CZ20004569A3 - Způsob přípravy expresního vektoru k produkci terapeutických proteinů v transgenních zvířatech - Google Patents
Způsob přípravy expresního vektoru k produkci terapeutických proteinů v transgenních zvířatech Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20004569A3 CZ20004569A3 CZ20004569A CZ20004569A CZ20004569A3 CZ 20004569 A3 CZ20004569 A3 CZ 20004569A3 CZ 20004569 A CZ20004569 A CZ 20004569A CZ 20004569 A CZ20004569 A CZ 20004569A CZ 20004569 A3 CZ20004569 A3 CZ 20004569A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- vector
- erythropoietin
- expression
- expression vector
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 115
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 34
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims description 25
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 42
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 30
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 26
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000005862 Whey Substances 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 241000169093 Tacca Species 0.000 claims 2
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims 1
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 29
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 8
- 238000009434 installation Methods 0.000 abstract description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 abstract description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 abstract description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 46
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 43
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 25
- 101710087237 Whey acidic protein Proteins 0.000 description 23
- 101150059663 WAP gene Proteins 0.000 description 17
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 14
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 9
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 9
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 9
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 101100333654 Homo sapiens EPO gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101150002621 EPO gene Proteins 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001173 gonocyte Anatomy 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000000468 rubriblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 101100448340 Arabidopsis thaliana GG3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 101100007538 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cpc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000006288 alpha thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 230000000463 effect on translation Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- 210000004265 eukaryotic small ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000006543 gametophyte development Effects 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000581 polycythemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108010087945 whey acidic proteins Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Způsob přípravy expresního vektoru k produkci terapeutických proteinů v transgenních zvířatech
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy expresních vektorů využitelných k produkci terapeutických proteinů v mléčné žláze transgenních zvířat. Zejména vektorů konstruovaných pomocí takové modifikace nukleotidové sekvence, při které je cíleně instalováno restrikční místo v oblasti translačního konsenzu Kozákové mezi nukleotidy -9 až +4. Zavedení nového restrikčního místa v tomto místě genu umožňuje definované a univerzální propojení 5'koncového úseku regulačního genu řídícím genovou expresi zvoleného strukturního genu kódujícího primární aminokyselinovou (AK) strukturu terapeutického proteinu.
Dosavadní stav techniky
Transgenní protein - erythropoetin
S mezidruhovým přenosem genů se otevřela cesta k izolaci terapeuticky významných lidských proteinů z organizmů, do jejichž genomu byla vpravena funkční lidská deoxyribonukleová kyselina (DNA) nesoucí genetickou informaci. Transkribce přeneseného řetězce DNA s lidským genem vede k syntéze cizorodé „messenger“ ribonukleové kyseliny (mRNA), která je následnou translací přepsána do původní struktury lidského proteinu. Takové proteiny, které nacházejí využití v medicíně, bylo možné dříve získávat jen nákladnou izolací z lidského materiálu. Nyní je lze izolovat ze zvířecích produktů ve větším množství. Tímto způsobem je možné kromě proteinů lidského původu s původními vlastnostmi vytvářet genovou manipulací nové výhodnější varianty takových proteinů s výhodnějšími terapeutickými vlastnostmi, či menšími vedlejšími účinky jako např. „humanizované“ protilátky, což jsou hybridní imunoglogulinové proteiny, jejichž variabilní část zvířecího původu je propojena s konstantní částí lidského imunoglobulinů.
