CZ20004594A3

CZ20004594A3 - Geny kódující ß-galaktosidasové polypeptidy rajčete

Info

Publication number: CZ20004594A3
Application number: CZ20004594A
Authority: CZ
Inventors: Kenneth C. Gross; David L. Smith
Original assignee: United States Department Of Agriculture
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2002-05-15
Also published as: CA2330233A1; EP1084228A1; MXPA00012210A; PL345269A1; WO1999064564A1; HUP0102605A2; NZ508968A; BR9911074A; CN1311816A; JP2002517226A; AU4549899A; AU778691B2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se vztahuje k novým rostlinným genům kódujícím polypeptidy charakterizované jejich schopností hydrolyzovat terminální ne-redukujícíβ-D-galaktosilové zbytky na β-D-galaktosidech. Konkrétněji je zajištěna polynukleotidová sekvence odvozená z klonu cDNA, který je označen jako pZBG2-l-4 (nazývaného v U.S. Provisional Appln. No. 60/088,805 jako pTom?gal4), které kódují specifické rostlinné polypeptidy nazývané ?-galaktosidasy II. Dále jsou zajištěny klony cDNA kódující šest dalších homologních polypeptidů, a dále metody použití těchto klonů cDNA k produkci β-D-galaktosidových polypeptidů popsaných ve vynálezu. A dále metody modifikace kvality ovoce s použitím polynukleotidů nebo polypeptidů předkládaného vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Nejnápadnější a nejdůležitější procesy vztahující se k posklizňové kvalitě klimatického ovoce jsou změny ve struktuře, barvě, chuti a aroma, které se objevuje během zrání. Z důvodů rozhodujícího vztahu, které mají zhoubné změny ve struktuře na kvalitu a posklizňovou trvanlivost, byl důraz kladen na studium mechanismů zahrnutých v procesu ztráty tvrdosti, která se objevuje během zrání rajských jablíček. Ačkoliv může měknutí plodů zahrnovat změny tlaku turgoru, anatomických charakteristikách a integritě buněčných stěn, je všeobecně předpokládáno, že procesy vedoucí ke ztrátě stěnové integrity jsou kritickými znaky. Nejjasnější změny, co se týče složení a velikosti, se objevují v pektinové frakci buněčné stěny (viz reference v Seynour a Grass, 1996) .

Známé změny vyskytující se v pektinové frakci buněčné stěny během zrání zahrnují zvýšenou rozpustnost, depolymerizaci, deesterifikaci a významné snížení obsahu neutrálních cukrů obsahujících postraní řetězce (Huber, 1983; Fischer a Bennett, 1991; Seymour a Gross, 1996). Nejlépe charakterizovanými enzymy, které modifikují pektin jsou polygalakturonasa (endo-?l-4-D-galakturonanhydrolasa; E.C. 3.2.1.15; PG) a pektinmetylesterasa (E.C. 3.1.1.11; PME). Ačkoliv se PG a PME vyskytují relativně hojně a mají během zrání rajčat velkou aktivitu, • · · · ··· ·· ··· stále se měknutí objevuje (i když o něco menší) i u transgenních plodů, u kterých byla genová exprese a enzymová aktivita PG (Smith et al. 1988, 1990) nebo PME (Tieman et al. 1992, Halí et al. 1993) významně snížena. Dále pak, overexprese PG nevedla v nikdy nedozrávajících mutantech rajčat rin k měknutí a to i přesto, že depolymerace a solubilizace byla zjevná (Giovannoni et al., 1989).

Mezi dalšími známými změnami, které se objevují během zrání plodu je nejlépe charakterizovaná významná ztráta galaktosilových zbytků, která probíhá v buněčné stěně mnoha zrajících plodů (Gross and Sams, 1984; Seymour and Gross, 1996). Ačkoliv stejná ztráta galaktosilových zbytků může být také nepřímým výsledkem působení PG, je jediným enzymem schopným přímo štěpit ?(1-4)galaktanové vazby identifikovaným ve vyšších rostlinách ?-galaktosidasa (exo-?

(1-4)-D-galaktopyranosidasa; E.C. 3.2.1.23). Tento enzym je zřejmě důležitý při ztrátě postranních řetězců galaktanu (DeVeau et al., 1993; Carey et al., 1995; Carrington and Opressey, 1996). Endogalaktanasa nebyla dosud identifikována ve vyšších rostlinách.

To, že je ?-galaktosidasa aktivní při uvolňování galaktosilových zbytků z buněčné stěny během zrání je podpořeno dramatickým zvýšením volné galaktosy (produktu ?-galaktosidasové aktivity)(Gross, 1984) a průvodním zvýšením aktivity specifického enzymu nazývaného ? -galaktosidasa II u zrajících rajčat (Carey et al., 1995). Zdá se, že aktivita ?-galaktosidasy je důležitá v metabolismu buněčné stěny (Carey et al., 1995). ?-galaktosidasy jsou běžně stanovovány pomocí umělých substrátů jako jsou p-nitrofenyl-?-D-galaktopyranosid (PNP), 4-metylbeliferyl-?-D-galaktopyranosid a 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl~? -D-galaktopyranosid (X-GAL). Je nicméně zřejmé, že ?-galaktosidasa II je také aktivní s přírodními substráty jako např. ?(1-4)galaktanem (Carey et al., 1995; Carrington and Pressey, 1983). ?-galaktosidasa byla purifikována a charakterizována v mnoha dalších plodech včetně kiwi (Ross et al., 1993), kávy (Golden et al., 1993), tomelu (Kang et al., 1994) a jablka (Ross et al., 1994).

Carey se spolupracovníky (1995) purifikovali tři dříve identifikované ?-galaktosidasy ze zrajících rajčat (Pressey, 1983), ale pouze jediná (?-galaktosidasa II) vykazovala aktivitu s ?

(1-4)galaktanem. I když byli též schopni identifikovat pravděpodobné klony cDNA, žádný z těchto klonů cDNA nevedl k aminokyselinové • · sekvenci, která by odpovídala konci aminokyselinové sekvence ? -galaktosidasy. I přesto, že byla ?-galaktosidasa, protein přítomný v plodech rajčete (Lycopersicon esculentum Milí) během zrání a schopný degradace rajčatového galaktanu, purifikována, klonování odpovídajícího genu zůstalo neprovedeno.

Změny genové exprese u rostlin může být dosaženo několika způsoby. Molekulární biologové si mohou vybrat z množství známých metod zvyšování či snižování genové exprese jednotlivého genu. Tak například exprese specifické antisense RNA či části sense RNA (zkrácené RNA) byla použita k redukci exprese různých cílových genů v rostlinách (Bird and Ray, 1991, Biotechnology and

Genetic-Engineering Rewiews 9: 207-227). Tyto techniky zahrnují vnesení syntetického genu, který je zkonstruován tak, aby exprimoval antisense nebo sense RNA, do genomu rostliny. Takto bylo s úspěchem dosaženo snížení exprese mnoha jednotlivých genů podílejících se na procesech růstu, vývoje a zrání rajčat (Gray et al., 1992, Plant Molecular Biology, i9: 69-87). Stejně tak byly vyvinuty metody, které vedou ke zvýšení exprese cílových genů. Do rostlinného genomu mohou být například vneseny geny zkostruované tak, aby probíhala overexprese genového produktu. Jsou dále známy další metody modifikující genovou expresi, např. použití alternativních regulačních sekvencí. Celkový popis každé citované metody je zde plně zahrnut její citací.

Existuje tedy potřeba klonování genu pro β-galaktosidasu II a příbuzné polypeptidy a s použitím známých metod změn genové exprese u rostlin tak poskytnout metodu ke změně kvality plodů, zvláště pak změnou buněčné stěny, čímž se přímo ovlivní zrání plodů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je založen na objevu nové sekvence DNA odvozené z klonů cDNA genové rodiny kódující β-galaktosidasy. Fylogenetický strom založený na sdílených aminokyselinových sekvenčních identitách pro sekvence DNA předkládaného vynálezu je na obrázku 1A,B. Bylo identifikováno pět klonů cDNA a dva klony RT-PCR, zde nazývané jako TBG1, TBG2, TBG3, TBG4, TBG5, TBG6 a TBG7 a mající sekvenci nukleových kyselin SEQ ID NOs (čísla) 1-7 (obr.2). Tyto klony vykazovaly vysoký stupeň sekvenční identity s ostatními známými β-galaktosidasami. Odpovídající aminokyselinové sekvence • tf jsou zde nazývány SEQ ID NOs (čísla) 8-16 a jsou ukázány na obrázku 2 a 3. Nukleotidové sekvence SEQ ID NOs 1-7 jsou zaznamenány v Gen Bank s následujícími vstupními čísly (Accessions Numbers):

SEQ	ID	NO: 1	TGB1	AF023847	vložena	10.9.1997
SEQ	ID	NO: 2	TGB2	AF154420	vložena	19.5.1999
SEQ	ID	NO: 3	TGB3	AF154421	vložena	20.5.1999
SEQ	ID	NO: 4	TGB1	AF020390	vložena	21.8.1999
SEQ	ID	NO: 5	TGB1	AF154423	vložena	20.5.1999
SEQ	ID	NO: 6	TGB1	AF154424	vložena	20.5.1999
SEQ	ID	NO: 7	TGB1	AF154422	vložena	20.5.1999

Je třeba vzít v úvahu, že všude tam, kde je v následující diskuzi zmíněna sekvence TBG4, platí totéž pto sekvence TBG1-3 a TBG 5-7, pakliže není uvedeno jinak.

Dále jsou také zajištěny metody získávání sekvencí DNA, vyskytujících se ve vynálezu. Získávat sekvence DNA lze klonováním cDNA (např. pZBG2-l-4), které kódují protein předkládaný ve vynálezu, jako je β-galaktosidasa II nebo odvozením sekvence DNA z genomové DNA, nebo syntézou sekvence DNA ab initio (od začátku) s použitím sekvence cDNA jako vodítka.

Dále je zajištěna metoda změny metabolismu buněčné stěny, což zahrnuje změnu aktivity alespoň jedné galaktosidasy a tím také změnu kvality plodů.

Dále jsou předkládaným vynálezem zajištěny konstrukty cDNA včetně některých či všech vzorových DNA sekvencí β-galaktosidasy pod kontrolou trankripčních iniciačních oblastí operujících v rostlinách, což znamená, že konstrukty mohou vytvářet RNA v rostlinných buňkách.

Objeven byl také enhancer/promotor spojený s expresí genů kódujících β-galaktosidasu.

Předkládaný vynález se dále týká rekombinantních vektorů, což zahrnuje izolované molekuly nukleové kyseliny předkládaného vynálezu a dále se týká hostitelských buněk obsahujících rekombinantní vektory a dále metod, které vedou k tvorbě takovýchto vektorů a hostitelských buněk a dále jejich použití k produkci β

-galaktosidasových polypeptidů nebo peptidů rekombinantními technikami.

Předkládaný vynález dále zajišťuje rostlinné buňky obsahující konstrukty s DNA předkládaného vynálezu, dále rostliny odvozené z těchto buněk mající modifikovanou expresi genu pro β-galaktosidasu a semena produkovaná těmito rostlinami.

Protein β-galaktosidasa II předkládaného vynálezu vykazoval enzymovou aktivitu podílející se na degradaci buněčné stěny, což vedlo ke ztrátě integrity pletiv a k měknutí plodů. Protein β -galaktosidasa II se může dále podílet na změnách (turnoveru) buněčné stěny, které mohou být zahrnuty v procesech buněčného prodlužování a/nebo buněčné expanze a takto v procesech vývoje a růstu rostlin.

Galaktosa sama, či ve spojení s nekonjugovanými N-glykany, může stimulovat tvorbu etylénu. Takto může enzym, uvolňující galaktosu z buněčné stěny hydrolýzou, zahájit proces zrání a/nebo jeho rozvoj.

β-galaktosidasa, které se týká předkládaný vynález, se může podílet na přeměně chloroplastů (zelená-chlorofyl) na chromoplasty (červená - lykopen) během zrání plodů a to tak, že degraduje chloroplastové membránové galaktolipidy.

Rodina genů reprezentovaná nukleotidovými sekvencemi ukázanými na obr. 2 by měla kódovat skupinu podobných enzymů se stejným typem hydrolytické aktivity, ale s rozdílnou pletivovou a/nebo substrátovou specifitou nebo s rozdílnou buněčnou lokalizací.

Protein β-galaktosidasa II předkládaného vynálezu a další proteiny kódované nukleotidovými sekvencemi ukázanými na obr.2 mohou být použity k přípravě pektinu a dalších polymerů (odvozených z buněčnén stěny) se sníženým obsahem galaktosilu. Tyto lze dále použít v biofilmech a roztocích (např. při čištění ovocných džusů) vyžadujících nižší nebo vyšší propojení (cross-linking), či větší či menší viskozimetrické vlastnosti.

Předkládaný vynález dále zajišťuje použití β-galaktosidasy jako části enzymových směsí používaných k izolaci protoplastů.

Přehled obrázků na výkresech

Obr.lA a 1B: Fylogenetický strom založený na identitě částí aminokyselinových sekvencí klonů β-galaktosidas rajčete TGB1-7 a dalších rostlinných β-galaktosidasových polypeptidů.

Obr.2: cDNA sekvence (SEQ ID NOs: 1-7) sedmi genů β-galaktosidas • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · ···· · · · · « · a · předkládaných ve vynálezu: TGB1, TGB2, TGB3, TGB4, TGB5, TGB6, TGB7 .

Obr.3: Vzájemné vyrovnání odvozených aminokyselinových sekvencí plodů rajčete, konkrétně cDNA klonů TGB1, TGB2, TGB3, TGB4, TGB5, TGB6 a TGB7 (SEQ ID NOs: 8-16) a různých rostlinných cDNA klonů β -galaktosidas.

Obr.4 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG v různých rostlinných pletivech (květech, listech, kořenech a stoncích).

Obr.5 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG v pletivech plodu v různých vývojových stádiích.

Obr.6 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG v pletivech plodu (zralá zelená slupka nebo slupka ve stádiu změny „turning, vnější perikarp, vnitřní perikarp a pouzdro (iokular)).

Obr.7 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG v pletivech normálních a mutantních plodů.

Obr.8 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG po ošetření zralých zelených pletiv plodu etylénem.

Obr.9 Analýza exprese TBG4 v kvasinkách pomocí western blotu.

Obr.10 Detekce β-galaktosidasové aktivity exprimovaného pZBG2-l-4 v E. coli.

Obr.il A-E(l-4) Srovnání výsledků měření struktur plodů rostlin rajčete obsahujících antisense konstrukt potlačující mRNA TBG4 a plodů z rodičovské linie.

Obr. 12 A-B Analýza exprese TBG4 v transgenních plodech obsahujících TBG4 antisense konstrukt pomocí northern blotu.

Obr. 13 Binární konstrukt použitý k transformaci rostlin a expresi TBG4 (pZBG2-l-4) v antisense orientaci.

• •00 · ·0 • · · 0

Podrobný popis vynálezu

Následující detailní popis je orientovaný na hlavní ztělesnění předkládaného vynálezu a je míněn jako ilustrativní příklad každé další DNA sekvence předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález zajišťuje izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující polynukleotid kódující β-galaktosidasové polypeptidy, zvláště pak polypeptid β-galaktosidasy II mající aminokyselinovou sekvenci zobrazenou na obrázku 2. DNA sekvence vzorového cDNA klonu β-galaktosidasy II, který byl odvozen z cDNA klonu pZBG2-l-4, kódujícího β-galaktosidasu II, je zaznamenán v GenBank pod vstupním číslem (Accession Number) AF020390. Né všechny β-galaktosidasy mají in vitro aktivitu uvolňující galaktosu ze stěnových polymerů obsahujících β (1-4)-D-galaktan vůči extrahovanému materiálu buněčné stěny. Polypeptid exprimovaný ze vzorového β -galaktosidasového II klonu - pZBG2-l-4 vykazoval β-galaktosidasovou aktivitu a exogalaktinasovou aktivitu.

Vzorová β-galaktosidasa II předkládaného vynálezu, jak je ukázána na obrázku 2, sdílí sekvenční homologii s aminokyselinovou sekvencí odvozenou z β-galaktosidasových cDNA klonů TBG2-7 a cDNA klonů plodů chřestu (accession number P45582), jablka (accession number P48981) a karafiátu (accession number Q00662) a dále také s cDNA klonem β-galaktosidasy rajčete nazvaným pToir^gall (accession number P48980) a izolovaným ze zralých plodů „Ailsa Craig. Sekvence tohoto plodu již byla dříve publikována (Carey et al., 1995). Otevřený čtecí rámec (ORF) klonu TBG1 objevený zde vynálezci (accession number AF023847) je téměř identický s cDNA dříve popsanou Careyem a spolupracovníky. Jak je ukázáno na obrázku 2, je sdílená odvozená sekvenční identita mezi všemi sedmi publikovanými rostlinnými β-galaktosidasovými klony (TBG1_7) a dalšími rostlinnými β-galaktosidasami vysoká.

Hledání v databázích pomocí BLASTu též ukázalo významnou sekvenční identitu mezi doménami rostlinných β-galaktosidas a savčími a houbovými β-galaktosidasami. Malá společná sekvenční identita byla však nalezena mezi rostlinnými β-galaktosidasami a bakteriálními β-galaktosidasami.

• ·

Jak je ukázáno na obrázku 1, byla sdílená aminokyselinová identita TBG1 a TBG3 vysoká. TBG4 byl také velmi podobný jak TBG1 tak i TBG3. Aminokyselinová sekvence TBG2 a TBG7 byla unikátní, protože se v jejich sekvenci objevilo několik oblastí aminokyselinových insertů (obr.3).

Molekuly nukleových kyselin

Všechny zde uvedené nukleotidové sekvence, stanovené sekvenací molekul DNA, byly stanoveny s použitím dideoxynukleotidového terminátorového protokolu založeného na PCR a s použitím automatického sekvenátoru ABI automated sequencer (např. model 373, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA), pokud není uvedeno jinak. A dále, všechny aminokyselinové sekvence zde uvedené byly předpovězeny pomocí translace sekvencí DNA stanovených pomocí výše uvedených protokolů. Proto také, jak je známo v oboru, jakákoliv sekvence DNA stanovená těmito automatickými přístupy a tedy jakákoliv nukleotidová sekvence stanovená zde, může obsahovat nějaké chyby. Nukleotidové sekvence stanovené automaty jsou typicky přinejmenším z 90% identické, spíše však jsou identické z 95% 99,9% se skutečnou nukleotidovou sekvencí sekvenované molekuly. Skutečná sekvence může být přesněji určena pomocí jiných přístupů včetně manuálních sekvenačních metod DNA, dobře známých v oboru. Jak je také v oboru známo, vnesení či vynechání jediného nukleotidu při stanovování nukleotidové sekvence (ve srovnání se skutečnou sekvencí) způsobí posunutí čtecího rámce při translaci nukleotidové sekvence a tím bude předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná stanovovanou nukleotidovou sekvencí od bodu inserce či delece úplně rozdílná od aminokyselinové sekvence skutečně kódované sekvenovanou molekulou DNA.

Termínem „nukleotidová sekvence molekuly nukleové kyseliny nebo polynukleotidů je v případě molekuly nebo polynukleotidů DNA míněna sekvence deoxyribonukleotidů a v případě molekuly nebo polynukleotidů RNA sekvence korespondujících ribonukleotidů (A,G,C a U), kde je každý thymidindeoxyribonukleotid (T) ve specifikované deoxyribonukleotidové sekvenci nahrazen ribonukleotidem uridinem (U) .

S použitím informací zde uvedených, jako např. vzorové nukleotidové sekvence ukázané na obrázku 2 (SEQ ID No:4), může být získána (pomocí standardních klonovacích a prohlížecích (screeníng) metod, jako je pro klonování cDNA použití mRNA jako startovního • · • · · ·

W materiálu) molekula nukleové kyseliny předkládaného vynálezu, kódující β-galaktosidasu II. Příkladem ve vynálezu je molekula nukleové kyseliny popsaná na obrázku 2 (SEQ ID NO:4), která byla objevena v cDNA knihovně připravené z perikarpu plodů rostlin rajčete „Rutgers v různých stádiích zrání (stádium „breaker, „turning a „pink(růžové)).

Úplná sekvence cDNA inzertu pZBG2-l-4 je dostupná v GenBank (číslo AF020390) a je ukázána na obrázku 2 (SEQ ID NO:4). cDNA insert je dlouhý 2532 nukleotidů (nt) a obsahuje jeden dlouhý otevřený čtecí rámec (ORF) s předpokládaným startem na prvním ATG uvnitř rámce (nt64) a končící na TAA (nt 2238). Tento ORF kóduje 79 kDa velký protein skládající se z 724 aminokyselin. Odvozená aminokyselinová sekvence pZBG2-l-4 sdílí významnou aminokyselinovou identitu ke všem publikovaným rostlinným sekvencím β-galaktosidas v databázi (obr. ΙΑ, B). Jestliže byl celý ORF každého genu β -galaktosidasy porovnán s pRBG2-l-4, byla sdílená sekvenční identita okolo 64% pro pTon^gall z rajčete (P48980), okolo 67,6% pro jablko (P48981), okolo 63% pro chřest (P45582) a okolo 55% pro karafiát (Q00662). Je zřejmé, že z důvodu možných sekvenačních chyb diskutovaných výše, může být skutečná úplná β-galaktosidasa kódovaná vloženou cDNA, která obsahuje 724 aminokyselin, o něco delší či kratší. Ještě obecněji lze říci, že skutečný otevřený čtecí rámec může být kdekoliv v rozsahu ± 20 aminokyselin, spíše však v rozsahu ± 10 aminokyselin předpovězeného ORF od prvního methioninového kodonu od N-konce ukázaného na obrázku 2 (SEQ ID NO:4). V jakémkoliv případě však, jak je diskutováno dále, vynález zajišťuje polypeptidy mající různé zbytky deletované z N-konce úplného polypeptidu, včetně polypeptidu postrádajícího jednu či více aminokyselin na N-konci β -galaktosidasy II zde popsané.

Zaváděcí a zralé sekvence

Analýza odvozené aminokyselinové sekvence pZBG2-l-4 naznačuje z velkou pravděpodobností sekreci. Tento předpoklad je založen na přítomnosti hydrofobní zaváděcí sekvence, na přítomnosti štěpícího místa v zaváděcí sekvenci a na přítomnosti tří možných

N-glykosilačních míst. K předpovědi, že ORF obsahuje hydrofobní zaváděcí sekvenci, která by byla štěpena mezi zbytky alaninu a šeřinu v pozicích 23 a 24, a že zralý polypeptid bude lokalizován • · · · · · • · vně buňku byly použity programy PSORT V6.4 (Nakai and Kanehisa,

1992, který je zde zahrnut odkazem) a SignalP VI.1 (Nielsen et al., 1997, který je zde zahrnut odkazem). Zralý polypeptid obsahuje tři možná glykosylační místa na asparaginu č. 282, 459 a 713. Asparagin na místě 713 však zřejmě nebude glykosylován, protože se na místě 714 nachází prolin. Předpovězená molekulová hmtnost neglykosylovaného zralého polypeptidů byla 75 kDa a Pl 8,9.

