d, J = 9,9 Hz), 4,03	(1H,
d, J	=7,7 Hz), 3,89 (3H, s), 3	,75
(1H,	m), 2,49 (6H, s), 2,14 (1H	9
m), í	>,01 (3H, s), 1,94 (1H, m),
1,79	(1H, d, J = 14,2 Hz) , 1,40
(3H,	s), 1,23 (1H, m), 1,04 (3H	9 S 9

• *	• 9	9 *«
9	9	9		•	9 <9	• ·
•	9	• ··	• ·	•	• a
•	•
•	•	•	• 9	•	• ·
• 9		99«	·· · * ·			• a

široký), 0,54 (3H, d, J = 6,5 Hz) ¹³C-NMR:

Zjištěné chemické posuny (ve vztahu k signálu DMSO-d6 δ 39,6):

δ 172,0, 168,2, 167,1, 167,0,

165,5,	165,	3,	163,2,	162,9,	161,	6,
161,2,	160,	6,	160,1,	158,7,	156,	3,
149,9,	149,	o,	148,2,	145,9,	138,	8,
136,9,	134,	3,	128,8,	127,9,	127,	2,
126, 6,	125,	6,	125,2,	124,7,	124,	1,
123,9,	122,	8,	117,9,	116,3,	115,	6,
109,9,	101,	9,	95,1,	79,0, 7	0,7,
68,4,	67,6,	66	,3, 66	,0, 64,	0, 62	,5
56,1,	55,1,	51	,4, 50	,6, 44,	4, 40	,5
30,6,	18,1,	18	,0, 13	,0

Biologické posouzení nokathiacinových antibiotik

Příklad 2

Antibiotická aktivita nokathiacinu I a II

Za účelem demonstrace antimikrobiálních vlasností nokathiacinu, se za použití běžných testů ředěným bujónem (metody sériového ředění bujónu za použití živného bujónu (Difco)) , získají minimální inhibiční koncentrace (MIK) nokathiacinových antibiotik u různých bakterií.

získané výsledky jsou uvedeny níže v tabulce 1 a demonstrují, že nokathiaciny mají využití při léčbě bakteriálních infekcí.

Tabulka 1 • ·es • · ·· · « · *» « organismus

MIK ^g/ml) MIK (gg/ml) kmen č. nokathiacin I nokathiacin I

Streptococcus pnaeumoniae	Ά9585	0, 001	0, 015
Streptococcus pnaeumoniae/středně citlivý na penicilín	A27881	0,001	0,015
Streptococcus pnaeumoniae/ penicilín resistentní	A28272	0,001	0,015
Streptococcus pyogenes	A9604	0, 001	0,125
Enterococcus faecalis	A20688	0,03	0,5
Enterococcus faecalis	A27519	0,03	0,5
Enterococcus faecalis + 50% telecí sérum	A20688	0,25	0,5
Enterococcus	A24885	0,015	0,5

faecium

Enterococcus faecium/thiostrepton resistentní 10 gg/ml)	SC15829	0,125	0,5
Enterococcus avium	A27456	0,015	0,5
Staphylococcus aureus	A9537	0,001	0, 06
Staphylococcus aureus/p-laktamasa pozitivní	A15090	0, 007	0,5
Staphylococcus aureus + 50% telecí sérum	A15090	0,015	0,5
Staphylococcus' aureus/QC/ ATCC č. 29213	A24407	0,007	0,5
Staphylococcus aureus/hetero methicilin resistentní	A27218	'0,003	0,5
Staphylococcus	A27218	0,007	0,5

aureus + 50% telecí sérum

4' *

Staphylococcus aureus/homo methicilin resistentní	A27223	0,003	0,125
Staphylococcus aureus + 50% telecí sérum	A27223	0,001	0,125
Micrococcus leteus	A9852	0,003	0,125
Bacillus subtilis	A9506A	0,001	0,125
Staphylococcus epidermidis	A24548	0,003	0,125
Staphylococcus haemolyticus	A27298	0,03	0,25
Escherichia coli	A15119	>128	>128
Escherichia coli	A22292	>128	>128
Escherichia coli/ AcrA::Kan	A28901	>128	>128
Salmonela enteritidis	A9531	>128	>12 8
Moraxela catarrhalis/p-laktamasa	A22344	0,06	0,125

pozitivní

Moraxela catar- rhalis/p-laktamasa pozitivní	A25409	0,06	0,12f
Haemophilus influenzae/ β-laktamasa negativní	A20191	>128
Haemophilus influenzae/ β-laktamasa negativní	A20183	>128
Haemophilus influenzae/ β-laktamasa pozitivní	A21515	>128
Salmonela/WT	A27207	>128	>128
Salmonela/RE	A27208	>128	>128

