CZ20004643A3 - Nukleová kyselina kódující giberelin-2-oxidázu - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje nukleovou kyselinu kódující giberelin-2- oxidázu, která katalyzuje 2p-oxidaci molekuly giberelinu, čímž se vnáší hydroxylová skupina na C-2, a dále katalyzuje oxidaci hydroxylová skupiny vnesené na C-2, čímž vzniká ketonový derivát. Takové sekvence jsou užitečné pro přípravu transgenních rostlin se změněnou hladinou giberelin-2- oxidázy.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového enzymu, který se podílí na řízení růstu rostlin a DNA sekvence kódující tento enzym. Dále se vynález týká použití nukleotídové sekvence kódující enzym pro přípravu transgenních rostlin se zlepšenými nebo změněnými růstovými vlastnostmi.

Dosavadní stav techniky

Gibereliny (GA) představují velkou skupinu diterpenoidových karboxylových kyselin, které se vyskytují u vyšších rostlin a některých hub. některé gibereliny fungují jako rostlinné hormony účastnící se mnoha vývojových procesů, včetně klíčení semen, prodlužování stonku, rozvoje listu, iniciace kvetení a růstu a vývoje semena a plodu. Biologicky aktivní gibereliny jsou obvykle sloučeniny obsahující 19 atomů uhlíku (Cis) obsahující 19-10 lakton, C-7 karboxylovou kyselinu a 3P~hydroxylovou skupinu. Pozdější stádia jejich biosyntézy zahrnují oxidativní odstranění C-20 a hydroxylaci na C-3. Hydroxylace v pozici 2β vede ke vzniku biologicky inaktivního produktu. Tato reakce je nejdůležitější cestou v metabolismu GA u rostlin, která zajišťuje, že se aktivní hormon nehromadí v rostlinném pletivu. Enzymy biosyntézy GA 7-oxidáza, 20-oxidáza, 3P~hydroxyláza a 2p-hydroxyléza jsou všechny dioxygenázy závislé na 2-oxoglutarátu. To je velká skupina enzymů, pro které 2-oxoglutarát je kosubstrát, který je v průběhu reakce dekarboxylován na sukcinát (viz přehledná publikace Hedden, P. a Kamiya, Y. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 431-460, 1997).

Chemické regulátory růstu rostlin se užívají v zemědělské a zahradnické praxi již mnoho let. Mnohé z nich působí tak, že ovlivňují koncentraci GA v pletivech rostlin. Tak např. růstové retardanty inhibují aktivitu enzymů účastnících se biosyntézy GA a tím snižují obsah GA. Takové chemické látky jsou užívány dosti obecně, např. k zabránění polehání obilovin a nebo k regulaci růstu okrasných rostlin. Naopak zase GA se mohou aplikovat na rostliny, např. GA₃ se aplikuje na bezsemenné odrůdy vinné révy ke zlepšení velikosti a kvality bobulí a nebo na zrno ječmene ke zlepšení produkce sladu. Směsi GA₄ a GA7 se aplikují na jabloně ke zlepšení kvality ovoce a na některé jehličnany ke stimulaci produkce šišek. Existuje však několik problémů spojených s aplikací růstových regulátorů. Některé růstové retardanty jsou značně perzistentní v půdě a je tudíž obtížné pěstovat po ošetřené plodině následnou plodinu. Jiné zase vyžadují opakované aplikace, aby bylo dosaženo požadovaného účinku. Je obtížné omezit aplikaci jen na cílový orgán rostliny, aniž by nedošlo k rozptýlení ne jiné orgány nebo na jiné rostliny s případnými nežádoucími účinky. Přesné zaměřování růstových regulátorů je velmi pracné. Je tedy velmi potřebná jiná než chemická cesta řízení morfologie rostlin.

Vyvíjející se semena často obsahují vysoké koncentrace GA a relativně velká množství enzymů biosyntézy GA. Zralá semena fazolu (Phaseolus coccineus} obsahují mimořádně vysoké koncentrace β-hydroxyGA, GA_S, a jeho glukosidu, což ukazuje, že zde musí být přítomna velmi vysoká 2P~hydroxylázová aktivita. To bylo potvrzeno i pro příbuzný druh Phaseolus vulgaris, kde dochází k rychlému zvýšení GA 2p-hydroxylázové aktivity krátce před tím, než semena dosáhnou plné zralosti (Albone a kol., Planta 177: 108-115, 1989). 2P~hydroxyláza byla částečně purifikována z děložních lístků Pisum sativum (Smith, V.A. a MacMillan, J., Planta 167: 9-18, 1983, a Phaseolus vulgaris (Griggs a kol., Phytochemistry 30: 2507-2512, 1991 a Smith, V.A. a MacMillan, J., J. Plant. Growth Regul 2: 251-264, 1984.

Tyto studie ukázaly důkazy, že u obou zdrojů jsou přítomny alespoň dva enzymy s odlišnou substrátovou specifitou. Dvě aktivity z děložních lístků botnajících semen P. vulgaris byly oddělitelné pomocí iontoměničové chromatografie a gelové filtrace. Hlavní aktivita, podle vylučovací HPLC odpovídající enzymu s M_r 26000, hydroxylůje GAi a GA₄ přednostně proti GA₉ a GA₂₀, zatímco GA₉ je přednostním substrátem druhého enzymu (M_r 42200). Avšak pokusy purifikovat enzymové aktivity, aby se získaly informace o N-koncových aminokyselinových sekvencích, se ukázaly neproveditelné vzhledem k velmi nízkému výskytu enzymu v rostlinném pletivu v porovnání s ostatními proteiny, a také vzhledem k tomu, že se souběžně purifikuje kontaminující lektin, který znemožňuje sekvencování N-konce.

Regulace deaktivace giberelinů byla zkoumána u hrachu (Pisum sativum) u mutanty sin („slender), jak publikovali Ross a kol. (The Plant Journal 7(3): 513-523, 1995). Mutace sin blokuje deaktivaci GA₂o, což je prekurzor biologicky aktivního GAi. Výsledek této studie ukázal, že gen sin může být regulační gen řídící expresi dvou samostatných strukturních genů účastnících se GA deaktivace, zejména oxidace GA₂o na GA₂₉ 2P~hydroxylací na C-2 po které následuje další oxidace hydroxylové skupiny na keton (GA₂₉ na GA₂₉-katabolít) . Konverze GA₂₉ na GA₂9~katabolit v semenech hrachu byla inhibována prohexadion-kalciem, což je inhibitor dioxygenáz závislých na 2-oxoglutarátu (Nakayama a kol., Plant Cell Physiol. 31: 11831190, 1990), což ukazuje na to, že reakce byla katalyzována enzymem tohoto typu. Ačkoliv bylo zjištěno, že mutace sin u hrachu blokuje konverzi jak GA₂₀ na GA₂₉, tak i GA₂₉ na GA₂₉-katabolit, neschopnost značeného GA₂o inhibovat oxidaci radioaktivně značeného GA₂₉ a naopak, ukazuje že tyto kroky byly katalyzovány odlišnými enzymy. Kromě toho, v pletivech nadzemní části rostliny mutace sin inhibuje 2p-hydroxylaci GA₂₀, ale nikoliv vytváření GA₂₉-katabolitu. Tato pozorování vedla k teorii, že se jedná o dva samostatné enzymy, které se účastní • ···· « « ·· « » • · · · · · d · · · • · · · · ♦ · • · · · · · * · A • · · · · · · · · · « · · v této metabolické dráze řídící deaktivaci GA v rostlinách (Hedden, P. a Kamiya, Y., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 431-460, 1997).

Avšak překvapivě bylo nyní zjištěno, že ve skutečnosti tyto dvě odlišné reakce může provádět jediný enzym. Předkládaný vynález poskytuje poprvé popis klonování cDNA kódující GA 23~hydroxylázu, jejímž substrátem je Cig-GA a jejíž jedinou hydroxylázovou aktivitou je 2P~hydroxylace. cDNA klon z dýňových semen kóduje enzym, který má jak 2β- tak i 3βhydroxylázovou aktivitu (Lange a kol., Plant Cell 9: 1459-1467, 1997), ale hlavní aktivitou je 3β-ϊιγ0Γθχγ1έζονέ aktivita a jako 2β-1ογάΓθχγ1έζ3 působí pouze s tri karboxylovými kyselinami (C₂o) jakožto substráty, tedy neprovádí 2β-ύγάΓθχγΐ3θί Cig-GA. Jelikož nový enzym podle předkládaného vynálezu katalyzuje jak β-hydroxylaci tak i následnou oxidaci substituované hydroxylové skupiny na ketonovou skupinu na C-2, byl tento enzym nazván „GA-2-oxidáza.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou purifikovanou nebo rekombinantní sekvenci nukleové kyseliny kódující enzymy giberelin-2-oxidázu, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou zde na obr. 1 nebo její funkční derivát, nebo její komplementární řetězec nebo sekvenci s ní homologní.

Systém nomenklatury enzymů biosyntézy giberelinů byl nedávno zaveden (Viz Coles a kol., The PLant Journal 17(5):547556, 199). Odkazy v předkládané přihlášce, pokud jde o gen giberelin-2-oxidázy z Phaseolus coccineus, se týkají také PcGA2oxl. Pokud jde o gen giberelin-2-oxidázy z Arabidopsis thaliana, jedná se také o at-2bt3, at2bt24 a T31E10.il, a nebo také AtGA2oxl, AtGA2ox2 a AtGA2ox3.

• · · · · tt · · ·· • · · ···· ··· •·· ·· ·· ···· ·· ···

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu kódující giberelin-2-oxidázu (GA-2-oxidáza) kódují enzymy, které jsou dioxygenázy závislé na 2-oxoglutarátu, které vnášejí hydroxylovou skupinu na 0-2β v GA, zejména Cig-GA, včetně bioaktivních GA jako jsou GAi a GA₄. Oxidují také 2βhydroxylované GA dále na GA-katabolity, které mají ketonovou funkční skupinu na C-2. Laktonový můstek v těchto katabolitech může být otevřen, čímž vzniká C-19 karboxylová kyselina a dvojná vazba na C-10. Aktivita 2-oxidázy vede k inaktivaci biologicky aktivního GA nebo ke konverzi biosyntetického prekurzoru aktivního GA na produkt, který již nemůže být přeměněn na biologický aktivní formu. Výhodné sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu kódují enzym giberelin2-oxidázu, který je schopen oxidovat Cig-giberelinové sloučeniny vnesením hydroxylové skupiny na <2-2β. Enzym také oxiduje 2β-hydroxylovou skupinu na ketonovou skupinu. Výhodné substráty giberelin-2-oxidázy podle vynálezu jsou GA₉, GA₄, GA₂o a GAi.

V kontextu předkládaného vynálezu stupeň identity mezi aminokyselinovými sekvencemi je nejméně 40%, výhodně alespoň 50%, např. 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% nebo 95%. Na úrovni nukleotidové sekvence stupeň identity mezi sekvencemi je nejméně 50%, výhodně alespoň 60%, např. 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% nebo 95%. Homologní sekvence podle vynálezu má tedy sekvenční identitu výše popsanou. Sekvenční homologie může být určena pomocí jakékoliv vhodné metody, např. metodou Clustal™ z University Strasbourgh a pomocí tabulek identity získaných pomocí Genedoc™ (Karl B. Nicholas).

Předmětem předkládaného vynálezu jsou také sekvence nukleové kyseliny, které hybridizují se sekvencí podle prvního aspektu vynálezu za stringentních (přísných) podmínek, nebo sekvence nukleové kyseliny, která je s ní homologní nebo která by hybridizovala nebýt degenerace genetického kódu, a nebo β

• 0 · · ·· ·· *· • · · ···· · · 9 ··· «· ·· ···· 0« ··« oligonukleotidová sekvence specifická pro jakoukoliv z výše uvedených sekvencí.

Stringentní podmínky hybridizace jsou charakterizovány nízkou koncentrací solí nebo vysokou teplotou. NApř. vysoce stringentní podmínky jsou definovány, když DNA vázaná na pevný nosič hybridizuje v 0,5M NaHPO₄, 7% SDS (dodecylsulfát sodný), lmM EDTA v 65 °C, oplachování v 0,lxSSC/0,l% SDS v 68 °C (viz Ausubel a kol. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, 1, s. 2.10.3., Green Publishing Associates, lne. John Wiley and Sons lne., New York, 1989. Za určitých okolností mohou být potřebné méně stringentní podmínky. Mírně (středně) stringentní podmínky v tomto popisu vynálezu znamenají , že oplachování se provádí v 0,2xSSC/0,l% SDS ve 42 °C (viz Ausubel a kol., cit. výše). Hybridizační podmínky se mohou upravit na více stringentní přidáním vyššího množství formamidu, což destabilizuje vytvářené duplexy hybridní nukleové kyseliny. Konkrétní hybridizační podmínky mohou být snadno upravovány podle potřeby a vybírají se podle požadovaných výsledků. Obecně řečeno, výhodná hybridizační teplota v přítomnosti 50% formamidu je 42 °C pro sondu, která je z 95 až 100% homologní cílovou DNA, 37 °C v případě 90 až 95% homologie sondy a 32 °C v případě 70 až 90% homologie.

Příklad výhodné sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu je sekvence, která kóduje enzym s aktivitou enzymu giberelin-2-oxidázy z Phaseolus coccineus (např. PcGA2oxl) nebo ekvivalentní protein z jiné rostliny čeledi Fabaceae. Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu kóduje také enzym giberelin-2-oxidázu z Phaseolus vulgaris nebo z Arabidopsis thaliana (např. AtGA2oxl, AtGA2ox2 a AtGA2ox3).

Další sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu mohou obsahovat sekvence, jak byly výše popsány, kde kódující sekvence je operativně spojena s promotorem. Promotor je konstitutivní nebo a/nebo specifický pro expresi v určitém pletivu nebo určité buňce rostliny, např. v kořenech - RB7 z • · · · · · · · · · • i · · · « t · • · · · · · • » · · · «· » tabáku (Yamamoto a kol. , Plant Cell 3: 371-382, 1991), v zeleném pletivu - rbcS-3A z rajčete (Ueda a kol., Plant Cell 1: 217-227, 1989), v dělících se buňkách -histon H3 z kukuřice (Brignon a kol. , Plant Mol. Biol. 22: 1007-1015, 1993, nebo CYC07 z Arabidopsis thaliana (Ito a kol. , Plant Mol. Biol. 24: 863-878, 1994), v rostlinném meristému užitím KNAT1 z Arabidopsis thaliana (Lincoln a kol. Plant Cell 6, 1859-1876, 1994, v cévním pletivu užitím GRP1.8 z fazolu (Keller, B. a Heierli, D., Plant Mol. Biol.26: 747-756, 1994), v květech užitím ACT11 z Arabidopsis thaliana (Huang a kol. Plant Mol. Biol. 33: 125-139, 1997) nebo chalkonsyntázy z petúnie (Vandermeer a kol. Plant Mol. Biol. 15: 95-109, 1990), v pestíku užitím SK2 z bramboru (Ficker a kol. Plant Mol. Biol. 35: 425-431, 1997), v prašníkách užitím TA29 z Brassica (Deblock, M., a Debrouwer, D., Planta 189: 218-225, 1993, v plodech užitím polygalakturonázy z rajčete (Bird a kol. Plant Mol. Biol. 11: 651-662, 1988). Alternativní promotory mohou být získány z rostlinných virů, např. 35S promotor z viru mozaiky květáku (CaMV). K vhodným promotorovým sekvencím patří promotorové sekvence z některých rostlinných druhů, např. z čeledi Brassicaceae.

Předkládaný vynález se týká také izolované, purifikované nebo rekombinantní sekvence nukleové kyseliny, která obsahuje promotor, který v přírodním stavu řídí expresi genu kódujícího enzym giberelin-2-oxidázu, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny jak je uvedena na obr. 1 nebo její funkční ekvivalent, nebo k ní komplementární řetězec nebo sekvenci s ní homologní.

Enzym giberelin-2-oxidáza je enzym z Phaseolus coccineus (např. PcGA2oxl) nebo ekvivalentní protein z jiného člena čeledi Fabaceae. Taková sekvence nukleové kyseliny může také kódovat enzym giberelin-2-oxidázu z P. vulgaris a A. thaliana (např. AtGA2oxl, AtGA2ox2 a AtGA2ox3). Výhodně sekvence nukleové kyseliny obsahuje promotor, který řídí expresi enzymu giberelin-2-oxidázy z P. coccineus, P. vulgaris nebo • · · · · ·· ·· · · • · · ···· · · · • · · · · ·· · ··· ·* ·· ···· ·· «··

Ά. thaliana. Taková promotorové sekvence obsahuje promotory, které se přirozeně vyskytují 5'-směrem od kódující sekvence uvedené na obr. 1. Promotory mohou být také vybrány tak, aby docházelo konstitutivně k nadměrné expresi („overexpression) nukleové kyseliny kódující giberelin-2-oxidázu. Promotory, které jsou indukovány vnějšími faktory, jako jsou např. chemické látky, rostlinné hormony, světlo nebo stress, mohou být také užity. K příkladům patří s patogenezí související geny indukovatelné kyselinou salicylovou nebo mědí řízená genová exprese (Mett a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 4567-4571, 1993), a tetracyklinem regulovaná genová exprese (Gatz a kol., Plant Journal 2: 397-404, 1992). K příkladům giberelinem indukovatelných genů patří γ-ΤΙΡ (Phillips, A.L. a Huttly, A.K., Plant Mol. Biol.24: 603-615, 1994) a GAST (Jacobsen, S.E. a Olszewski, N.E., Planta 198: 78-86, 1996). Geny giberelin20oxidázy jsou tlumeny („down-regulation) GA (Phillips a kol. , Plant Physiol. 108: 1049-1057, 1995) a jejich promotor navázaný na ORF (otevřený čtecí rámec) GA-2 oxidázy může být také užitečný z hlediska předkládaného vynálezu.

Enzym giberelin-2-oxidáza kódovaný sekvencí nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu výhodně katalyzuje 2βoxidaci molekuly C₁₉-giberelinu vnesením hydroxylové skupiny na C-2, po kterém následuje další oxidace, jejímž výsledkem je ketonový derivát.

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu může také kódovat mRNA, která je antisense RNA vzhledem k RNA normálně se vyskytující v rostlinných buňkách, nebo může kódovat RNA, která je schopná štěpit RNA normálně se vyskytující v rostlinných buňkách. Tudíž vynález poskytuje také sekvenci nukleové kyseliny kódující ribozym schopný specificky štěpit RNA kódovanou genem giberelin-2-oxidázy. Taková DNA kódující ribozym je obecně užitečná k inhibici deaktivace giberelinu, zejména Cig-GA.

···· «· ·· • « · · · • · · ·

Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu dále obsahují na 5'-konci signální sekvence, aby bylo možné směrovat expresi proteinového produktu. K signálním sekvencím patří také sekvence pro směrování proteinu („protein targeting sequence), které mohou směrovat exprimovaný protein do konkrétního místa uvnitř nebo vně hostitelské buňky, která exprimuje příslušnou nukleovou kyselinu. Alternativně sekvence nukleové kyseliny obsahují na 3'-konci signální sekvenci jako je např. polyadenylační signál nebo jiný regulační signál.

Předkládaný vynález nabízí významné výhody pro zemědělství tím, že poskytuje sekvence nukleové kyseliny, které regulují metabolismus giberelinových rostlinných hormonů. Regulace vede buďto k inhibicí růstu rostlin, když se zesílí působení giberelin-2-oxidázy, nebo k podpoře růstu, když se zabrání deaktivaci giberelinů giberelin-2-oxidázou. Tak např. v roce 1977 byly ztráty poléháním ve Velké Británii u pšenice 15 % a ječmene 30 %, což způsobilo pěstitelům škody ve výši 100 milionů Liber. Tudíž dostupnost odrůd obilovin, které by byly odolné k poléhání, s kratším a silnějším stéblem v důsledku sníženého obsahu GA, by byla značným finančním přínosem.

DAlší aspekt předkládaného vynálezu poskytuje antisense sekvence nukleové kyseliny, obsahující transkribovatelný řetězec DNA komplementární k alespoň částí řetězce DNA, která je přirozeně transkribována v genu kódujícím enzym giberelin-2oxidázu, jako je např. giberelin-2-oxidáza z P. coccineus, P. vulgaris nebo A. thaliana. Výhodné geny jsou PcGA2oxl, AtGA2oxl_r AtGA2ox2 a AtGA2ox3.

Antisense nukleové kyseliny a nukleové kyseliny kódující ribozymy popsané výše jsou příklady obecnějšího principu: ještě další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje DNA, která způsobuje (např. svou expresí) selektivní narušení správné exprese genu giberelin-2-oxidázy, ve výhodném provedení genu PcGA2oxl z P. coccineus.

• ···· ·· · · ·· • · · · · · · ··· ··· ··· · · · ··· ·· ·· ···· ·· ···

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje izolovaný, purifikovaný nebo rekombinantní polypeptid obsahující enzym giberelin-2-oxidázu, který má aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedena na obr. 2.

Rekombinantní DNA podle vynálezu je ve formě vektoru. Vektor je např. plazmid, kozmid, fág nebo arteficiální chromozóm. Vektory často obsahuje jeden nebo více selekčních markérů, které umožňují selekci transfekovaných buněk (nebo transformovaných, oba termíny se používají zaměnitelně v popisu předkládaného vynálezu), výhodně umožňují selekci buněk nesoucích vektory s vloženou heterologní DNA. Obecně jsou ve vektorech přítomny vhodné „start a „stop signály. A dále, pokud je vektor zamýšlen jako expresní vektor, obsahuje regulační sekvence dostatečné pro expresi. Jelikož DNA podle vynálezu bude zpravidla exprimována v rostlinných buňkách, a mikrobiální exprese není hlavním cílem vynálezu, ačkoliv není vyloučena (např. v bakteriálních buňkách nebo v kvasinkách). Vektory, které neobsahují regulační sekvence, jsou užitečné jako klonovací vektory.

Klonovací vektory mohou být vneseny do E. coli nebo jiného vhodného hostitele, který umožňuje manipulovat s nimi. Jeden aspekt předkládaného vynálezu proto poskytuje hostitelskou buňku transformovanou sekvencí nukleové kyseliny popsanou výše. dalším provedením předkládaného vynálezu je produkce enzymu expresí cDNA GA-2-oxidázy v heterologním hostiteli, jako je např. Escherichia coli, kvasinky včetně kmenů Saccharomyces cerevisiae, nebo v hmyzích buňkách infikovaných bakulovirem obsahujícím rekombinantní DNA. Enzym se pak užívá k výrobě 2p-hydroxylovaných GA a GA-katabolitů nebo pro přípravu protilátek proti GA-2-oxidázám. Hostitelské buňky mohou být také vhodné rostlinné buňky v buněčné kultuře nebo jako součást kalusového pletiva.

Sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakoukoliv v oboru známou metodou, včetně • «··· ·· · · ·· ·· · · · · · ··· • · · · · · · např. kondenzace po sobě následujících nukleotidů a/nebo ligace (spojení) oligonukleotidů a polynukleotidů, kromě jiného i bezbuněčném systému, ale známé metody rekombinantní DNA (tj. genového inženýrství) jsou výhodné metody pro realizaci vynálezu.

Nakonec nukleové kyseliny podle vynálezu jsou vneseny do rostlinných buněk, a sice jakýmkoliv v oboru známým způsobem. Tudíž další aspekt vynálezu poskytuje rostlinnou buňku obsahující nukleovou kyselinu podle vynálezu.

Výhodně jsou nukleové kyseliny podle vynálezu vneseny do rostlinných buněk transformací užitím binárního vektoru pLARS120, modifikované verze pGPTV-Kan (becker a kol. Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197, 1992), kde je β-glukuronidázový reportérový gen nahrazen promotorem 35S z viru mozaiky k\rětáku (CaMV) z plazmidu pBl220 (Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405, 1987). TAkové plazmidy mohou pak být vneseny elektroporací do Agrobacterí um tumefacíens a pak mohou být přeneseny do hostitelských buněk metodou vakuové filtrace. Alternativně lze provést transformaci užitím vektorů z upravených Ti-plazmidů vnesených do Agrobacterium tumefacíens postupem v oboru známým, např. jak bylo popsáno v EP-A-0116718 a EP-A-027082. Pokud je přenos pomocí Agrobacterium tumefacíens neúčinný, cizorodá DNA může být vnesena přímo do rostlinných buněk pomocí zařízení pro aplikaci elektrického výboje, např. pro transformaci jednoděložných rostlin. V podstatě jakákoliv jiná metoda, které vede k trvalé inkorporaci sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu do jaderné nebo mitochondriální DNA rostlinné buňky, je vhodná. Týká se to také rostlinných druhů, které dosud nejsou schopny genetické transformace.

Výhodně sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu pro vnesení do hostitelských buněk také obsahují druhý chimérický gen (gen pro markér) , který umožňuje snadno odlišit transformované rostliny obsahující cizorodou DNA od ostatních rostlin, které neobsahují cizorodou DNA. K příkladům takových markerových genů patří geny rezistence k antibiotikům (HerreraEstrella a kol., EMBO J. 2: 987-995, 1983), geny rezistence k herbicidům (EP-A-0242246) a glukuronidázový (GUS) expresní systém (EP-A-0344029). Exprese markerových genů je výhodně řízena druhým promotorem, který dovoluje expresi v buňkách ve všech stadiích vývoje, takže přítomnost markerového genu může být určena ve všech stadiích regenerace rostliny.

Celá rostlina může být regenerována z jediné transformované rostlinné buňky, předkládaný vynález proto poskytuje také transgenní rostliny (nebo jejich části, jako je materiál vhodný k množení, tj. protoplasty, buňky, kalusy, pletiva, orgány, semena, embrya, vajíčka, zygoty, hlízy, kořeny a pod.) obsahující sekvence nukleových kyselin podle vynálezu. Termín „transgenní se v popisu předkládaného vynálezu není omezen pouze na označení organismu, který obsahuje v zárodečné linii jeden nebo několik genů jiného druhu, ačkoliv mnoho těchto organismů obsahuje takový gen nebo geny. Tento termín se spíše užívá v širším významu k označené jakéhokoliv organismu, jehož zárodečná linie byla technickým způsobem pozměněna, t j. metodami genového inženýrství. Tak např. organismus, jehož endogenní gen byl v jeho zárodečné linii odstraněn, duplikován, aktivován nebo modifikován, je transgenním organismem ve smyslu předkládaného vynálezu, stejně tak jako organismus, do jehož zárodečné linie byla přidána exogenní DNA.

K výhodným druhům rostlin patří jednoděložné rostliny, avšak ne výlučně, včetně semen a potomstva z odnoží, např. biologických rodů Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Triticale, Sa echa rum, Bromus, Oryza, EÁvena, Hordeum, Secale a Setaria. zejména užitečné transgenní rostliny jsou kukuřice, pšenice, ječmen a jejich semena. Dvouděložné rostliny spadají také do předmětu předkládaného vynálezu, a k výhodným transgenním rostlinám patří, avšak ne výlučně, rostlinné druhy z čeledí Fabaceae, Solanacea, Brassiceae, zejména brambory, fazole, • · · · · · zelí, ale i lesní stromy, růže, klematis, řepka olejná, slunečnice, chrysantéma, Poinsetia a Antirrhinum.

Screening rostlinných buněk, tkání a celých rostlin na přítomnost specifických sekvencí DNA lze provést Southernovým přenosem, jak bylo popsáno např. v příručce Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). Takový screening se může také provádět pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce), což je metoda v oboru známá.

Transformace rostlinných buněk zahrnuje oddělení transformovaných rostlinných buněk od těch, které nebyly transformovány. Vhodnou metodou pro takové oddělení nebo selekci je vložení genu pro selekční markér do genetického materiálu, který se vnáší do rostlinné buňky. Výsledkem pak je, že pouze ty buňky, které byly úspěšně transformovány, obsahují markerový gen. Translační produkt markerového genu typicky vnáší fenotypový znak, který umožňuje selekci. Obvykle je takovým fenotypovým znakem schopnost přežívat v přítomnosti určitého chemického činidla, jako je např. antibiotikum, např. kanamycin, G418, paromomycin atd., které je pak součástí selekčního média. K příkladům genů, které poskytují rezistenci k antibiotikům, patří např. gen kódující neomycinfosfotransferázu, tj. rezistenci ke kanamycinu (Velten a kol., EMBO J. 3: 2723-2730, 1984), rezistenci k hygromycinu (van den Elzen a kol.. Plant Mol. Biol.5: 299-392, 1985,), gen rezistence ke kanamycinu (NPTII) odvozený z Tn5 (Bevan a kol. , NAture 304: 184-187, 1983, McBride a kol. Plant Mol. Biol. 14, 1990) a gen chloramfenikolacetyltransferázy. Pro vnesení rezistence k herbicidu lze užít gen PAT, který popsali Thompson a kol., EMBO J. 6: 2519-2523, 1987).

Příkladem genu užitečného primárně jako selekční markér v tkáňové kultuře pro identifikaci rostlinných buněk obsahujících připravené vektory, je takový gen, který produkuje chromogenní produkt. Příkladem takové genu je gen ··*· ·· · · ·· • · · · · ··· kódující β-glukuronidázu (GUS). Tento enzym se široce využívá, jeho příprava a použití byly popsány v Jefferson a kol. (Plant Mol. Biol. Reportér 5: 387-405, 1987).

Jakmile jsou transformované rostliny kultivovány na selekčním médiu, selektují se přežívající buňky pro další zkoumání a manipulace. Způsoby a materiály vhodné pro selekci jsou odborníkům známy, a umožňují selektovat takové buňky, které byly s velkou pravděpodobností úspěšně transformovány exogenní DNA.

Po transformaci rostlinných buněk nebo rostlin pomocí např. Ti-plazmidu z Agrobacterium, rostliny transformované plazmidem čili exprimující enzym, se mohou selektovat na základě vhodného fenotypového markéru. K těmto fenotypovým markérům patří, aniž by však byl výčet omezen, rezistence k antibiotikům. Také jiné fenotypové markéry, odborníkům známé, mohou být využity v předkládaném vynálezu.

Pozitivní klony jsou regenerovány metodami, které jsou odborníkům známy. Připravené transformované rostliny se vyhodnocují z hlediska výskytu požadované vlastnosti a/nebo rozsahu, v jakém je požadovaná vlastnost exprimována. První hodnocení transgenních rostlin může obsahovat např. míru rezistence k bakteriím/houbám, trvalou dědičnost požadovaných vlastností, polní pokusy apod.

Jako souhrnný a ilustrativní příklad je zde uveden typický postup, kterým se připravuje transgenní materiál, včetně celých rostlin. Obecně tento způsob obsahuje pět kroků:

1) izolace z vhodného zdroje nebo syntéza, a to způsoby odborníkovi známými, sekvence DNA kódující protein projevující aktivitu GA-2 oxidázy,

2) operativní spojení sekvence DNA ve směru 5'- 3' k rostlinné expresní sekvenci, definované výše,

3) transformace rostlinného materiálu konstruktem podle bodu 2) užitím odborníkovi známých způsobů a exprese konstruktu v rostlinném materiálu, • ···· · · · · · · ·· · · · · · · · ·

4) screening rostlinného materiálu z bodu 3) na přítomnost DNA sekvence kódující protein projevující aktivitu GA-2 oxidázy, a

5) volitelně regenerace celé rostliny z transformovaného materiálu z kroku 3).

Předkládaný vynález se také týká transgenních rostlin, včetně jejich sexuálního a/nebo asexuálního potomstva, které byly transformovány sekvencí rekombinantní DNA podle vynálezu. Regenerace rostlin se může provádět jakýmkoliv známým způsobem, který je vhodný, z vhodného rozmnožovacího materiálu, buďto připraveného dle popisu výše, nebo získaného z takového materiálu.

Termín sexuální a/nebo asexuální potomstvo zahrnuje podle vynálezu všechny mutanty a varianty, které mohou být získány způsoby, které jsou odborníkovi znám, jako je např. buněčná fúze nebo selekce mutant, a které stále ještě mají charakteristické vlastnosti původních transformovaných rostlin, a také všechny produkty křížení a fúzí transformovaného materiálu.

Dalším předmětem vynálezu je proliferační materiál transgenních rostlin. Proliferační materiál transgenních rostlin je podle vynálezu definován jako jakýkoliv rostlinný materiál, který může být sexuálně rozmnožován in vivo nebo in vitro. Ke zvláště výhodným příkladům patří protoplasty, buňky, kalusy, pletiva, orgány, semena, embrya, vaječné buňky, zygoty a jakýkoliv další rozmnožovací materiál získaný z transgenních rostlin.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje protilátky proti alespoň části aminokyselinové sekvence giberelin 2-oxidázy. Takové protilátky jsou užitečné pro screening cDNA knihovny získané z RNA z rostlinného pletiva ve vhodném vektoru.

Gen giberelin 2-oxidázy podle předkládaného vynálezu je » Μ

0« 0 «000 <000 0 0 0» 0 000 • 0000 · 0 0 0 0 00« 00» 000 000 »» 00 0000 00 00 0 užitečný pro modifikaci růstu a vývojových procesů transgenních rostlin. Dalším důležitý aspekt předkládaného vynálezu se proto týká přípravy transgenních rostlin nebo semen, kde je giberelin 2-oxidáza konstitutivně nadměrně exprimována, což snižuje koncentraci bioaktivních giberelinů v rostlině nebo semenech. K výhodným genům pro giberelin-2-oxidázu patří PcGA2oxl, AtGA2oxl, AtGA2ox2 a AtGA2ox3. Takové transgenní rostliny nadměrně exprimující připomínají rostliny, které byly ošetřeny růstovými retardanty. vynález lze tudíž využít k redukci vegetativního růstu, tedy např. ke zlepšení poléhavosti obilovin, zabránění poléhání u řepky olejně a ke zlepšení struktury porostu, zlepšení kvality semenáčků pro přesazování, snížení růstu okrasných trav, redukce růstu kmene u sadových a okrasných stromů, produkci okrasných rostlin s kompaktnějším habitem, zlepšení tolerance k chladu, suchu a infekcím, zlepšení výnosů přesunem asimilátů z vegetativních do reprodukčních orgánů, eliminace předčasného dozrávání u křížatých rostlin, např. cukrové řepy, salátu, řepky a špenátu. Vynález lze rovněž využít k indukci samčí a/nebo samičí sterility expresí v květních orgánech, k zabránění předsklizňového klíčení u obilovin, k redukci růstu rostlin pro živé ploty, k reverzibilní inhibici klíčení semen a k redukci růstu komerčních dřevin.

Nadměrná exprese nukleových kyselin kódujících GA-2 oxidázu může být dosažena užitím DNA konstruktů, které obsahují konstitutivní promotor a kódující sekvenci nukleové kyseliny, v transgenních rostlinách připravených technikami rekombinantní DNA. Alternativně lze nadměrné exprese dosáhnout užitím technik homologní rekombinace k tomu, že se do jádra buňky vloží konstitutivní promotor do míst upstream od normální umlčené kopie nukleové kyseliny podle vynálezu.

Předkládaný vynález dále poskytuje použití sekvence nukleové kyseliny definované výše, pro přípravu transgenních rostlin a/nebo semen, kde je snížena (tj. umlčena) exprese

endogenního genu pro GA-2 oxidázu, např. tím, že se exprimují antisense kopie sekvence DNA endogenní GA-2 oxidázy, exprimují se zkrácené sense kopie endogenního genu GA-2 oxidázy (ko-suprese) nebo se užijí syntetické ribozymy zacílené na endogenní transkripty. K výhodným genům GA-2 oxidázy podle vynálezu patří PcGA2oxl, AtGA2oxl, AtGA2ox2 a AtGA2ox3.

To vede k rostlinám s redukovaným metabolickým obratem, a tudíž zvýšenou koncentrací, bioaktivního GA. V této formě může být vynález využit např. ke zlepšení nasazování plodů a růstu plodů u bezsemenného hroznového vína, citrusů a hrušek, zlepšení textury pokožky jablek a tvaru plodů, prodloužení stébla a tudíž výnosů u cukrové třtiny, zvýšení výnosů a ranosti u celeru a rebarbory, zlepšení výnosů a sladovnické kvality u obilovin, zejména u chmelu. Může být také využit ke zvýšení výnosů u dřevin.

Výhodné rysy druhého a dalších aspektů vynálezu jsou výhodné také pro první aspekt vynálezu a mutatís mutandis.

Předkládaný vynález je dále popsán pomocí následujících příkladů a také výkresů, jejichž funkce je pouze ilustrativní a nijak rozsah vynálezu neomezují. Příklady se odkazují na následující obrázky:

Přehled obrázků

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci cDNA giberelin-2-oxidázy z P. coccineus, klon pc-2boh.dna (PcGA2oxl) s kódujícím úsekem zahrnujícím nukleotidy (nt) 68 až 1063 (332 aminokyselin).

Obr. 2 ukazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci pro nukleotidovou sekvenci z P. coccineus (PcGA2oxl) uvedenou na obr. 1.

Obr. 3 ukazuje sekvenci DNA sondy T3 pro Arabidopsis thaliana (obr. 3a) a sondy T24 (obr. 3b).

• · • · · · · · β· ···· »· ··

Obr. 4 ukazuje dvě hlavní metabolické dráhy biosyntézy giberelinu.

Obr. 5 ukazuje parciální nukleotidovou sekvenci klonu at-2bt3 (AtGA2oxl) z Arabidopsis thaliana s kódující úsekem obsahujícím nukleotidy Nt) 41 až 1027 (329 aminokyselin).

Obr. 6 ukazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci klonu at-2bt3 {AtGA2oxl) z Arabidopsis thaliana.

Obr. 7 ukazuje parciální nukleotidovou sekvenci klonu at-2bt24 (AtGA2ox2) z Arabidopsis thaliana s kódující úsekem obsahujícím nukleotidy (nt) 109 až 1131 (341 aminokyselin).

Obr. 8 ukazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci klonu at-2bt24 (AtGA2ox2) z Arabidopsis thaliana.

Obr. 9 ukazuje nukleotidovou sekvenci genomového klonu

T31E10.il (AtGA2ox3].

Obr. 10 ukazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci genomového klonu T31E10.11 (AtGA2ox3).

Obr. 11 ukazuje fotografii transformovaných rostlin Arabidopsis thaliana (ekotyp Columbia) exprimujících cDNA pro giberelin 2-oxidázu z P. coccineus řízenou promotorem 35S CaMV, včetně transformovaných rostlin nevykazujících zvláštní fenotyp (zcela vpravo).

····· · · ·· ·· « • · · · · · · ···« • · · ·· ·· ···· · · ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace cDNA klonu kódujícího GA 2P~hydroxylázu z Phaseolus coccineus cDNA klon kódující GA 2p-hydroxylázu byl izolován z embryí Phaseolus coccineus užitím screeningu cDNA knihovny na expresi funkčního enzymu, a sice následujícím postupem:

RNA byla izolována z děložních lístků zralých semen Phaseolus coccineus postupem, který publikoval Dekker a kol. (1989). Poly(A)+ mRNA byla purifikována chromatografií na oligo(dT)-celulóze. cDNA byla syntetizována z 5 pg Póly(A)+ mRNA pomocí soupravy pro usměrněnou syntézu cDNA (λ-ΖΑΡ II cDNA synthesis kit, Stratagene). cDNA byla ligována s rameny λ-ΖΑΡ II, sbalena pomocí sbalovací („pakážovací) soupravy Gigapack Gold III (Stratagene) a bylo amplifikováno 1 χ 10⁶ klonů podle návodu výrobce.

Fagemidový základní kmen byl připraven z cDNA knihovny P. coccineus (1 χ 10⁹ pfu) vystřižením in vivo podle protokolu výrobce (Stratagene). pro primární screening byl E. coli infikovány základním fagemidovým kmenem podle protokolu výrobce (Stratagene) , což poskytlo přibližně 11000 - jednotek vytvářejících kolonie (cfu). Ty byly rozděleny do 48 jamek objem jamky 3,5 ml) mikrodestičky (destička s uspořádáním 6 x 8) a amplifikovány kultivací přes noc s třepáním při teplotě 37 °C v 0,5 ml živného média 2xYT s přídavkem 50 pg/ml kanamycinu a 100 pg/ml karbenicilinu. Alikvóty (20 pl) ze šesti jamek v každé řadě, a z osmi jamek v každém sloupci byly sloučeny a vytvořily tak 14 sloučených skupin, z nichž každá byla přidána k 10 ml média 2YT s přídavkem 50 pg/ml kanamycinu a 100 pg/ml karbenicilinu, a byly kultivovány přes noc s třepáním při • ···· ·· · · · · ·· · ···· ·· • · · · · · · • · teplotě 37 °C až do dosažení hodnoty OD₆oo 0,2 až 0,5. Kultury pak byly přeneseny do třepaného inkubátoru s 30 °C a produkce rekombinantního proteinu byla indukována přidáním IPTG na finální koncentraci lmM. Indukce kultur trvala 16 hodin. Bakterie pak byly sklizeny centrifugaci (3000 g, 10 minut) a resuspendovány v 750 μΐ lyzovacího pufru (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5mM DTT). Baktérie pak byly lyžovány sonikací (3 x 10 sekund) a zbytky buněk byly odstraněny centrifugaci 10 minut v minicentrifuze. Supernatant byl pak testován na přítomnost GA 2P~hydroxylázové aktivity níže popsaným postupem. Buněčné lyzáty ze sloučených bakterií řady 6 (R6) a sloupce 1 (Cl) byly schopné katalyzovat uvolňování ³H2O z [1,2-³H2]GA₄ a [2,3— ³H₂]GA₉. Pro sekundární screening byly baktérie z jamek R6C1 vysety na plotny s 2YT-agarem s přídavkem 50 gg/ml kanamycinu a 100 pg/ml karbenicilinu a pěstovány 16 hodin ve 37 °C. Bylo odebráno 100 kolonií náhodným způsobem a tyto kolonie byly přeneseny do 5 ml média 2xYT obsahujícího 50 μρ/πιΐ kanamycinu a 100 μρ/πιΐ karbenicilinu a dále pěstovány za třepání 16 hodin ve 37 °C. Kultury pak byly uspořádány do mřížky 10 x 10 a sloučené vzorky z každé řady a každého sloupce byly indukovány a analyzovány na GA 2P~hydroxylázovou aktivitu jak bylo již výše popsáno. Řady 2 a 9 a sloupce 7 a 10 byly schopné katalyzovat ³H20 z [1,2-³H2]GA₄ a [2, 3-³H₂]GA₉. Kultury č. 27 a 90 byly zodpovědné za tyto aktivity. Předpokládaný klon GA 2p-hydroxylázy byl označen 2B27.

Plazmidová DNA, izolovaná z klonu 2B27 použitím soupravy Promega SV miniprep kit, byla sekvencována pomocí soupravy pro sekvencován! Taq cycle sequencing kit, Amersham užitím oligonukleotidových primerů pro sekvencován! M13 universal(20) a reverse. Produkt terminační sekvenační reakce byl analyzován pomoci automatického sekvenačního analyzátoru Applied Biosystems 373A. Sekvenční analýzy získaných dat pak byla provedena pomocí programového vybavení Sequencer 3.0 (gene Code Corporation). další analýzy nukleotidových a aminokyselinových sekvencí byly provedeny pomocí programového vybavení GCG (Genetic Computer Group, University of Wisconsin).

Příklad 2

Analýza GA-2 oxidázové aktivity inkubováno s v přítomnosti

GA 2p-hydroxylázová aktivita byla stanovena měřením uvolňování ³H₂O z 2p-tritiem značeného substrátu, jak popsali Smith a MacMillan (Smith,V.A., MacMillan, J., J. Plant Growth Regulation, 2: 251-164, 1984. 90 μΐ bakteriální lyzátu bylo [1,2-³H2]GA4 a [2,3-³H2]GA₉ (přibližně 50000 dpm) 4mM 2-oxoglutarátu, 0,5mM Fe(II)SC>4, 4mM askorbátu, 4 mM DTT, 1 mg/ml katalázy, 2 mg/ml BSA, v celkovém reakčním objemu 100 μΐ . reakční směs byla inkubována 60 minut ve 30 °C. Tritiem označený GA byl odstraněn přidáním 1 ml aktivovaného uhlí (5% hmot./objem) a následnou centrifugací 5 minut v mikrocentrifuze. Alikvoty (po 0,5 ml) supernatantu byly smíchány s 2 ml scintilační tekutiny a byla změřena radioaktivita scintilačním počítačem.

Tiby bylo možné potvrdit funkci expresního produktu cDNA, byl bakteriální lyzát inkubován s [17-¹⁴C]GA v přítomnosti kofaktoru, jak bylo popsáno výše. Po inkubaci bylo přidáno 10 μΐ kyseliny octové a 140 μΐ vody s pH 3,0 a směs byla centrifugována 10 minut při 3000 rpm.' Supernatant byl analyzován HPLC s on-line monitorováním radioaktivity a produkt byl identifikován pomocí GC-MS, jak již bylo publikováno (macMillan a kol., Plant Physiol. 113: 1369-1377, 1997).