Aminokyselinová sekvence úplné β-galaktosidasy II předkládaného vynálezu tedy zahrnuje zaváděcí sekvenci a zralý protein tak, jak je ukázáno na obrázku 3 (SEQ ID N0:4). Konkrétněji dále předkládaný vynález zajišťuje molekulu nukleové kyseliny kódující zralou formu β -galaktosidasy II. Znamená to tedy, dle signální hypotézy, že sekretovaný protein má signální nebo sekrečni zaváděcí sekvenci, která je odštěpena z úplného polypeptidů a vzniká tak sekretovaná „zralá forma proteinu. V některých případech není štěpení sekretovaného proteinu zcela jednotné, což vede ke dvěma nebo více zralým druhům proteinů. Dále je již dlouho známo, že specifita štěpení sekretovaného proteinu je nakonec určena primární strukturou úplného proteinu, což znamená, že je obsažena v aminokyselinové sekvenci polypeptidů. Předkládaný vynález tedy zajišťuje nukleotidovou sekvenci kódující zralou β-galaktosidasu II mající aminokyselinovou sekvenci kódovanou cDNA ukázanou na obrázku 2 (SEQ ID N0:4) a zajištěnou v GenBank (Accession No. AF20390). Termínem zralá β-galaktosidasa II mající aminokyselinovou sekvenci kódovanou cDNA klonem ukázaným na obrázku 2 (SEQ ID NO: 4) je míněna zralá forma/formy β-galaktosidasy II produkovaná v rostlinných buňkách expresí úplného otevřeného čtecího rámce kódovaného cDNA sekvencí klonu ukázaného na obrázku 2 (SEQ ID NO:4) a zajištěného v GenBank (Accession No. AF20390).

Příklad cDNA β-galaktosidasy II předkládaného vynálezu (TBG4) byl exprimován v E.coli kmeni XLI blue MR (lacZ) (Stratagene, La Jolla, CA, USA), jak je popsáno dále (viz Příklady provedení vynálezu).

Analýza odvozené aminokyselinové sekvence cDNA klonů reprezentujících ostatní geny β-galaktosidas vynálezu také ukázala otevřené čtecí rámce a, v některých případech, naznačila vysoce pravděpodobnou sekreci kódovaných proteinů. U všech cDNA klonů plné • ·

9· · ·· · délky byla předpovězena signální sekvence (obr.2). K předpovědím byly použity dva programy - SignalP a PSORT. Oběma programy bylo předpovězeno, že TBG4 by měl být sekretován. Program SignalP předpověděl, že TBGl, 2 a 3 by měl mít signální sekvenci schopnou štěpení, PSORT však předpověděl u těchto klonů neštěpitelnou signální sekvenci. PSORT naznačil, že TBG7 by měl být směrován do chloroplastů. Individuální zkoumání každého ze sedmi klonů, pomocí programů PSORT V6 a SignalP V 1.1, založené na přítomnosti hydrofobních zaváděcích sekvencí, vedlo k následujícím předpovědím: TBGl: iniciační kodon na 306 (SEQ ID NO: 1), ORF= 835 aminokyselin (SEQ ID NO:8), signální sekvence na 1-24; TBG2: iniciační kodon nebyl stanoven (SEQ ID NO: 2), ORF= 888 aminokyselin (SEQ ID NO:9), signální sekvence na 1-25; TBG3: iniciační kodon na 32 (SEQ ID NO: 3), ORF= 838 aminokyselin (SEQ ID NO:10), signální sekvence na 1-22; TBG5: iniciační kodon nebyl stanoven (SEQ ID NO: 5) , ORF= 251 aminokyselin (SEQ ID N0:12), signální sekvence nebyla stanovena; TBG6: iniciační kodon nebyl stanoven (SEQ ID NO: 6), ORF= 248 aminokyselin (SEQ ID NO:13), signální sekvence nebyla stanovena;

TBG7: iniciační kodon na 104 (SEQ ID NO: 7), ORF= 870 aminokyselin (SEQ ID NO:14), signální sekvence na 1-35.

Odvozené aminokyselinové sekvence sedmi klonů byly dále podrobeny analýze s použitím programu DNAsis k predikci molekulové hmotnosti, lokalizace uvnitř buňky, pl a možných míst pro N-vázanou glykosylaci. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1: Sekvenční data cDNA rajčatové β-galaktosidasy (TBG). Pět cDNA plné délky a dvě částečné cDNA byly klonovány a sekvenovány. Data DNA a odvozených aminokyselinových sekvencí jsou presentovány níže.

Klon	mRNA (kb)	kD	pl	N-vazba	Cíl
TBGl	3,2	90,8	6,2	2	ER/V
TBG2	3,0	97,0	6,2	6	PM
TBG3	2,8	90,5	8,2	1	ER/V
TBG4	2,6	77,9	8,9	3	V
TBG5	cca 3
TBG6	cca 3
TBG7	3,0	93,3	8,0	6	CHLOR

• ·

N-vazba= možné místo N-vázané glykosylace, ER= endoplasmatické retikulum, V= sekretovaný, PM= vazba na plasmatickou membránu, CHLOR=chloroplasty

Jak je naznačeno, mohou být molekuly nukleových kyselin předkládaného vynálezu ve formě RNA jako např. mRNA nebo ve formě DNA včetně např. cDNA či genomové DNA a mohou být získány klonováním nebo vytvořeny synteticky. DNA mohou být dvouvláknové nebo jednovláknové. Jednovláknová DNA či RNA může být kódující vlákno, známé též jako „sense vlákno nebo může být nekódující vlákno, známé též jako „anti-sense vlákno.

Izolací molekuly (molekul) nukleové kyseliny je míněna molekula nukleové kyseliny, DNA nebo RNA, která byla vyjmuta ze svého přirozeného prostředí. Například rekombinantní molekula DNA obsažená ve vektoru je považována za izolovanou pro potřeby předkládaného vynálezu. Další příklady izolovaných molekul DNA zahrnují rekombinantní molekuly DNA udržované v heterologních hostitelských buňkách nebo purifikované (částečně nebo značně) molekuly DNA v roztoku. Izolované molekuly RNA zahrnují in vivo nebo in vitro RNA transkripty molekul DNA předkládaného vynálezu. Izolované molekuly nukleových kyselin dle předkládaného vynálezu dále zahrnují takovéto molekuly získané synteticky.

Izolované molekuly nukleové kyseliny předkládaného vynálezu zahrnují molekuly DNA obsahující otevřený čtecí rámec (ORF) s iniciačním kodonem na pozici 64 nukleotidové sekvence ukázané na obrázku 2 (SEQ ID NO: 4). Dále jsou zahrnuty také molekuly DNA obsahující kódující sekvenci zralé β-galaktosidasy II ukázané na místech 135-2532 obrázku 2 (SEQ ID NO:4).

Dále izolované molekuly nukleové kyseliny vynálezu zahrnují molekuly DNA, které obsahují sekvence značně odlišné od těch, které byly popsány výše, ale které díky degenerovanému genetickému kódu stále kódují β-galaktosidasu. Samozřejmě, že vztah genetického kódu a na druhu závislé specifické kodonové preference jsou v oboru známé. Takto by tedy bylo jednoduché pro jedince zručného v oboru vytvořit degenerované alternativy výše popsaných molekul. Např. optimalizovat kodon pro expresi v určitém hostiteli (např. změnit kodony v rostlinné mRNA na ty, které jsou preferovány bakteriálními hostiteli jako např. E. coli). Tato molekula nukleové kyseliny bude kódovat zralý polypeptid kódovaný výše popsaným vloženým cDNA klonem.

Vynález dále zajišťuje izolované molekuly nukleové kyseliny • · • · ·· • · • · • · • ·· · ·· • · · · · · • · * · · · · ···· mající nukleotidovou sekvenci ukázanou na obrázku 2 (SEQ ID NN0:4) nebo molekulu nukleové kyseliny mající sekvenci komplementární k výše uvedené sekvenci. Takovéto izolované molekuly, zvláště pak molekuly DNA, jsou použitelné jako sondy při genovém mapování in sítu hybridizací s chromozomy a k detekci exprese genu β -galaktosidasy II v rostlinných pletivech analýzou pomocí northern blotu.

Předkládaný vynález je dále směrován na molekuly nukleové kyseliny kódující části nukleotidových sekvencí zde popsaných a taktéž na fragmenty izolovaných molekul nukleových kyselin zde popsaných. Zvláště pak vynález zajišťuje polynukleotidy mající nukleotidové sekvence reprezentující části obrázku 2 (SEQ ID N0:4). které se skládají z míst 1-2538 obrázku 2 (SEQ ID NO:4).

Dále vynález zajišťuje další molekuly nukleové kyseliny mající nukleotidové sekvence související s velkými částmi obrázku 2 (SEQ ID NO:4), které byly stanoveny z následujících cDNA klonů: TBG1-3 a TBG5-7 jak je ukázáno na obrázku 3, SEQ Nos 1-3 a 5-7.

Z jiné stránky vynález zajišťuje izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy, které hybridizují za stringentních hybridizačních podmínek s částmi polynukleotidů v molekule nukleových kyselin vynálezu popsaných výše, například s cDNA klonem ukázaným na obrázku 2 (SEQ ID NO:4). Stringentními hybridizačními podmínkami je míněna inkubace přes noc při 42°C v roztoku obsahujícím: 50% formamid, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM citronan sodný), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5x Denhardtův roztok, 10% dextransulfát a 20 μρ/ml denaturované, jednotné DNA ze spermií lososa. Poté následuje promytí filtrů v 0,lxSSC při cca 65°C.

Jak je naznačeno, molekuly nukleové kyseliny předkládaného vynálezu, které kódují β-galaktosidasu II mohou zahrnovat (ale nejsou omezeny na) ty, které kódují aminokyselinové sekvence samotného zralého polypeptidů, dále mohou zahrnovat kódující sekvence zralého polypeptidů a dalších sekvencí jako jsou sekvence kódující cca 1-23 aminokyselinu zaváděcí sekvence, jako jsou prenebo pro- nebo prepro-proteinové sekvence, a dále mohou zahrnovat kódující sekvence zralého polypeptidů s nebo bez shora zmíněných dalších kódujících sekvencí.

Dále je objeven enhancer/promotor asociovaný s expresí genů kódujících β-galaktosidasu. Vynálezci charakterizovali expresní • · • · · · • · · ··· ··· ···· ·· ·· ···· φ· ·« profil mRNA TBG2 a klonovali lambda genomickou cDNA. TBG2 je exprimován před započetím procesu zrání a pokračuje na stejné úrovni během všech stádií zrání. Bylo zjištěno, že TBG2 je exprimován ve všech pletivech plodu a bylo též zjištěno, že je specifický pro plody. Experimenty prokázaly, že TBG2 není ovlivněn etylénem. TBG2 je exprimován také u mutantů s pozměněným zráním - rin, nor a Nr, v normálním čase po odkvětu. Objevený promotor by byl použitelný k expresi jakéhokoliv genu v sense či antisense orientaci, zvláště v plodech rajčete, ve všech pletivech rajského jablíčka. Exprese by začala před a pokračovala během celého procesu zrání. Promotor by mohl být také použit k expresi jakéhokoliv genu v mutantech rin, nor a Nr, bez potřeby ošetření plodů exogenním etylénem.

Variantní a mutantní polynukleotidy

Předkládaný vynález se dále týká variantních molekul nukleových kyselin předkládaného vynálezu, které kódují části β-galaktosidasy nebo její analoga čí odvozené formy. Variantní formy se mohou objevit přirozeně jako přírodní alelické varianty. Alelickou variantou je míňena jedna z několika alternativních forem genu, který se nachází na daném místě na chromozomu organismu (Genes II,

Lewin B, ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Varianty, které se nevyskytují přirozeně mohou být získány s použitím mutačních technik známých v oboru.

Takovéto varianty zahrnují formy, které jsou získávány nahrazením (substitucí), vypuštěním (delecí) či vnesením (adicí) nukleotidů. Nahrazení, vypuštění či vnesení se může týkat jednoho nebo více nukleotidů. Varianty mohou být změněny v kódující oblasti, v nekódující oblasti nebo v obou oblastech. Změny v kódujících oblastech mohou tvořit stálé nebo nestálé aminokyselinové substituce, delece nebo adice. Zvláště se dává přednost „tichým substitucím, delecím a adicím. Takové změny nemění vlastnosti a aktivity β-galaktosidasy či jejich častí. Přednost se v této souvislosti také dává stálým substitucím.

Nejvíce jsou upřednostňovány molekuly nukleových kyselin kódujících zralý protein mající aminokyselinovou sekvenci ukázanou na obrázku 2 jako pZBG2-l-4 nebo kódujících zralou β-galaktosidasu mající aminokyselinovou sekvenci kódovanou vloženým cDNA klonem.

Další ztělesnění vynálezu zahrnují izolovanou molekulu nukleové

kyseliny obsahující polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci přinejmenším z 90% identickou, ale lépe přinejmenším z 95%, z 96%, z 97%, z 98% nebo z 99% identickou s polynukleotidem vybraným ze skupiny skládající se z: a) nukleotidové sekvence kódující polypeptid β-galaktosidasy, která má úplnou aminokyselinovou sekvenci na obrázku 2 (SEQ ID NO: 4), b) nukleotidové sekvence kódující zralý polypeptid β-galaktosidasy ukázaný na obrázku 2 (SEQ ID NO: 4), c) nukleotidové sekvence komplementární ke kterékoliv nukleotidové sekvenci zmíněné v a) a b) výše.

Vektory a hostitelské buňky

Předkládaný vynález se dále týká vektorů, které nesou izolované molekuly DNA předkládaného vynálezu, hostitelské buňky, které jsou geneticky sestavené s rekombinantními vektory a získávání β -galaktosidasy II nebo jejich fragmentů rekombinantními technikami. Vektor může být např. fág, plasmid, virový nebo retrovirový vektor. Retrovirový vektor může být schopný replikace nebo může být defektní při replikaci. V naposled uvedeném příkladě se obecně objeví virová propagace pouze v komplementních hostitelských buňkách.

Polynukleotidy mohou být spojeny ve vektoru se selektovatelným markérem množení v hostiteli. Obecně je plasmidový vektor vnesen ve sraženině jako je sraženina fosforečnanu vápenatého nebo v komplexu s nabitým lipidem. Jestliže je vektor virus, může být zabalen in vitro s použitím vhodné balící buněčné linie a poté transdukován do hostitelských buněk.

DNA insert by měl být účinně spojen s vhodným promotorem jako je PL promotor fágu lambda, promotory E.coli lac, trp, phoA a tac, časné a pozdní promotory SV40 a promotory retrovirů LTRs. Jmenovány byly jen některé, další vhodné promotory budou známy znalým oboru. Expresní konstrukty budou dále obsahovat místa pro iniciaci transkripce, terminační místa a v překládané oblasti ribozomální vazebná místa pro translaci. Kódující část transkriptu exprimovaného konstruktem bude přednostně obsahovat iniciační translační kodon na začátku a terminační kodon (UAA,UGA nebo UAG) vhodně umístěn na konci polypeptidu, který má být překládán.

Jak bylo naznačeno, expresní vektor bude přednostně zahrnovat přinejmenším jeden selekční markér. Mezi takové markéry patří např. dihydrofolatreduktasa, G418 nebo rezistence k neomycinu u • · ···· ·· · · · • · · · · · ···« ·· ·· ··«· eukariotických buněčných linii a k tetracyklinu, kanamycinu nebo ampicilinu u kultur E. coli a dalších baktérií. Typickými příklady vhodných hostitelů jsou např. bakteriální buňky jako je E. coli, StrepZBG2-l-4 s Salmonelly typhimurium; dále buňky hub, jako jsou kvasinky; hmyzí buňky jako jsou buňky Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; živočišné buňky jako jsou CHO, COS, 293 a melanomové buňky Bowes a dále také rostlinné buňky. Vhodní hostitelé však nejsou limitováni výše vyjmenovanými příklady. Vhodná kultivační média a podmínky pro výše uvedené hostitelské buňky jsou v oboru známá.

Mezi vektory přednostně používané v bakteriích patří pQE7O, pQE60 a pQE-9, které jsou dostupné u firmy QIAGEN, lne., dále supra, pBS vektory, vektory Phagescript, vektory Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, které jsou dostupné u firmy Stratagene a dále vektory ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 a pRIT5, které jsou dostupné u firmy Pharmacia. Mezi přednostně používané eukariotické vektory patří pWELNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl a pSG, které jsou dostupné u firmy Stratagene a pSVK3, pBPV, pMSG a pSVL dostupné u firmy Pharmacia. Další vhodné vektory budou jasně zřejmé odborníkům.

Vnesení konstruktu do hostitelských buněk může být uskutečněno transfekcí pomocí fosforečnanu vápenatého, transfekcí zprostředkovanou DEAE-dextranem, transfekcí zprostředkovanou kationtovými lipidy, elektroporací, transdukcí, infekcí nebo dalšími metodami. Tyto metody jsou popsány v mnoha běžných laboratorních manuálech jako např. v Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Příklady provedení vynálezu

Rostliny rajčete (Lycopersicon esculentum Milí, cv. „Rutgers) byly pěstovány ve skleníku s použitím běžných pěstitelských praktik. Všechny mutanty se změněným zráním - ripening inhibitor (rin), non-ripening (nor) a never ripe (Nr) (Tigchelaar et al., 1978) měly též jako základ kultivar „Rutgers. Květy byly v době kvetení označeny a plody byly sklízeny podle počtu dnů po odkvětu (dpa days post-anthesis) nebo na základě barvy jejich povrchu a to tak, aby odpovídaly různým stádiím zralosti jak bylo již dříve popsáno (Mitchan et al., 1989, který je zde zahrnut odkazem). Pro studium exprese genů byla sklízena z rostlin pěstovaných ve skleníku různá ·· «

• ·· • · · · · · ·· ···· ·· ·· ·«·· ·· pletiva listů, květů a stonků. Kořeny byly sklizeny z klíčních rostlin pěstovaných v základním médiu pro tkáňové kultury po čtyři týdny po vyklíčení.

Extrakce RNA

Plody byly zpracovány ihned po sklizni ve skleníku a to ochlazením ledem, odstraněním nechtěných pletiv a jejich zmrazením kapalným dusíkem. Vzorky pletiv byly rozdrceny v třecí misce a skladovány při -80°C. RNA byla extrahována metodou dle Verwoerda a spolupracovníků (1989). Poly(A)RNA byla purifikována z celkové RNA s použitím kolon oligo(dT) (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). RNA byla kvantifikována měřením A260 s použitím dvoupaprskového spektrofotometru.

RT-PCR

Degenerované primery byly navrženy na základě nejvyšší společné odvozené aminokyselinové sekvenční podobnosti, kterou jsme našli mezi cDNA klony β-galaktosidas jablka (vstupní číslo P48980), chřestu (P45582) a karafiátu (Q00662). Dva primery použité v první reakci byly BG5'E1 (WSNGGNWSNATHCAYTAYCC) a BG3'E (CCRTAYTCRTCNADNGGNGG). Druhá reakce byla udělána s produktem z první rekce s použitím BG5'I1 (ATHCARACNTAYGTNTTYTGG) a BG3'E. Degenerovaný kód pro sekvence primerů je N=a+t+c+g, H=a+t+c,

D=a+t+g, V=a+c+g, R=a+g, Y=c+t, M=a+c, K=t+g, S=c+g a W=a+t. 5' a 3' primery korespondovaly s aminokyselinami 72-78 a 321-315 klonu jablka. Amplifikace byla provedena s použitím AmpliTaqDNA polymerasy (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) a standardních PCR podmínek s použitím cDNA připravené pro první cDNA knihovnu (viz níže) jako templátu (Ausubel et al., 1987). Produkty PCR byly separovány na agarozovém gelu a fragmenty očekávané velikosti (okolo 750 bp) byly purifikovány, klonovány do pCRscript (Straragene, La Jolla, CA, USA) a sekvenovány.

cDNA knihovna

Byly připraveny dvě cDNA knihovny. První obsahovala póly(A)RNA izolovanou z perikarpu plodů rostlin „Rutgers v různých stádiích zrání (braker, turning a růžové). Syntéza cDNA a konstrukce knihovny byly provedeny přesně podle instrukcí dodaných výrobcem pro kit

ZAP-cDNA Gigapack II Gold Cloning (které jsou zde tímto zahrnuty

44 4 *· 4· 4· 44 * 4 4·· · · ’ »· · 4 4 « ₉ * · · · 4 4 44 4 · 4 4» » * ·· 44 4444 44 odkazem) (Stratagene). První vlákno syntetizované cDNA bylo podrobeno PCR reakci za použití primerů poly(dT) a inzerty byly směrově klonovány do vektoru Uni-Zap XR s použitím restrikčních míst EcoRl a Xhol. Druhá knihovna obsahovala póly(A)RNA, která byla izolována ze všech pletiv plodů (vyjma semen) rostlin „Rutgers v různých stádiích zrání (nezralá zelená, zralá zelená, braker, turning, růžové, červené zralé a přezrálé). Syntéza cDNA a konstrukce knihovny byly provedeny přesně podle instrukcí dodaných výrobcem pro kit SuperScript Lambda System for cDNA synthesis and Cloning (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA). První vlákno syntetizované cDNA bylo podrobeno PCR reakci za použití primerů oligo(dT) a cDNA inzerty byly klonovány směrově do klonovacího vektoru ZipLox s použitím restrikčních míst Sáli a Notl. Obě knihovny byly amplifikovány a udržovány za použití hostitelských kmenů dodaných výrobci dle jejich instrukcí.

Jeden z klonů (RT-PCR2-1) byl použit k vyšetření 10θ kolonií z cDNA knihoven plodů rajčete za podmínek nízké stringence (hybridizace při 45°C, bez formamidu a závěrečné promytí 0,2xSSC při 42°C). Bylo identifikováno a částečně sekvenováno třicet pozitivních klonů. Úplná sekvenace a charakterizace RT-PCR a cDNA klonů ukázala sedm možných jedinečných β-galaktosidasových genů.

Analýza DNA a RNA gelů pomocí blotování

Southern analýza byla provedena s použitím 3'UTR každého klonu celé délky a RT-PCR klonů jako sond proti enzymaticky naštěpené genomické DNA. Analýza DNA gelů pomocí blotů byla provedena přesně tak, jak je popsána v Smith and Fedoroff (1995) vyjma toho, na každé štěpení byly použity 3 pg genomické DNA. Geny korespondující s klony byly přítomny v jediné kopii (data nejsou ukázána). Stejné sondy byly použity k mapování šesti ze sedmi genů pomocí RFLP rekombinantních imbredních linií. Pozice a jména jsou uvedena v Tabulce II (James Gioviannone, Texas A&M University, osobní sdělení).

Tabulka II. Pozice TBG. Geny byly mapovány Southernovou analýzou za použití RFLP rekombinantních imbredních linií

Gen_chromozom__pozice • · · · · · • · · · · · • · · ·

TBG1	12*	překryv IL12-2, IL12-3
TBG2	9	IL9-3
TBG3	3	IL3-5
TBG4	12*	překryv IL12-2, IL12-3
TBG5	11	IL11-3
TBG6	2	překryv IL2-4, IL2-5
TBG7	bez RFLP
*TBG1 a 4	jsou volně vázané

Celková RNA (20gg/dráhu) byla rozdělena ve formaldehyd/Mops agarosovém gelu, přenesena na nylonovou membránu Hybond-N⁺ (Amersham, Arlington Heights, IL, USA), fixována inkubací 2 hodiny při 80°C, hybridizována přes noc v hybridizačním inkubátoru (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA, USA) za použití pufru popsaného Churchem a Gilbertem (1984). Dále byla membrána promyta na konečnou stringenci 0,lxSSC s 0,2% SDS při 65°C. S takto připravenou membránou byla provedena autoradiografie přesně podle postupu popsaného Ausubelem a spolupracovníky (1987). Ke stanovení délky RNA byl použit standard RNA (GibcoBRL). Sondy byly syntetizovány s použitím náhodných primerů a 32ρ_^_Τρ j_ak_o značky (random priming kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA). Northern analýza byla provedena za použití 3'UTR každého klonu celé délky a RT-PCR klonů jako templátů pro syntézu sond. Pro kontrolu nanášení byly sejmuty RNA bloty a reprobovány za snížených hybridizačních podmínek a promývací stringence s použitím sojového 26S rDNA fragmentu (Turano et al. , 1997) . Pro všechny hybridizace byla ^2ρ(^ψρ) značená sonda ředěna na 1-2 x 10θ dpm/ml. Výše uvedené reference jsou zde plně uvedeny citacemi.

Sekvenční analýza

Sekvenace byla provedena na sekvenačních zařízeních Iowa State University (Iowa State University Sequencing Facility, Ames, IA,

USA) za použití metody založené na PCR dideoxynukleotidovém terminačním protokolu a s použitím automatického sekvenátoru ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvenace obou vložených vláken cDNA byla provedena metodou chodících primerů (primer • · · · • · · · · ·· · • · · · · · * · · · v · ··· • *·· · · · · ···· · · ···· walking). Porovnání nukleové a odvozené aminokyselinové sekvence s databasemi byla provedena za pomoci BLASTu (Altschul et al., 1990). Sekvenční data byla analyzována a srovnána s pomocí programů DNA Strider 1.2 (Marek, 1988) a MacDNAsis (Hitachi, San Bruno, CA, USA). Výše uvedené reference jsou zde plně uvedeny citacemi.

Analýzy pomocí northern blotů

Tkáňově specifická exprese

Northern blot analýza byla provedena s cílen odhalit, který, jestliže nějaký, β-galaktosidasový gen je exprimován specificky v plodech. S výjimkou TBG2 byly transkripty všech klonů detekovány v jiných pletivech než jsou plody (obr.4). Transkripty TBG1,4,5 a 6 byly detekovány ve všech pletivech, která byla testována. Nízká hladina transkriptu TBG3 byla detekována v kořenech a pletivech stonku, zatímco transkript TBG7 byl detekován v květech a pletivech stonku.

Časově závislá exprese v plodech

Byla stanovena exprese všech sedmi genů v plodech v závislosti na čase. K těmto pokusům byla použita RNA extrahovaná ze všech pletiv plodů vyjma semen. Transkripty všech sedmi genů byly detekovány v některých stádiích vývoje plodu (obr.5). TBG1 a 3 měly podobný průběh exprese a jejich transkripty byly detekovány během všech stádií od stádia braker po stadium přezrálých plodů. Exprese TBG2 byla unikátní a hladina jeho transkriptu byla konstantní detekován v době 30 dpp až po stádium přezrálých plodů. Exprese TBG4 byla podobná expresi TBG1 a 3 s tím rozdílem, že hladina transkriptu byla významně vyšší ve stadiu turning. Exprese TBG5 byla podobná expresi TBG4 během stádií zrání, nicméně transkript TBG5 byl taktéž detekován během všech předcházejících stádií vývoje plodu. Exprese TBG6 byla zajímavá, jeho transkript byl detekován ve vysokých hladinách pouze ve všech stádiích před stádii zrání plodu, které byly testovány. Exprese TBG7 byla též jedinečná a jeho transkript byl detekován ve velmi nízkých hladinách během všech testovaných stádií a ve středních hladinách ve stádiu 10 dpp a ve stádiu přezrálých plodů.

Exprese v pletivech plodů

Northern blot analýza byla také použita ke stanovení akumulace • · • · · · transkriptů v různých pletivech plodu. Protože byly nalezeny rozdíly v expresi TBG genů během vývoje plodů byly k extrakci RNA použity plody ve stádiích zralého zeleného plodu a ve stádiu plodu „turning (obr.6). Jak trankript TBG2 tak i transkript TBG6 byly detekovány ve všech testovaných pletivech stádia zralého zeleného plodu.

Transkript TBG7 byl přítomen ve všech testovaných pletivech vyjma pouzdra. Transkripty TBG1 a TBG4 byly detekovány ve všech vzorcích extrahovaných ze všech pletiv ve stádiu plodu „turning. Transkript TBG4 byl jasně více zastoupen ve slupce. Exprese TBG3 a TBG5 byla jedinečná a jejich transkripty byly detekovány ve všech pletivech vyjma vnějšího perikarpu a nozdra.

Exprese v normálních a mutantnich plodech

Pro lepší pochopení možné role produktů TBG a trankripčních regulačních mechanismů byla provedena northern analýza pletiv plodů mutantů se změněným vývojem plodu. Byly použity následující mutanty:

rin, nor a N^r. Tyto analýzy byly důležité, protože mohly poskytnou vodítko ke kterékoliv potenciální roli kteréhokoliv TBG při zrání a/nebo měknutí plodů.

Výsledky northern analýzy mutantnich plodů ukázaly, že regulace transkripce TBG1, 2, 3, 5 a 7 nebyla ovlivněna v pletivech mutantnich plodů a že jejich transkripty byly přítomny během vývoje plodů (dpp) stejně jako v případě normálních plodů (obr.7). Nicméně množství transkriptů TBG4 a 6 bylo u mutantnich plodů rozdílné.

Transkript TBG4 nebyl detekován v pletivu plodu N^r a byl detekován v o mnoho nižších koncentracích v mutantech rin a nor oproti pletivům normálních plodů. Normálně jsou transkripty TBG6 detekovatelné ve vysokých hladinách během časných stádií vývoje plodu, ale nejsou detekovatelné po stádiu zralého zeleného plodu (40-42 dpp). U všech tří mutantů zůstával transkript TBG6 dokonce až do 50 dpp.

Regulace transkripce etylénem

Northern analýza provedená s mutantními a normálními plody naznačila, že by exprese TBG4 mohla být zvýšena etylénem a že exprese TBG6 by mohla být snižována etylénem. K ověření této hypotézy byly sklizeny zralé zelené plody a vystaveny plynulému proudu etylénu o koncentraci 10 ppm ve vzduchu. RNA byla extrahována z kontrolních plodů a z plodů ošetřených etylénem v 1, 2, 12 a 24 hodině. Výsledky tohoto experimentu potvrdily nálezy získané • · northern analýzou mutantních plodů. Jak se předpokládalo, přítomnost a množství transkriptů TBGl, 2, 3, 5 a 7 nebylo u pletiv zralých zelených plodů vystavených exogennímu působení etylénu v podstatě ovlivněno (obr.8). Množství transkriptů TBG4 však bylo v pletivech zralého zeleného plodu přítomností etylénu zvýšené. Z dat naměřených dat nebylo zřejmé, zdali bylo množství transkriptů TBG6 sníženo ošetřením exogenním etylénem, protože normální hladina transkriptů byla v tomto stádiu vývoje plodu snížena.

Aktivita enzymu

Ve snaze zjistit roli produktů kódovaných TBG jsme zahájili experimenty, které by vedly za použití heterologních expresních systémů k expresi kódovaných enzymových cDNA. Bylo testováno několik expresních systémů v E. coli, výtěžnost produktů však byla velmi nízká. Důvodem byla zřejmě toxicita vznikajících produktů (viz níže uvedený příklad). Z tohoto důvodu jsme použili kvasinkový expresní systém, který sekretoval zralý amino-koncový-FLAG fůzní protein do kultivačního média. Jako první byla testována cDNA TBG4 a výsledkem byla tvorba přibližně lmg aktivního TBG4 proteinu na 50 ml kultury. TBG4 byl použit jako první, protože cDNA kóduje enzym β -galaktosidasu II, který byl purifikován z plodů rajčete a detailněji charakterizován (Carey et al., 1995, Smith et al., 1998). Mohli jsme tak porovnat aktivitu heterologním systémem exprimovaného proteinu s nativním enzymem purifikovaných z rajčat. Protein TBG4 byl· s úspěchem afinitně purifikován za použití anti-FLAG afinitního nosiče (obr.9).

Afinitně purifikovaný TBG4 enzym vykazoval β (1-4)-D-galaktosidasovou aktivitu vzhledem ke své schopnosti hydrolyzovat syntetický substrát p-nitrofenyl-p-D-galaktopyranosu (Smith et al., 1998). Enzym může odštěpovat galaktosilové zbytky z mnoha substrátů v buněčné stěně a tak má exo-galaktanasovou aktivitu (tabulka III). V současné době jsou prováděny pokusy o úspěšnou expresi aktivních enzymů kódovaných zbývajícími klony cDNA plné délky. Předběžné výsledky ukazují, že TBGl taktéž kóduje enzym, který má také jak β-galaktosidasovou tak i exo-galaktanasovou aktivitu (tabulka III).

• · ···· · » · ·· ·

Tabulka III. Aktivita TBG4 a TBG1 exprimovaných v kvasinkách při degradaci buněčné stěny. Uvolňování galaktosilových zbytků z pektinové frakce buněčné stěny rozpuštěné v chelatoru (CSP) a v alkalickém prostředí (ASP) a z hemicelulozové frakce buněčné stěny
(HCF). Frakce buněčné stěny h	)yly purifikovány z rajčatových plodů
	pg uvolněné galaktosy
enzym substrát	povařený živý
a tbq4 CSP	0	5
ASP	O	14,5
HCF	0	4
b TBG1 ^ASP	O	1,2
2 mg substrátu, 4 hodiny při ^a 0,005 U enzymu/reakci k 0,0005 U enzymu/reakci	37°C

pZBG2-l-4 kóduje β-galaktosidasu

TBG4 ORF byl klonován do represibilního/inducibilního bakteriálního expresního vektoru pFLAG-CTC. Hostitelský kmen XLl-Blue MR je mutantní kmen neobsahující ani endogenní β -galaktosidasovou aktivitu ani α-komplementaci. Indukce genového transkriptu IPTG způsobilo okamžité zastavení růstu E. coli při 30 až 37°C. Nicméně indukce při 20°C dovolila limitovaný růst E. coli. Jestliže byly klony obsahující pZBG2-l-4 4 ORF pěstovány při 20°C a indukovány IPTG, obarvily se buňky v médiu obsahujícím substrát pro β-galaktosidasu X-GAL pomalu po 36 hodinách do modra (obr. 10) . Jestliže nebylo použito IPTG, nebyla pozorována modrá barva a to dokonce ani po prodlouženém růstu v médiích obsahujících X-GAL. Jako další negativní kontrola byly zařazeny klony skládající se z XLl-Blue MR transformovaných samotným vektorem FLAG. Takovéto buňky nikdy nevykazovaly jakoukoliv β-galaktosidasovou aktivitu jak už po či bez indukce IPTG a dokonce ani po sedmidenním růstu (obr. 10) . Jako pozitivní kontrola s maximální β-galaktosidasovou aktivitou (odvozenou z β-galaktosidasy E. coli) byl klonovací vektor pGEM transformován do hostitelského kmene DH5a. Výsledek je taktéž ukázán obrázku 10. Obrázek 10 ukazuje detekci aktivity β-galaktosidasy při expresi pZBG2-l-4 v E. coli. Buňky byly sklízeny každých 12 hodin a Af;i s bylo měřeno. Kultury bvlv oěstovánv s ořídavkem • · · · transkripčním inducerem IPTG (zavřené symboly) v médiu. Vektor použitý jako pozitivní kontrola pro β-galaktosidasovou aktivitu E. coli byl pGEM (?) a vektor použitý jako negativní kontrola a k expresi byl pFLAG-CTC buď bez (?,?) nebo s pZBG2-l-4 ORF (?,?) .

Vliv na strukturu rostlinných pletiv

Následující experimenty byly provedeny s cílem dále demonstrovat funkci TBG4 kódované β-galaktosidasy II.

Plody rajčat obsahujících antisense konstrukt k potlačení mRNA TBG4 byly až o 40% tvrdší (srovnání průměrů rodičovské linie č.l s antisense linií č.2 na obrázku 11A-11E (1-4)) než plody rodičovské linie. Mezi transformanty měly linie s nej tvrdšími plody také nejnižší celkovou hladinu TBG4 mRNA (obr. 12A,B). Tato korelace naznačuje, že snížená hladina mRNA TBG4 je spojena se zvýšenou tvrdostí plodů. Tvrdší plody mohou vést k 1) menší poškození během lodní přepravy a) menší ztráty související s poškozením a b) možnost sklizně v pozdějších stádiích, což vede k lepší chuti na trhu 2) delší trvanlivost jak pro trh tak i pro konzumenta. 3) lepší kvalitě plodů na trhu čerstvých plátků - jestliže jsou plody v růžovém/červeném stádiu tvrdší, lépe se krájí .

Metody

Ke stanovení funkce TBG4, který kóduje β-galaktosidasy II byl připraven konstrukt s použitím konstitutivně exprimujičího 35S CaMV promotoru tak, aby exprimoval TBG4 anitisense RNA (obr. 13). Konstrukt byl vpraven do rajčete za pomoci Agrobakteriem zprostředkované transformace. Čtyři kultivary rajčete byly transformovány za účelem zjištění vlivu potlačení TBG4 na kvalitu rajčatového protlaku (cv UC82b) a na tři nově vybrané kultivary. Jeden z nově vybraných kutivarů je měkký, velký třešňovitý plod rajčete (cv Ailsa Craig), druhý je měkký plod klasické šlechtitelské linie (cv Rutgers) a třetí je nedávno vyšlechtěný poněkud tvrdší kultivar New Rutgers. Mezi liniemi, ve kterých byla potlačena mRNA TBG4 jsme očekávali zvyšující se tvrdost a viskozitu protlaku.

Struktura

Ačkoliv je tento projekt téměř hotový, nejsou úplně hotové všechny biochemické a molekulárně biologické analýzy. Předběžné • · • · • · · výsledky analýzy kultivaru New Rutgers jsou prezentovány na obrázku 11A-E (1-4) a na obrázku 12A,B. V tomto případě byl použit nově vybraný kultivar nazývaný New Rutgers. Rostliny byly vypěstovány ze zakoupených semen a jejich semena byla dále použita jako rodičovská kontrola (linie 1). Sedm nezávislých transformovaných rostlin (linie 2-8) obsahujících antisense TBG4 konstrukt bylo pěstováno a bylo jim dovoleno samoopylení. Transformace (inzerce T-DNA) byla potvrzena Southern analýzou (data nejsou ukázána). Z každé transformované linie bylo pět rostlin pěstováno společně s 10 rostlinami rodičovské linie. Ve stádiu breaker (počátek změny barvy) byly plody označeny a sedm dní poté (stádium breaker + 7 dní) sklizeny. Data byla naměřena za použití 15-20 plodů z každé linie. Každý typ měření struktury byl proveden dvakrát pro každý plod a byly měřeny čtyři typy struktury za použití analyzátoru struktury Stable Micro System's TA-XT2Í. Tyto čtyři typy byly: ztlačení 1,2 inchovou destičkou na 3mm (obr. 11A), ztlačení sférickým 2,4 milimetrovým inderterem na 3mm (obr 11B), ztlačení cylindrickým 3,4 milimetrovým inderterem na 3 mm (obr.llC) a proražení 3,4 milimetrovým cylindrickým inderterem na 10 mm (obr. 11D). Celkový přehled těchto výsledků je vidět na obrázku 11E (1-4). Na obrázku 11A-E byla dráha 1 rodičovská linie a každá z drah 2-8 reprezentuje nezávislý transformant obsahující jednu kopii T-DNA TBG4 antisense konstruktu. Statistická analýza (Duncans and Scheffé) získaných dat ukázala, že plody z transformovaných linií 3, 7 a 8 se významně neliší od rodičovské linie, zatímco linie 2,4,5 a 6 byly významně tvrdší než rodičovské plody. Nejpozoruhodnější byly plody z transformované linie 2, jejíž plody byly tvrdší průměrně o 40% než plody rodičovské linie (obr.llA-D).

Analýza pomocí northern blotu

V současné době zkoumáme jakékoliv změny v biochemickém složení plodů, ve kterých byla snížena hladina TBG4 mRNA. Tyto experimenty jsou navrženy tak, aby ukázaly vazbu mezi zvýšenou tvrdostí plodů a potlačením TBG4 mRNA, potlačením aktivity enzymu kódovaného TBG4, případnými změnami buněčné stěny (např. zvýšené množství galaktosilových zbytků) a snížení hladiny volné galaktosy během zrání plodu.

Tyto experimenty ještě nejsou dokončeny, některé předběžné experimenty za použití northern blotu však byly provedeny a data • · · · jsou ukázána na obrázku 12 A,B. Na obrázku 12 A, B není ještě zařazena kontrolní RNA z rodičovských nebo azygotních plodů, protože tyto byly pěstovány jako poslední a extrakce RNA je dělána právě teď. Pro porovnání hladiny mRNA TBG4 normálních plodů je možné použít obrázek 5. Data na obr. 5 ukazují, že hladina TBG4 mRNA je nižší ve stádiu zralých zelených plodů, dosahuje vrcholu ve stádiu turning a je snížena ve stádiu červených plodů. Všechny linie vyjma linie 2 a 3 exprimovaly antisense TBG4 mRNA (obe. 12 A,B). Antisense transkript se objevil jako dva proužky menší než endogenní mRNA. Dva proužky jsou pravděpodobně výsledkem předpokládaného transkripčního stop signálu z NOS-terminátoru (první proužek) a kryptického transkripčního stop signálu v antisense TBG4 cDNA (druhý proužek). Nejzajímavější výsledek byl zaznamenán u linie 2, kde nebyla detekována ve stádiu turning žádná TBG4 mRNA. Linie 2 měla také nej tvrdší červené plody (viz obr. 11A-D) . Absence detekovatelně TBG4 mRNA byla zřejmě důsledkem společného potlačení jak endogenní tak i antisense mRNA. V porovnání s dřívějšími bloty (např. s obr.4) se zdá, že všechny linie obecně mají sníženou hladinu TBG4 mRNA. Není však možné v této chvíli přiřadit těmto výsledkům žádná čísla bez přítomnosti rodičovské a azygotní RNA na stejném northern blotu.

Tento popis vynálezu ukázal, že se β-galaktosidasa II podílí na degradaci pektinu buněčné stěny během zrání plodů. V předkládaném vynálezu byla ukázána role β-galaktosidasy v procesech zrání a měknutí rajských jablíček. Dále bylo v tomto vynálezu popsáno klonování β-galaktosidasových cDNA klonů, které kódují enzym degradující β(1-4)galaktan, a které jsou exprimovány v pletivech zrajících plodů rajčete.

Za prvé, odvozená aminokyselinová sekvence vysoce konzervované aminokoncové oblasti předpokládaného zralého produktu translace pZBG2-l-4 se téměř přesně shoduje (28 ze třiceti aminokyselin) s N-koncovou sekvencí β-galaktosidasy II, která byla purifikována Careyem a spolupracovníky (1995) a nazvána TOMAA. Zda se však, což je důležité, že dvě aminokyseliny (KY) v sekvenci β-galaktosidasy II (TOMAA), které se neshodují s ze pZBG2-l-4 odvozenou aminokyselinovou sekvencí předkládaného vynálezu jsou nesprávné, protože všechny sekvence β-galaktosidas rostlin nacházející se v • · a · databázi a další čtyři cDNA příbuzné s β-galaktosidasami, které byly identifikovány v rajčatech se shodují nebo mají konzervovanou substituci s odvozenou aminokyselinovou sekvencí pZBG2-l-4 v těchto stejných dvou aminokyselinových (ST) místech (obr.3).

Za druhé, transkript detekovaný pZBG2-l-4 je přítomný v normálních zrajících plodech ve stejný čas kdy byla detekována aktivita β-galaktosidasy (obr.5; Carey et al., 1995). Dále nebyla zjištěna přítomnost (či byla zjištěna přítomnost malého množství) transkriptu v plodech ve stádiu 45 a 50 dní po odkvětu u mutantů nor, rin, a Nr (obr.7). Tato pozorování se také shodují s daty prezentovanými Careyem a spolupracovníky (1995), který ukázal, že aktivita β-galaktosidasy II zůstává u rostlin nor nebo rin na stejné úrovni až do stádia zralého zeleného plodu a v době 45 - 65 dní po odkvětu se v plodu nezvyšuje. Je zajímavé, že Carrington a Pressey (1996) ukázali, že aktivita β-galaktosidasy II byla detekována v plodech kultivaru „Rutger po stádiu zrání „turning. Data vycházející z analýz pomocí northern blotu prezentovaná v tomto vynálezu naznačují, že se maximum aktivity β-galaktosidasy II objevuje vždy po stádiu „turning, což znamená, že by hladina mRNA předpovídala extrahovatelnou enzymovou aktivitu (obr. 5).

Za třetí, zdánlivá molekulová váha zralého proteinu předpovězeného ze sekvence pZBG2-4-l je 77,9 kDa a PI se rovná 8,9. Tyto hodnoty jsou podobné hodnotám, které byly stanoveny pro β -galaktosidasu II. Pressey (1983) stanovil gelovou kolonovou chromatografii molekulovou váhu na 62 kDa a izoelektrickou fokusací PI na 7,8, kdežto Carey a spolupracovníci (1995) stanovili pomocí SDS-PAGE molekulovou hmotnost na 75 kDa a pomocí izolelektrické fokusace PI na 9,8.

Za čtvrté, enzym kódovaný pZBG2-l-4 ORF a produkovaný heterologním expresním systémem v kvasinkách vykazuje jak β -galaktosidasovou aktivitu tak i exogalaktinasovou aktivitu.

Literatura

Altschul SF, Gish W, Miller W, Meyers EW, Lipman DJ (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403-410 • · · · • ·

Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman J, Smith J, Struhl K, eds, (1987) Current Protocol in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York

Carey AT, Holt K, Picard S, Wilde R, Tucker GA, Bird CR, Schuch W, Seymour GB (1995) Tomato exo-(1-4)-β-D-galactanase. Isolation, changes during ripening in normál and murant tomato fruit, and characterization of related cloně. Plant Physiol 108: 1099-1107

Carrington CM, Pressey R (1996)β-galactosidase II activity in relation to changes in cell wall galactosyl composition during tomato ripening. J Amer Soc Hort Sci 121: 132-136

Church GM, Gilbert W (1984) Genomic sequencing. Proč Nati Acad Sci USA 81: 1991-1995

De Veau EJ, Gross KC, Hubert DJ, Watada AE (1993) Degradation and solubilization of pectin by β-galactosidases purified from avocado mesocarp. Physiol Plant 87: 279-285

Fischer RL, Bennett AB (1991) Role of cell wall hydrolases in fruit ripening. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42: 675-703

Giovannoni JJ, DellaPenna D, Bennett AB, Fischer RL (1989)

Expression of a chimeric polygalacturonase gene in transgenic rin (ripening inhibitor) tomato fruit results in polyuronide degradation but not fruit softening. Plant Cell 1: 53-63

Golden KD, John MA, Kean EA (1993)β-Galactosidase from Coffea arabica and its role in fruit ripenning. Phytochemistry 34: 355-360

Gross KC (1984) Fractionation and partial characterization of cell wall from normál and non-ripening mutant tomato fruit. Physiol Plant 62: 25-32

Gross KC, Sams CE (1984) Changes in cell wall neutrál sugar composition during fruit ripening: A species survey. Phytochemistry 23: 2457-2461

Gross KC, Wallner SJ (1979) Degradation of cell wall polysacharides during tomato fruit ripening. Plant Physiol 63: 117-121

Halí LN, Tucker GA, Smith CJS, Watson CF, Seymour GB, Bundick Y, Boniwell JM, Fletcher JD, Ray JA, Schuch W, Bird CR, Grierson D. (1993) Antisence inhibition of pectin esterase gene expression in transgenic tomatoes. Plant J 3: 121 - 129

Huber DJ (1983) The role of cell wall hydrolases in fruit softening. Hort Rev 5: 169-219

Kang IK, Suh SG, Gross KC, Byun JK (1994) N-terminal amino acid sequence of persimmon fruit β-galactosidase. Plant Physiol 105: 975-979

Kim J, Gross KC, Solomos T (1991) Galactose metabolism and ethylene production during development and ripening of tomato fruit. Postharv Biol Technol 1: 67-80

Marek C (1988) DNA Strider: a „C program for the fast analysis of DNA and protein sequences on the Apple Macintosch family of computers Nucleic Acids Res 16: 1829-1836

Mitcham EJ, Gross KC, Ng TJ (1989) Tomato fruit cell wall synthesis during development and senescence. In vivo radiolabeling of cell wall fractions using [l^C]sucrose. Plant Physiol 89: 477-481

Nakai K, Kanehisa M (1992) A knowledge base for predicting protein localization sites in eukaryotic cell. Genomics 14: 897 - 911

Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, von Heijne G (1997)

Identification of procaryotic and eucaryotic signál peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1-6

Pressey R (1983) β- Galactosidases in ripening tomatoes. Plant Physiol 71: 132 - 135

Ross GS, Redgwell RJ, MacRae EA (1993) Kiwifruit β- galactosidase isolation and activity against specific fruit cell-wall polysaccharides. Planta 189: 499-506

Ross GS, Wegrzyn T, MacRae EA, Redgwel RJ (1994) Apple β

-galactosidase. Activity against cell wall polysaccharides and characterization of related cDNA cloně. Plant Physiol 106: 521-528 • · • · ·

Seymour GB, Gross KC (1996) Cell wall disassembly and fruit softening. Postharvest News Info 7: 45N-52N

Smith CJS, Watson CFS, Ray J, Bird CR, Morris PC, Schuch W, Grierson D (1988) Antisence RNA inhibition of polygalacturonase gene expression in transgenic tomatoes. Nátuře 334: 724-726

Smith DL, Fedoroff NV (1995) LRP1, a gene expressed in lateral and adventitious root primordia of Arabidopsis. Plant Cell 7: 735-745

Smith DL, Starrett DA and Gross KC (1998) A gene coding for tomato fruit β-galatosidase II is expressed during fruit ripening. Plant Physiol. 117: 417-423

Tieman DM, Harriman RW, Ramamohan G, Handa AK (1992) An antisence pectin methylesterase gene alters pectin chemistry and soluble solids in tomato fruit. Plant Cell 4:667-679

Tigchelaar EC, McGlasson WB, Buescher RW (1978) Genetic regulation of tomato fruit ripening. HortScience 13: 508 - 513

Turano FJ, Thakkar SS, Fang T, Weisemann JM (1997) Characterization and expression of NAD(H) dependent glutamate dehydrogenase genes ín Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 113: 1329 - 1341

Verwoerd TC, Dekker BMM, Hoekema A (1989) A small-scale proceduře for the rapid isolation of plant RNAs. Nuc Acids Res 17: 2362

Wegrzyn TF, MacRae EA (1992) Pectinesterase, polygalacturonase, and β-galactosidase during softening of ethylene -treated kiwifruit. HortScience 27: 900-902

Claims

PATENOVÉ NÁROKY

T/Uro-Wi

Ία

1. Molekula izolované nukleové kyseliny, která obsahuje polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci přinejmenším z 95% identickou se sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z:

nukleotidové sekvence kódující β-galaktosidasu II, která má úplnou aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID:8, SEQ ID:9, SEQ ID:10, SEQ ID:11,

SEQ ID:12, SEQ ID:13, SEQ ID:14, SEQ ID:15 a SEQ ID:16 a pojmenované TBGl, TBG2, TBG3, TBG4, TBG5, TBG6 a TBG7 tak, jak je ukázáno na obrázku 2 nebo jak je kódována cDNA klony vybranými ze skupiny skládající se z cDNA klonů obsažených v Gen Bank pod vstupními čísly (Accession No.) AF023847, AF154420, AF154421, AF020390, AF154423, AF154424 a AF154422, b) nukleotidové sekvence kódující zralý polypeptid β -galaktosidasy II, který má aminokyselinovou sekvenci na místech cca 27 - 724, vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID:8, SEQ ID:9, SEQ ID:10, SEQ ID:11, SEQ ID:12, SEQ ID:13, SEQ ID:14, SEQ ID:15 a SEQ ID:16 a pojmenované TBGl, TBG2, TBG3, TBG4, TBG5, TBG6 a TBG7 tak, jak je ukázáno na obrázku 2 nebo jak je kódována cDNA klony vybranými ze skupiny skládající se z cDNA klonů obsažených v Gen Bank pod vstupními čísly (Accession No.) AF023847, AF154420,

AF154421, AF020390, AF154423, AF154424 a AF154422, nukleotidové sekvence komplementární k jakékoliv shora uvedené nukleotidové sekvenci bodu a) nebo b).
2. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID:1, SEQ ID:2, SEQ ID:3, SEQ ID:4, SEQ ID:5, SEQ ID:6 a SEQ ID:7 jak je ukázáno na obrázku 2.
3. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid nukleotidovou sekvenci na obrázku 2 (SEQ ID:4) a která kóduje polypeptid β-galaktosidasy II mající aminokyselinovou sekvenci pojmenovanou TBG4 na obrázku 2.

i • · • · · ·
4. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid nukleotidovou sekvenci na obrázku 2 (SEQ ID:4) a která kóduje zralý polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci od cca 24 po cca 724 v aminokyselinové sekvenci pojmenované TBG4 na obrázku 2.
5. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci cDNA klonu obsaženého v Gen Bank Accession No. AF023847.
6. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci cDNA klonu obsaženého v Gen Bank Accession No. AF154422.
7. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci cDNA klonu obsaženého v Gen Bank Accession No. AF154421.
8. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci cDNA klonu obsaženého v Gen Bank Accession No. AF020390.
9. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci cDNA klonu obsaženého v Gen Bank Accession No. AF154423.
10. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci cDNA klonu obsaženého v Gen Bank Accession No. AF154424.
11. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 1, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci cDNA klonu obsaženého v Gen Bank Accession No. AF154422.
12. Molekula izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotid, který hybridizuje za stringentních hybridizačních podmínek s polynukleotidem majícím nukleotidovou sekvenci identickou s nukleotidovými sekvencemi v bodě a), b) nebo c) dle nároku 1, kde řečený polynukleotid, který hybridizuje, nehybridizuje za • · • · • · střingentních hybridizačních podmínek s polynukleotidem majícím nukleotidovou sekvenci, která obsahuje pouze zbytky A nebo pouze zbytky T.
13. Molekula izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotid, který kóduje aminokyselinovou sekvenci oblasti nesoucí epitop polypeptidu β-galaktosidasy II, která má aminokyselinovou sekvenci dle nároku 1 bodu a), b) nebo c) .
14. Metoda přípravy rekombinantního vektoru, která zahrnuje vnesení izolované molekuly nukleové kyseliny dle . nároku 1 do vektoru.
15. Rekombinantní vektor vytvořený metodou dle nároku 14
16. Metoda přípravy rekombinantní hostitelské buňky, která zahrnuje vnesení rekombinantního vektoru dle nároku 15 do hostitelské buňky.
17. Rekombinantní hostitelská buňka vytvořená metodou dle nároku 16.
18. Rekombinantní metoda tvorby polypeptidu β-galaktosidasy II, která zahrnuje pěstování rekombinantní hostitelské buňky dle nároku 17 za podmínek, za kterých je řečený polypeptid exprimován a získán.
19. Izolovaný polypeptid β-galaktosidasy II obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je přinejmenším z 95% identická se sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z:

aminokyselinové sekvence na místech cca 27 - 724, vybrané ze skupiny skládající se z SEQ ID:8, SEQ ID:9, SEQ ID:10,

SEQ ID:11, SEQ ID:12, SEQ ID:13, SEQ ID:14, SEQ ID:15 a SEQ ID:16 a pojmenované TBG1, TBG2, TBG3, TBG4, TBG5, TBG6 a TBG7 tak, jak je ukázáno na obrázku 2 a aminokyselinové sekvence kódováné cDNA klony vybranými ze skupiny skládající se z cDNA klonů obsažených v Gen Bank pod vstupními čísly (Accession No.) AF023847, AF154420, AF154421, AF020390, AF154423, AF154424 a AF154422.

• · • · ·« ··· ··· · · · ···· ·· ·· ··· «· ·»«·
20. Izolovaný polypeptid obsahující oblast nesoucí epitop proteinu β-galaktosidasy II.
21. Izolované protilátky, které se specificky váží na polypeptid β-galaktosidasy II dle nároku 20.
22. Molekula izolované nukleové kyseliny, která obsahuje polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci přinejmenším z 95% identickou se sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z:

nukleotidové sekvence kódující β-galaktosidasu II, která má úplnou aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID:8, SEQ ID:9, SEQ ID:10, SEQ ID:11,

SEQ ID:12, SEQ ID:13, SEQ ID:14, SEQ ID:15 a SEQ ID:16 a pojmenované TBG1, TBG2, TBG3, TBG4, TBG5, TBG6 a TBG7 tak, jak je ukázáno na obrázku 3 nebo jak je kódována cDNA klony vybranými ze skupiny skládající se z cDNA klonů obsažených v Gen Bank pod vstupními čísly (Accession No.) AF023847,

AF154420, AF154421, AF020390, AF154423, AF154424 a AF154422, b) nukleotidové sekvence kódující zralý polypeptid β -galaktosidasy II, který má aminokyselinovou sekvenci na místech cca 27 - 724, vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID:8, SEQ ID:9, SEQ ID:10, SEQ ID:11, SEQ ID:12, SEQ ID:13, SEQ ID:14, SEQ ID:15 a SEQ ID:16 a pojmenované TBG1,

TBG2, TBG3, TBG4, TBG5, TBG6 a TBG7 tak, jak je ukázáno na obrázku 3 nebo jak je kódována cDNA klony vybranými ze skupiny skládající se z cDNA klonů obsažených v Gen Bank pod vstupními čísly (Accession No.) AF023847, AF154420,

AF154421, AF020390, AF154423, AF154424 a AF154422, nukleotidové sekvence komplementární k jakékoliv shora uvedené nukleotidové sekvenci bodu a) nebo b).
23. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 22, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci na obrázku 2 a je vybrán ze skupiny zahrnující SEQ ID NOs:1-3 a 5-7.
24. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 22, kde má řečený polynukleotid nukleotidovou sekvenci na obrázku 2 a • · ·· • 9 · ♦··· ·· ·· ·· * « · · • » · ·· ·»?· ·· ···· je vybrán ze skupiny zahrnující SEQ ID N0s:l-3 a 5-7 kódující polypeptid β-galaktosidasu a mající aminokyselinovou sekvenci pojmenovanou TBG1-3 a TBG5-7.
25. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 22, kde má řečený polynukleotid nukleotidovou sekvenci na obrázku 2 a je vybrán ze skupiny zahrnující SEQ ID NOs:l-3 a 5-7 kódující zralý polypeptid a mající aminokyselinovou sekvenci pojmenovanou TBG1-3 a TBG5-7.
26. Molekula nukleové kyseliny dle nároku 22, kde má řečený polynukleotid úplnou nukleotidovou sekvenci cDNA klonu obsaženého v Gen Bank pod vstupními čísly (Accession No.) AF023847, AF154420, AF154421, AF020390, AE154423, AF154424 a AF154422.
27. Metoda změny metabolismu buněčné stěny v rostlině, která zahrnuje transformaci řečené rostliny DNA konstruktem, který je uzpůsoben tak, aby měnil aktivitu β-galaktosidasy, dále zahrnuje pěstování řečených rostlin nebo od ní odvozených linií a dále zahrnuje selekci rostlin majících změněné charakteristiky buněčné stěny, řečené konstrukty obsahující transkripční iniciační oblasti účinné v rostlinách a operativně spojené se sekvencemi DNA kódujícími přinejmenším jednu β-galaktosidasu.
28. Metoda dle nároku 27, kde je řečená DNA sekvence vybraná ze skupiny obsahující sekvence molekul nukleových kyselin dle nároku 1 nebo dle nároku 22.
29. Rostlinná buňka transformovaná molekulou nukleové kyseliny dle nároku 1 nebo dle nároku 22.
30. Rostlina odvozená z rostlinné buňky dle nároku 29.
31. Semena rostlin odvozených z rostlin dle nároku 30.

32. Metoda změny genové exprese β-galaktosidasy v rostlině, která zahrnuje transformaci řečené rostliny molekulou nukleové kyseliny dle nároku 1 nebo dle nároku 22, dále • ·

44 4 · 4 4 44 4444 zahrnuje pěstování transformované rostliny a selekci rostliny , která má změněnou genovou expresi β-galaktosidasy ve srovnání s netransformovanou rostlinou.

TBG2

TBG5

TBG1

TBG3

TBG4

TBG6

TBG7

59%

79%

64%

59%

47%

42% cauliflower carnation

TBG2

Obr.l Fylogenetický strom β-galaktosidas založený na aminokyselinové sekvenční identitě. A - β-galaktosidasové cDNA (TBG) rajčete. B rostlinné β-galaktosidasy. Higgins-Sharpův algoritmus (metoda UPGMA).

• · • · • · · · · 4 ··· • · · · · · · · ···· ·· ····

Gana/clone nm·: TBO1/PIBG2-1-10, acc«»«ion nuaber ΛΡ023847, Segueace ID niuninx 1 wtiwc.wtltic.tittoctcaqcactag 30 31 AGCCTAGAAGAAGGAAAAAAAGAAGTATGSAOTAATGGAATAAACATAAAAAAGAGAGAAAAAAAAAAAAGAAGAAAATTCTTCAGACAACA 122 123 AAAACASCTCWTTCIITTCACTACTWTTWWCCCAATCrCTATATAATTGCAAGAArAGAATAAAGTTTGCAACTTGAWAAAAAAAAA ' 214 215 GAATAATAAGCTCTGGGGGTAGOGAGGAAGWAGTTCAWAGTTCATTQOCTTCTAAAGGCACAATCTTGATTCTTCAWTCTrGACAAAT 305

306 ATG GGT TTT 1 Met Gly Phe TCG ATC GCA ATC TTG CTG ATG TTC TTA TTG TCT TTA TO3 CTT TCT TCT GGA ATT GCT TCT 374 23 Trp Het Ala Met Leu Leu Het Leu Leu Leu Cys Leu Trp Val Ser Cys Gly Ile Ala Ser 375 GTT TCA TAT GAC CAT AAA GCT ATC ATT GTA AAT GGA CAA AGA AAA ATT CTC ATT TCT GGA TCC ATT CAC 443 24 Val Ser Tyr ASp His Lys Ala Ile Ile Val Asn Gly Gin'Arg Lys Ile Leu Ile Ser Gly Ser Ile His 46 444 TAC CCT AGA AGC ACC CCT GAG ATG TCG CCA GAT C7T ATT CAG AAG GCA AAA GAA GGG G3A GIT GAT GTT 512 47 Tyr Pro Arg Ser Thr Pro Glu Met Tip Pro Asp Leu Ile Gin Lys Ala Lys Glu Gly Gly Val Asp Val 69 513 ATA CAG ACT TAT GTT TTC TGG AAT GGG CAT GAG CCT GAA GAA GGG AAA TAT TAT TTT GAA GAG AGG TAT 581 70 Ile Gin Thr Tyr val Phe Trp Asn Gly His Glu Pro Glu Glu Gly Lys Tyr Tyr Phe Glu Glu Arg Tyr 92 582 GAT TTA GTG AAG TTC ATT AAA GIG GTC CAA GAA GCA GGA CTT TAT GTC CAT CTT AQS ATT GGA CCT TAT 650 93 Asp Leu Val Lys Phe Ile Lys Val Val Gin Glu Ala Gly Leu Tyr Val His Leu Arg Ile Gly Pro Tyr 115 651 GCA TCT GCT GAA TCG AAT TCT GGG GGT TCT CCT GIT TCG CTC AAG TAT GTT CCA GGT ATT AGT TTC AGA '719 116 Ala Cys Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Val Trp Leu Lys Tyr Val Pro Gly Ile Ser Phe Arg 138 720 ACA AAC AAT GAG CCA TTC AAG GCT GCA ATC CAA -AAG WC ACT AAG ATT GTT GAT ATC ATC AAA GCA 788 139 Thr Asn Asn Glu Pro Phe Lys Ala Ala Met Gin Lys Phe Thr Thr Lys Ile Val Asp Met Met Lys -Ala 161 789 GAA AAG CTC TAT GAA ACT CAG GGT GGT CCA ATT ATT CTA TCT CAG ATA GAA AAT GAA TAT GGA CCT ATG 857 162 Glu Lys Leu Tyr Glu Thr Gin Gly Gly Pro Ile Ile Leu Ser Gin Ile Glu Asn Glu Tyr Gly Pro Met ¹⁸⁴ 858 GAG TCG GAA CTA GGT GAA CCT GGT AAA GIT TAC TCA GAA TCG GCA GCC AAA ATC GCT GTC GAT CW GGC 926 185 Glu Trp Glu Leu Gly Glu Pro Gly Lys Val Tyr Ser Glu Trp Ala Ala Lys Met Ala Val Asp Leu Gly 207 927 ACT GGT GTC CCA TCG ATC ATG TCC AAG CAA GAT GAT GTC CCT GAT CCT ATT ATT AAT ACT TCC AAT GGT 995 208 Thr Gly Val Pro Trp Ile Met Cys Lys Gin Asp Asp Val Pro Asp Pro Ile tle Asn Thr Cys Asn Gly 230 996 TTC TAC TCT GAC TAC TTC ACA CCA AÁT AAG GCT AÁT AAÁ -CCC AAG ATC TGG ACT GAA GCC TCG ACA GCC 1064 231 Phe Tyr Cys Asp Tyr Phe Thr Pro Asn Lys Ala Asn Lys Pro Lys Met Trp Thr Glu Ala Tip Thr Ala 253 1065 TCG TCT ACC GAA TTT GGA GGT CCA CTT CCT TAC CGT CCT GCA GÁG GAT ATC GCA .WT GCT GřC GCA AGA / .1133 254 Trp Phe Thr Glu Phe Gly Gly Pro Val Pro Tyr Arg Pro Ala Glu Asp Met Ala Phe Ala Val Ala Arg 276 1134 TCT ATA CAA ACG GGA GGC TCC TCC ATC AAT TAC TAT ATC TAT CAT GGA GGA ACA AAC TTT GGA AGG ACT . 1202 277 Phe Xle Gin Thr Gly Gly Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr : Met Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr .299

1203 300 TCT GGT GGC CCA TTT ATT GCT ACT Thr AGT TAT GAT TAT GÁT Asp GCA CCC ČTA Ala Pro Leu GAT Asp GAA WT G3G TCA WA CGG Glu Phe Gly Ser Leu Arg 1271 . 322 Ser Gly Gly Pro Phe Ile Ala Ser Tyr Asp Tyr 1272 CAG CCT AAA TGG GGT CAT CTG AAA GAT CTA CAT AfiA GCA ATA AAG CTC TGT GAG CCA GCT WÁ GTA TCT - 1340 323 Gin Pro Lys Trp Gly His Leu Lys Asp Leu His Arg Ala Ile Lys Leu cys Glu Pro Ala Leu Val Ser 345 1341 GTA GAT CCA ACT GTG ACA TCC TTA GGA AAC TAT CAA GAG GCA .CGT CTT WC AAG TCA GÁG TCT CGG GCC . 1409 346 Val Asp Pro Thr Val Thr Ser Leu Gly Asn Tyr Gin Glu Ala Arg Val Phe Lys Ser Glu Ser Gly Ala 368 1410 tgc GCT GCC WC CTA GCA AAT TAC AAC CAG CAC TCT WT GCT AAA GTG GCA TW GGG AAC ATC CAT TÁT . 1478 369 cys Ala Ala Phe Leu Ala Asn Tyr Asn Gin His Ser Phe Ala Lys Val Ala Phe Gly Asn Met His Tyr . 391 1479 AAC TTG CCA áX TGG TCT ATC AGC ATT CTT CCC GAC TGC AAG AAC ACT GTC TÁT ÁÁT ACT GCA -AGG GTT ] 1547 392 Asn Leu Pro Pro Trp Ser Ile Ser Ile Leu Pro Asp cys Lys Asn Thr Val Tyr Asn Thr Ala Arg Val 414 1548 GGT GCT CAA AGT GCT CAG ATC AAG ATG ACT CCA GTC AGT AGA GGA TTC TCA TGG GAG TCA TTC AAT GAA 1616 415 Gly Ala Gin Ser Ala Gin Met Lys Met Thr Pro Val Ser Arg Gly Phe Ser Trp Glu Ser Phe Asn,Glu 437

Obr. 2 (str.l) • · · · · · · • · · · · · · len·/clona nanei TBei/pZBC2WF10; accaasion sunber A7023847, Segd^p&e ID nunber 1 cont.

···· ·· ·· ····

1617 GAC GCA GCA TCG CAT GAA GAC GAC ACT TTC ACA CTÍ GTT GGG TTA TTG GAG CAG ATT AAT ATC ACA AGA 1685

438 Asp Ala Ala Ser His Glu Asp Asp Thr Phe Thr Val Val Gly Leu Leu Glu Gin Ile Asn Ile Thr Arg 460

1686 GAT GTA TCT GAT TAC TTG TGG TAT ATG ACT GAC ATT GAG ATT GAT CCA ACA GAA GGA TTT TTG AAT AGT 1754

461 Asp Val Ser Asp Tyr Leu Trp Tyr Met Thr Asp Ile Glu Ile Asp Pro Thr Glu Gly Phe Leu Asn Ser 483

1755 GGA AAT TGG OCT TGG CTT ACT GTC TTT TCT OCT GGC CAT GCA TTG CAT GTA TTC GTG AAT GGT CAA TTA 1823

484 Gly Asn Trp Pro Trp Leu Thr Val Phe Ser Ala Gly His Ala Leu His Val Phe Val Asn Gly Gin Leu 506

1824 GCA GGA ACT GTG TAC GGA AGT TTA GAA AAC CCA AAA CTA ACT TTC AGC AAC GGT ATA AAT CTG AGA GCT 1892

507 Ala Gly Thr Val Tyr Gly Ser Leu Glu Asn Pro Lys Leu Thr Phe Ser Asn Gly Ile Asn Leu Arg Ala 529

1893 GGT GTG AAC AAG ATT TCT CTG CTA AGC ATT GCT GTT GGT CTT CCG AAC CTT GGC CCT CAT TTT GAG ACA 1961

530 Gly Val Asn Lys Ile Ser Leu Leu Ser Ile Ala Val Gly Leu Pro Asn Val Gly Pro His Phe Glu Thr 552

1962 TGG AAT GCT GGT GTT CTT GGA CCA GTT TCA CIT AAT GGA CTT AAT GAA GGA ACA AGA GAT TTA ACA TGG 2030

S53 Trp Asn Ala Gly Val Leu Gly Pro Val Ser Leu Asn Gly Leu Asn Glu Gly Thr Arg Asp Leu Thr Trp 575

2031 CAG AAA TGG TTC TAC AAG GTT GGT CTA AAA GGA GAA GCC CTG AGT CTT CAT TCA CTC AGT GGT AGC CCA 2099

576 Gin Lys Trp Phe Tyr Lys Val Gly Leu Lys Gly Glu Ala Leu Ser Leu His Ser Leu Ser Gly Ser Pro 598

2100 TCC GTG GAG TGG GTG GAA GGC TCT TTA GTG GCT CAG AAG CAG CCA CTC AGT TGG TAT AAG ACT ACA TTC 2168

599 Ser Val Glu Trp Val Glu Gly Ser Leu Val Ala Gin Lys Gin Pro Leu Ser Trp Tyr Lys Thr Thr Phe 621

2169 AAT GCT CCA GAT GGA AAT GAA CCT TTG GCT TTA GAT ATG AAT ACC ATG GGC AAA GGT CAA GTA TGG ATA 2237

622 Asn Ala Pro Asp Gly Asn Glu Pro Leu Ala Leu Asp Met Asn Thr Met Gly Lys Gly Gin Val Trp Ile 644

2238 AAT GCT CAG AGC CTC GGA CGC CAC TGG CCT GCA TAT AAA TCA TCT GGA AGT TGT AGT GTC TGT AAC TAT 2306

645 Asn Gly Gin Ser Leu Gly Arg His Trp Pro Ala Tyr Lys Ser Ser Gly Ser Cys Ser Val Cys Asn Tyr 667

2307 ACT GGC TGG TTT GAT GAG AAA AAG TGC CTA ACT AAC TGT GGT GAG GGC TCA CAA AGA TGG TAC CAC GTA 2375

668 Thr Gly Trp Phe Asp Glu Lys Lys Cys Leu Thr Asn Cys Gly Glu Gly Ser Gin Arg Trp Tyr His Val 690

2376 CCC CGG TCT TGG CTG TAT CCT ACT GGA AAT TTG TTA GTT GTA TTC GAG GAA TGG GGA GGA GAT 'CCT TÁT 2444

691 Pro Arg Ser Trp Leu Tyr Pro Thr Gly Asn Leu Leu Val Val Phe Glu Glu Trp Gly Gly Asp Pro Tyr 713

2445 GGA ATC ACT TTA GTC AAA AGA GAA ATA GGG AGT GTT TGT GCT GAT AŤA TAT GAG TGG CAA CCA CAG TTA ) 2513

714 Gly Ile Thr Leu Val Lys Arg Glu Ile Gly Ser Val Cys Ala Asp Ile Tyr Glu Trp Gin Pro Gin Leu 736

2514 TTG AAT TGG CAG AGG CTA GTA TCT GCT AAG TTT GAC AGA CCT CTC AGA CCT AAA GCC CAT CTT AAG TGT 2582

737 Leu Asn Trp Gin Arg Leu Val Ser Gly Lys Phe Asp Arg Pro Leu Arg Pro Lys Ala His Leu Lys Cys ’ 759

2583 GCA CCT GGT CAG AAG ATT TCT TCA ATC AAA TTT GCA AGC TTT GGA ACA CCA GAG GGA GTT TCT GGG AAC 2651

760 Ala Pro Gly Gin Lys Ile Ser Ser Ile Lys Phe Ala Ser Phe Gly Thr Pro Glu Gly Val Čys Gly Asn 7Θ2

2652 TTC CAG CAG GGA AGC TGC CAT GCT CCG CGC TCA TAT GÁT GCT TTC AAA AAG AAŤ TGT GTT GGG AAA GAG 2720

783 Phe Gin Gin Gly Ser Cys His Ala pro Arg Ser Tyr Asp Ala Phe Lys Lys Asn Cys Val Gly Lys Glu 805

2721 TCT TGC TCA GTA CAG GTA ACA CCA GAG AAT TTT GGA GGT GAT-CCA TGT CGA AAC GTT CTA AAG AAA CTC 2789

806 Ser Cys Ser Val Gin Val Thr Pro Glu Asn Phe Gly Gly Asp Pro Cys Arg Asn Val Leu Lys Lys Leu ,828

2790 TCA GTG GAA GCC ATT TGT AGT TGA TGATTCTGACTATACAAGTGAAAAAÁTÁCTTGAACCACTCATATAAACATITTTCAAACG 2873

829 Ser Val Glu Ala Ile Cys Ser ··· 836

2874 AGCTACTAGACATCCATTAACCCACACTACCATTTITTGGCTTTCCTGGGGTTGAAGCTGTACAGTTAAGCAACACACCTCTTTGATCAAAG 2965 2966 CTCACCTGATTATGAAGATGATTGACGAAAGATTCTCTACATCTAAGGrrrCGTCTAATřACACATÁCAGATATGATTCTTGATGAATCGAT 3057 3058 GTGCAAATTTTGTTTGTGCTAGGGTGAGAGAGACTTGAAAAÍÍCATTTTGCTTTCATGATGTŤCTACATTAtXCAATCATAATGTAAGTAAGC 3149 3150 AAGCAATAATTCATTGCTTTGCACATTGAAAAATGCATTTTACTATGÍTGCAGTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAX . 3224

Obr. 2 (str.2)

Gene/clone saxaei TBG2/pZBG2-l-12; »cc««BÍon number AF154420} gequence XD aumber 2

1 GG 2

3 AGC AGA AGA AAA ACA CTG AAT TTT CCG TTA ATA CTA ACG GTG TTA ÁCT ATC CAC TTT GTG ATC GTC CCC 71

1 Ser Arg Arg Lys Thr Leu Asn Phe Pro Leu Ile Leu Thr Val Leu Thr Ile His Phe Val Ile Val Ala 23

72 GGC GAG TAT TTC AAG CCG TTC AAT GTC ACC TAC GAT AAC CGA GCT CTC ATC ATC GGC GGT-AAA CGC CGT Í40

24 Gly Glu Tyr Phe Lys Pro Phe Asn Val Thr Tyr Asp Asn Arg Ala Leu Ile Ile Gly Gly Lys Arg Arg 46

141 ATG CTT ATC TCC GCC GGA ATT CAC TAC CCT CGC GCC ACT CCT GAG ATG TCG CCC ACA TTC ATA GCT AGG 209

47 Met Leu Ile Ser Ala Gly Ile His Tyr Pro Arg Ala Thr Pro Glu Met Trp Pro Thr Leu Ile Ala Arg 69

210 70 AGC AAA GAA GCT GCT GCA GAT GTC ATC GAG ACT TAT ACA TTT TCG AAT GCT CAT GAC CCA ACC AGG GGA 278 92 Ser Lys Glu Gly Gly Ala Asp Val Ile Glu Thr Tyr Thr Phe Trp Asn Gly His Glu Pro Thr Arg Gly 279 CAG TAC AAT TTT GAA GGA AGA TAT GAT ATT CTC AAG TTC GCA AAG CTA GTC GGA TCT CAT GGA CTG TTC 347 93 Gin Tyr Asn Phe Glu Gly Arg Tyr Asp Ile Val Lys Phe Ala Lys Leu Val Gly Ser His Gly Leu Phe 115 348 CTC TTT ATT CGA ATA GCT CCT TAT GCC TCT GCA GAA TCG AAC TTC GGG GGA TTC CCC ATA TCG CTT CCT 416 116 Leu Phe Ile Arg Ile Gly Pro Tyr Ala Cys Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Ile Trp Leu Arg 138 417 GAT ATA CCT GGA ATA GAA TTT CGA ACA GAT AAT GCA CCA TTC AAG GAG GAG ATC GAG CGC TAT GTT AAA 485 139 Asp Ile Pro Gly Ile Glu Phe Arg Thr Asp Asn Ala Pro Phe Lys Glu Glu Met Glu Arg Tyr Val Lys 161 486 AAG ATA GTT GAT CTT ATC ATA TCT GAG TCG CTC TTT TCG TCG CAA GCT GCT CCT ATC ATT TTC CTC CAG 554 162 Lys Ile Val Asp Leu Met Ile Ser Glu Ser Leu Phe Ser Trp Gin Gly Gly Pro Ile Ile Leu Leu Gin 184 555 ATT GAA AAT GAA TAT GGA AAT GTT GAA AGC TCA TTC GCT CCC AAG GGG AAG TTA TAT ATC AAA TCG GCT 623 185 Ile Glu Asn Glu Tyr Gly Asn Val Glu Ser Ser Phe Gly Pro Lys Gly Lys Leu Tyr Met Lys Trp Ala 207 624 GCT GAA ATG GCT GTT GCT CTT QCT GCT GCT GTT CCA TCG GTC ATC TCT AGG CAA ACT GAT GCT CCA GAA 692 208 Ala Glu Met Ala Val Gly Leu Gly Ala Gly Val Pro Trp Val Met Cys Arg Gin Thr Asp Ala Pro Glu 230 693 TAC ATC ATA GAT ACT TCT AAT GCA TAC TAT TCT GAT GGG TTC ACG CCG AAT TCC GAG AAG AAA CCG AAA 761 231 Tyr Ile Ile Asp Thr cys Asn Ala Tyr Tyr Cys Asp Gly Phe Thr Pro Asn Ser Glu Lys Lys Pro Lys ., 253 762 ATT TCG ACT GAG AAT TCG .AAT OSA TCG TTT GCA GAT TCG GCT GAA AGA CTT CCA TAT AGA CCT TCC GAG ,830 254 ile Trp Thr Glu Asn Trp Asn Gly Trp Phe Ala Asp Trp Gly Glu Arg Leu Pro Tyr Arg Pro Ser Glu 276 831 GAT -ATT GCA TTT GCA ATT GCT CGT TTCTŤT CAA CCT GGG GGC ACT TÍA CAG AÁC TAT TAT ATC TAT TTT 899 277 Asp Ile Ala Phe Ala Ile Ala Arg Phe Phe Gin Arg Gly Gly Ser Leu Gin Asn Tyr Tyr Met Tyr Phe 299 900 GCT GGG ACA AAT TTT GGC COS ACT GCT GCT GGC CCA ACT CAA ATC ACT AGC TAT GAT TAT GAŤ GCT CCA 968 300 Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr Ala Gly Gly Pro Thr Gin Ile Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro 322 969 CTC GAT GAA TAT GGA CTA CTA CCT CAA CCT AAA TCG GCT CAT TTC AAG GAT CTC CAT GCT GCT ATA AAG 1037 323 Leu Asp Glu Tyr Gly Leu Leu Arg Gin Pro Lys Trp Gly His Leu Lys Asp Leu His Ala Ala Ile Lys 345

1038 CTT TCT GAA CCA GCT CTT GTT GCT GCT GAT TCA CCT CAG TAT ATT AAA CTG GGA CCA AAA CÁS GAG GCA 1106 346 Leu cys Glu Pro Ala Leu Val Ala Ala Asp Ser Pro Gin Tyr Ile Lys Leu Gly Pro Lys Gin Glu Ala 368 1107 CAT GTC TAT CCT GGA ACA TCC AAC AAC ATT GGC CAA TAT ATG TCC TTA AAT GAA GGC ATA TCC GCA GCA .1175 369 His Val Tyr Arg Gly Thr Ser Asn Asn Ile Gly Gin Tyr Met Ser Leu Asn Glu Gly Ile Cys Ala Ala 391 1176 TTT ATT GCA AAT ATT GAT GAA CAT GAA TCA GCA ACA GTG AAA TTT TAC GCT CAA GAG TTC ACT TTA CCT 1244 392 Phe Ile Ala Asn Ile Asp Glu His Glu Ser Ala Thr Val Lys Phe Tyr Gly Gin Glu Phe Thr Leu Pro 414 1245 CCA TCG TCA GTC CTA TřC TCC CAG ATT GCÁ GAA ATA CAG CTT TCA ACA CAG CTA' AGG TCG GGG CAC AAA 1313 • 41S Pro Trp Ser Val Val Phe Cys Gin Ile Ala Glu Ile Gin Leu Ser Thr Gin Leu Arg Trp Gly His Lys 437 1314 CTT CAA TCA AAA CAG TGG GCT CAG ATT CTC TTT CAG TTC GGA ATA ATT CTT TCT TTC' TAC AAG TTA TCA 1382 438 Leu Gin Ser Lys Gin Trp Ala Gin Ile Leu Phe Gin Leu Gly Ile Ile Leu cys Phe Tyr Lys Leu Ser .460

Obr. 2 (str.3)

X • · · · · · ···· · · 9 9 9 9 9 9

Ceae/clo»· ηβ»βι TBG2/pZBG2*-^0í2; acceesion nunber AF154420j ID nunber 2 cont.

1383 CTA AAA GCA AGC TCG GAA AGT TTT TCA CAA TCT TCG ATG ACA TTG AAG GAG CCA CTT GGT GTG TGG GGT 1451 461 Leu tys Ala Ser Ser Glu Ser Phe Ser Gin Ser Trp Met Thr Leu Lys Glu Pro Leu Gly Val Trp Gly 483 1452 GAC AAG AAT TTC ACT TCT AAA GGA ATA CTS GAG CAT CTG AAT GTG ACA AAA GAC CAG TCT GAT TAC CTG 1520 484 Asp Lys Asn Phe Thr Ser Lys Gly Ile Leu Glu His Leu Asn val Thr Lys Asp Gin Ser Asp Tyr Leu 506 1521 TGC TAT CTG *ACC AGG ATA TAT ATT TCT GAT GAT GAC ATC TCA TTT TGG GAG GAA AAT GAT GTT AGT CCA 1589 507 Trp Tyr Leu Thr Arg Ile Tyr Ile Ser Asp Asp Asp Ile Ser Phe Trp Glu Glu Asn Asp •Val Ser Pro 529

1590 ACA ATT GAT ATT GAT AGC ATC CGT GAT TTT GTT CGC ATT TTT GTT AAT GGG CAG CTT GCA GGT AGT CTG 1658 530 Thr Ile Asp Ile Asp Ser Met Arg Asp Phe Val Arg Ile Phe Val Asn Gly Gin Leu Ala Gly Ser Val 552 1659 AAA GGC AAA TGG ATC AAG GTG GTT CAA CCT GTT AAG CTG GTT CAG GGA TAC AAC GAC ATA CTG CTA TTA 1727 553 Lys Gly Lys Trp Ile Lys Val Val Gin Pro Val Lys Leu Val Gin Gly Tyr Asn Asp Ile Leu Leu Leu S75 1728 TCT GAG ACG GIG GGA TTG CAG AAT TAT GGT GCC TTC TTG GAG AAG GAT GGG GCA GGT TTT AAA GGT CAG 1796 576 Ser Glu Thr Val Gly Leu Gin Asn Tyr Gly Ala Phe Leu Glu Lys Asp Gly Ala Gly Phe Lys Gly Gin 598 1797 ATA AAG CTT ACA GGA TGC AAA AGC GGG GAT ATC AAT CTC ACA ACA TCT TTA TGG ACC TAC CAG GTG GGG 1865 599. Ile Lys Leu Thr Gly Cys Lys Ser Gly Asp Ile Asn Leu Thr Thr Ser Leu Trp Thr Tyr Gin Val Gly 621 1866 CTT AGA GGC GAA TTC CTG GAA GTA TAT GAT GTC AAT AGT ACT GAA AGT GCA GGA TCG ACT GAG TTT CCC 1934 622 Leu Arg Gly Glu Phe Leu Glu Val Tyr Asp Val Asn Ser Thr Glu Ser Ala Gly Trp Thr Glu Phe Pro 644 1935 ACT GGT ACA ACT CCG TCA GTC TTT TCG TGG TAC AAG ACA AAG TTT GAT GCC CCA GGC GGG ACA gat CCA 2003 645 Thr Gly Thr Thr Pro Ser Val Phe Ser Trp Tyr Lys Thr Lys Phe Asp Ala Pro Gly Gly Thr Asp Pro 667

2004 GTT GCT CTT GAT TTT AGT AGC ATG GGA AAA GGT CAG GCA TCG GTT AAT GGC CAC CAT GTA GGA AGA TAT 2072 668 Val Ala Leu Asp Phe Ser Ser Met Gly Lys Gly Gin Ala Trp Val Asn Gly His His val Gly Arg Tyr 650 2073 TGG ACT TTG GTT GCA CCA AAT AAT GGA TGT GGA AGA ACT TCT GAT TAT CGT GGT GCT TAC CAC TCT GAT 2141 ' 691 Trp Thr Leu Val Ala Pro Asn Asn Gly Cys Gly Arg Thr cys Asp Tyr Arg Gly Ala Tyr His Ser Asp 713 2142 AAA TCT AGG ACA AAC TGT GGA GAG ATT ACT CAG GCC TGG TAC CAT ATA CCT AGA TCA TCG CTA AAG ACA 2210 714 Lys Cys Arg Thr Asn Cys Gly Glu Ile Thr Gin Ala Trp Tyr His Ile Pro Arg Ser Trp Leu Lys Thr 736 2211 TTA AAT AAT GTA CTA GTT ATC TTT GAA GAA ACA GAT AAA ACT CCG TTT GAT ATT TCC ATT TCT ACG CGT 2279 737 Leu Asn Asn Val Leu Val Ile Phe Glu Glu Thr Asp Lys Thr Pro Phe Asp Ile Ser Ile Ser Thr Arg 759 2280 TCT ACT GAA ACC ATT TGT GCT CAA GTA TCG GAA AAG CAC TAT CCA CCT CTA CAT AAG TCG TCT CAT TCG 2348 760 Ser. Thr Glu Thr Ile Cys Ala Gin Val Ser Glu Lys His Tyr Pro Pro Leu His Lys Trp Ser His Ser 782 2349 GAG TTT GAC AGA AAG TTG TCT CTG ATG GAT AAA ACA CCA GAA ATC CAC TTG CAG TGT GAC GAA GGA CAT 2417 783 Glu Phe Asp Arg Lys Leu Ser Leu Met Asp Lys Thr Pro Glu Met His Leu Gin Cys Asp Glu Gly His 805 2418 ACA ATC TCT TCT ATT GAA TTT GCA AGC TAT GGA AGT CCG AAT CGC AGC TGT CAA AAG TTC TCA CAA GGA 2486 806 Thr Ile Ser Ser Ile Glu Phe Ala Ser Tyr Gly Ser Pro Asn Gly Ser Cys Gin Lys Phe Ser Gin Gly 828 24B7 AAA TGC CAT GCT GCA AAT TCC TTG TCT GTT GTA tct CAG GCT TGT ATA GGA AGA ACT AGT TGC AGC ATT 2555 829 Lys Cys His Ala Ala Asn Ser Leu Ser Val Val Ser Gin Ala Cys Ile cly Arg Thr Ser Cys Ser Ile 851 2556 GGC ATT TCC AAT GGT GTA TTT GGA GAT CCA TGT CGA CAC GTT GTC AAG AGT TTG GCT GTT CAA GCA AAA 2624 852 Gly Ile Ser Asn Gly Val Phe Gly Asp Pro Cys Arg His Val Val Lys Ser Leu Ala Val Gin Ala Lys 874 2625 TGC TCA CCA CCA CCA GAC ctc AGC ACT TCA GCT TCC TCG TCA GGAGACTCTGGTAACACGTTAACCTTTTAGAACGAA 2702 875 Cys Ser Pro Pro Pro Asp Leu Ser Thr Ser Ala Ser Ser ... 888

2703 ACGATCXCTTAAAGTCCACTCGTTCCCCTGCCCCCGAGCCCTCTGCTACATTTCTCAGATCGCATCGTTACAATCAGGCGGAGAAAACGTAC 2794

2887 ACTAACAAATCAAAATAGAAAACTCCTCTCTGTCAAAGAATTTTAACAACACCATTTATrAAAAGTTAGTTAACATCATTAAAAAAAAAAAA 2978

2979 AAAAAA 2984

Obr. 2 (str.4)

• · • · · ·

Oene/clone namet TBG3/p2-^^0cZbl; accaaaion numbar A7154421; í^^tnce ID nuaber 3 ··· · · φ ·· • ··· ·· ·· · *·· ··

1 AGAGCTKACTACTTTCTTTCCATCTTCAAA 30

31 AAGAQGAAAAAAATAAAGTTAAAGGGGGGGGAAAAAGCTTTCACTTTCCCTTAAAAAGGCACAATCTTCATAGAAAAGGAGATAACTTTAC 121

122 ATG GGT TGT ACG CTT ATA CTA ATG TTG AAT GTG TTG TTC GIG TTG TTG GGT TCA TGG GTT TTT TCT GGA 190 1 Mec Gly Cys Thr Leu Xle Leu Met Leu Asn Val Leu Leu Val Leu Leu Gly Ser Trp Val Phe Ser Gly 23 191 ACA GCT TCT GTT TCA TAT GAC CAT AGG GCT ATT ATT GTA AAT GGA CAA AGA AGA ATA CTT ATT TCT GGT 259 24 Thr Ala Ser Val Ser Tyr Asp His Arg Ala lle Xle Val Asn Gly Gin Arg Arg lle I>eu Xle Ser Gly 46 260 Tcr GTT CAT TAT CCA AGA AGC ACT CCT GAG ATG TGG CCA GGT ATT ATT CAA AAG GCT AAA GAA GGA GGT 328 47 Ser Val Kis Tyr Pro Arg Ser Thr Pro Glu MeC Trp Pro Gly lle Xle Gin Lys Ala Lys Glu Gly Gly 69

329 GTC 70 Val GAT GTG ATT CAG ACT TAT GTT TTC TGG AAT GGA CAT GAG CCT CAA CAA GGG AAA TAT TAT TTT GAA 397 92 Asp Val Xle Gin Thr Tyr Val Phe Trp Asn Gly His Glu Pro Gin Gin Gly Lys Tyr Tyr Phe Glu 398 GGG AGA TAT GAT TTA GTG AAG TTT ATT AAG CTG GTC CAC CAA GCA GGA CIT TAT GTC CAT CTT AGA GTT 466 93 Gly Arg Tyr Asp Leu Val Lys Phe Xle Lys Leu Val His Gin Ala Gly Leu Tyr Val His Leu Arg val 115 467 GGA CCT TAT GCT TCT GCT GAA TCG AAT TTT GGG GGC TTT CCT CTT TCG CTC AAA TAT GTT CCA GGT ATC 535 116 Gly Pro Tyr Ala cys Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Val Trp leu Lys Tyr Val Pro Gly lle 138 536 AGT TTC AGA ACA GAT AAT GGA CCT TTC AAG GCT GCA ATC CAA AAA TTT ACT GCC AAG ATT GTC AAT ATC 604 139 Ser Phe Arg Thr Asp Asn Gly Pro Phe Lys Ala Ala MeC Gin Lys Phe Thr Ala Lys lle Val Asn Met 161 605 ATC AAA GCG GAA CGT TTC TAT GAA ACT CAA GGG GGG CCA ATA ATT TTA TCT CAG ATT GAG AAT GAA TAT 673 162 Mec Lys Ala Glu Arg Leu Tyr Glu Thr Gin Gly Gly Pro lle Xle Leu Ser Gin lle Glu Asn Glu Tyr 184 674 GGA CCC ATG GAA TCG GAA CTC GGA GCA CCA GGT AAA TCT TAC GCA CAG TCG GCC GCC AAA ATC GCT GTG 742 185 Gly Pro Mec Glu Trp Glu Leu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Tyr Ala Gin Trp Ala Ala Lys Met Ala Val 207 743 GGT CIT GAC ACT GGT GTC CCA TCG GTT ATC TCC AAG CAA GAC GAT GCC CCT GAT CCT ATT ATA AAT GCT .811 208 Gly Leu Asp Thr Gly Val Pro Trp Val Met Cys Lys Gin Asp Asp Ala Pro Asp Pro Xle Xle Asn Ala 230 812 TCC AAT GGC TTC TAC TGT GAC TAC TTT TCT CCA AAC AAG GCT TAT AAA CCA AAG ATA TCG ACT GAA. GCC 880 231 Cys Asn Gly Phe Tyr Cys Asp Tyr Phe Ser Pro Asn Lys Ala Tyr Lys Pro Lys lle Trp Thr Glu Ala ²⁵³ 881 TCG ACT GCA TCG CTT ACT GGT CTT GGA AAT CCA GTT CCT TAC CGT CCT GCT GAG GAC TTG GCA CTT TCT 949 254 Trp Thr Ala Trp Phe Thr Gly Phe Gly Asn Pro Val Pro Tyr Arg Pro Ala Glu Asp Xeu Ala Phe Ser 276 950 GTT· GCA AAA TTT ATA CAG AAG GGA GGT TCC TTC ATC AAT TAT TAC ATC TAT CAT GGA GGA ACA AAC CTT 1Ó18 277 Val Ala Lys Phe Xle Gin Lys Gly Gly Ser Phe Xle Asn Tyr Tyr Met Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe 299 1019 GGA CGG ACT GCT GGT GGT CCA CTT ATT GCT ACT AGT TAT GAC TAT GAT GCA CCA CTT GÁT GAA TAT GGA 1087 300 Gly Arg Thr Ala Gly Gly Pro Phe lle Ala Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu Tyr Gly 322 1088 TTA TTC CGA CAA CCA AAA TGG GGT CAC CTC AAA GAT CTC CAT AGA GCA ATA AAG CTT TCT GAA CCA GCT 1156 323 Leu Leu Arg Gin Pro Lys Trp Gly His Leu Lys Asp Leu His Arg Ala lle Lys Leu Cys Glu Pro Ala 345 1157 TTA GTC TCT GGA GAT CCA GCT GTC ACA GCA CTT GGA CAC CAG CAG GAG GCC CAT GTT CTT AGG TCG AAG 1225 346 Leu Val Ser Gly Asp Pro Ala val Thr Ala Leu Gly His Gin Gin Glu Ala His Val Phe Arg Ser Lys 368 1226 GCT CGC TCT TCT GCT GCA TTC CTT GCT AAC TAC GAC CAA CAC TCT CTŤ GCT ACT GTC. TCA TTT GCA AAC 1294 369 Ala Gly Ser Cys Ala Ala Phe Leu Ala Asn Tyr Asp Gin His Ser Phe Ala Thr Val Ser Phe Ala Asn 391

1295 AGG CAT TAC AAC TTG CCA CCA TCG TCA ATC AGC ATT CTT CCC GAC TCC AAG AAC ACT GTA CTT AAT ACA 1363 414 392 Arg His Tyr Asn Leu Pro Pro Trp Ser Xle Ser Xle Leu Pro Asp cys Lys Asn Thr Val Phe Asn Thr 1364 GCA CGG ATC GGT GCT CAA AGT GCT CAG ATC ÁÁG ATC ACT CCA GTC AGC AGA GGA TTG CCC TCG CAG TCA 1432 415 Ala Arg lle Gly Ala Gin Ser Ala Gin Met Lys Met Thr Pro Val Ser Arg Gly Leu Pro Trp Gin Ser 437 1433 TTC AAT GAA GAG ACA TCA TCT TAT GAA GAC ÁGŤ AGT TTT ACA GTT GTT GGG CTA TTC GAA CAG ATA AAT' 1501 438 Phe Asn Glu Glu Thr Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Phe Thr Val Val Gly Leu Leu Glu Gin lle Asn 460

Obr. 2 (str.5) • 0

0 0 • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · * ···· · · · · · * · ·

Gone/clone ηυη·! TBO3/p2-l-accesaioa nunber AJ*154421; s«gB0Ve· ID srfwáber í coat.

1502 ACA ACA AGA GAC GTG TCT GAT TAT TTG TGG TAT TCA , ACA . GAT GTC AAG ATT GAT TCA AGA GAA AAG TTT 1570 461 Thr Thr Arg Asp Val Ser Asp Tyr Leu Trp Tyr Ser Thr Asp Val Lys Ile Asp Ser Arg Glu Lys Phe 483 1571 TTG AGA GGC GGA AAA TGG CCT TGG CTT ACG ATC ATC TCA GCT GGG CAT GCA TTC CAT GTT TTT GTC AAT 1639 484 Leu Arg Gly Gly Lys Trp Pro Trp Leu Thr Ile Hec Ser Ala Gly His Ala Leu His Val Phe Val Asn 506 1640 GGT CAA TTA GCA GGA ACT GCA TAT GGA AGT TTA GAA AAA CCG AAA CTA ACT TTC AGT AAA •GCC GTA AAT 1708 507 Gly Gin Leu Ala Gly Thr Ala Tyr Gly Ser Leu Glu Lys Pro Lys Leu Thr Phe Ser Lys Ala Val Asn 529 1709 CTC AGA GCA GGT GTT AAC AAG ATT TCT CTA CTG AGC ATT GCT GTT GGC CTT CCG AAT ATC GGC CCA CAT 1777 530 Leu Arg Ala Gly Val Asn Lys Ile Ser Leu Leu Ser Ile' Ala Val Gly Leu Pro Asn Ile Gly Pro His 552 1778 TTT GAG ACA TGG AAT GCT GGT GTT CTT GGG CCA GTC TCA CTA ACT GGT CTT GAC GAG GGG AAA AGA GAT 1846 S53 Phe Glu Thr Trp Asn Ala Gly Val Leu Gly Pro Val Ser Leu Thr Gly Leu Asp Glu Gly Lys Arg Asp 575 1847 TTA ACA TGG CAG AAA TGG TCT. TAC AAG CTT GGT CTA AAA GGA GAA GCC TTG AGC CTC CAT TCA CTC AGT 1915 576 Leu Thr Trp Gin Lys Trp Ser Tyr Lys Val Gly Leu Lys Gly Glu Ala Leu Ser Leu His Ser Leu Ser S98 1916 GGT AGC TCG TCA GTT GAG TGG GTC GAG GGT TCT TTA GTG GCT CAG AGA CAG CCA CTC ACA TGG TAC MC 1984 599 Gly Ser Ser Ser Val Glu Trp Val Glu Gly Ser Leu Val Ala Gin Arg Gin Pro Leu Thr Trp Tyr Lys 621 1985 AGC ACT TTT AAT GCT CCA GCT GGA AAT GAT CCT TTG GCT TTA GAC TTC AAT ACC ATC GGC AAA GGA CAA 2053 622 Ser Thr Phe Asn Ala Pro Ala Gly Asn Asp Pro Leu Ala Leu Asp Leu Asn Thr Mec Gly Lys Gly Gin 644 2054 GTC TCG ATA AAT GGT CAA AGC CTC GGA CGC TAT TCG CCT GGA TAT AAA GCA TCT GGT AAC TGC GGT GCC 2122 645 Val Trp Ile Asn Gly Gin Ser Leu Gly Arg Tyr Trp Pro Gly Tyr Lys Ala Ser Gly Asn cys Gly Ala 667

2123 668 TGT AAC TAT GCA GGC TGG TTT AAT GAG Asn Glu AAA AAA TGC CTA AGT AAC TGT GGA GAG GCT TCA CAA CGA TCG 2191 690 Cys Asn Tyr Ala Gly Trp Phe Lys Lys Cys Leu Ser Asn cys Gly Glu Ala Ser Gin Arg Trp 2192 TAT CAT GTT CCC CGT TCT TGG CTC TAT CCT ACT GGA AAT TTG TTA GTT CTA TTT GAG GAA TCG GGA GGA 2260 691 Tyr His Val Pro Arg Ser Trp Leu Tyr Pro Thr Gly Asn Leu Leu Val Leu Phe Glu Glu Trp Gly Gly 713 2261 GAG CCT CAT GGA ATC TCT TTG GTA AAA AGA GAA GTT GCA AGT GTT TCT GCA GAT ATA AAC GAA TCG CAA 2329 714 Glu Pro His Gly Ile Ser Leu Val Lys Arg Glu Val Ala Ser Val Cys Ala Asp Ile Asn Glu Trp Gin 736 2330 CCA CAG TTG GTG AAT TGG CAA ATC CAA GCA TCT GGT AAA GTT GAC AAA CCA CTG AGA CCT AAA GCT CAC 2398 737 Pro Gin Leu Val Asn Trp Gin Met Gin Ala Ser Gly Lys Val Asp Lys Pro Leu Arg Pro Lys Ala His 759 2399 CTC TCG TGT GCT TCT GGT CAG AAG ATT ACT TCA ATC AAA TTT GCA AGC TTT GGA ACA CCA CAA GGG GTC 2467 760 Leu Ser Cys Ala Ser Gly Gin Lys Ile Thr Ser Ile Lys Phe Ala Ser Phe Gly Thr Pro Gin Gly Val 782 2468 TCC GGA AGC TTC CGT GAA GGA AGC TGC CAC GCC TTC CAC TCA TAT GAT GCT TTT GAA AGG TAT TCC ATC 2536 783 Cys Gly Ser Phe Arg Glu Gly Ser Cys His Ala Phe His Ser Tyr Asp Ala Phe Glu Arg Tyr Cys Ile 805 2537 GGG CAA AAC TCG TGC TCA GTA CCT GTA ACA CCA GAG ATC TTT GGA GGT GAT CCA TCT CCA CAT GTT ATG 2605 806 Gly Gin Asn Ser Cys Ser Val Pro Val Thr Pro Glu Ile Phe Gly Gly Asp Pro cys Pro His Val Met 828 2606 829 AAC Lys AAA Lys CTC Leu TCA Ser GTT GAG Val Glu GTT Val ATT TGC Ile Cys AGT Ser TGA TGACACTGAGGAGAAACAAATAAAAGTCGTTTCAGTTAGTTGTCTGAA 2685 840

2687 CATATCAAAAAGTTGGCTTTGATGGAGGTGAAGTTGTACAGATATGCAACACACCTTTCCATTTGAGGCACATATGAAtTGCAATGGCCCAA 2778 2779 GATTCTSTACATATATGTTOGTTACTXSTCAAGTTGGTATTQGTITSCAAATGTAAAACAGTAGTATAGTCATrGGTTCAAGTGCGCATCGAG 2870 2871 ATTGTGCTAGTGGGAGCTACTAOCTACCGATCGATCTATCGTTGTTTGCACAAGCTGGGCCTAGATTCCACTATTATTATAACAAAGAAAGC 2962 2963 ACAATGAGACTGATTCTTGACTAarCCATGTCTAGATATTGTTACTGrrGGAATTTGCAAATCTTGTGATTTCAGCAAAAAAAAAAAÁAAAA 3054 3055 AAAAAAAAAAAAAAA 3069

Obr. 2 (str.6)

• · ·· · · 99 9 9 9 9 • · · · * · · ···· • · · · ·· · ·· · 9 9 · 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · 9 · ···

9999 99 99 9999 99 999 9 •ne/cXox>«

TBC4/pZBG2-mprpTonPflrel4; acceilioa nuaber ΚΓ0203seguenee XD zxuaher 4

1 AAAAAAAGTTTCAATTTTTTTTCTAAAATAAAAAAAAATrCATTTrrTTTGAATCTGGAAAAA £3 64 ATG CTA AGG ACT AKT GTG TTG TTG TTA TTA GIT ATT TGT TTA TTG GAT TTT TTT TCT TCA GTG AAA GCT 132 1 Kec Leu Arg Thr Asn Val Leu Leu Leu Leu Val Ile Cys Leu Leu Asp Phe Phe Ser Ser Val Lys Ala 23 133 AGT GIT TCT TAT GAT GAC AGA GCT ATA ATC ATA AAT GGG AAA AGA AAA ATT CTT ATT TCT GGT TCA ATT 201 24 Ser Val Ser Tyr Asp Asp Arg Ala Ile Ile Ile Asn Gly Lys Arg Lys Xle Leu Ile Ser Gly Ser Ile 46 202 CAT TAT CCA AGA AGC ACT CCA CAG ATG TGG CCT GAT CTT ATA CAA AAG GCT AAA GAT GGA GGC TTA GAT 270 47 His Tyr Pro Arg Ser Thr Pro Gin Met Trp Pro Asp Leu Ile Gin Lys Ala Lys Asp Gly Gly Leu Asp 69 271 GTT ATT GAA ACT TAT GTT TTC TGG AAT GGA CAT GAG CCT TCT CCT GGA AAA TAT AAT TTT GAA GGA AGA 339 70 Val Ile Glu Thr Tyr Val Phe Trp Asn Gly His Glu Pro Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Phe Glu Gly Arg 92 340 TAT GAT CTT GTT AGA TTC ATC AAA ATG GTA CAA AGA GCA GGA CTT TAT GTC AAT TTA CGT ATT GGC CCT 408 93 Tyr Asp Leu Val Arg Phe Ile Lys Met Val Gin Arg Ala Gly Leu Tyr Val Asn Leu Arg Ile Gly Pro 115 409 TAC GTC TGT GCT GAA TGG AAC TTT GGG GGA TTC CCT GTT TGG CTA AAA TAT GTG CCT GGT ATG GAA TTT 477 116 Tyr Val Cys Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Val Trp Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Glu Phe 138 478 AGA ACA AAC AAT CAG CCT TTT AAG GTG GCT ATG CAA GGA TTT GTT CAG AAA ATA GTC AAC ATG ATG AAG 546 139 Arg Thr Asn Asn Gin Pro Phe Lys Val Ala Het Gin Gly Phe Val Gin Lys Ile Val Asn Het Met Lys 161 547 TCA GAA AAT TTG TTT GAA TCT CAA GGA GGA CCA ATA ATT ATG GCC CAG ATA GAA AAT GAG TAT GGA CCA 615 162 Ser Glu Asn Leu Phe Glu Ser. Gin Gly Gly Pro Ile Ile Met Ala Gin Ile Glu Asn Glu Tyr Gly Pro 184 616 CTA GAA TGG GAA ATT GGT GCT CCT GGT AAA GCT TAT ACA AAA TGG GCA GCT CAA ATG GCT GTA GGT TTG 684 185 Val Glu Trp Glu Ile Gly Ala Pro Gly Lys Ala Tyr Thr Lys Trp Ala Ala Gin Met Ala Val Gly Leu 207 665 AAA ACT GGT GTC CCA TGG ATC ATG TGT AAG CAA GAG GAT GCT CCT GAT CCT GTG ATT GAT ACT TGT AAT '753 208 Lys Thr Gly Val Pro Trp Ile Met Cys Lys Gin Glu Asp Ala Pro Asp Pro Val Ile Asp Thr Cys Asn 230 754 GGC TTC TAC TGC GAA GGG TTC CGT CCT AAT AAG CCT TAC AAA CCT AAA ATG TGG ACA GAA GTA TGG ACT 822 231 Gly Phe Tyr Cys Glu Gly Phe Arg Pro Asn Lys Pro Tyr Lys Pro Lys Met Trp Thr Glu Val Trp Thr 253 823 GGC TGG TAT ACG AAA TTC GGT GGT CCA ATT CCT CAA AGA CCA GCC GAA GAC ATT GCA TTT TCA GTT GCC '. 891 254 Gly Trp Tyr Thr Lys Phe Gly Gly Pro Ile Pro Gin Arg Pro Ala Glu Asp Ile Ala Phe Ser Val Ala 276 892 AGG TTT GTT CAG AAC AAT GGT TCA TTC TTC AAT TAC TAC ATG TAT CAT GGA GGA ACA AAT ΤΓΓ GGC CGG 960 277 Arg Phe Val. Gin Asn Asn Gly Ser Phe Phe Asn Tyr Tyr Met Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg 299 961 ACA TCA TCA GGG CTT TTC ATT GCA ACT AGC TAC GAT TAT GAT GCT CCT CTC GAT GAA TAT GGG TTG CTG 1029 300 Thr Ser Ser Gly Leu Phe Ile Ala Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu Tyr Gly Leu Leu 322 1030 AAT GAA CCA AAG TAT GGG CAC TTG AGA GAC TTA CAT AAA GCT ATC AAG CTA TCT GAA CCG GCT TTA GTT 1098 323 Asn Glu Pro Lys Tyr Gly His Leu Arg Asp Leu His Lys Ala Ile tys Leu Ser Glu Pro Ala Leu Val 345 1099 TCA TCA TAT GCT GCG GTG ACT AGT CTT GGA AGT AAT CAA GAG GCT CAT CTT TAT AGA TCA AAA TCT GGA 1167 346 Ser Ser Tyr Ala Ala Val Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gin Glu Ala His Val Tyr Arg Ser Lys Ser Gly 368 1168 GCT TGT GCT GCT TTT TTA TCC AAC TAT GAC TCT AGA TAT TCA GTA AAA CTC ACC TTT ..CAG AAT AGG CCA 1236 369 Ala Cys Ala Ala Phe Leu Ser Asn Tyr Asp Ser Arg Tyr Ser Val Lys Val Thr Phe Gin Asn Arg Pro 391 1237 TAC AAT CTG CCT CCA TGG TCC ATC AGC ATT CTT CCC GAC TGC AAA ACT GCC GTT TAC AAC ACT GCA CAG 1305 392 Tyr Asn Leu Pro Pro Trp Ser Ile Ser Ile Leu Pro Asp Cys Lys Thr Ala Val Tyr Asn Thr Ala Gin 414 1306 GIT AAC TCT CAA AGC TCG AGC ATA AAG ATG ACG CCT GCA GGT GGT GGA TTG TCT TGG CAG TCA TAC AAT 1374 415 Val Asn Ser Gin Ser Ser Ser Ile Lys Met Thr Pro Ala Gly Gly Gly Leu Ser Trp Gin Ser Tyr Asn 437 1375 GAA GAA ACG CCT ACT GCT GAT GAC AGC GAT ACA CTT ACA GCT AAC CGA CTA TGG GAA CAG AAA AAC GTC 1443 438 Glu Glu Thr Pro Thr Ala Asp Asp Ser Asp Thr Leu Thr Ala Asn Gly Leu Trp Glu Gin Lys Asn Val 460

Obr. 2 (str.7) « · «4 ·· · · • · ♦♦·· · · ·

Λ 999 · · · ♦ ·

9 4 9 4 9 9 9 »94 9

4 4 4 4 9 · 4 4 4

44 4 9 ·· ·* ·<·· ·< ···

2«n»/clone najae t TBQ4/pZ£G2-JJ^l/ρτοχαβρ&14 / «cceeeioa namber XX0203^(F Sequence ZP nuiaber 4 cont.

1444 ACA AGA GAT TCA TCA GAC TAT CTG TGG TAC ATG ACA AAT GTA AAT ATA GCA TCT AAT GAA GGA TTT CTA 1512 483 461 Thr Arg Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Trp Tyr Met Thr Asn Val Asn Ile Ala Ser Asn Glu Gly Phe Leu 1513 AAG AAC GGA AAG GAT CCT TAT CTC ACT GTT ATG TCC GCT GCT CAT GTC TTG CAT GTT TTC GTC AAT GGA 1581 484 Lys Asn Gly Lys Asp Pro Tyr Leu Thr Val Met Ser Ala Gly His Val Leu His Val Phe Val Asn Gly 506 1582 AAA CTA TCA GGA ACT GTT TAT CCT ACA TTG GAT AAT CCA AAA CTT ACA TAC ACT GGC AAC -CTG AAG TTA 1650 507 Lys Leu Ser Gly Thr Val Tyr Gly Thr Leu Asp Asn Pro Lys Leu Thr Tyr Ser Gly Asn Val Lys Leu 529 1651 AGA GCT GGT ATT AAC AAG ATT TCT CTG CTC ACT GTT TCC CTT GCT CTC CCG AAC CTT GGC GTG CAT TAT 1719 530 Arg Ala Gly Ile Asn Lys Ile Ser Leu Leu Ser Val Set Val Gly Leu Pro Asn Val Gly Val His Tyr S52 1720 GAT ACA TGG AAT GCA GGA GTT CTA GGT CCA GTC ACG TTG AGC GCT CTC AAT GAA GGG TCA AGA AAC TTG 1788 553 Asp Thr Trp Asn Ala Gly Val Leu Gly Pro Val Thr Leu Ser Gly Leu Asn Glu Gly Ser Arg Asn Leu 575 1789 GCG AAA CAG AAA TGG TCT TAC AAG GTT GCT CTG AAA GGC GAA TCG TTA ACT CTT CAC TCC TTA ACT GGG 1857 576 Ala Lys Gin Lys Trp Ser Tyr Lys Val Gly Leu Lys Gly Glu Ser Leu Ser Leu His Ser Leu Ser Gly 598 1858 ACT TCT TCT GTT GAA TQG GTT CGA GGT TCA CTA ATG GCT CAA AAG CAG CCC CTG ACT TGG TAC AAG GCT 1926 599 Ser Ser Ser Val Glu Trp Val Arg Gly Ser Leu Met Ala Gin Lys Gin Pro Leu Thr Trp Tyr Lys Ala 621 1927 ACA TTT AAC GCG CCT GGA GGA AAT GAT CCA CTA GCT TTA GAC ATG GCA AGT ATG GGA AAA GGT CAG ATA· 1995 622 Thr Phe Asn Ala Pro Gly Gly Asn Asp Pro Leu Ala Leu Asp Met Ala Ser Met Gly Lys Gly Gin Ile 644 1996 TQG ATA AAT GGT GAA GGC GTA GGT CGC CAT TGG CCT GGA TAC ATA GCA CAA GGC GAC TGC AGC AAA TGC 2064 645 Trp Ile Asn Gly Glu Gly Val Gly Arg His Trp Pro Gly Tyr Xle Ala Gin Gly Asp Cys Ser Lys Cys 667 2065 AGT TAT GCT GGA ACG TTC AAC GAG AAG AAG TGC CAG ACT AAC TGC GGA CAA CCT TCT CAG AGA TGG TAC 2133 668 Ser Tyr Ala Gly Thr Phe Asn Glu Lys Lys Cys Gin Thr Asn Cys Gly Gin Pro Ser Gin Arg Trp Tyr 690 2134 CAT GTT CCA CGA TCG TGG CTG AAA CCA AGT GGA AAC TTG TTA GTA .GTA TTC GAA GAA TGG GGA GCT AAT 2202 691 His Val Pro Arg Ser Trp Leu Lys Pro Ser Gly Asn Leu Leu Val Val Phe Glu Glu Trp Gly Gly Asn ⁷¹³ 2203 CCA ACA GGA ATT TCT CTA GTC AGG AGA TCA AGA TAA AGAACTCGAAAAGTAAAACTTGTTCAGTAACTATGGTGCTTGAA 2282 714 Pro Thr Gly Ile Ser Leu Val Arg , Arg Ser Arg ·** .. 725

2283 TTOGCGCCGAAAAATACATACACGAAGCTAACAATGGAGGCTACWnTTGCAAATTGCAGCTGAATAAAACATTAGAAGATAAAGAAATATr 2374 2375 TGATTAAAAGGAGTATATAAATTTAOúSAGAATITrCTTrATTCTTrcTAAAACrTrGGTrrATAAAGTTTATACAGAATTTrCTGTTATTT 2466 2467 GGATTATGAGATTGAAGAAGATTGTACAGCTTCCAAATACTATTAGAATACAAA7AAATTTCATGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 2554

Obr. 2 (str.8) ···· · · · · » · « * · · · · · 9 · · a · ··· « » · 9 9» ···· 49 94 949l ·· 9994

Gene/cloně na»·» TaGS/RsS^RS-l/bX; acceeelon number AF154423^Jpnjuetice XD number 5

1 ATC CAG ACT TAC GTT TTC TG3 AAC CTTCAT GAACCT GTT OSA AAT CAG TAT GAT TTTCAAGGA AGG AAA 69

1 Ile Gin Thr Tyr Val Phe Trp Asn Leu His Glu Pro Val Arg Asn Gin Tyr Asp Phe Glu Gly Arg Lys 23 70 GAT TTG ATT· AAT ITT GTG AAG TTG GTG GAG AGA GCT QGC TTA ITT GTT CAT ATA AGG ATT GGG CCT TAT 138 24 Asp Leu Ile Asn Phe Val Lys Leu Val Glu Arg Ala Gly Leu Phe Val His Ile Arg Ile Gly Pro Tyr 46 139 GIT TGT GCA GAA TGG AAC TAT GGT GGG TTT CCT CIT TGG TTG CAT TTC ATT CCT GGA ATT GAA TTT CGA 207 47 Val Cys Ala Glu Trp Asn Tyr Gly Gly Phe Pro Leu Trp Leu His Phe Ile Pro Gly Ile Glu Phe Arg 69 208 ACC GAC AAT GAA CCG TTC AAG GCA GAA ATG AAG CGA TTC ACA GCT AAA ATT GIT GAC ATG ATC AAG CAA 276 70 Thr Asp Asn Glu Pro Phe Lys Ala Glu Met Lys Arg Phe Ihr Ala Lys Ile Val Asp Met Ile Lys Gin 92 277 GAA AAT CTA TAT GCA TCC CAG GGT GGG CCG GTT ATC TTG TCT CAG ATA GAA AAT GAG TAX GGC AAT GGT 345 93 Glu Asn Leu Tyr Ala Ser Gin Gly Gly Pro Val Ile Leu Ser Gin Ile Glu Asn Glu iyr Gly Asn Gly 115 346 GAT ATT GAG TCT CGT TAT GGT CCT CGT GCC AAA CCT TAC GTG AAC TGG GCA GCA TCA ATG GCT ACG TCT 414 116 Asp Ile Glu Ser Arg Tyr Gly Pro Arg Ala Lys Pro Tyr Val Asn Trp Ala Ala Ser Met Ala Thr Ser 138 415 TTA AAT ACG GGA GTG CCA TGG GTT ATG TGT CAG CAA CCA GAT GCC CCT CCT TCC GIT ATT AAC ACT TGC 483 139 Leu Asn Thr Gly Val Pro Trp Val Met Cys Gin Gin Pro Asp Ala Pro Pro Ser val Ile Asn Thr Cys 161 484 AAT GGA TTT TAT TGT GAC CAA. TTC AAG CAA AAT TCC GAT AAA ACA CCC AAG ATG IGG ACT GAG AAT TGG 552 162 Asn Gly Phe Tyr Cys Asp Gin Pfae Lys Gin Asn Ser Asp Lys Thr Pro Lys Met Trp Thr Glu Asn Trp 184 553 ACC GGA TGG TTT CT3 TCG TTT GGT GGT CCT GTC CCT TAC AGA CCA GTG GAA GAC ATC GCT TTC GCT GTG 621 185 Thr Gly Trp Phe Leu Ser Phe Gly Gly Pro Val Pro Tyr Arg Pro Val Glu tep Ile Ala Phe Ala Val 207

622 GCT CGA TTT TTC CAG CGA QGC GGA ACTTTC CAG AAC TAT TAC ATG TAC CAC GGG GGA ACT AAC TTT GGG 690

208'Ala Arg Phe Phe Gin Arg Gly Gly Thr Phe Gin Asn Tyr Tyr Met Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe Gly 230

691 AGA ACC AGT GGT GGA CCG TTT ATT GCA ACT AGC TAT GAC TAT GAT GCC CCT CTC GAC GAA TAC 03 755

231 Arg Thr Ser Gly Gly Pro Phe Ile Ala Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu Tyr 252

Obr. 2 (str.9)

Oeae/<?lone s&aie

TBOS/RT

2-6/bl; acceeeioa auaber AF154424;

ence ~ÍO? tiuaťfefc* Ϊ

1 1 ATC CAG ACA TAT GTT TTT TGG AAT GTT CAT GAG Glu CCT TCT Pro Ser CCT GGC AAT TAC AAT Asn TTT GAA Phe Glu GGA AGA TAT Gly Arg Tyr 69 23 Ile Gin Thr Tyr Val Phe Trp Asn Val His Pro Gly Asn Tyr 70 GAC CTG GTG AGG TTT GTA AAA ACG ATT CAG AAA GCA GGG CTG TAT GCT CAT CTT CGA ATT GGC CCT TAC 138 24 Asp Leu Val Arg Phe Val Lys Thr Ile Gin Lys Ala Gly Leu Tyr Ala His Leu Arg Ile ..Gly Pro Tyr 46 139 GTT TGT GCA GAG TGG AAT TTT GGA GGG TTT CCA GTA TGG CTG AAG TAT GTA CCT GGC ATT AGC TTC AGA 207 47 Val cys Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Val Trp Leu Lys Tyr Val Pro Gly Ile Seř Phe Arg 69 208 GCT GAT AAT' GAA CCT TTC AAG AAC GCA ATG AAA t GGG TAT GCT GAG AAA ATT GTT AAC TTG ATG AAG ATC 276 70 Ala Asp Asn Glu Pro Phe Lys Asn Ala Met Lys Gly Tyr Ala Glu Lys Ile Val Asn Leu Met Lys Ile 92 277 ATA ATC TTT TCG AGT CTC AGG GTG GTC CAA TCA TAC TCT CAC AGA TTG AGA ATG AGT ATG GGC CTC AAG 345 93 Ile Ile Phe Ser Ser Leu Arg Val Val Gin Ser Tyr Ser His Arg Leu Arg Met Ser Met Gly Leu Lys 115

346 116 CCA AGG TAC Pro Arg Tyr TTG GAG CAC GGG GAC ATC AGT ATT CAA CAT 033 CTG CAA ATA TGG CAG TTG GAT TTG AAC 414 138 Leu Glu His Arg Asp Ile Ser Ile Gin His Gly Leu Gin Ile Trp Gin Leu Asp Leu Asn 415 ACA GGC GTC CCA'TGG GTG ATG TGC AAG GAA GAA GAT GCA CCA GAT CCT GTG ATC AAC ACA TGC AAT GGT 483 139 Thr Gly Val Pro Trp Val Met Cys Lys Glu Glu Asp Ala Pro Asp Pro Val Ile Asn Thr Cys Asn Gly 161 484 TTC TAC TGT GAT AAT TTC TTC CCA AAC AAA CCA TAC AAA CCT GCA ATT TGG ACT GAA GCT TGG AGT GGA 552 162 Phe Tyr Cys Asp Asn Phe Phe Pro Asn Lys Pro Tyr Lys Pro Ala Ile Trp Thr Glu Ala Trp Ser Gly 184 553 TGG TTC, TCG GAA TTT GGC GGT CCC CIT CAT CAG AGA CCA GTT CAG GAT TTG GCA TTT GCT GTT GCC CAA 621 185 Trp Phe Ser Glu Phe Gly Gly Pro Leu His Gin Arg Pro Val Gin Asp Leu Ala Phe Ala Val Ala Gin 207 622 TTT ATA CAA AGA GGA GGA TCT TTT GTT AAC TAT TAC ATG TAC CAT GGG GGC ACG AAC TTT GGA CGC ACT 690 208 Phe Ile Gin Árg Gly Gly Ser Phe Val Asn Tyr Tyr Met Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr 230 691 GCG GCT GGG CCA TTC ATC ACT ACC AGC TAT GAT, TAT GAT GCC CCC CTC GAC GAG TAT GG 749 231 Ala Gly Gly Pro Phe Ile Thr Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu Tyr 250

Obr. 2 (str.10)

Qtt&e/clooa Uwse;

TBC7/

2-1-18,· accession amnber AP154422,· .umher 7 i GCAAcrrercefc*- ~ n

13 GTGAATAACACCGCTAAACGGCCAATGCCAACTCTCGTCGGAATCTGAATAGTGATTTAAGCAGCTTAGCTAGCTAACTTTTCCCTCTGCA 103

104 ATG AAC ACA ATG AGT TGT TTG TCC TCT AAT TTC AAG TTC GTT TTC CTT GCC TCG ACT GTG ATA TGG ATG 172 1 Met Asn Thr Met Ser cys Leu Ser Ser Asn Phe Lys Phe Val Phe Leu Ala Ser Thr Val Ile Trp Met 23 173 ACG GTA ATG TCG TCG TCG TTA GCA GCA GTA GAT GCT TCC AAT GTT ACT ACT ATT GCT ACT GAT AGT GTG 241 24 Thr Val Met Ser Ser Ser Leu Ala Ala Val Asp Ala Ser Asn Val Thr Thr Ile Gly Thr Asp Ser Val 46 242 ACT TAC GAT CGA CGC TCG TTG ATT ATT AAC GGC CAG AGG AAG CTG CTC ATC TCC GCT TCC ATT CAC TAT 3Í0 47 Thr Tyr Asp Arg Arg Ser Leu Ile Ile Asn Gly Gin Arg Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ser Ile His Tyr 69 311 CCT CGC AGT GTC CCT GCC ATG TGG CCT GCT CTG GTT CGA TTG GCG AAG GAA GGA GGA GTG GAT GIT ATT 379 70 Pro Arg Ser Val Pro Ala Met Trp Pro Gly Leu Val Arg Leu Ala Lys Glu Gly Gly Val Asp Val' Ile 92 380 GAA ACG TAT GTT •rrc TGG AAC GCT CAC GAA CCT TCT CCG GGC AAT TAT TAC TTT GGA GGA AGG TTT GAT 448 93 Glu Thr Tyr Val Phe Trp Asn Gly His Glu Pro Ser Pro Gly Asn Tyr Tyr Phe Gly Gly Arg Phe Asp 115

449 CTA GTC AAA TTT TCT AAG ATC ATT CAG CAG GCT GGA ATG TAT ATG ATT CTT CGG ATT GGA CCA TTT GTA 517 138 116 Leu Val Lys Phe Cys Lys Ile Ile Gin Gin Ala Gly Met Tyr Met Ile Leu Arg Ile Gly Pro Phe Val 518 GCT GCA GAA TGG AAC TTT GCT GGA CTT CCT GTG TGG TTG CAT TAT GTG CCA GCT ACC ACC TTT CGG ACT 586 139 Ala Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Leu Pro Val Trp Leu His Tyr Val Pro Gly Thr Thr Phe Arg Thr 161 587 GAT ACT GAA CCA TTT AAG TAT CAC ATG CAG AAG TTC ATG ACA TAT ACA GTG AAC TTA ATG AAG AGA GAG 655 162 Asp Ser Glu Pro Phe Lys Tyr His Met Gin Lys Phe Met Thr Tyr Thr Val Ajsn Leu Met Lys Arg Glu 184 656 AGG CIT TTT GCA TCT CAA GGA GCT CCA ATC ATC TTG TCA CAG CTA GAA AAT GAG TAC GGC TAC TAT GAA 724 185 Arg Leu Phe Ala Ser Gin Gly Gly Pro Ile Ile Leu Ser Gin Val Glu Asn Glu Tyr Gly Tyr Tyr Glu 207 725 AAT GCA TAT GGA GAA GGA GQG AAA AGG TAT GCC TTA TGG GCT GCT AAA ATG GCC CTT TCT CAA AAT ACT 793 208 Asn Ala Tyr Gly Glu Gly Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Trp Ala Ala Lys Met Ala Leu Ser Gin Asn Thr 230 794 GCT CTA CCT TGG ATA ATG TGC CAG CAG TAT GAT GCT CCT GAT CCT GTG ATT GAC ACA TGC AAT TCA TTŤ 862 231 Gly Val Pro Trp Ile Met Cys Gin Gin Tyr Asp Ala Pro Asp Pro Val Ile Asp Thr Cys Asn Ser Phe 253 863 TAC TGC GAC CAA TTT AAA CCA ATC TCT CCA AAC AAG CCC AAA ATT TGG ACA GAG AAC TGG CCG GGA TGG 931 254 Tyr Cys Asp Gin Phe Lys Pro Ile Ser Pro Asn Lys Pro Lys Ile Trp Thr Glu Asn Trp Pro Gly Trp 276 932 TTC AAG ACA TTT GGG GCC AGA GAT CCT CAC AGG CCT GCA GAA GAT CTT GCT TAT TCC GTG GCT CCT TTT 1000 277 Phe Lys Thr Phe Gly Ala Arg Asp Pro His Arg Pro Ala Glu Asp Val Ala Tyr Ser Val Ala Arg phe 299 1001 TTC CAA AAA GGA GGA AGC GTG CAG AAT TAT TAC ATG TAC CAT GCT GGG ACG AAC TTT GGC AGG ACA GCA 1069 300 Phe Gin Lys Gly Gly Ser Val Gin Asn Tyr Tyr Met Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr Ala 322 1070 GCT GGC CCT TTC ATT ACC ACA ACT TAT GAC TAT GAT GCC CCA ATT GAC GAA TAT GCT TTA CCA AGG TTT 1138 323 Gly Gly Pro Phe Ile Thr Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Ile Asp Glu Tyr Gly Leu Pro Arg Phe 345 1139 CCA AAA TGG GCT CAC CTT AAA GAA CTT CAT AAA GTC ATA AAA TCG TGT GAG CAT GCT CTG CTG AAC AAT 1207 346 Pro Lys Trp Gly His Leu Lys Glu Leu His Lys Val Ile Lys Ser Cys Glu His Ala Leu Leu Asn Asn 368 1208 GAT CCA ACT CTT CTT TCA TTA GCT CCT CTA CAA GAG GCT GAT CTT TAT GAA GAT GCT TCA GGC GCT TGT 1276 369 Asp Pro Thr Leu Leu Ser Leu Gly Pro Leu Gin Glu Ala Asp Val Tyr Glu Asp Ala Ser Gly Ala Cys 391

1277 GCT GCC TTT CTC GCG AAT ATG GAT GAC AAA AAT GAC AAG GTG CTA CAG TTC CGA CAT GTA TCA TAC CAC 1345

392 Ala Ala Phe Leu Ala Asn Ket Asp Asp Lys Asn Asp Lys Val Val Gin Phe Arg His Val Ser Tyr His 414

1346 TTG CCA GCA TGG TCT GTT AGC ATT TTG CCA GAC TGC AAA AAT GTA GCG TTC AAC ACA GCA AAG GTT GGA 1414

415 Leu Pro Ala Trp Ser Val Ser Ile Leu Pro Asp Cys Lys Asn Val Ala Phe Asn Thr Ala Lys Val Gly 437

1415 TGT CAA ACT TCT ATT GTC AAT ATG GCA CCC ATA GAT TTG CAT CCC ACC GCA AGT TCA CCA AAG AGA GAC 1483

438 Cys Gin Thr Ser Ile Val Asn Her Ala Pro Ile Asp Leu His Pro Thr Ala Ser Ser Pro Lys Arg Asp 460

Obr. 2 (str.11)

Gane/cláne name: TBG7/pZBGeH6; aecs.sion nuaber AF154422; Seq^mpa nmaber 7 cont.

1484 ATC AAG TCT CTT CAG TGG GAA GTC TTC AAG GAA ACA GCT GGA GTA TGG GGA GTT GCT GAT TTC ACT AAA 1552 483 461 Ile Lys Ser Leu Gin Trp Glu Val Phe Lys Glu Thr Ala Gly Val Trp Gly Val Ala Asp Phe Thr Lys 1553 AAC GGA TTT GTA GAT CAC ATT AAC ACC ACA AAA GAT GCT ACA GAC TAC CTC TGG TAC ACA ACA AGT ATT 1621 484 Asn Gly Phe Val Asp His Ile Asn Thr Thr Lys Asp Ala Thr Asp Tyr Leu Trp Tyr Thr Thr Ser Ile 506 1622 TTT GTT CAT GCA GAG GAG GAT TTC CTA AGA AAC AGA GGC ACT GCA ATG CTT TTC GTT GAA TCA AAG GGT 1690 507 Phe val His Ala Glu Glu Asp Phe Leu Arg Asn Arg Gly Thr Ala Hec Leu Phe Val Glu Ser Lys Gly 529 1691 CAT GCT ATG CAT GTC TTC ATC AAT AAA AAG CTT CAA GCC AGT GCA TCT GGA AAT GGC ACA GTC CCA CAG 1759 530 His Ala Met His Val Phe Ile Asn Lys Lys Leu Gin Ala Ser Ala Ser Gly Asn Gly Thr Val Pro Gin 552 1760 TTC AAG TTT GGA ACT CCT ATT GCT CTA AAG GCA GGG AAG AAT GAA ATT TCC TTG TTA AGC ATG ACT GTG 1828 S53 Phe Lys Phe Gly Thr Pro Ile Ala Leu Lys Ala Gly Lys Asn Glu Ile ser Leu Leu Ser Met Thr Val 575 1829 GGC CTA CAA ACA GCT GGA GCG TTT TAT GAA TGG ATT GGA OCT GGT CCA ACA AGT GTC AAA GTT GCA GGG 1897 576 Gly Leu Gin Thr Ala Gly Ala Phe Tyr Glu Trp Ile Gly Ala Gly Pro Thr Ser Val Lys Val Ala Gly 598 1898 TTC AAG ACT GGG ACT ATG GAC TTG ACT GCG TCT GCT TGG ACC TAT AAG ATT GGA TTG CAA GGA GAA CAT 196$ 599 Phe Lys Thr Gly Thr Met Asp Leu Thr Ala Ser Ala Trp Thr Tyr Lys Ile Gly Leu Gin Gly Glu His 621 1967 TTG AGG ATA CAG AAG TCA TAT AAC TTG AAG AGT AAA ATT TGG GCA CCA ACT TCG CAG CCA CCA AAG CAA 2035 622 Leu Arg Ile Gin Lys Ser Tyr Asn Leu Lys Ser Lys Ile Trp Ala Pro Thr Ser Gin Pro Pro Lys Gin 644 2036 CAG CCC CTC ACA TGG TAT AAG GCA GTA GTA GAT GCG CCT CCT GGT AAT GAA CCT GTP GCA CTT GAT ATG 2104 645 Gin Pro Leu Thr Trp Tyr Lys Ala Val Val Asp Ala Pro Pro Gly Asn Glu Pro Val Ala Leu Asp Met 667 2105 ATT CAT ATG GGA AAA GGA ATG GCT TGG TTG AAT GGA CAA GAA ATT GGC AGA TAT TGG CCG AGG AGA ACT 2173 668 Ile His Met Gly Lys Gly Met Ala Trp Leu Asn Gly Gin Glu Ile Gly Arg Tyr Trp Pro Arg Arg Thr 690

2171 TCT AAA TAT GAG AAT TGT GTT ACT CAA TGT GAC TAC AGA GGC AAA TTT AAC CCT GAT AAG TGT GTC ACT 2242 713 691 Ser Lys Tyr Glu Asn cys Val Thr Gin Cys Asp Tyr Arg Gly Lys Phe Asn Pro Asp Lys Cys Val Thr 2243 GGC TGT GGA CAA CCT ACA CAG AGA TQG TAT CAT GTG CCA CGA TCT TGG TTC AAG CCA TCA GGA AAT GTC 2311 714 Gly Cys Gly Gin Pro Thr Gin Arg Trp Tyr His Val Pro Arg Ser Trp Phe Lys Pro Ser Gly Asn Val 736 2312 TTA ATT ATC TTT GAG GAA ATA GGT GGA GAT CCC TCT CAA ATT AGA TTC TCA ATG CGA AAG GTT TCT GGA 2380 737 Leu Ile Ile Phe Glu Glu Ile Gly Gly Asp Pro Ser Gin. Ile Arg Phe Ser Met Arg Lys Val Ser Gly 759 2381 GCT TGT GGT CAT CTT TCA GTG GAC CAT CCA TCC TTT GAT GTT GAA AAT CTG CAA GGA AGT GAA ATT GAG 2449 760 Ala Cys Gly His Leu Ser Val Asp His Pro Ser Phe Asp Val Glu Asn Leu Gin Gly Ser Glu Ile Glu 782 2450 AAC GAC AAA AAC AGG CCA ACT CTA AGT TTG AAA TGC CCC ACA AAT ACT AAT ATT TCC TCT GTC AAA TTT 2518 783 Asn Asp Lys Asn Arg Pro Thr Leu Ser Leu Lys Cys Pro Thr Asn Thr Asn Ile Ser Ser Val Lys Phe 805 2519 GCC AGC TTT GGA AAT CCT AAT GGT ACA TGT GGC TCC TAC ATG CTA GGA GAC TGC CAC GAT CAG AKT TCT 2587 806 Ala Ser Phe Gly Asn Pro Asn Gly Thr Cys Gly Ser Tyr Met Leu Gly Asp Cys His Asp Gin Asn Ser 828 2588 GCA GCA CTC GTC GAA AAG GTT TGC CTG AAC CAA AAT GAG TGT GCA TTA GAA ATG TCC AGC GCA AAC TTT 2656 829 Ala Ala Leu Val Glu Lys Val Cys Leu Asn Gin Asn Glu cys Ala Leu Glu Met Ser Ser Ala Asn Phe 851 2657 AAC ATG CAA TTG TGT CCA AGT ACA GTA AAG AAA CTT GCA GTT GAA GTG AAT TGC AGC TGA GTGTCATTGCCC 2728 852 Asn Met Gin Leu Cys Pro Ser Thr Val Lys Lys Leu Ala Val Glu Val Asn Cys Ser **· 871

2729 AAAATGAATGAC^TATTCTAATTTATATAGTTTGCTACGGAGATCCTCATTCTTAAACCTTTCTTATATAGCAGAAAAATCTGCTATTCCTT 2820 2821 CTTTCGTCTATGATTrGAAGTTTAAGATATGAGTACTGATGTCTTATTAAGCATCACCAGATAACCTrcGATATTCATGITTGAAAGACTAA 2912 2913 GTATTCA.TATTTATTCAGTCGAGATGCAAGA7TTATTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA · 2972

Obr. 2 (str.12) • ·

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccali

Lupin

10 20 30 40 50

-24 ........................M3FWMA MLlMLiĚiLGLW VSCGIÍ^Š$S

-14 ..............MSRRKT LNFPLILTVL TIHFVTVAGE YFKPFNVTSÍ3

-20 ....................M3CTLIIMLN VÍLVLLGSWV FSG@Sý^C!

-22 ......................MLRTOVÍíli ÍŮOTCiiLDF^

1---------- ---------------------------------------1---------- ----------------------------------------1 .MNTMSCLSS NFKFVFIAST VIWMTVMSSS LAAVDASNVT TIGTDSVTÝb

-21 .....................M3VGÍQTOW SILLLFSCIF SAASŠgVSXD

-16 ................MLCG KENNVMKMML VYVFVLITLI SCVYGNVWÝD

-20 ....................MALSÍVIMIM VALLAAVWSP PAj^ajT^

-20 .................... MKM&QFNLLS LFLIIÍTTSPG Š$NSTÍ$?HÍ>

-12 ............MEGSRIVM ESEMSRRNFH WftifFrW CYVTASVlgp

29 34'

30 30 38

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccoli

Lupin '31

29 ,51 51 50

30 35

31 31 39

100 100 . 99 ' 79 84 80 80 88

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccoli

Lupin

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-0RF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccoli

Lupin

160 170. 180 . 190 200

127 WLKYVEGISĚ MŠix——AE ŘLÝOTQGGPÍ . 176

137 WÉRDIEGIEE ji^&APĚKEE «ERYVKiďpyD LMI-----SE ŠLFSWQGGPI 186

131 WÍKYS/PGISR' MI&-----AE RLYETQÓGPI .' 180

129 WLKřVPGMEF· i^RVQKEW 'MMK-----SE NLRESQGGPI / 178

151 WLHFIPGIĚF- Kři^Pjr^ . MKR^AigýD MIK-----QE NLYÁŠQGGPV 200

151 WLKYVPGISF RaENEPEKNA -MKGYAEKÍVN LMKIIIFSSL RWQSYSHRL 200 150 WLHYVPGTTF RTDSEPFKYH MQKĚMTYTVN LMK-----RE RLFASQGGPI 199

130 WLKYVPGIAF R.WNSPEKňÁ 1&Í&ÉEKÍVS MMK-----AE KLFQTQGGPI 179

135 WLKYVPGIEF ROTNGFE7CEK MSyETTKIVD MMK-----AE KLFHWQGGPT 184

131 WLKYVPGIHF ŘTEN3PFKAA M3KFTEKIV5 MMK-----AE GLYETQGGPI ) 180

131 WLHNMPCMKF. ŘTINPGFMNE MQNFITKIVN MMK-----EE SLFAŠQGGPI ' ISO

139 WLKYVPGIAF RTDNBPFKEÁ MQKFTEKIW IMK-----AE KLPQSQGGPI . 188

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation

210 220 230 240 250

177 ILSQ-IENEY GP—MEWELG EPGKVYSEWA AKMAVDLGTG VpWlMCKQD- , 226

187 ILLQ-IENEY GN—VESSFG PKGKLÝMKWA AEMÁVGLGAG VPWVMČRQ-T .236 ,·' 181 ILSQ-IENEY GP—MEWELG ÁPGKSYAQWA AKMAVGLDTG VPWMCKQD- 230

179 IMAQ-IENEY GP—VEWEÍG APGKAYTKWA AQMAVGLKTG VPWTMCKQE- . .228 ' 201 ILSQ-IENEY GNGDIESRYG PRAKPYVNWA .ASMATSLNTG VPWVMCQQ-P . 250 ' 201 RMSMGLKPRY ——LEHRDI SIQHGLQIWQ----LDLNTG VPWVMCKEE- 250

200 ILSQ-VENEY G—YYENAYG BGGKRYALWA AKMALSQNTG VEWIMC-QQY 249

180 ILSQ-IENEF GP—VEWEIG APGKAYTKWA AQMAVGLDTG VPWIMCKQE- 229 .185 ILNQ-IENEY GP—VEWEIG APGKAYIHWA AQMAQSLNÁG VEWIMCKQOS 234

Obr. 3 (str.l) • ·

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple caroation asparagus broccoli

Lupin

451--------------------450 VAFlmkvfc QTŠIVNMAP- 430 EVYŇTOSKVGS ČSSQV--Q--435 EyXi^RyNE PSPKLHS5--431 TVFř^^^ Sttt3--e---431 ÉAÝříp^VOT QTŠIITEDS--439 EVFNTAKVNS PRLHR— K—

----------------------- 500 & E—HPTASSS KRDIKŠLQťfe 499

---------l^Š<3EP--$a : 479

---------&ŠKLN--P 484

---------J32Y LG-ggé—₄₈₀

---§-------_D EPEKLKWT?BR 480

---------ifág ýttíŠAFA—488

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple caroation asparagus broccoli

Lupin

477 '487

481

479 501 501 500

480 485

481 481 489

510 520 530 540 /550

S-ĚNEEAASH EDD-^WG ί&Ε&ΙΜΤΤ^ VSOSLW^^ rEÍOPTĚ-gF T-LKEPLGVW GĚKN-fajsSŠ IpHL^KS' Q^g^QLÍR IYkSDDDISE S-ÉřŽSSSŠY EĎS-SgTVVG V§ág$5Sl& $KIDŠRE-KĚ

S-YNgE®PTA ĎĎŠD&43&JG: EWeSkMÍSĚĚÍD

V-FXÉTAGVW GVAD-^<n| FVEHggr^ S-KT^JřSS ĎETSg^LDG EypOgfffeg Š-YSDEVPTA DSPGPgRS&K A-YTP3ŠDAL NOJ-S&ĚKDG ÍJ^LST^ PEFT^KTIL R3ŠGDLlgg§ i&DgKDféÍNg Š-YŇgEP£SS SENDPVB3YA ÉWES&ZGlSKSi

M-E5 'BKKDPIW P§D--ssasíáK®

526

536

530

528 550 550 549

529 534

530 530 538

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple caroation asparagus broccoli

Lupin

527

537

531

529 551 551 550

530 535

531 531

539

560 ........ 570 ₄ ..... 580 ; ,590 600

WEE^sÍtI dÍdImRDFVK KVV^|||í^ umsgŠHOí věv^^sť 'sjbskaw?®

LKNGK-DEYĚ &&Š?ffiMĚÍ Í®3<íSSÍj VÝÍ3T®áŠ3 ířn-rgtamS Fiiggkgflgkg

LKSGK-SPLE gEF,----^=ro lkkSB-eSSs tvn, iKrg|-Y§f|í

SRNMS----L

IKDGíŠ-ÍŽ&/g

576

586

580

578 600 600 599

579 584

580 580 588

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

T3G5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple caroation asparagus broccoli

Lupin

577 : 587

581

579 601 , 601 600

580 585

581 581 589

J10 ⁶²⁰ ·’ ' ⁶³⁰ Jí⁴⁰ -⁶⁵⁰

GVtObfcg?! WŠ*Š

GYNDjLjáiŠE TVGfcWgAF LEXLGfigFKG QIK^CKSg; D—INffÍTS GVNWTÍSn AVGLFNIGPH FETaWGVLS BfelíTG&BG: K—HDLTWQ GIŇKlŠSiSV; ŠVGLEHVGVH WTWNXGVLG ťŠWŠGLNEGÍ S—KNLAK.Q

GKNEÍŠLLŠM TVGLQTAGAF YE-WIGAGPT SVKVAGFKTG T---MDLTAS

GINKLALLSI SVGLPNVCTH FETWNTUrÁLtí EIŤĚKGLNSG·' T---WCMSGW

GVNRISLLSA VVSUANVGWH FERYKQGVlG( Ě7SLSGLNEG· T---RDLIWQ

GSNKIŠILSV SVGLPNVGNH FE7V.WGVL3 Ě^TGLNÉG K—RDLSLQ CTNHLALLSV SVGLQNYGPF FÉSGPTGING PVKLVGYKGD ETIEKOLSKH GNNKIŠLLSV SVGLANVCTH FĚTONTGVLG FVTLTCLSSG' T—WDLSKQ

626

636 .630

628

650

649

629 634

630 630 638

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple caroation asparagus broccoli

Lupin

660 670 680 ~ 690 700

627 KWFÝKVGLKG EALSLHSLSG SPŠVE—WVE GŠLWAQKQPL' SwřkrŤFŇAP 676

637 LWTYQVGLRG EFLEVYDVNS TESAG—WTE FPTGTTPSVF SWÝKTKFDAP ' 686

631 KWSYKVGLKG EALSLHSLSG SSSVE—WVE GŠLVAQRQPL TWYKSTFNAP 680

629 KWSYKVGLKG ESLSLHSLSG SSSVE—WVR GSIMAQKQPL TWYKATFNAP 678

651 -------------------------------------------------- 700

650 AWTYklGLQG EHLRIQKSYN LKSKI—WAP TSQPPKQQPb TWYKAWDAP 699

630 KWTYKTGLKG EAIGLHTVTG SSSVE—WVE GPSMAEKQPL TWYKATVNřJ 679

635 YWSYKIGTKG EEQQVYNSGG SSHVQ—W3P PAW—KQPL VWYKTTFDAP 684

631 KWTYQIGIHG ETLSLHSLTG SSNVE—W7E AS---QKQPL ŤWYKTFFNAP · 680

631 QWDYKXGLNG FNKKLFSMKS AGKHHKKWST EKLPADRM-L SWYKANFKAP · 680 639 KWSYKIGLKG ESLSLHTEAG SNSVE—WVQ GSLVAKKQPL AWYKTTFSAP · 688

TBGl-ORF

710 720 730 740 750 677 DGNEPLALDM NTMGKGQVWI NGQSLGRHWP AYKSS-GSCS V-CNYTGWFD

726

Obr. 3 (str.2) « ·

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccoli

Lupin

451--------------------------450 VAFŇTŽKVÍSC QTŠXVNMAP-------430 EVYíATAKVGS ČSSQV—0--------435 PgPIQj8g|--------431 EAÝN^^NT QTŠIITEDS-------439 EVFOTAKVNS PRLHR— R---------H3 E—HPTASgg KRDXKŠLQÍfe

----------ijsg $Η££ΕΡ-|§

----------pgg IŽISNLN—®

---------_§2Y us-ggjj—

----é-------_D EPEKLKOTW

----------£g?. VNŠÁFA—tíŽ

500

499

479 484

480 480 488

TBG1-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccoli

Lupin

510 _520

477 S-ĚNEC&ASH EDD-ÍEEjgVVG 487 T-LKEPLGVW GDKN-ggsgÓ 481 S-FÍIEEISSY EÓS-SftFVVG

479 S-YNEEgPTÍČ ĎDSDiti&té

501-------------------501-------------------500 V-FKETAGVW GVAD-J3ĚKN§r

480 S-FTEpÁSS '

485 Š-YSIWT# _

481 A-YTfbjiftL NEN-^3<DS 481 PEFTTQKTIL KGSGDLlgg? 489 S-YNgEPASS SENDFVB3YA _ 530 __ 540 ‘550 vspYLW^g ieidptě-®:

IgEHLÍ^TKQ' QŠpIgĚWYLÍR IY£SDDDIS& l^gírriTĚya vsóyčwYsíS ^η^κε-κε awěsraSOB sšěBSěísSin

TBGl-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-QRF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccoli

Lupin

SBIH |s VK^G?--—i KWQPýKfi

IFVHAEE-DE 2TjG^|-Ag

Ý gDjÁKgg-Eg iPKKDPIW

Ď3P$D--€00

526

536

530

528 550 550 549

529 534

530 530 538

TBG1-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccoli

Lupin

TBG1-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple camation asparagus broccoli

Lupin

TBG1-ORF

560 570

527 LNS&I-$g$2 Í&F5^ĚSg&'

537 WEEŇDVSSrí DLDgMRDFVR I^3g

531 LRGgÉf-íSS JJ&SKAWR#

529 1XNCS5-DEYIÍ VE0^K£SgK VáĚŠ*ÍSSěB8

551---------------------------------------551---------550 LRN-RGTAiíS tv&,

530 LKNGK-SELS Í£F,

535 £ΚΚ@5-Ε§^'

531 LKT^-YEY^

531 SRNMS— --13 539 IKD^C-Wg

576

586

580

578 600 600 599

579 584

580 580 588

610

577

587 GYNDJLjEĚSE 581 GVMSwěrr

579 GINKÍŠLLSyi

601---------601---------600 GKNEISLLS-l

580 GINKLALLSI 585 GVNRIŠLLSA

581 GSNKISILSV. 581 GTNHLALLSV. 589 QtfNKÍSLLSV

620 ;·' . .·· 630 640 650

Sfv·»· Λ;,· ί,ίι'.ίγιι r «»»»; - iM*·» »»»> β» Λι «.*>»»«—· ayglksxgea s^bníphO 2— šetíw íte-WKg Qg&WKsg; d—mte

AVGLSCGřH. F&glUMSgUS. BfeLTGEDEGÍ K— RDJiTWQ ŠVGLPNVGVH YtTWNSGviG Ě^PSGLNES' S—KNLAKQ

TVGLQTAGAF

SVGLSNVGTH

WGIANVGWH

SVGLR&ZGNH

ŠVGLQNYGPF

SVGLWGTH

YE-WIGAGPT

FÉTWNAfiVLŠ fekynqGVlg:

EEItyj^TTGÝÍG

EESGPTGING

FETWOTGVL3

SVKVAGFKTG bítikglnsG

SSŽLSGiSNEff

R^LTGtNEG·

ŘVKLVGYKGD

RVTLTGLSSG'

T---MDLTAS

T---WEMSGW

Φ---RDL1WQ

K---RDLSLQ

ETIEKDLSKH T—WDtSKQ

626

636

630

628

650

649

629 634

630 630 638

660 670 680 690 700

637 LWTYQVGLRG ErLEVYDVNS TESAG—WTE FPTGTTPSVF SWÝKTKFDAP

631 KWSYKVGLKG EALSLHSLSG SSSVE—WVE GSLVAQRQPL TWYKSTFNAP

629 KWSYKVGLKG ESLSLHSLSG SSSVE—WVR GSÍMAQKQPL TWYKATFNAP '651-------------------------------------------------651-------------------------------------------------650 AWTYKÍGLQG EJÍLRIQKSYN LKSKI —NAP TSQPPKQQPL TWYKAWDAP

630 KWTYKTGLKG EA1GLHTVTG SSSVE—WVE GPSMAEKQPL TWYKATFNAP

635 YWSYKIGTKG EEQQVYNSGG SSKVQ—W3P PAW—KQPL VWYKTTFDAP

631 KWTYQIGLHG ETLSLHSLTG SSNVE—WGE AS—QKQPL ŤWYKTFFNAP

631 QWDYKIGING FNHKLFSMKS AGHHHRKWST EKLPADRM-L SWYKANFKAP .639 KWSYKIGLKG ESLSLHTEAG SNSVE—WVQ GSLVAKKQPL AWYKTTFSAP

710 720 730 740 750

677 DGNEPLALDM OTMGKGQVWI NGQŠLGRKWP AYKSS-GSCS V-CNYTGWFD

676

686 '680

678 700 700 699

679 684

680 680 688

726

Obr. 3 (str.3)

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-0RF

TBG6-0RF

TBG7-0RF apple carnation asparagus broccoli

Lupin

687 O^ĎívSEeF 681 AGMD“

679 701 701 700

680 685 681 681 689

GGNpPL&LEfrí '(^rfíT LVAPN-NG§G (slgS&vp' £5í?Xš-gnčg ^SGVGRMWP ěnSÁQ-Gix^S K-gS^SÍFií

PGNEÍVALEM pgcapSaeím

GGNDPLAtDL pGNEPržijáaí

LGKDPVfviX agndpláisl

IHMGKGMAWL

GSMGKGQAWE.'

NGLGKGEWe

GŠj^KGEÍW'

IGHYWP RRTSKYENGV GÍIAR-GŠ®3 řjj^SiGRHNS NNIAK-GŠjN ’ ŠIGKYWP ÁÝJ&Š-GSŠČG “TGKfWP SFNSŠDEGGT βίσκφΐΡ. ajKAR-áiSš

TQCDXRGKFN 1>CSYRGTTO rŇČNŽKGra* S-Gb YRGŤYří EEČDYRGEYG N-@gAG^P

736

730

728 750 750 749

729 734

730 730 738

TBG1-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple carnation asparagus broccoli

Lupin

760 770

727 gKKČLTŇGGE GŠQŘWYHVPR . 737 sdkcrtncge Ϊ •^1 MB 729 msQsssfie 751 ----------_ 780 790 800

É^pI&ŠĚL 'ř-VFEEWOSD ĚÝGStlVí$HE —---“Ťž yrlEÉĚTOKT PFDČSTŠTgŠ ‘i %-LjBggB i B-í

Ě&ĚRFS ' ISrXWE

ITLÍ-E§<áŠf5 ^SivKFKTW e ouB® hísmešt

776

786

780

778

800

799

779 784

780 .780

788

TBG1-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple carnation asparagus broccoli

Lupin

751

750 PDKGý^pGGQ

730 735

731 731 739

810

777 IGS®§

787 TETieÁOySE KHYRP 781 gASVeMWE 779

820 830 840

RLVŠ&ŠFiŠp SgHSEFDRKLSL MDKTPEMHSQ fig MQgW/ÍJKP W——g_ ...

850

-801---------801---------800 jfeGAČGHLŠV 780

-DHPSF&--V ENLQGSEIEN DKNRPjTLSřX -------------------IA ÉD—Ag---785 1$----------------------781 VAŠye&EVEE LQ-RIM^^R TK&TG------gt-PKVíO ζ5>Ε&35Μ§ΚΪ;

781 TGKVCAKAHE-----------------------HN^VEté. ČN-NRP&ŠAV

789 -------------------------------------------------826

836

830

828

850

849

829 834

830 830 838

TBGl-ORP

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple carnation asparagus broccoli

Lupin

TBG1-ORF

TBG2-ORF

TBG3-ORF

TBG4-ORF

TBG5-ORF

TBG6-ORF

TBG7-ORF apple carnation asparagus broccoli

860 870 880 890 900

827 XÉASFGíTĚEG VČ®P$QGŠŠ H^RŠÝÓAÉk K-----NCVG KEŠÓŠVQVTP

837 EFASYGSPNG SCQKĚSQGKGÍ HASjSLSV—---VSQACXG RTSCSIGISN

831 KFASFGTPQG VČGŠFREGŠC HÁFHSYDAFE R-----YCIG QNSCSVPVTP

829 -------------------------------------------------851 -------------------------------------------------851-------------------------------------------------850 KFASFGNPNG TCGSYMLGDC HDQŇŠAALVE K-----VCLN QNECALEMSS

830 -------------------------------------------------835-------------------------------------------------831 KFASPGTPQG ŤCGSFŠEGSC HAHKSYDAFE QBGLMQNCVG QEFCSVNVAP

831 KFASFGNPSG QCGSFAAGSC EEÁKDAVKV----VAKECVG KLNCTMNVSS

839 -------------------------------------------------910 920 930 940 ..... 950

877 ENFGGDP-CR NVLKKLSVEA. XGS............................

887 GVFG-DP-CR HWKSLAVQA KCSPPPDLST SASS................

881 EIFGGDP-CP HVMXKLSVEV £eš...........................

879 ----------------------------------------·..........

901-------------------------------------------------901-------------------- —............................

900 ANFNMQL-CP STVKKLAVEV NCS...........................

880 --------------KL..................................

885 -------------------------------------------------881 EVFGGDP-CP GTMKKLAVEA ICE...........................

881 HKFGSNLDCG DSPKRLFVEV EC-----------------..........

876

886

880

878 900 900 899

879 884

880 880 888

926

936

930

928 950 950 949

929 934

930 930

Obr. 3 (str.4) * · · ·

F L R S

Obr. 4 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG v různých rostlinných pletivech.

Dvacet pg celkové RNA extrahované z květů (F), listů (L), kořenů (R) a stonků (S) bylo naneseno do každé dráhy. RNA byla rozdělena na agarozovém gelu a přenesena na nylonovou membránu. Bloty byly hybridizovány se sondami popsanými napravo, promyty na konečnou stringenci O,1XSSC při 65°C a použity k exponování rentgenových filmů. Pro kontrolu nanášení byl u každého blotu použit ribosomální genový klon 26S ze sóji. Jeden příklad je ukázán.

• ·

Obr. 5 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG v pletivech plodu. Dvacet hg celkové RNA extrahované ze slupky a vnějšího perikarpu bylo naneseno do každé dráhy. Plody byly sklízeny v 10, 20, 30, 35 a 40 dni po odkvětu a dále ve stádiích zrání plodu „breaker (Br), „turning (Tr), růžovém (Pk), červeném (Rd) a přezrálém (OR). RNA byla rozdělena na agarozovém gelu a přenesena na nylonovou membránu.

Bloty byly hybridizovány se sondami popsanými napravo, promyty na konečnou stringenci O,1XSSC při 65°C a použity k exponování rentgenových filmů. Pro kontrolu nanášení byl u každého blotu použit ribosomální genový klon 26S ze sóji. Jeden příklad je ukázán. cDNA klon kódující polygalakturonasu (PG) z rajčete byl použit jako sonda s cílem ukázat dobře charakterizovanou a pro zrání plodů specifickou kontrolu.

MATURE GREEN P OP IP L

TBG2

TBG6

ŤBG7

26S

TURNING P OP IP L

TBG1

TBG3 ŤBG4 TBG5 PG ; 26Š

Obr. 6 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG v pletivech plodu. Dvacet μρ celkové RNA extrahované ve stádiích zrání plodu „zralý zelený (mature green) a „turning ze slupky (Ρ) , vnějšího perikarpu (OP), vnitřního perikarpu (IP) a pouzdra (L) bylo naneseno do každé dráhy. RNA byla rozdělena na agarózovém gelu a přenesena na nylonovou membránu.

• · • · · · · · · · ··· ·· ····

Obr.7 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG v pletivech normálních a mutantních plodů. Dvacet μg celkové RNA extrahované ze slupky a vnějšího perikarpu v různou dobu po odkvetu (dpp) bylo naneseno do každé dráhy. RNA byla rozdělena na agarozovém gelu a přenesena na nylonovou membránu. Bloty byly hybridizovány se sondami popsanými napravo, promyty na konečnou stringenci O,1XSSC při 65°C a použity k exponování rentgenových filmů. Pro kontrolu nanášení byl u každého blotu použit ribosomální genový klon 26S ze sóji. Jeden příklad je ukázán. cDNA klon kódující polygalakturonasu (PG) z rajčete byl použit jako sonda s cílem ukázat dobře charakterizovanou a pro zrání plodů specifickou kontrolu. Značky - a > na levé straně ukazují pozici rajčatové 27S a 18S rRNA.

X • · · • · · ·

Obr. 8 Autoradiograf northern blotu. Pomocí northern blotu byla provedena analýza exprese TBG po ošetření zralých zelených pletiv plodu etylénem. Dvacet pg celkové RNA extrahované ze slupky a vnějšího perikarpu v různou dobu (1, 2, 12 a 24 hodin) po ošetření (+) nebo neošetření (-) etylénem bylo naneseno do každé dráhy. RNA byla rozdělena na agarozovém gelu a přenesena na nylonovou membránu. Bloty byly hybridizovány se sondami popsanými napravo, promyty na konečnou stringenci O,1XSSC při 65°C a použity k exponování rentgenových filmů. Pro kontrolu nanášení byl u každého blotu použit ribosomální genový klon 26S ze sóji. Značky - na levé straně ukazují pozici rajčatové 27S rRNA.

X • · • ·

Obr. 9 Analýza exprese TBG4 v kvasinkách pomocí western blotu. Byl izolován kvasinkový klon, který sekretoval do kultivačního média vysoké množství fůzního proteinu FLAG-TBG4. Vzorky proteinů byly rozděleny na 8% akrylamidovém gelu, přeneseny na nitrocelulosu a blotovány s primárními protilátkami Ml anti-FLAG. Bloty byly promyty a blotovány se sekundárními protilátkami s navázanou alkalickou fosfatasou. Aktivita alkalické fosfatasy byla detekována pomocí substrátu Sigma Fast substráte. Dráha 1 - kultivační médium netransformovaného kvasinkového bylo použito jako negativní kontrola, dráha 2 - kultivační médium kvasinkového klonu exprímujícího fůzní protein FLAG-TBG4, dráha 3 - afinitně purifikovaný fůzní protein FLAG-TBG4.

• · · ·

Obr. 10

Fiaure 11A

WO 99/64564

PCT/US99/12697

25/31

Fiat plate compression tó 3 mm Breaker + 7 d

Line# * Standard Deviation

FPO7 Line #FP07 mean FP07 std dev 1 17.52665 3.418542 2 24.56026 4.786548 3 20.81681 4.066194 4 22.54655 4.15923 5 23.03255 4.493091 6 22.84338 4.517462 7 20.36124 3.24608 8 17.81924 2.665468

Sférický índertor - na 3mm

Stádium „breaker + 7dní

S

E * Standardní odchylka

Obr. 11B • · • · · ·

4mm cylindrický indertor - na lOmm

Stádium „breaker + 7dní * Standardní odchylka

Obr. 11C • « • · · · • · · ·

4mm cylindrické proražení - na lOmm

Stádium „breaker + 7dní max

Linie č.

* Standardní odchylka

Obr. 11D ·· • · 00 • · · • · ·· • · « · • 0 · 0 0«

0 0 • 0 ·· · 0

ObL-. ΠΕ(4) , 4mm cylindrické proražení na lOmm

Obr.11E(3), 4mm cylindricky indertor

Breakcr+7d

2 3 4 5 $ 7 B 3

Linie č.

Standardní odchylka

9 9 »

9 9 9

Obr. 12 Analýza exprese TBG4 v transgenních plodech obsahujících TBG4 antisense konstrukt pomocí northern blotu. A. Celková RNA byla extrahována ze stádií: zralý zelený/42 dní po odkvětu (MG), „turning/breaker + 3 (TR) a red/breaker + 7 (RD). Dvacet pg RNA bylo naneseno do každé dráhy. RNA byla rozdělena na agarozovém gelu a přenesena na nylonovou membránu. Bloty byly hybridizovány se sondami popsanými napravo, promyty na konečnou stringenci O,1XSSC při 65°C a použity k exponování rentgenových filmů. Pro kontrolu nanášení byl u každého blotu použit ribosomální genový klon 26S ze sóji. Značky - a { ukazují pozice endogenní TBG4 a antisense mRNA. na levé straně ukazují pozici rajčatové 27S rRNA. Dráhy 2-8 korespondují s transgeními liniemi 2-8 na obrázcích 11A-E. B. Graf zobrazující hladiny mRNA v liniích 2-8. Autoradiodrafy byly skenovány denzitometrem a hladiny TBG4 mRNA byly normalizovány na kontrolu nanášení. Hladiny TBG4 mRNA jsou vyneseny v bezrozměrných jednotkách.