Příklad 3

Antibiotická aktivita nokathiacinu I in vivo na modelu systémové infekce Staphylococcus aureus

Antibiotická aktivita nokathiacinu I se in vivo posoudí na modelu systémové infekce za použití samic myší ICR. Zvířata se intraperitoneálně infikují kuturou Staphylococcus ······ * ·» ·· · *·· · · · · ·«·· í t*·*·· í ; :« i ; í » · · ·»«»·» ····· ··· *· ·t · · 9 aureus inkubovanou přes noc o 6,5 x 10⁶ CFU suspendovanou v 7% mucinu. Nokathiacin se rozpustí v testovaném přípravku obsahujícím 10 % dimethylsulfoxidu, 5 % Tveenu 80 a 85 % vody. Roztok se podává subkutánně v celkové dávce 100 mg/kg (2 x 50 mg/kg 1 a 4 hodiny po infekci). Devět z devíti zvířat přežilo trvání experimentu bez známek toxicity. PD50 nokathiacinu I byla stanovena na <6,25 mg/kg.

Nokathiacin III připravený fermentací

Produkce nokathiacinu III může být dosaženo za teploty vedoucí k uspokojivému růstu produkujícího organismu, například mezi 16 a 40 °C, avšak výhodné je provádět fermentaci při teplotě 22 až 2 6 °C. Vodné médium se po dobu nutnou k dovršení produkce nokathiacinu III, jak je sledováno vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC), obvykle po dobu asi 1 až 5 dnů, na rotační protřepávačce pracující při frekvenci 50 až 300 otáček za minutu, výhodně při frekvenci 150 až 250 otáček za minutu.

Produkt, nokathiacin III se z kultivačního média získá běžnými způsoby, které jsou obvykle používány pro získávání jiných biologicky aktivních látek. Nokathiacin III může být získán kultury běžným rozpouštědlem, jako je ethylacetát, pomocí běžných pryskyřic (například anioto- nebo kationtoměnivé pryskyřice nebo neiontové adsorpční pryskyřice), pomocí běžného adsorpčního činidla (například aktivního uhlí, silikagelu, celulózy, oxidu hlinitého), krystalováním, rekrystalováním a/nebo čištěním preparativní HPLC na reverzní fázi.

Následující příklady popisují přípravu nokathiacinu III fermentací. Mohou být uskutečněny jejich rozumné obměny, ·····« · · · ·· · • «9 · · · · ·«·· ·«··· ··· « « · 9« « · ··«··· · · · ·*«»«· ·· · · · β < » «· * « « · « jako jsou obměny, které by napadly odborníka v oboru, aniž by tím byl opuštěn rozsah tohoto vynálezu.

Fermentace

Příklad 4

Ze zmrazené zásobní vegetativní kultury Nocardia sp.

ATCC 202099 se naočkují 4 ml do 100 ml očkovacího média sestávajícího se z následujících látek na 1 litr deionizované vody: 20 g japonského rozpustného škrobu, 5 g glukózy, 3 g N-Z čase, 2 g kvasničného extraktu, 5 g extraktu z rybího masa a 3 g uhličitanu vápenatého, do 500ml baňky. Kultura se inkubuje 3 dny při 28 °C v rotační třepačce pracující při frekvenci 250 otáček za minutu. 4 ml výsledné kultury se použijí k naočkování každé z deseti 500ml baněk obsahujících 100 ml produkčního média sestávajícího se z následujících látek na 1 litr deionizované vody: 10 g HY kvasinek 412, 20 g glukózy a 10 g Nutrisoy. Produkční kultury se inkubují 2 dny při 28 °C v rotační třepačce pracující při frekvenci 250 otáček za minutu. Poté se kultury zpracují k získání nokathiacinu III.

Příklad 5

Ze zmrazené zásobní vegetativní kultury Nocardia sp.