····· ·» ·· ·· * • · · · · » · · « · * • · · «· · · · · · · · · ··

Příklad 3

Klonování cDNA kódující GA-2 oxidázu z Arabidopsis thaliana

Predikovaná proteinová sekvence klonu 2B27 byla použita k prohledávání databáze sekvencí Genomic Survey Sequences (National Centre for Bioogical Information, ncbi.nlm.nih.gov) pomocí programu TblastN. bylo zjištěno, že dvě genomové sekvence z Arabidopsis thaliana, T3M9-Sp6 a T24E24TF vykazovaly velkou míru identity aminokyselinových sekvencí se sekvencí 2B27. Na základě genomové sekvence T3M9-Sp6 byly navrženy následující oligonukleotidové primery:

5'-TAATCACTATCCACCATGTC-3' (sense)

5'-TGGAGAGAGtCACCCACGTT-3 (antisense)

A na základě genomové sekvence T24E24TF byly navrženy oligonukleotidové primery:

5'-GGTTATGACTAACGGGAGGT-3' (sense)

5'-CTTGTAAGCAGAAGATTTGT-3 (antisense) a byly užity v PCR (polymerázové řetězové reakci) s genomOvou DNA Arabidopsis thaliana jakožto templátem. PCR reakční směs obsahovala 200 ng genomové DNA, lx PCR pufr, 1,5 mM MgCl₂, 200 μΜ deoxynukleosidtrifosfátů, 1 μΜ každého primeru a 2 jednotky Tag DNA polymerázy (Promega). Reakce byla zahájena zvýšením teploty na 94 °C na 3 minuty a pak proběhlo 35 cyklů amplifikace (94 °C, 30 sekund, 55 °C, 30 sekund, 72 °C, 30 sekund) a nakonec 10 minutová inkubace při 72 °C. Vzniklé PCR produkty byly přímo klonovány do vektoru pCR2.1 pomocí klonovací soupravy TA Cloning Kit (Stratagene). Klony byly označeny AtT3 a AtT24. Tobolky, květy, horní část stonku (horní 2 cm), spodní část stonku, listy (jak ze stonku tak z přízemní * · ··· ··· ·· ··· ·· ·· · · · · ·· · růžice) a kořeny z Arabidopsis thaliana ekotypu Columbia byly odebrány a zmraženy v kapalném N₂. Póly(A)+ mRNA byla extrahována jak bylo již popsáno výše. Po elektroforéze vzorků 5 μς Póly(A)+ mRNA na agarózovém gelu obsahujícím formaldehyd byly vzorky přeneseny na nitrocelulózovou membránu metodou tzv. Northern přenosu (viz Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Pomocí náhdných primerů byly pro atT3 i AtT24 připraveny sondy značené ³²P užitím soupravy se značícími perličkami Ready to go labelling beads, Pharmacia. Obr. 3 ukazuje DNA sekvenci sondy T3 (obr. 3a) a sondy T24 (obr. 3B) Arabidopsis thaliana. Hybridizace se prováděla za přítomnosti 50 % formamidu 16 hodin při teplotě 42 °C (hybridizační pufr: 5x SSPE, 2x Denhardtův roztok, 0,5% (hmot.) SDS, 100 gg/ml denaturované sonikované DNA ze spermatu lososa, 10% dextransulfát. membrány pak byly opláchnuty dvakrát po 10 minutách v lx SSC/0,5% SDS při 20 °C. Pak byly znovu 2 x opláchnuty po 10 minutách v 0,lx SSC/0,5% SDS při 60 °C. Pak byly membrány exponovány při -80 °C na film Kodak MS s užitím intenzifikačního stínítka: výsledek ukázal, že nejvyšší exprese byla v květech. cDNA knihovna byla konstruována z 5 gg Póly(A)+ mRNA z květů. Celkem bylo vyseto 5 χ 10⁵ rekombinantních fágů v E. coli XL-1 Blue MRF' na pěti čtvercových miskách 24 x 24 cm. Plaky byly pěstovány až do konfluEnce (8 až 10 hodin), pak byly provedeny otiskly ve dvou replikách na nitrocelulózový filtr 20 x 22 cm (Nitropure, MSI) metodou dle Sambrook a kol. (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) Hybridizace se sondami AtT3 a AtT24 značenými ³²P byla provedena jak bylo popsáno výše. Pozitivní plaky byly identifikovány pomocí autoradiografie a přeneseny z misek do 750 μΐ pufru SM (50mM Tris HCI, pH 7,5, lOOmM NaCl, lOmM MgSC>4, 0,5% želatina) a znovu screenovány, dokud nebyly izolovány klony bez plaků. Získávání plazmidů bylo prováděno s použitím soupravy Rapid • ···· ·· · · ·· • · · · · · · ·· • · · · · · · β • · ♦ · · ··«· * • · ··· ·· ·· ···· ·· ··

Excision kit od Stratagene. cDNA klony byly sekvencovány a rekombinantní protein exprimován v E. coli a testován na aktivitu GA 2-oxidázy, jak je popsáno výše. Parciální nukleotidové sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence pro klony jsou ukázány na obrázcích 5, 6, 7 a 8.

V databázi GenBank byla také detekována třetí genomová sekvence Arabidopsis T31E10.il (AtGA2ox3) s vysokou aminokyselinovou identitou s GA 2-oxidázou P. coccineus (PcGA2oxl). Její odvozená aminokyselinová sekvence má 53%, 49% a 67% identitu (67%, 67% a 84% podobnost) s GA 2-oxidázou P.

coccineus (PcGA2oxl), T3 (AtGA2oxl) a T24 (AtGA2ox2), v daném pořadí. Nukleotidové sekvence T31 je ukázána na obrázku 9 a dedukovaná aminokyselinová sekvence je ukázána na obrázku 10.

Příklad 4

Transformace Arabidopsis se sense a antisense konstrukty s cDNA GA 2-oxidázy

Predikovaná kódující oblast 2B27 byly amplifikována prostřednictvím PCR s použitím oligonukleotidových primerů:

5'-TGAGCTCAACCATGGTTGTTCTGTCTCAGC-3' (sense), a

5'-TGAGCTCTTAATCAGCAGCAGATTTCTGG-3' (antisense), každý z nich měl na svém 5' konci inkorporované restrikční místo Sací. Produkt PCR byl subklonován do pCR2.1 pro usnadnění sekvencování DNA, jak je popsáno výše. Kódující oblast 2B27 byla štěpena se Sací a subklonována do místa Sací binárního vektoru pLARS120, modifikované verze pGPTV-Kan (Becker a kol., Plant. Mol. Biol., 20, 1195-1197, 1992), ve kterém je β-glukuronidázový reportérový gen nahrazen 35S promotorem viru mozaiky květáku z pB!220 (Jefferson, R.A., Plant. Mol. Biol.

····· ·· ·» ·· · • · · ···· ···« ··♦ ·· ·· ···· ·· ··

Rep., 5, 387-405, 1987). DNA byla vložena v sense orientaci pod kontrolou 35S promotoru. Plazmid byl zaveden do Agrobacetrium tumefaciens prostřednictvím elektroporace, a pak přenesen do Arabidopsis cv. Columbia prostřednictvím metody vakuové infiltrace (Bechtold a kol., Compt. Rend. Acad. Sci. Serie iiiSciences de la Vie-Life Science, 316, 1194-1199, 1993). Podobně byly fragmenty Sací z AtT3 a AtT24 subklonovány do pLARS120, kromě toho, že v těchto dvou případech byla DNA vložena v antisense orientaci pod kontrolu 35S promotoru. Arabidopsis byla transformována těmito dvěma antisense konstrukty, jak je popsáno výše.

Příklad 5(a)

Změněná exprese GA 2 oxidázy v transgenních rostlinách cDNA 2-oxidázy P. coccineus (PcGA2oxl} v sense orientaci a cDNA 2-oxidázy A. thaliana v antisense orientaci byly vloženy mezi CaMV 35S promotor a nos terminátor ve vektoru pLARS120. Vektor pLARS120 je binární vektor pro transformaci rostlin zprostředkovanou Agrobacterium·. T-DNA obsahuje, kromě CaMV 35S promotoru a nos terminátoru, nptll selektivní markér pod nos promotorem. Vektor pochází z pGPTV-Kan (Becker a kol., Plant. Mol. Biol., 20, 1195-1197, 1992), reportérový gen uidA v pGPTVKan byl nahrazen 35S promotorem. Binární expresní konstrukty byly zavedeny pomocí elektroporace do kmene GV3101 Agrobacterium tumefaciens nesoucího plazmid pAD1289 propůjčující nadměrnou expresi VirG. Ty byly zavedeny do Arabidopsis pomocí metody vakuové infiltrace (Bechtold a kol., Compt. Rend. Acad. Sci. Serie iii-Sciences de la Vie-Life Science, 316, 1194-1199, 1993). Aby se identifikovaly transgenní rostliny, byla semena z infiltrovaných rostlin pěstována na MS miskách doplněných kanamycinem (50 pg/ml) po ····· · · · · ·· · • · · ···· ···· ··· ·· ·· ···· ·· ·· dobu přibližně 14 dnů a rezistentní rostliny byly přeneseny do půdy. T-DNA obsahující konstrukt 2-oxidázy P. coccineus byla také zavedena do Nicotiana sylvestris pomocí infekce listových terčíků prostřednictvím transformovaného Agrobacterium tumefaciens.

Transformace rostlin Arabidopsis s cDNA GA 2-oxidázy P. coccineus pod kontrolu CaMV 35S promotoru poskytla následující výsledky. Více jak polovina všech transformant vykazovala určitý stupeň zastavení růstu, mnoho z nich bylo vážně zakrslých a některé nenasadily na květ. Obrázek 11 ukazuje fotografii výběru zakrslých transformovaných rostlin ve srovnání s transformovanou rostlinou nevykazující žádný fenotyp (ekotyp Columbia). Transformanty odpovídaly na ošetření s GA₃ zvýšeným prodloužením stonku a normálním vývojem květů, takže bylo možné získat semena. Nadměrná exprese cDNA GA 2-oxidázy P. coccineus v Nicotiana sylvestris měla za následek rostliny se sníženou výškou stonku. Jedna transformanta ani nenasadila ani netvořila květy, zatímco stejně staré netransformované rostliny již kvetly.

Příklad 5(b)

Změněná exprese GA 2-oxidázy v transgenních rostlinách

Bylo získáno pět linií Arabidopsis, které jsou homozygotní pro transgen 35S-PcGA2oxl. Jedna linie vyrazila stonek ve stejnou dobu jako rostliny divokého typu (Columbia), ale měla sníženou výšku stonku, zatímco další čtyři linie zůstaly jako přízemní růžice a nevyrazily, když byly pěstovány při dlouhých (16hodin) nebo krátkých (10 hodin) fotoperiodách. Jedna silně zakrslá linie selhala při tvorbě homozygotních rostlin, dokonce i když semena klíčila v přítomnosti GA₃, což indikovalo, že vývoj semen byl u této linie, kde byly přítomny • · · « • · • · · * ·· · ···· · · · <» • · · · · · 9 9' 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 dvě kopie genu, zhoršen. Vážně zakrslé linie měly malé tmavé listy, které zůstávaly v téměř svinutém stavu. Když byly pěstovány při dlouhých fotoperiodách, tak vytvářely poupata, ačkoliv se květy nevyvinuly normálně a byly infertilní. Když byly rostliny pěstovány při krátkých obdobích světla, nebyla získána žádná poupata. Ošetření transgenních linií s 10 μΜ GA₃ jim umožnilo, aby vyrazily a tvořily normální květy, které poskytly životaschopná semena.

U vážně zakrslé linie 35S-PcGA2oxl byl metabolismus Ci₉-Gas porovnán s metabolismem rostlin divokého typu. Na základě HPLC zakrslá linie konvertovala GAi, GA₄, GA₉ a GA₂o na 2-oxidované produkty do mnohem většího stupně, než rostliny divokého typu. Zakrslá linie nemetabolizovala GA₃, což pocvrdilo výsledky s rekombinantním enzymem ukazující, že GA₃ není substrát pro GA 2-oxidázy. Tento GA může být tedy použit, je-li žádoucí, pro reverzi GA deficitu plynoucího z nadměrné exprese genů GA 2-oxidázy.

Analýza northernovým přenosem linií 35S-PcGA2oxl potvrdila vysoký stupeň exprese transgenu. Přebytek transkriptů pro geny GA 20-oxidázy (AtGA2oxl) a 3£-hydroxylázy (AtGA3oxl) byl zvýšen u rozet linií 35S-PcGA2oxl ve srovnání s rostlinami divokého typu, zatímco hladina transkriptů nativní GA 2-oxidázy (AtGA2ox2) byla snížena jako důsledek kontrolního mechanismu GA homeostázy.

Příklad 6

Typy exprese Arabidopsis GA 2-oxidázy genů T3 a T24 (AtGA2oxl a AtGA2ox2) ^ΤΥΡΥ exprese Arabidopsis GA 2-oxidázy genů T3 a T24 byly vyšetřovány testováním northernových blotů s RNA extrahovanou z různých tkání sondami s kompletní cDNA. Geny vykazovaly • · 0 0 • · 0 · · · · · · · » • 0 ·< · · · « • 0000 ···· · • · · 00· « » · 0 00 00 0 · · 0 ·· · · podobný typ exprese, kdy se transkripty obou genů vyskytovaly v listech, dolních částech stonků, horních částech stonků, květech a silicích. Nejvyšší stupeň exprese byl ve květech, silicích a horních částech stonků, nadbytek transkriptů se snižoval v tomto pořadí. T24, ale ne T3, byla také exprimována v kořenech. Nadbytek transkriptů obou T3 a T24 v nezralých poupatech u GA deficitních mutant Arabidopsis, gal-2, byl po ošetření s GA₃ zvýšen, což indikuje, že exprese těchto genů 2oxidázy je zvýšena prostřednictvím GA. To je v kontrastu s expresí genů GA 20-oxidázy a 3p-hydroxylázy, která je prostřednictvím GA tlumena. Nadbytek transkriptů T31 byl ve všech pletivech mnohem nižší než T3 nebo T24. Transkript T31 byl pomocí RT-PCR detekován ve květech, horních částech stonků a listech, ale ne v kořenech nebo luskách.

Příklad 7

Funkce rekombinantních GA 2-oxidáz z Phaseolus coccineus a Arabidopsis thaliana

Katalytické vlastnosti rekombinantních proteinů získaných expresí cDNA z P. coccineus (PcGA2oxl) a A. Thaliana [AtGA2oxl,

AtGA2ox2 a AtGA2ox3) v E. coli byly vyšetřovány inkubací v přítomnosti dioxygenázových kofaktorů s celou řadou GA substrátů značených ¹⁴C, zahrnujících Cig-GAs GAi, GA4, GAg a GA2o a C2o^-GAs, GA12, GAi5. U posledně uvedené sloučeniny byly inkubovány obě formy laktonu, zavřená i otevřená. S žádným enzymem nebylo dosaženo konverze GAi2, zatímco GA_i5 byl konvertován na jednoduchý produkt prostřednictvím PcGA2oxl a AtGA2ox2. Otevřená forma laktonu GA_i5 (20-hydroxyGAi₂) byla konvertována na stejný produkt prostřednictvím AtGA2ox2, ale méně účinně, než laktonová forma, zatímco konverze otevřeného laktonu GA₁₅ prostřednictvím PcGA2oxl nenastala. Hmotnostní • · · ♦ · ·· ·· « • ·· · · · · w • · · · · ♦ • · · · · · « • · · · · • · · · · · · · ·· spektrum produktu z GA15 je souhlasné se spektrem

2p-hydroxyGAi5, ačkoliv totožnost tohoto produktu je pouze předpoklédáaná, protože pro srovnání není dostupná autentická sloučenina.

Srovnání substrátových specifit rekombinantních enzymů pro C₁₉-GAs (tabulka 1) ukázalo, že GA₉ byl výhodný substrát pro PcGA2oxl, AtGA2oxl a AtGA2ox2. Rekombinantní enzymy se poněkud lišily ve svých substrátových specifitách, přičemž GA₄ byl konvertován stejně účinně jako GA₉ prostřednictvím PcGA2oxl a AtGA2ox3, ale byl relativně chudý substrát pro AtGA2oxl a AtGA2ox2. Ačkoliv GA20 byl 2p-hydroxylován účinněji než GA₄ prostřednictvím AtGA2oxl a AtGA2ox2, po inkubacích s GA₂₀ nebyl detekován žádný katabolit GA₂₉, zatímco byly získány nízké výtěžky katabolitu GA₃₄, když byl GA₄ inkubován s PcGA2oxl,

AtGA2ox2 a AtGA2ox3. Aktivity rekombinantních PcGA2oxl,

AtGA2ox2 a AtGA2ox3a pro 23-hydroxylaci GA₉ málo kolísaly v rozmezí pH 6,5 až 8, a aktivita AtGA2oxl vrcholila v pH 7, přičemž při pH ^5,9 a > 8,1 nebyla aktivita detekovatelná.

Výsledky ukazují, že non-3p-hydroxy C_i9-GA, které jsou bezprostřední prekurzory biologicky aktivních sloučenin, jsou pro GA 2-oxidázy lepší substráty, než aktivní GA samotné. Tudíž

nadměrná exprese genů GA	2-oxidázy	vede k tomu,	že se	tvoří
velmi málo aktivní GA.
Tabulka 1
Specifita rekombinantní	GA	2-oxidázy	pro substráty	C19—GA
Hodnoty jsou	0, 0	výtěžku	prostřednictvím	HPLC

radioaktivního monitorování produktů po inkubaci buněčných lyzátů z E. coli exprimujících cDNA s GA substrátem značeným ¹⁴C a kofaktory po dobu 2,5 hodiny. Produkty a substrát byly odděleny prostřednictvím HPLC a produkty identifikovány pomocí GC-MS. Kde je spojený výtěžek produktů < 100 %, zbytek je nekonvertovaný substrát.

« ♦ ·· · >

< * « · • 4 t • · · , • * * • 9 · · · ·

Rekombinantní	GA	substrát	2p-hydroxy GA	GA-katabolit
enzymy	značeny C	produkt	produkt
PcGA2oxl	GAX	100	-
	GA4	83	17
	GAg	87	13
	GA20	86	-
AtGA2oxl	GAi	41	-
	GA4	25	-
	GA9	91	-
	GA20	50	-
AtGA2ox2	GAi	100
	GA4	77	23
	ga9	-	100
	GA20	100	-
AtGA2ox3	GAi	100	stopa
	ga4	86	14
	ga9	100	-
	GA20	25	-

Biosyntéza giberelinu (GA)

Obrázek 4 ukazuje dvě hlavní dráhy biosyntézy giberelinu (GA) _f od GA12 do GA₄ a od GA53 do GA^. GAi a GA4 jsou biologicky aktivní GAs. Konverze GA_i2 na GA₉ a GA53 na GA₂o jsou katalyzovány GA 20-oxidázou. Konverze GA₉ na GA₄ a GA₂o na GAi jsou katalyzovány GA 33-hydroxylázou. GA₉, GA₄, GA₂₀ a GA_X jsou všechno substráty pro 2£-hydroxylázovou aktivitu GA 2-oxidázy, jsou konvertovány na GA51, GA34, GA₂₉ a GA₈, v příslušném pořadí. Tyto 2β-hydroxy1ováné GAs mohou být dále oxidovány na odpovídající katabolity. Předkládaný vynález ukazuje, že enzym z P. coccineus a dva enzymy z Arabidopsis thaliana katalýzují 23~hydroxylaci každého substrátu. Kromě toho předkládaný vynález ukazuje, že enzym z P. coccineus a jeden ze dvou enzymů

A. thaliana tvoří GA51 katabolit a GA34 katabolit, když jsou inkubovány s GA₉ a GA4, v daném pořadí.

• · • · ·

32.

SEZNAM SEKVENCÍ <210> 1 <211> 1318 <212> DNA <213> Phaseolus coccineus <400> 1 gtttctcttc cttaccctgt tctgcttctc tttttcatag taacaatcga caacaacaac 60 aacaaccatg gttgttctgt ctcagccagc attgaaccag tttttccttc tgaaaccatt 120 caagtccacg cccttgttca cggggattcc tgtggtcgac ctcacgcacc ccgatgccaa 180 gaatctcata gtgaacgcct gtagggactt cggcttcttc aagcttgtga accatggtgt 240 tccattggag ttaatggcca atttagaaaa cgaggccctc aggttcttta aaaaatctca 300 gtccgagaaa gacagagctg gtccccccga ccctttcggc tatggtagca agaggattgg 360 cccaaacggt gatgtcggtt gggtcgaata cctcctcctc aacaccaacc ctgatgttat 420 ctcacccaaa tcactttgca ttttccgaga aaatcctcat catttcaggg cggtggtgga 480 gaactacatt acagcagtga agaacatgtg ctatgcggtg ttggaattga tggcggaggg 540 gttggggata aggcagagga atacgttaag caggttgctg aaggatgaga aaagtgattc 600 gtgcttcagg ttgaaccact acccgccttg ccctgaggtg caagcactga accggaattt 660 ggttgggttt ggggagcaca cagacccaca gataatttct gtcttaagat ctaacagcac 720 atctggcttg caaatctgtc tcacagatgg cacttgggtt tcagtcccac ctgatcagac 780 ttcctttttc atcaatgttg gtgacgctct acaggtaatg actaatggga ggtttaaaag 840 tgtaaagcat agggttttgg ctgacacaac gaagtcaagg ttatcaatga tctactttgg 900 aggaccagcg ttgagtgaaa atatagcacc tttaccttca gtgatgttaa aaggagagga 960 gtgtttgtac aaagagttca catggtgtga atacaagaag gctgcgtaca cttcaaggct 1020 agctgataat aggcttgccc ctttccagaa atctgctgct gattaaccaa acacaccctt 1080 caaattccac tcattttacg cacgtgttat taccccaatt ttctttcctt tttcttttcc 1140 tgtgtctgtc taggtttcaa acagttgact ctacttgaca tatatagaaa atgaataggt 1200 taagatgttt atcattttct ttttcttgtt tcatctaagt gtaacagttg gtctcaactt 1260 ccctttcctc aattgtcaat ggaacgcaac tctagttaca aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1318 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Phaseolus coccineus <400> 2

Met Val Val Leu Ser Gin Pro Ala Leu Asn Gin Phe Phe Leu Leu Lys • · · · • · • ·

I ··· ·· · · «··· ·· ···

Pro Phe Lys Ser Thr Pro Leu Phe Thr Gly Ile Pro Val Val Asp Leu 20 25 30

Thr His Pro Asp Ala Lys Asn Leu Ile Val Asn Ala Cys Arg Asp Phe 35 40 45

Gly Phe Phe Lys Leu Val Asn His Gly Val Pro Leu Glu Leu Met Ala 50 55 60

Asn Leu Glu Asn Glu Ala Leu Arg Phe Phe Lys Lys Ser Gin Ser Glu 65 70 75 80

Lys Asp Arg Ala Gly Pro Pro Asp Pro Phe Gly Tyr Gly Ser Lys Arg 85 90 95

Ile Gly Pro Asn Gly Asp Val Gly Trp Val Glu Tyr Leu Leu Leu Asn 100 105 110

Thr Asn Pro Asp Val Ile Ser Pro Lys Ser Leu Cys Ile Phe Arg Glu 115 120 125

Asn Pro His His Phe Arg Ala Val Val Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Val 130 135 140

Lys Asn Met Cys Tyr Ala Val Leu Glu Leu Met Ala Glu Gly Leu Gly

145 150 155 160

Ile Arg Gin Arg Asn Thr Leu Ser Arg Leu Leu Lys Asp Glu Lys Ser

165 170 175

Asp Ser Cys Phe Arg Leu Asn His Tyr Pro Pro Cys Pro Glu Val Gin 180 185 190

Ala Leu Asn Arg Asn Leu Val Gly Phe Gly Glu His Thr Asp Pro Gin 195 200 205

Ile Ile Ser Val Leu Arg Ser Asn Ser Thr Ser Gly Leu Gin Ile Cys 210 215 220

Leu Thr Asp Gly Thr Trp Val Ser Val Pro Pro Asp Gin Thr Ser Phe 225 230 235 240 • · · · • · • · · · · · * ··· • ♦ · · · · 9 • · · · · 9 9·· • · · ·»· «· • · « ·· 4· ···· ·« ·

Phe

Ile Asn Val

Gly 245

Asp

Ala

Leu

Gin

Val 250

Met

Thr

Asn

Gly

Arg 255

Phe

Lys

Ser

Val

Lys

His

Arg

Val

Leu

Ala

Asp

Thr

Thr

Lys

Ser

Arg

Leu

260

265

270

Ser

Met

Ile

Tyr

Phe

Gly

Gly

Pro

Ala

Leu

Ser

Glu

Asn

Ile

Ala

Pro

275

280

285

Leu

Pro

Ser

Val

Met

Leu

Lys

Gly

Glu

Glu

Cys

Leu

Tyr

Lys

Glu

Phe

290

295

300

Thr

Trp

Cys

Glu

Tyr

Lys

Lys

Ala

Ala

Tyr

Thr

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

305

310

315

320

Asn

Arg

Leu

Ala

Pro

Phe

Gin

Lys

Ser

Ala

Ala

325

330

<210>	3
<211>	210
<212>	DNA
<213>	Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	sekvence: sonda

<400> 3 taatcactat ccaccatgtc ctcttagcaa taagaaaacc aatggtggta agaatgtgat 60 tggttttggt gaacacacag atcctcaaat catctctgtc ttaagatcta acaacacttc 120 tggtctccaa attaatctaa atgatggctc atggatctct gtccctcccg atcacacttc 180 cttcttcttc aacgtgggtg actctctcca 210 <210> 4 <211> 199 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis sekvence: sonda • · <400> 4

ggttatgact	aacgggaggt	tcaagagtgt	taaacacagg	gtcttagccg	atacaaggag	60
atcgaggatt	tcaatgatat	atttcggcgg	accgccattg	agccagaaga	tcgcaccatt	120
gccatgcctt	gtccctgagc	aagatgattg	gctttacaaa	gaattcactt	ggtctcaata	180
caaatcttct	gcttacaag					199

<210> 5
<211> 1318
<212> DNA
<213> Arabídopsis thaliana
<220>
<221> různé znaky <222> (1243, 1265)
<223> neidentifikovaný zbytek
<400> 5
tcaaaatcaa	aaaaattcta	tcaaacaagg	aaatatatca	atggcggtat	tgtctaaacc	60
ggtagcaata	ccaaaatccg	ggttctctct	aatcccggtt	atagatatgt	ctgacccaga	120
atccaaacat	gccctcgtga	aagcatgcga	agacttcggc	ttcttcaagg	tgatcaacca	180
tggcgtttcc	gcagagctag	tctctgtttt	agaacacgag	accgtcgatt	tcttctcgtt	240
gcccaagtca	gagaaaaccc	aagtcgcagg	ttatcccttc	ggatacggga	acagtaagat	300
tggtcggaat	ggtgacgtgg	gttgggttga	gtacttgttg	atgaacgcta	atcatgattc	360
cggttcgggt	ccactatttc	caagtcttct	caaaagcccg	ggaactttca	gaaacgcatt	420
ggaagagtac	acaacatcag	tgagaaaaat	gacattcgat	gttttggaga	agatcacaga	480
tgggctaggg	atcaaaccga	ggaacacact	tagcaagctt	gtgtctgacc	aaaacacgga	540
ctcgatattg	agacttaatc	actatccacc	atgtcctctt	agcaataaga	aaaccaatgg	600
tggtaagaat	gtgattggtt	ttggtgaaca	cacagatcct	caaatcatct	ctgtcttaag	660
atctaacaac	acttctggtc	tccaaattaa	tctaaatgat	ggctcatgga	tctctgtccc	720
tcccgatcac	acttccttct	tcttcaacgt	tggtgactct	ctccaggtga	tgacaaatgg	780
gaggttcaag	agcgtgaggc	atagggtttt	agctaactgt	aaaaaatcta	gggtttctat	840
gatttacttc	gctggacctt	cattgactca	gagaatcgct	ccgttgacat	gtttgataga	900
caatgaggac	gagaggttgt	acgaggagtt	tacttggtct	gaatacaaaa	actctaccta	960
caactctaga	ttgtctgata	ataggcttca	acaattcgaa	aggaagacta	taaaaaatct	1020
cctaaattga	tgtgatatat	ctatttaatc	tataagtgtg	tgctacatac	agacaatgca	1080
tctgtatatt	ttgaagtata	atgttatttg	ttaatccaat	aactgtaaaa	acatgcaaga	1140
gtgtgtttgt	ttgtttcgta	atatcaacat	cgctcccatc	ttttatggat	aaaaaaaaaa	1200
aaaaaaaaaa	cactgttttg	atgtaagcta	cattttactt	tangtgtaca	tcttattgtg	1260
ttaantaaat	tatttcaaaa	taaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaa	1318

• · · · · · · · ·· • ···· ··· • · · ······ ·· « <210> 6 <211> 329 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6

Met Ala Val Leu Ser Lys Pro Val Ala Ile Pro Lys Ser Gly Phe Ser 15 10 15

Leu Ile Pro Val Ile Asp Met Ser Asp Pro Glu Ser Lys His Ala Leu 20 25 30

Val Lys Ala Cys Glu Asp Phe Gly Phe Phe Lys Val Ile Asn His Gly 35 40 45

Val Ser Ala Glu Leu Val Ser Val Leu Glu His Glu Thr Val Asp Phe 50 55 60

Phe Ser Leu Pro Lys Ser Glu Lys Thr Gin Val Ala Gly Tyr Pro Phe

70 75 80

Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Ile Gly Arg Asn Gly Asp Val Gly Trp Val

90 95

Glu Tyr Leu Leu Met Asn Ala Asn His Asp Ser Gly Ser Gly Pro Leu 100 105 110

Phe Pro Ser Leu Leu Lys Ser Pro Gly Thr Phe Arg Asn Ala Leu Glu 115 120 125

Glu Tyr Thr Thr Ser Val Arg Lys Met Thr Phe Asp Val Leu Glu Lys 130 135 140

Ile Thr Asp Gly Leu Gly Ile Lys Pro Arg Asn Thr Leu Ser Lys Leu

145 150 155 160

Val Ser Asp Gin Asn Thr Asp Ser Ile Leu Arg Leu Asn His Tyr Pro

165 170 175

Pro Cys Pro Leu Ser 180

Gly Phe Gly Glu His 195

Asn Asn Thr Ser Gly 210

Ser Val Pro Pro Asp 225

Leu Gin Val Met Thr 245

Leu Ala Asn Cys Lys 260

Pro Ser Leu Thr Gin

275

Glu Asp Glu Arg Leu 290

Ser Thr Tyr Asn Ser 305

Arg Lys Thr Ile Lys 325

Asn Lys Lys Thr Asn Gly 185

Thr Asp Pro Gin Ile Ile 200

Leu Gin Ile Asn Leu Asn 215

His Thr Ser Phe Phe Phe 230 235

Asn Gly Arg Phe Lys Ser 250

Lys Ser Arg Val Ser Met 2 65

Arg Ile Ala Pro Leu Thr 280

Tyr Glu Glu Phe Thr Trp 295

Arg Leu Ser Asp Asn Arg 310 315

Asn Leu Leu Asn

Gly Lys Asn Val Ile 190

Ser Val Leu Arg Ser 205

Asp Gly Ser Trp Ile 220

Asn Val Gly Asp Ser 240

Val Arg His Arg Val 255

Ile Tyr Phe Ala Gly 270

Cys Leu Ile Asp Asn 285

Ser Glu Tyr Lys Asn 300

Leu Gin Gin Phe Glu 320

<210>	7
<211>	1237
<212>	DNA
<213>	Arabidopsis thaliana
<400>	7

gaattcggca tttttataaa ccacagccag gttctcactt cgagtttcct gattttgcaa tcactttaga cccattcaat tcttcttcct gttaagtgta taaccacatc ccccgtcgtc caacctttgc aacctacaaa tccctaatcc aacctagccg ttcaatcttc aaccaaacat ccacatacaa atccggaagc aacaactttc 60 ggtggttttg 120 accggttccg 180 gaaaacccga 240 • · · · • · atcgtaaaag cctgcgagga gttcgggttc ttcaaggtcg taaaccacgg agtccgaccc 300 gaactcatga ctcggttaga gcaggaggct attggcttct tcggcttgcc tcagtctctt 360 aaaaaccggg ccggtccacc tgaaccgtac ggttatggta ataaacggat tggaccaaac 420 ggtgacgttg gttggattga gtatctcctc ctcaatgcta atcctcagct ctcctctcct 480 aaaacctccg ccgttttccg tcaaacccct caaattttcc gtgagtcggt ggaggagtac 540 atgaaggaga ttaaggaagt gtcgtacaag gtgttggaga tggttgccga agaactaggg 600 atagagccaa gggacactct gagtaaaatg ctgagagatg agaagagtga ctcgtgcctg 660 agactaaacc attatccggc ggcggaggaa gaggcggaga agatggtgaa ggtggggttt 720 ggggaacaca cagacccaca gataatctca gtgctaagat ctaataacac ggcgggtctt 780 caaatctgtg tgaaagatgg aagttgggtc gctgtccctc ctgatcactc ttctttcttc 840 attaatgttg gagatgctct tcaggttatg actaacggga ggttcaagag tgttaaacac 900 agggtcttag ccgatacaag gagatcgagg atttcaatga tatatttcgg cggaccgcca 960 ttgagccaga agatcgcacc attgccatgc cttgtccctg agcaagatga ttggctttac 1020 aaagaattca cttggtctca atacaaatct tctgcttaca agtctaagct tggtgattat 1080 agacttggtc tctttgagaa acaacctctt ctcaatcata aaacccttgt atgagagtag 1140 tcatgatgat ctttatcatc ctttgtacga tagaaagtca taatcacaaa aagaaggaaa 1200 tggatagtgt tttggattaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1237 <210> 8 <211> 341 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 8