• · 0 0 0·· · · · · • · · · · · · 0
00 0 Φ00000
000 ·· 00··
000 00 ··· 0000 ·· ,0 0
Jedním z řady lidských proteinů, které začaly být produkovány v savčích tkáňových kulturách in vitro a nebo izolovány ze zvířecích produktů in vivo, je lidský glykoprotein erythropoetin (EPO). Je to kyselý glykoprotein s molekulovou hmotností přibližně 34 Kda a vyskytuje se ve formách : α, β,γ, které se vzájemně liší formou glykosylace a jejich asialovými formami, ve kterých je odstraněna koncová cukerná složka. (Dordal,
M. S, Wang, F.F. Goldwasser, E. (1985) The role of carbohydrate in erythropoietin action. Endocrinology, 116:2293-9; Goldwasser, E. Kung, C.K. Eliason, J. (1974) The role ofsialic acid in erythropoietin action. J. Biol. Chem, 249:4202-6; Goto, M. Murakami, A. Akai, K. Kawanishi, G. Ueda, M. Chiba, H. Sasaki, R. (1989) Characterization and use of monoclonal antibodies directed against human erythropoietin that recognize different antigenic determinants. Blood, 74:1415-23;
Lukowsky, W.A. Painter, R.H. (1972) Studies on the role ofsialic acid in the physical and biological properties of erythropoietin. Can. J. Biochem, 50:909-17; Miyake, T Kung, C.K. Goldwasser, E. (1977) Purification of human erythropoietin. J. Biol. Chem, 252:5558-64; Takeuchi, M. Inoue,
N. Strickland, T.W. Kubota, M. Wada, M. Shimizu, R. Hoshi, S. Kozutsumi, H. Takasaki, S. Kobata, A. (1989) Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proč. Nati.
Acad. Sci. USA, 86:7819-22; Takeuchi, M. Takasaki, S. Shimada, M. Kobata, A. (1990) Role of sugar chains in the in vitro biological activity of human erythropoietin produced in recombinant Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem, 265:12127-30; Tsuda, E. Kawanishi, G. Ueda, M. Masuda, S. Sasaki, R. (1990) The role of carbohydrate in recombinant human erythropoietin. Eur. J. Biochem, 188:405-11).
Erythropoetin je schopen stimulovat přeměnu primitivních zárodečných buněk v kostní dřeni na proerythroblasty, které postupně dozrávají, syntetizují hemoglobin a jsou uvolňovány do krevního oběhu jako červené krvinky.(Erslev, A. (1953) Humoral regulation ofred cell production. Blood, 8:349-357).
• ·
Erythropoetin je v plazmě přítomen ve velmi nízkých koncentracích. Přesto je tato normální nízká koncentrace dostatečná ke stimulaci náhrady červených krvinek podléhajících fyziologickému rozpadu.
(Fried, W. (1972) The liver as a source of extrarenal erythropoietin production. Blood, 40:671-7; Jacobson, L.O. Goldwasser, E. Plzak, L.F. Fried, W. (1957) Studies on erythropoiesis Part IV. Reticulocyte response of hypophysectomized and polycythemic rodents to erythropoietin. Proč. Soc. Exp. Biol. Med, 94:243-249; Zanjani, E.D. Ascensao, J.L. McGlave, P.B. Banisadre, M. Ash, P.C. (1981) Studies on the liver to kidney switch of erythropoietin production. J. Clin. Invest, 67:1183-1188). Množství erythropoetinu se zvětšuje při nedostatku kyslíku v případě, že je snížen přenos kyslíku červenými krvinkami, jako odpověď na stress hypoxické tkáně (Beru, N. McDonald, J. Lacombe, C. Goldwasser, E. (1986) Expression ofthe erythropoietin gene. Mol. Cell. Biol, 6:2571-5; Bondurant, M.C. Koury, M.J. (1986) Anemia induces accumulation of erythropoietin mPNA in the kidney and liver. Mol. Cell. Biol, 6:2731-3; Lacombe, C. Da Silva, J.L. Bruneval, P. Fournier, J.G. Wendling, F. Casadevall, N. Camilleri, J.P. Bariety, J. Varet, B. Tambourin, P (1988) Peritubular celíš are the site of erythropoietin synthesis in the murine hypoxic kidney. Clin. Invest, 81: 620-623;
Zanjani, E.D. Peterson, E.N. Gordon, A.S. Wasserman, L.P. (1974) Erythropoietin production in the fetus: role ofthe kidney and matemal anemia J. Lab. Clin. Med, 83:281-7; ShusterSJ, et al. 1987). Díky svým účinkům je erythropoetin vhodným prostředkem pro diagnostiku a léčbu krevních poruch charakterizovaných defektní tvorbou červených krvinek. Nukleotidová sekvence lidského erythropoetinu byla získána a publikována autory (Jacobs, K. Shoemaker, C. Pudersdorf, P. Neill, S.D. Kaufman, P.J. Mufson, A. Seehra, J. (1985) Isolation and characterization ofgenomic and cDNA dones ofhuman erythropoietin. Nátuře, 313:806-10; Lin, F.K. Suggs, S. Lin, C.H. Browne, J.K. Smalling, P. Egrie, J.C. Chen, K.K. Fox, G.M. Martin, F. Stabinsky, Z. (1985) Cloning and expression of the human erythropoietin gene. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82:7580-4). Biologicky aktivní erythropoetin byl v • · · · · · · ···· • · · ····· • · · · ······ ··· · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ·· podmínkách in vitro nejprve připraven na stabilně transfekovaných jaterních buňkách afrického kočkodana (Green Monkey) (Jacobs, K. Shoemaker, C. Rudersdorf, R. Neill, S.D. Kaufman, R.J. Mufson, A. Seehra, J. (1985) Isolation and characterization ofgenomic and cDNA dones of human erythropoietin. Nátuře, 313:806-10) a vaječníkových buňkách čínského křečka (CHO) (Lin, F.K. Suggs, S. Lin, C.H. Browne, J.K. Smalling, R. Egrie, J.C. Chen, K.K. Fox, G.M. Martin, F. Stabinsky, Z. (1985) Cloning and expression ofthe human erythropoietin gene. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82:7580-4). Později byl izolován i z dalších savčích systémů jako transformovaných lidských fetáních jaterních buněk (Browne, J.K. Cohen, A.M. Egrie, J.C. Lai, P.H. Lin, F.K. Strickland, T. Watson, E. Stebbing, N. (1986) Erythropoietin: gene cloning, protein structure, and biological properties. Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol, 1:693-702), v B-lymfoblastoidních buňkách (Yanagi, H. Yoshima, T. Ogawa, I. Okamoto, M. (1989) Recombinant human erythropoietin DNA produced by Namalwa cells. DNA, 8:419-27), Buněk melanomu (Keay, L. Walsh, J.M. Buchholz, R.M. Terando, J.M. (1990) Production of recombinant human erythropoietin in Bowes melanoma cells in suspension culture. Appl. Microbiol. Biotechnol, 34:198-202) a jaterních buňkách křečka (Brody VC etal.1988; Dube, S. Fisher, J.W. Powell, J.S. (1988) Glycosylation at specific sites of erythropoietin is essential for biosynthesis, secretion, and biological function. J. Biol. Chem, 263:17516-21; Powell, J.S. Berkner, K.L. Lebo, P.V. Adamson, J.W. (1986) Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells and chromosome localization. Proč. Natí. Acad. Sci. USA, 83:6465-9; Tsuda, E. Goto, M. Murakami, A. Akai, K. Ueda, M. Kawanishi, G. Takahashi, N. Sasaki, P. Chiba, H. Ishihara, H. (1988) Comparative structural study ofN-linked oligosaccharides of urinary and recombinant erythropoietins. Biochemistry, 27:5646-54). Pokud je gen pro erythropoetin vpraven do buněk bezobratlých nebo prokaryontních organizmů, tak jako hmyzích buněk (Quelle, F.W. Caslake, L.F. Burkert, P.E. Wojchowski, D.M. (1989) High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin • · · • · • · · « · · produced using a baculovirus vector. Blood, 74:652-7), bakterií (íeeHuang, S. (1984) Cloning and expression ofhuman erythropoietin cDNA in Escherichia coli. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81:2708-12), nebo kvasinek (Elliott, S. Giffín, J. Suggs, S. Lau, E.P. Banks, A.R. (1989) Secretion of glycosylated human erythropoietin from yeast directed by the alpha-factor leader region. Gene, 79:167-80), postrádá cukerné struktury, které jsou v nativním stavu přítomné na lidském hormonu izolovaného ze savčích transfekovaných buněk.Většina studií využívá k expresi genu pro erythropoetin transfekované ovariální buňky čínského křečka (CHO) (Browne, J.K. Cohen, A.M. Egrie, J.C. Lai, P.H. Lin, F.K. Strickland, T. Watson, E. Stebbing, N. (1986) Erythropoietin: gene cloning, protein structure, and biological properties. