CZ20004910A3 - Zárodečné krystaly pro přípravu peptidů nebo proteinů - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy zárodečných mikrokrystalů vhodných při výrobě lidského insulinu, kde uvedené mikrokrystalyjsou prosté nehumánního pankreatového insulinu, a uvedený způsob zahrnuje přípravu neočkované suspenze lidského inzulínu, kde uvedená suspenze je prostá nehumánního pankreatového insulinu, a homogenizaci uvedené suspenze insulinu pod tlakem za tvorby mikrokrystalů lidského insulinu, které jsou vhodné jako zárodečné mikrokrystaly při výrobě produktů obsahujících insulin se zinkem. Způsob homogenizace pod tlakem podle vynálezu je možné použít i k přípravě zárodečných krystalů pro další peptidy nebo proteiny, zejména peptidy nebo proteiny používané jako léčivajako je insulin, GLP-1, glukagon a růstové hormony.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká zárodečných krystalů pro přípravu peptidů nebo proteinů jako jsou produkty obsahující insulin se zinkem.

Dosavadní stav techniky

Skupina produktů obsahujících insulin se zinkem označovaná jako Leňte zahrnuje insulinové suspenze obsahující zinek, původně vyvinuté v letech 1950 s cílem přípravy insulinových přípravků umožňujících pokrytí potřeb diabetiků na insulin jedním injekčním denním podáním (viz například Jens Brange, Galenics of Insulin, 1987). Různé insulinové produkty Leňte s odlišnými účinky při podání jsou dostupné ve formě různých kombinací amorfních a/nebo krystalických částic insulinu u firmy Novo Nordisk A/S, Dánsko. Patří mezi ně forma SEMILENTE, což je suspenze amorfních částic insulinu,

ULTRALENTE, suspenze krystalických částic insulinu, a LEŇTE, směs 30 % amorfních a 70 % krystalických částic insulinu.

Několik desetiletí se zárodečné krystaly pro přípravu Leňte Zn-insulinových přípravků připravovaly v podstatě stejným lyofilizačním způsobem, který byl vyvinut a patentován začátkem let 1950. Tento způsob, popsaný v popisu GB patentu č.766,994, zahrnuje přídavek lyofilizovaného amorfního insulinu, obvykle hovězího insulinu, ke krystalizačnímu médiu obsahujícími insulin, čímž se získá suspenze mikrokrystalů insulinu o velikosti asi 2-7 μπι. Tato suspenze, která se pak nakonec použije k přípravě konečného produktu obsahující krystalicky Zn-insulin, se rozplňuje do malých lahviček • · · (například 10 ml), vymrazí se ve směsí alkohol/oxid uhličitý, a uchovává se při teplotě pod -18 °C.

Ačkoliv se výše uvedený způsob stále používá, má více nevýhod:

1. Způsob je založen na použití hovězího insulinu protože dosud nebylo možné připravit použitelné mikrokrystaly čistého lidského insulinu. Výsledek použití zárodečných jader hovězího insulinu k přípravě mikrokrystalů je takový, že konečný produkt obsahuje malé množství hovězího insulinu, což je nežádoucí.

2. Uvedený způsob zahrnující lyofilizaci vyžaduje použití zařízení pro lyofilizaci a následnou přepravu a uchovávání při teplotě nepřevyšující -18 °C. Tím je uvedený způsob ekonomicky a prostorově náročný.

3. Uvedený způsob přípravy je mimořádně obtížné provádět za dostatečně aseptických podmínek.

Možnost přípravy insulinových zárodečných krystalů způsobem, který by nezahrnoval nevýhody uvedených známých způsobů by tedy byla velmi výhodná. Autoři vynálezu s překvapením zjistili, že lze připravit zárodečné krystaly prosté hovězího insulinu poměrně jednoduchým a ekonomicky nenákladným způsobem, přičemž připravené krystaly lze uchovávat při teplotě místnosti a které vedou k insulinovým přípravků majícím výhodné vlastnosti například z hlediska velikosti částic a jejich stejnoměrnosti. Rovněž se předpokládá, že navrhovaný způsob bude možné aplikovat na přípravu zárodečných krystalů pro další peptidy a proteiny, zejména peptidy a proteiny které se používají jako léčiva.

·· · · ···· ·· • · · · · · · ··· · • · ···· ·· • · · · · ·· ·· · · ·

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je poskytnutí nového způsobu přípravy peptidových nebo proteinových zárodečných krystalů. Zejména je cílem vynálezu poskytnutí způsobu přípravy insulinových zárodečných krystalů, při kterém není potřebné použití hovězího insulinu, který umožňuje uchovávání a transport bez potřeby použití nízkých lyofilizačních a skladovacích teplot pod teplotou -17,8 °C, a který je možné provádět v uzavřeném systému a tak snadněji realizovat aseptické způsoby výroby.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout způsob přípravy insulinových zárodečných krystalů pro přípravu suspenzí krystalického Zn-insulinu, majících úzké rozmezí velikosti částic.

Ve svém nejširším aspektu vynález zahrnuje způsob přípravy zárodečných mikrokrystalů pro přípravu peptidových nebo proteinových přípravků, který spočívá v přípravě neočkované suspenze peptidu nebo proteinu a homogenizaci uvedené suspenze pod tlakem za tvorby mikrokrystalů peptidu nebo proteinu, které jsou vhodné k použití jako zárodečné mikrokrystaly.

Ve specifickém provedení vynález zahrnuje způsob přípravy zárodečných mikrokrystalů pro přípravu lidského insulinu, kde uvedené mikrokrystaly neobsahují nehumánní insulin pankreatu, který zahrnuje přípravu neočkované suspenze lidského insulinu prosté nehumánního pankreatového insulinu a homogenizaci uvedené suspenze pod tlakem za tvorby mikrokrystalů lidského insulinu, které jsou vhodné jako zárodečné mikrokrystaly při přípravě přípravků obsahujících insulin se zinkem.

• · 4 · · 4 4 4 4 ·· • · 4 · ·· · ··· • 44 I*·· ·· • 4 4 4 4 4 · 4·· 4

4 4444 44

44444 · 4 44 44 4

V dalším aspektu vynález zahrnuje způsob přípravy peptidového nebo proteinového produktu, který spočívá v přípravě neočkované suspenze peptidu nebo proteinu a naočkování uvedené suspenze mikrokrystaly připravenými způsobem naznačeným výše.

Ve specifickém provedení výše uvedeného aspektu vynálezu, uvedený peptidový nebo proteinový produkt určený k přípravě je produkt obsahující insulin se zinkem, a uvedená neočkovaná suspenze je suspenze lidského insulinu.

Další aspekt vynálezu se týká mikrokrystalů lidského insulinu vhodných k použití jako zárodečné krystaly pro přípravu produktů obsahujících insulin se zinkem, kde uvedené mikrokrystaly neobsahují nehumánní pankreatový insulin.

Ještě další aspekt vynálezu se týká produktu obsahujícího lidský insulin se zinkem, který je prostý nehumánního pankreatového insulinu.

Podrobný popis vynálezu

Jak je uvedeno výše, způsob podle vynálezu se obecně týká přípravy zárodečných mikrokrystalů pro peptidy a proteiny, zvláště pro peptidy a proteiny které se používají jako léčiva. Zejména se uvedený způsob vztahuje na zárodečné mikrokrystaly vhodné k přípravě terapeuticky používaných peptidů nebo proteinů jako je insulin, GLP-1, glukagon, a růstové hormony jako je lidský růstový hormon, a rovněž analogy a deriváty těchto peptidů a proteinů. Specificky je tímto peptidem nebo proteinem lidský insulin nebo jeho analog nebo derivát jak je dále popsané níže. Pokud jde o peptidy nebo proteiny jiné než insulin, výrazy analog nebo derivát je nutné chápat obdobně jako popisy uvedených výrazů pro insulin uvedených níže.