Met 1

Val

Val

Leu

Pro 5

Gin

Pro

Val

Thr

Leu 10

Asp Asn

His

Ile

Ser 15

Leu

Ile

Pro

Thr

Tyr

Lys

Pro

Val

Pro

Val

Leu

Thr

Ser

His

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Val

Val

Asn

Leu

Ala

Asp

Pro

Glu

Ala

Lys

Thr

Arg

Ile

Val

Lys

Ala

35

40

45

Cys

Glu

Glu

Phe

Gly

Phe

Phe

Lys

Val

Val

Asn

His

Gly

Val

Arg

Pro

50

55

60

Glu

Leu

Met

Thr

Arg

Leu

Glu

Gin

Glu

Ala

Ile

Gly

Phe

Phe

Gly

Leu

70 75 * · · · · ·· ·· ·· ·· · »··· » · · • · * · · · · · · •·· ·· ·· ···· ·· ···

Pro Gin Ser Leu Lys Asn Arg Ala Gly Pro Pro Glu Pro Tyr Gly Tyr 85 90 95

Gly Asn Lys Arg Ile Gly Pro Asn Gly Asp Val Gly Trp Ile Glu Tyr 100 105 110

Leu Leu Leu Asn Ala Asn Pro Gin Leu Ser Ser Pro Lys Thr Ser Ala 115 120 125

Val Phe Arg Gin Thr Pro Gin Ile Phe Arg Glu Ser Val Glu Glu Tyr 130 135 140

Met Lys Glu Ile Lys Glu Val Ser Tyr Lys Val Leu Glu Met Val Ala

145 150 155 160

Glu Glu Leu Gly Ile Glu Pro Arg Asp Thr Leu Ser Lys Met Leu Arg

165 170 175

Asp Glu Lys Ser Asp Ser Cys Leu Arg Leu Asn His Tyr Pro Ala Ala 180 185 190

Glu Glu Glu Ala Glu Lys Met Val Lys Val Gly Phe Gly Glu His Thr 195 200 205

Asp Pro Gin Ile Ile Ser Val Leu Arg Ser Asn Asn Thr Ala Gly Leu 210 215 220

Gin Ile Cys Val Lys Asp Gly Ser Trp Val Ala Val Pro Pro Asp His

225 230 235 240

Ser Ser Phe Phe Ile Asn Val Gly Asp Ala Leu Gin Val Met Thr Asn

245 250 255

Gly Arg Phe Lys Ser Val Lys His Arg Val Leu Ala Asp Thr Arg Arg 260 265 270

Ser Arg Ile Ser Met Ile Tyr Phe Gly Gly Pro Pro Leu Ser Gin Lys 275 280 285

Ile Ala Pro Leu Pro Cys Leu Val Pro Glu Gin Asp Asp Trp Leu Tyr 290 295 300

Lys

Glu

Phe

Thr

Trp

Ser

Gin

Tyr

Lys

Ser

Ser

Ala

Tyr

Lys

Ser

Lys

305

310

315

320

Leu

Gly

Asp

Tyr

Arg

Leu

Gly

Leu

Phe

Glu

Lys

Gin

Pro

Leu

Leu

Asn

325

330

335

His

Lys

Thr

Leu

Val

340 <210> 9 • <211> 1008 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 9 atggtaattg tgttacagcc agccagtttt gatagcaacc tctatgttaa tccaaaatgc 60 aaaccgcgtc cggttttaat ccctgttata gacttaaccg actcagatgc caaaacccaa 120 atcgtcaagg catgtgaaga gtttgggttc ttcaaagtca tcaaccatgg ggtccgaccc 180 gatcttttga ctcagttgga gcaagaagcc atcaacttct ttgctttgca tcactctctc 240 aaagacaaag cgggtccacc tgacccgttt ggttacggta ctaaaaggat tggacccaat 300 ggtgaccttg gctggcttga gtacattctc cttaatgcta atctttgcct tgagtctcac 360 aaaaccaccg ccattttccg gcacacccct gcaattttca gagaggcagt ggaagagtac 420 attaaagaga tgaagagaat gtcgagcaaa tttctggaaa tggtagagga agagctaaag 480 atagagccaa aggagaagct gagccgtttg gtgaaagtga aagaaagtga ttcgtgcctg 540 agaatgaacc attacccgga gaaggaagag actccggtca aggaagagat tgggttcggt 600 gagcacactg atccacagtt gatatcactg ctcagatcaa acgacacaga gggtttgcaa 660 atctgtgtca aagatggaac atgggttgat gttacacctg atcactcctc tttcttcgtt 720 cttgtcggag atactcttca ggtgatgaca aacggaagat tcaagagtgt gaaacataga 780 gtggtgacaa atacaaagag gtcaaggata tcgatgatct acttcgcagg tcctcctttg 840 • agcgagaaga ttgcaccatt atcatgcctt gtgccaaagc aagatgattg cctttataat 900 gagtttactt ggtctcaata caagttatct gcttacaaaa ctaagcttgg tgactatagg 960

J cttggtctct ttgagaaacg acctccattt tctctatcca atgtttga 1008 <210> 10 <211> 335 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana • · · · • · • · • · • ·

<400> 10

Met

Val

Ile

Val

Leu

Gin

Pro

Ala

Ser

Phe

Asp

Ser

Asn

Leu

Tyr

Val

1

5

10

15

Asn

Pro

Lys

Cys

Lys

Pro

Arg

Pro

Val

Leu

Ile

Pro

Val

Ile

Asp

Leu

20

25

30

Thr

Asp

Ser

Asp

Ala

Lys

Thr

Gin

Ile

Val

Lys

Ala

Cys

Glu

Glu

Phe

35

40

45

Gly

Phe

Phe

Lys

Val

Ile

Asn

His

Gly

Val

Arg

Pro

Asp

Leu

Leu

Thr

50

55

60

Gin

Leu

Glu

Gin

Glu

Ala

Ile

Asn

Phe

Phe

Ala

Leu

His

His

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Asp

Lys

Ala

Gly

Pro

Pro

Asp

Pro

Phe

Gly

Tyr

Gly

Thr

Lys

Arg

85

90

95

Ile

Gly

Pro

Asn

Gly

Asp

Leu

Gly

Trp

Leu

Glu

Tyr

Ile

Leu

Leu

Asn

100

105

110

Ala

Asn

Leu

Cys

Leu

Glu

Ser

His

Lys

Thr

Thr

Ala

Ile

Phe

Arg

His

115

120

125

Thr

Pro

Ala

Ile

Phe

Arg

Glu

Ala

Val

Glu

Glu

Tyr

Ile

Lys

Glu

Met

130

135

140

Lys

Arg

Met

Ser

Ser

Lys

Phe

Leu

Glu

Met

Val

Glu

Glu

Glu

Leu

Lys

145

150

155

160

Ile

Glu

Pro

Lys

Glu

Lys

Leu

Ser

Arg

Leu

Val

Lys

Val

Lys

Glu

Ser

165

170

175

Asp

Ser

Cys

Leu

Arg

Met

Asn

His

Tyr

Pro

Glu

LyS

Glu

Glu

Thr

Pro

180

185

190

Val

Lys

Glu

Glu

Ile

Gly

Phe

Gly

Glu

His

Thr

Asp

Pro

Gin

Leu

Ile

195

200

205

• · · · • ·

Ser Leu Leu Arg Ser Asn Asp Thr 210 215

Asp Gly Thr Trp Val Asp Val Thr 225 230

Leu Val Gly Asp Thr Leu Gin Val 245

Val Lys His Arg Val Val Thr Asn 260

Ile Tyr Phe Ala Gly Pro Pro Leu 275 280

Cys Leu Val Pro Lys Gin Asp Asp 290 295

Ser Gin Tyr Lys Leu Ser Ala Tyr 305 310

Leu Gly Leu Phe Glu Lys Arg Pro 325

Glu Gly Leu Gin Ile Cys Val Lys 220

Pro Asp His Ser Ser Phe Phe Val 235 240

Met Thr Asn Gly Arg Phe Lys Ser 250 255

Thr Lys Arg Ser Arg Ile Ser Met 265 270

Ser Glu Lys Ile Ala Pro Leu Ser 285

Cys Leu Tyr Asn Glu Phe Thr Trp 300

Lys Thr Lys Leu Gly Asp Tyr Arg 315 320

Pro Phe Ser Leu Ser Asn Val 330 335

<210>	11
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	sekvence:
<400>	11

primer taatcactat ccaccatgtc

<210>	12
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence

• · · · • · • 0 <220>

<223> Popis sekvence: primer «400> 12 tggagagagt cacccacgtt <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis sekvence: primer <400> 13 ggttatgact aacgggaggt <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis sekvence: primer <400> 14 cttgtaagca gaagatttgt 20

<210>	15
<211>	30
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis sekvence
<400>	15

tgagctcaac catggttgtt ctgtctcagc • · · · • · <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis sekvence: primer <400> 16 tgagctctta atcagcagca gatttctgg

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY ?l/

   1. Izolovaná, purifikovaná nebo rekombinantní sekvence nukleové kyseliny kódující enzym giberelin 2-oxidázu, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou na obr. 1 nebo její funkční derivát, sekvenci komplementárního řetězce nebo sekvenci homologní.
2. 2. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 1, která kóduje enzym, který má aktivitu enzymu giberelin 2-oxidázy z Phaseolus coccineus.
3. 3. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 1, která kóduje enzym giberelin 2-oxidázu z P. coccineus nebo Arabidopsis thaliana.
4. 4. Sekvence nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde kódující sekvence je operativně spojena s promotorem.
5. 5. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 4, kde promotor je konstitutivní promotor.
6. 6. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 4, kde promotor je specifický promotor pro expresi v určité rostlinné buňce.
7. 7. Izolované, purifikovaná nebo rekombinantní sekvence nukleové kyseliny obsahující promotor, který v přírodním stavu řídí expresi genu kódujícího enzym giberelin 2oxičázu, obsahující sekvenci nukleové kyseliny uvedenou na obr. 1 nebo její funkční derivát, sekvenci komplementárního řetězce nebo sekvenci homologní.

   • ···· »· · · ·· • · · ···· · · ·
8. 8. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7, kde enzym giberelin 2-oxidáza je giberelin 2-oxidáza z Phaseolus coccineus (PcGA2oxl) .
9. 9. Sekvence nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde giberelin 2-oxidéza katalyzuje 2P~oxidaci molekuly Cig-giberelinu, čímž se vnáší hydroxylová skupina na C-2.
10. 10.Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 9 kde giberelin 2oxidáza dále katalyzuje oxidaci hydroxylové skupiny vnesené na C-2, čímž vzniká ketonový derivát.
11. 11.Sekvence nukleové kyseliny, která kóduje ribozym schopný specificky štěpit RNA kódovanou genem pro giberelin 2oxidázu.
12. 12.Sekvence antisense nukleové kyseliny, která obsahuje transkribovatelný řetězec DNA komplementární k alespoň části řetězce DNA, která je v přírodním stavu transkribována v genu kódujícím enzym giberelin 2-oxidázu.
13. 13.Izolovaný, purifikovaný nebo rekombinantní polypeptid, který obsahuje enzym giberelin 2-oxidázu mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2.
14. 14. Vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12.
15. 15. Hostitelská buňka transfekovaná nebo transformovaná sekvencí nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12.
16. 16. Rostlinná buňka obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12.

    • ···· · · «· «· ·· * «·«· «·· »«· ·· · · »··· · · ·
17. 17. Rostlina, nebo část takové rostliny, jejíž alespoň některé buňky jsou buňky podle nároku 16.
18. 18. Rozmnožovací materiál z rostliny podle nároku 17.
19. 19. Použití sekvence nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 pro přípravu rostliny.
20. 20. Použití podle nároku 19, kde giberelin 2-oxidáza je konstitutivně nadměrně exprimována v rostlině, aby se snížila koncentrace biologicky aktivních giberelinů v rostlině.
21. 21. Použití podle nároku 19, kde je v transgenní rostlině snížena exprese endogenního genu pro giberelin 2-oxidázu.