ATCC 202099 se naočkují 4 ml do 100 ml očkovacího média sestávajícího se z následujících látek na 1 litr deionizované vody: 20 g japonského rozpustného škrobu, 5 g glukózy, 3 g N-Z čase, 2 g kvasničného extraktu, 5 g extraktu z rybího masa a 3 g uhličitanu vápenatého, do 500ml baňky. Kultura se inkubuje 3 dny při 28 °C v rotační třepačce pracující při frekvenci 250 otáček za minutu. 4 ml ······ ♦ «· «· · • · · · · · ♦ ·« a · •••♦· *«· »·· • · · · ·*··«·· • · ♦ ·»«·»>

»· · · · ·a· · » a« · · · výsledné kultury se přidají do každé z pěti 500ml baněk obsahujících 100 ml čerstvého očkovacího média a kultura se inkubuje 3 dny při 28 °C v rotační třepačce pracující při frekvenci 250 otáček za minutu. Výsledná kultura z pěti baněk se slije dohromady a 4 ml kombinované kultury se použijí k naočkování každé z jednoho sta 500ml baněk obsahujících 100 ml produkčního média sestávajícího se z následujících látek na 1 litr deionizované vody: 10 g HY kvasinek 412, 20 g glukózy a 10 g Nutrisoy. Produkční kultury se inkubují 4 dny při 24 °C v rotační třepačce pracující při frekvenci 180 otáček za minutu. Poté se kultury zpracují k získání nokathiacinu III.

Příklad 6

Izolace nokathiacinu III

Příprava surového extraktu

1,2 L fermentačního bujónu Nocardia sp. ATCC 202099 (celý bujón včetně mycelií) se za mohutného třepání extrahuje přibližně 1 L ethylacetatu. Bifázní směs se odstředí a fáze se oddělí. Vodná část se opět extrahuje ethylacetatem. Světle žluté ethylacetatové extrakty se shromáždí a odpaří se v rotační sušičce ve vakuu do suchá, čímž se získá přibližně 198 mg odparku A.

Frakce odparku A kapalina-kapalina.

198 mg odparku A se rozpustí ve 10 ml 10% roztoku vody v methanolu. Roztok se převede do dělicí nálevky a třikrát se extrahuje stejným objemem hexanu. Hexanová vrstva se odstraní. Vodná methanolová fáze se zředí přidáním 3,8 ml • · ···· · ·· · · ·«· ♦ · · · · · · ····· * · · * · • * e » · · · · ··· ··· ·· φ · · vody na 35% roztok vody v methanolu a třikrát se extrahuje stejným objemem chloroformu. Chloroform se předem nasytí 35% roztokem vody v methanolu. Hexan, chloroform a vodné methanolové extrakty se ve vakuu v rotační sušičce odpaří do sucha. Nokathiacinová antibiotika se primárně detekují v chloroformové frakci, 106 mg odparku B.

Izolace nokathiacinu III

Odparek B se dále čistí za použití specifikovaného preparativního HPLC systému Beckman Systém Gold; kolona YMC ODS-AQ C18. Typická velikost injekce vzorku je 50 mg/250 μΐ dimethylsulfoxidu. Eluování se započne směsí O,1M amoniumacetatu v acetonitrilu v poměru objemovém 55 : 45 s 30 minutovým lineární gradientem do acetonitrilu. Detekce (UV) se provádí při 360 nm. Tímto způsobem získáme nokathiacin III (pík v 9 minutě, celkový výtěžek 12 mg).

Fyzikálně chemické vlastnosti nokathiacinu I

Popis: žlutohnědá amorfní pevná látka

Molekulární vzorec: C52H43N13O16S5

Molekulová hmotnost: 1265

Hmotnostní spektrum: HR-ESIMS [M+H]⁺ m/z 1266,162

ESI-MS/MS fragmentace iontů: m/z 1248, 1222, 1204, 1186, 788

Infračervené spektrum: Hlavní infračervený pás (cm^-1) 3382, 1720, 1667, 1643 posun, 1534, 1510,

	1477, 1420, 1250, 1207, 1126, 1015, 750
Ultrafialové spektrum:	X_max (MeOH) nm 224, 2 90, 364 (log ε 4,85, 4,52, 4,11)
Cirkulárni dichroismus:	CD ληπι (Δε) (MeOH) 212 (+38,7), 238 (-47,6), 266 (+21,2), 305 (-11,4), 362 (+5,1)
HPLC (Rt):	19,3 min; (C18; acetonitril - 0.01M pufr fosforečnanu draselného o pH 3,5 gradient (J. Chromatogr. 385, 99 (1997))
^-NMR:	Zjištěné chemické posuny (ve vztahu k signálu DMSO-d6 δ 2,49):

δ 10	,05 (	1H, s), 8,	93 (1H, s), 8,59
(1H,	s) ,	8,51 (1H,	s), 8,46 (1H,
s) ,	8,37	(1H, d, J	= 8,9 Hz), 8,20
(1H,	s) ,	8,05 (1H,	s), 7,91 (1H, d,
J =	10,9	Hz), 7,77	(2H, široký s),
7,74	(2H,	široký s)	, 7,69 (1H, d, J
= 8,	4 Hz)	, 7,60 (1H	s), 7,38 (1H,
d, J	= 7,	5 Hz) , 7,3	4 (1H, dd, J =
8,2,	7,2	Hz), 7,18	(1H, d, J = 7,0
Hz) ,	6,37	(1H, s),	6,07 (1H, d, J =
7,1	Hz) ,	5,92 (1H,	d, J = 12,2 Hz),
5,89	(1H,	d, J = 10	\|,3 Hz) , 5,74
(1H,	dd,	J = 10,8,	4,8 Hz), 5,72
(1H,	s),	5,24 (1H,	m), 5,02 (1H, d,

J = 12,5 Hz), 4,71 (1H, d, J = 10,4 Hz), 4,54 (1H, d, J = 11,2 Hz), 4,50 (1H, m), 4,20 (1H, m), 4,13 (1H, d, J = 10,4 Hz), 4,02 (1H, dd, J = 9,4, 7,2 Hz), 3,87 (1H, s), 3,73 (1H, d, J = 9,6 Hz), 1,97 (3H, s), 1,15 (3H, široký s) ¹³C-NMR: Zjištěné chemické posuny (ve vztahu k signálu DMSO-dg δ 39,6):

δ 174,5, 172,2, 168,1, 167,8,

166,	6,	165,	3,	164,	4,	163,0,	161,	2,
160,	4,	159,	3,	158,	8,	154,7,	152,	9,
149,	6,	148,	8,	146,	o,	141,6,	135,	7,
135,	o,	134,	5,	129,	9,	128,6,	127,	1,
126,	4,	126,	3,	125,	6,	125,3,	124,	2,
123,	1,	119,	7,	119,	5,	112,5,	111,	3,
109,	8,	103,	7,	81,4	/	67,9, 67	,3,
65,3	f	64,5,	63	,5,	56	,2, 55,7	, 49	>7
49,5	f	18,0,	13	,2,

Příklad 7

Antibiotická aktivita nokathiacinu III

Za účelem demonstrace antimikrobiálních vlasností nokathiacinu, se za použití běžných testů ředěným bujónem (metody sériového ředění bujónu za použití živného bujónu (Difco)), získají minimální inhibiční nokathiacinového antibiotika u různých koncentrace (MIK) bakterií. Získané výsledky jsou uvedeny níže v tabulce 2 a demonstrují, že nokathiacin III má využití při léčbě bakteriálních infekcí.

Tabulka 2

MIK (pg/ml) organismus kmen č. nokathiacin III

Streptococcus pnaeumoniae	A9585	<0,002
Streptococcus pnaeumoniae/středně citlivý na penicilín	A27881	<0,002
Streptococcus pnaeumoniae/ penicilín resistentní	A28272	<0,002
Enterococcus faecalis	A20688	0,03
Enterococcus faecalis	A27519	0, 03
Enterococcus faecalis + 50% telecí sérum	A20688	0,25
Enterococcus faecium	A24885	0,03
Enterococcus avium	A27456	0,03
Staphylococcus aureus/βlaktamasa pozitivní	A15090	0,007

• · ··· · « · • · ··

Staphylococcus aureus + 50% telecí sérum	A15090	0,03
Staphylococcus aureus/QC/ ATCC č. 29213	A24407	0,007
Staphylococcus aureus/homo methicilin resistentní	A27223	0,007
Staphylococcus aureus + 50% telecí sérum	A27223	0,007
Staphylococcus epidermidis	A24548	0,007
Staphylococcus haemolyticus	A27298	0,07
Moraxela catarrhalis/βlaktamasa pozitivní	A22344	0,06
Moraxela catarrhalis/βlaktamasa pozitivní	A25409	0,06
Haemophilus influenzae/ β-laktamasa negativní	A20191	>64
Haemophilus influenzae/ β-laktamasa negativní	A20183	>64

Haemophilus influenzae/ A21515 >64 β-laktamasa pozitivní

JUDr. P$třítiijenský

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina nokathiacinu vzorce:

ve kterém je atom vodíku nebo hydroxylová skupina;

w nebo je atom vodíku nebo skupina vzorce její farmaceuticky přijatelná sůl.

t
2. Sloučenina podle nároku 1 vybraná ze skupiny sestávající z nokathiacinu I, II a III nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí;

kde nokathiacin I má následující vlastnosti:

a) vypadá jako světle žlutá amorfní pevná látka;

b) má molekulovou hmotnost určenou hmotnostní spektrometrií 1436;

c) má molekulární vzorec C61H60N14O18S5;

d) když je rozpuštěn v methanolu vykazuje ultrafialové absorpční spektrum v zásadě jako na obrázku 1;

e) vykazuje infračervené absorpční spektrum v bromidu draselném v zásadě jako na obrázku 2;

f) když je rozpuštěn v deuterovaném dimethylsufoxidu vykazuje spektrum protonové magnetické rezonance v zásadě jako na obrázku
3;

g) když je rozpuštěn v deuterovaném dimethylsufoxidu vykazuje ¹³C spektrum magnetické rezonance v zásadě jako na obrázku
4;

h) na reverzní fázi v silikagelové koloně C18, vykazuje, při použití 0,01M pufru fosforečnanu draselného o pH 3,
5 s acetonitrilovým gradientem, retenční čas vysoko výkonné kapalinové chromatografie 25,
6 min;

i) a má vzorec:

kde nokathiacin II má následující vlastnosti:

a) vypadá jako světle žlutá amorfní pevná látka;

b) má molekulovou hmotnost určenou hmotnostní spektrometrií 1420;

c) má molekulární vzorec C61H60N14O17S5;

d) když je rozpuštěn v methanolu vykazuje ultrafialové absorpční spektrum v zásadě jako na obrázku 5;

e) vykazuje infračervené absorpční spektrum v bromidu draselném v zásadě jako na obrázku 6;

f) když je rozpuštěn v deuterovaném dimethylsufoxidu vykazuje spektrum protonové magnetické rezonance v zásadě jako na obrázku 7;

g) když je rozpuštěn v deuterovaném dimethylsufoxidu vykazuje ¹³C spektrum magnetické rezonance v zásadě jako na obrázku 8;

h) na reverzní fázi v silikagelové koloně C18, vykazuje, při použití 0,01M pufru fosforečnanu draselného o pH 3,5 s acetonitrilovým gradientem, retenční čas vysoko výkonné kapalinové chromatografie 21,1 min;

i) a má vzorec:

·· ···· e »« _φφ • · ···**· ···· ·♦· »« • ·· ·· *·0φ ♦ · · · · ·· ·· ··· · · · ·· · · a kde nokathiacin III má následující vlastnosti:

a) vypadá jako žlutohnědě zbarvená amorfní pevná látka;

b) má molekulovou hmotnost určenou hmotnostní spektrometrií

12 65;

c) má molekulární vzorec C52H43N13O16S5;

d) když je rozpuštěn v methanolu vykazuje ultrafialové absorpční spektrum v zásadě jako na obrázku 9;

e) vykazuje infračervené absorpční spektrum v bromidu draselném v zásadě jako na obrázku 10;

f) když je rozpuštěn v deuterovaném dimethylsufoxidu vykazuje spektrum protonové magnetické rezonance v zásadě jako na obrázku 11;

g) když je rozpuštěn v deuterovaném dimethylsufoxidu vykazuje ¹³C spektrum magnetické rezonance v zásadě jako na obrázku 12;

h) na reverzní fázi v silikagelové koloně C18, vykazuje, při použití 0,01M pufru fosforečnanu draselného o pH 3,5 s acetonitrilovým gradientem, retenční čas vysoko výkonné kapalinové chromatografie 19,3 min;

i) a má vzorec:

3. Sloučenina podle nároku 1, kterou je nokathiacin I. 4. Sloučenina podle nároku 1, kterou je nokathiacin II. 5. Sloučenina podle nároku 1, kterou je nokathiacin III. 6. Farmaceutický prostředek, v y z n a č u j i c í se

tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny podle některého z nároků 1 až 5 a vhodný nosič nebo ředidlo.
7. Způsob prevence nebo léčby bakteriální infekce savců, vyznačující setím, že zahrnuje krok podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny podle některého z nároků 1 až 5 uvedenému savci, který to potřebuje.

•> <·<· • · • · ··
8. Biologicky čistá kultura mikroorganismu Nocardia sp.

(ATCC-202099).
9. Způsob výroby sloučeniny podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky fermentace mikroorganismu Nocardia sp. (ATCC-202099) a izolace antibiotik nokathiacinu I, II a III z fermentačního buj ónu.