Výraz lidský insulin použitý v tomto popise znamená označení pro přirozeně se vyskytující lidský insulin a stejně tak jeho analogy a deriváty. Výraz analog insulinu se používá k označení peptidů vykazujícího účinky insulinu, který je odvozen z přirozeně se vyskytujícího insulinu substitucí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, vynecháním jednoho nebo více aminokyselinových zbytků a/nebo přídavkem jednoho nebo více aminokyselinových zbytků. Insulin nebo analog insulinu může být případně ve formě derivátu insulinu, kde výraz derivát znamená peptid, ve kterém jedna nebo více aminokyselin mateřského peptidů je chemicky modifikovaných, například alkylací, acylací, tvorbou esteru nebo amidu. Výraz acylovaný insulin (nebo analog insulinu), znamená insulin (nebo analog insulinu), který obsahuje acylovou skupinu v εaminoskupině jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, často v lysinovém zbytku.

Výraz nehumánní pankreatový insulin použitý v tomto popisu, znamená přirozeně se vyskytující insulin který není lidského původu, například hovězí nebo vepřový insulin.

Základní princip výhodného provedení podle vynálezu je schématicky znázorněný na obrázku 1. Zařízení podle obrázku 1 zahrnuje sběrnou nádobu 1, ze které se suspenze insulinu vede pomocí čerpadla 2 do homogenizátoru 3. Homogenizátor 3 obsahuje ventil s velmi malým otvorem kterým se suspenze inzulínu čerpá při vysokém tlaku, například tlaku asi 1000.10⁵ Pa nebo vyšším. Na výstupu z ventilu dojde k náhlému snížení tlaku kterému je suspenze vystavena, což vede k rozrušování • · · krystalů insulinu, tj. k homogenizačnímu účinku. Výhodně se suspenze insulinu proto zpracuje ve více homogenizačních cyklech aby se připravila dostatečně homogenní suspenze mikrokrystalú mající požadovanou velikost částic a jejich distribuci v závislosti na velikosti, a protože vysoký tlak použitý v homogenizátoru 2 vede ke zvýšení teploty suspenze, tak ke snížení teploty suspenze zařízení výhodně obsahuje výměník tepla _4 umístěný za homogenizátorem 3. Z výměníku tepla _4 se suspenze insulinu vede zpět do sběrné nádoby 1^ k provedení dalších homogenizačních cyklů podle potřeby.

Teplota suspenze se zvyšuje podle následující rovnice:

ΔΤ = P/(c x δ) kde:

ΔΤ = přírůstek teploty (°C),

P = tlak suspenze (N x m’²) , δ = hustota suspenze (g x m'³) , c = měrné teplo (J x g’¹ x Vj ·

Během provozu jsou tlak i teplota monitorované, a výše uvedenou rovnici lze použít v souvislosti s návrhem zařízení a regulace průběhu postupu.

Ve způsobu podle vynálezu se homogenizace obvykle provádí při tlaku nejméně asi 500.10⁵ Pa, výhodně při tlaku nejméně asi 800.10⁵ Pa, a ještě výhodněji při tlaku nejméně asi 1000.10⁵ Pa. V určitých případech se může použít tlak například nejméně asi 1200.10⁵ Pa až asi 1500.10⁵ Pa nebo více, i když se obecně nepředpokládá potřeba použití tlaků nad asi 1000.10⁵ Pa.

Ve výhodném provedení se homogenizace suspenze provádí ve více homogenizačních cyklech, tj., nejméně ve 2 cyklech, protože bylo zjištěno, že použitím více homogenizačních cyklů se docílí zlepšené výsledky, tj. optimální velikosti zárodečných krystalů a jejich stejnoměrnosti. Předpokládá se, že obvykle bude výhodné použít více než 2 cykly, tj. použít 3,

4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 cyklů nebo více, v některých případech například až 15 nebo 20 cyklů nebo někdy dokonce i více než 20 cyklů. Nejvýhodnější počet homogenizačních cyklů určí pracovník v oboru pro každý konkrétní případ na základě faktorů zahrnujících charakter insulinové suspenze, vlastnosti použitého homogenizačního zařízení, tlak použitý při homogenizaci, a požadovanou velikost částic mikrokrystalického insulinu a jejich distribuci podle velikosti.

Protože, jak již bylo uvedeno výše, vysoký tlak použitý v homogenizátoru vede ke zvýšení teploty suspenze, je výhodné spojit použití více homogenizačních cyklů s použitím výměníku tepla snižujícího teplotu suspenze tak, aby teplota suspenze zůstávala na teplotě vhodné pro homogenizaci. Uvedené výměníky jsou v oboru známé a pracovník v oboru snadno stanoví vhodné parametry výměníku tepla, které by vyhovovaly danému způsobu a zařízení. Výhodně se teplota recyklované insulinové suspenze udržuje v rozmezí asi 10-40 °C například asi 20-35 °C.

I když velikost částic výsledných mikrokrystalů insulinu bude kolísat v závislosti na zamýšleném použití, vhodné mikrokrystaly budou mít střední velikost částic, hodnocenou nejdelší diagonálou krystalů, v rozmezí asi 0,5-4 μπι, například asi 1-3 μτη.

Výše uvedeným homogenizačním zpracováním se připraví mikrokrystaly lidského insulinu vhodné jako zárodečné • · · ·* »» »· • · · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ··· mikrokrystaly při přípravě produktů obsahujících insulin se zinkem, kde význačný rys těchto mikrokrystalů je, že neobsahují nehumánní pankreatický insulin. Při přípravě produktů obsahujících insulin se zinkem se zárodečné mikrokrystaly použijí obvyklým způsobem, tj. neočkovaná suspenze lidského insulinu se naočkuje mikrokrystaly připravenými způsobem popsaným výše a krystalizace se provede způsobem známým v oboru. Přesné množství mikrokrystalů, které je nutné přidat k dané neočkované suspenzi insulinu je možné, jako obvykle v tomto oboru, stanovit empiricky.

Vynález je dále objasněn následujícími příklady, které však vynález nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Způsoby provedení a zařízení

K hodnocení počtu homogenizačních cyklů a homogenizačního tlaku a doby homogenizace bylo provedeno více pokusů s použitím základního postupu pro homogenizaci a zařízení jak je popsané výše, tj. recirkulačního homogenizátoru a výměníku tepla.

Jako pokusné zařízení byl použit vysokotlaký homogenizátor Rannie, model LAB 10,51 VH (série 1.89239), opatřený keramickým ventilem typu SEO 719685. Kapacita homogenizátoru je 80 1/h při tlaku 1000.10⁵ Pa. Byl použit výměník tepla pracující s chladící vodou o teplotě asi 20 °C. Pokud jde kapacitu výměníku tepla, tak ve spojení s uvedeným homogenizátorem byla při jeho maximálním vstupu nedostatečná a vstupní teplota suspenze byla poněkud vyšší, tj. asi 28-29 °C, při spodní hodnotě vstupu do homogenizátoru tj. asi 65 1/h • · · byla však již jen mírně vyšší, tj. asi 24-2 °C. Jako sběrná nádoba byla použita tlaková nádrž objemu 100 1 a malá kónická nádobka objemu asi 3 1.

Pro přípravu mikrokrystalů byla použita suspenze inzulínu spojené šarže (2 x 20 1) neočkovaného ULTRALENTE HM(ge), 100 j./ml, firmy Novo Nordisk A/S.

Příklad 1

1 podíl spojené šarže insulinové suspenze ULTRALENTE byl homogenizován při tlaku 1000.10⁵ Pa, přičemž suspenze se nechala cirkulovat ve více homogenizačních cyklech jak je popsané výše, což vedlo k postupnému zvyšování stupně homogenizace. Průtoková rychlost byla 80 1/h. Bylo provedeno celkem 18 homogenizačních cyklů, při kterých v prvních 10 cyklech a po konečném cyklu byl prováděn odběr vzorků. Teplota insulinové suspenze byla měřená ve výstupním potrubí homogenizátoru mezi homogenizátorem a výměníkem tepla. Doby zpracování a změřené teploty v různých cyklech jsou uvedené níže v tabulce 1:

Tabulka 1

Příklad č.	Počet homogenizačnich cyklů	Doba od počátku pokusu (minuty)	Teplota (°C)
1-0	0	0	12,5
1-1	1	5	29
1-2	2	12	29
1-3	3	19	28,3
1-4	4	26	29,5
1-5	5	33	29,5
1-6	6	40	29, 8
1-7	7	47	29,5
1-8	8	54	29,2
1-9	9	61	28,1
1-18	18	122	28,1

U některých vzorků bylo provedeno mikroskopické hodnocení s následujícími zjištěními:

Příklad 1-0: většinou celistvé, ostrohranné romboedrické krystaly o velikosti asi 3-80 pm; několik porušených krystalů a jejich fragmentů.

Příklad 1-1: stále ještě mnoho celistvých romboedrických krystalů o velikosti asi 20-40 pm, ale rovněž mnoho malých fragmentů krystalů o velikosti 3 pm nebo méně.

Příklad 1-2: ještě přítomné celistvé romboedrické krystaly o velikosti asi 20 pm a několik větších shluků • · »· ···· ·· · • · ·· · · · · · ·· ·· · 4 · · ····· · ··· · · • ···· ·· · • · ·· · · ·· ··· krystalů o velikosti až asi 40 μιτι; zjištěno ještě více malých fragmentů krystalů o velikosti 3 μπι nebo méně.

Příklad 1-18: malé mikrokrystaly o velikosti asi 1 μιη nebo méně; několik fragmentů krystalů o velikosti až asi 10; žádné celistvé romboedrické krystaly.

Příklad 2

1 podíl spojené šarže insulinové suspenze ULTRALENTE byl homogenizován při tlaku 1000.10⁵ Pa, přičemž suspenze se nechala cirkulovat ve více homogenizačních cyklech jak je popsané výše při průtokové rychlosti byla 65 1/h. Bylo provedeno celkem 10 homogenizačních cyklů, kdy po každém cyklu byl proveden odběr vzorku. V tomto případě však místo toho, aby se suspenze zaváděla přímo zpět do sběrné nádoby z výměníku tepla, tak se po každém cyklu oddělila. Z každého podílu byl odebrán vzorek a zbytek byl vrácen do sběrné nádoby k provedení dalšího cyklu homogenizace. Doby zpracování a změřené teploty byly následující:

Tabulka 2

Příklad č.	Počet homogenizačních cyklů	Doba od počátku pokusu (minuty)	Teplota < °C)
2-0	0	0	-
2-1	1	-	24,5
2-2	2	-	26, 3
2-3	3	-	27,1
2-4	4	15	27,7
2-5	5	-	27,8
2-6	6	-	28,0
2-7	7	-	28,0
2-8	8	-	28,0
2-9	9	-	-
2-10	10	30	-

Příklad 3

K hodnocení vlivu tlaku při homogenizaci byly provedeny zkoušky při tlaku 1400.10⁵ -1500.10⁵ Pa při celkem 9 homogenizačních cyklech. Vzhledem ke zvýšení tlaku a průvodní zvýšené teplotě suspenze byl dále snížen průtok na 54 1/h tak, aby výměník tepla mohl dostatečně snížit teplotu. Velikost vsádky byla v tomto případě 3 litry. Teplota suspenze byla udržovaná na asi 26-29 °C.

» ·· «·«··· ·« · ···· ·· · *··· ····*· ··· • ···»· · · · · · · * ········ *·· ·· «· ·· ·« ···

Tabulka 3

Příklad č.	Počet homogenizačních cyklů	Doba od počátku pokusu (minuty)	Teplota (°C)
3-0	0	0	16, 3
3-9	9	30	28,6

Příklad 4

Byl použit stejný postup jako v příkladu 3 s tou výjimkou, že použitá suspenze insulinu ULTRALENTE v tomto případě tvořila během krystalizace divergentní krystaly (růžicovité) . Velikost vsádky byla 2 litry a doba homogenizace byla proto zredukovaná na celkem 21 minut.

Tabulka 4

Příklad č.	Počet homogenizačních cyklů	Doba od počátku pokusu (minuty)	Teplota (°C)
4-0	0	0	-
4-9	9	21	27,5

Příklad 5

Hodnocení očkování zvolenými typy mikrokrystalů

Vybrané vzorky mikrokrystalického lidského insulinu připravené způsobem uvedeným ve výše uvedených příkladech byly použity jako zárodečné krystaly při krystalizaci. Ve ·· · · ·««· ·· * » 9 * ···· ·'»·· · · 9 · « • « · · · · ·

C · *« ·· ·« srovnávacím pokusu byly použity standardní mikrokrystaly hovězího insulinu. V těchto pokusech byly použity vsádky 1 litru ULTRALENTE (40 j/ml). Krystalizace byly prováděny za míchání s použitím vrtulového míchadla po 20 hodin. Výsledky jsou uvedené níže v tabulce 5.

Tabulka 5

Mikrokrystaly podle	Střední velikost	10%-90%
příkladu č.	krystalů (μιη)	odchylka (μιη)
srovnávací pokus	28	16
1-18	23	15
2-10	26	17
3-9	26	17
4-9	27	16

Z výsledků uvedených v tabulce 5 je patrné, že s mikrokrystaly lidské insulinu podle vynálezu se připraví krystalický insulin o velikosti krystalů a s příslušnou odchylkou srovnatelnou s krystaly připravenými s použitím mikrokrystalů hovězího insulinu, a že v uvedených pěti vsádkách bylo dosaženo přibližně stejných výsledků.

U uvedených pěti šarží insulinu připravených výše uvedeným způsobem byly kromě toho provedeny i některé další analytické zkoušky zahrnující pH, účinnost insulinu, složku A + Μ + B, obsah amorfního insulinu (v %), obsah methyl-phydroxybenzoatu, obsah dimeru a polymeru, obsah kyselých a neutrálních desamidoinů, a obsah zinku. Bylo zjištěno, že šarže insulinu připravené s použitím mikrokrystalů podle vynálezu byly obecně srovnatelné s insulinem připraveným pomocí standardních mikrokrystalů hovězího insulinu.

Protože je známé, že na vlastnosti vzniklých romboedrů má vliv doba krystalizace a způsob míchání, vsádka připravená podle jednoho z uvedených příkladů (3-9) způsobem podle vynálezu byla použita pro hodnocení očkování při kterém byla měněna doba krystalizace a typ míchání. Pokud jde o míchání, nebyly zjištěné žádné podstatné rozdíly mezi použitím vrtulového míchadla a mícháním pohybem pomocí výkyvného rámu. Pokud jde do dobu krystalizace, bylo zjištěno že dostatečná doba jsou 4 hodiny, tj. že doba krystalizace 20 hodin není nezbytná. K dosažení nejlepších výsledku se proto doporučuje použití vrtulového míchadla a doba krystalizace hodiny, kdy již vzniká nejmenší množství odchylných krystalů.

Závěr

Závěrem lze konstatovat, že čisté mikrokrystaly lidského insulinu lze připravit vysokotlakou homogenizací neočkovaného insulinu ULTRALENTE MH (ge). Uvedeným způsobem se připraví mikrokrystaly ve formě malých krystalových fragmentů o velikosti částic asi 1-2 μιη, s obsahem některých větších fragmentů o velikosti částic až 10 μπι.

Změna tlaku v rozmezí 1000.10⁵ Pa až asi 1500.10⁵ Pa nemá na připravované mikrokrystaly pozorovatelný vliv. Na druhé straně počet homogenizačních cyklů má vliv na tvorbu mikrokrystalů, alespoň do určité míry, kde zvýšený počet cyklů vede k tvorbě stejnoměrnější suspenze mikrokrystalů s větším podílem mikrokrystalů o velikosti 1-2 μιη a s menším podílem větších krystalových fragmentů a celistvých romboedrických krystalů.

Nicméně počet homogenizačních cyklů vedoucí k danému stupni homogenizace také souvisí s dobou homogenizace v každém cyklu.

Zvýšení teploty suspenze, které bylo ve výše uvedených pokusech zjištěné v důsledku homogenizace, se neprojevilo účinky na mikrokrystaly z hlediska jejich chemické degradace. Regulaci teploty lze optimalizovat příslušnými změnami parametrů, například typem a kapacitou výměníku tepla.

Variabilitu velikosti částic mikrokrystalů připravených podle výše uvedených příkladů a tím i variabilitu velikosti částic v produktu obsahujícím insulin se zinkem a připraveným pomocí výše uvedených mikrokrystalů je možné redukovat v případě potřeby například sedimentací nebo odstředěním.

Kvalita zárodečných mikrokrystalů podle vynálezu se projevila jako vyhovující, protože použití uvedených mikrokrystalů vede k produktům s obsahem insulinu se zinkem obsahujících romboedrické krystaly přijatelné velikosti krystalů.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Způsob přípravy zárodečných mikrokrystalů vhodných pro výrobu peptidu nebo proteinu vyznačující se tím že zahrnuje přípravu neočkované suspenze peptidu nebo proteinu a homogenizaci uvedené suspenze pod tlakem za tvorby mikrokrystalů peptidu nebo proteinu, které jsou vhodné jako zárodečné mikrokrystaly při výrobě uvedeného peptidu nebo proteinu.
2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený peptid nebo protein je peptid nebo protein používaný jako léčivo.
3. 3. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že peptid nebo protein je zvolený ze skupiny zahrnující insulin, GLP-1, glukagon, a růstové hormony jako je lidský růstový hormon a rovněž jejich analogy a deriváty.
4. 4. Způsob podle nároku 1 pro přípravu zárodečných mikrokrystalů vhodných pro výrobu lidského insulinu, kde uvedené mikrokrystaly neobsahují nehumánní pankreatický insulin, vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu neočkované suspenze lidského insulinu, kde uvedená suspenze neobsahuje nehumánní pankreatický insulin, a homogenizaci uvedené insulinové suspenze pod tlakem za tvorby mikrokrystalů lidského insulinu, které jsou vhodné jako zárodečné mikrokrystaly při výrobě produktů obsahujících insulin se zinkem.
5. 5. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že homogenizace se provádí při tlaku nejméně 500.10⁵ Pa, výhodně při tlaku nejméně asi 800.10⁵ Pa, ještě výhodněji při tlaku nejméně asi 1000.10⁵ Pa, například alespoň při asi 1200.10⁵ Pa.
6. 6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že homogenizace se provádí ve více homogenizačních cyklech.
7. 7. Způsob podle nároku 6vyznačující se tím, že teplota recyklované suspenze se řídí výměníkem tepla.
8. 8. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že teplota recyklované suspenze se udržuje v rozmezí asi 10 až 40 °C, například asi 20 až 35 °C.
9. 9. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že připravené mikrokrystaly mají střední velikost částic, definovanou nejdelší diagonálou krystalů, v rozmezí asi 0,5 až 4 pm, například asi 1-3 pm.
10. 10. Mikrokrystaly lidského insulinu připravené způsobem podle kteréhokoli z nároků 4-9.
11. 11. Mikrokrystaly lidského insulinu vhodné k použití jako zárodečné krystaly při výrobě produktů obsahujících insulin se zinkem, kde uvedené mikrokrystaly jsou prosté nehumánního pankreatového insulinu.
12. 12. Mikrokrystaly podle nároku 11 které mají střední velikost částic v rozmezí asi 0,5 až 4 pm, například 1-3 pm.

    • · · ·· ···· ·· ···· ·· · ··· ····· · · «· · · ·
13. 13. Způsob výroby peptidového nebo proteinového produktu vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu neočkované suspenze peptidu nebo proteinu a naočkovaní uvedené suspenze mikrokrystaly připravenými způsobem podle kteréhokoli z nároků 1 až 9.
14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačuj ící se tím, že peptid nebo protein určený k výrobě je produkt obsahující insulin se zinkem, neočkovaná suspenze je suspenze lidského insulinu a zárodečné mikrokrystaly jsou mikrokrystaly lidského insulinu.
15. 15. Produkt obsahující lidský insulin prostý nehumánního pankreatového insulinu, připravený způsobem podle nároku 14.
16. 16. Produkt obsahující lidský insulin se zinkem prostý nehumánního pankreatového insulinu.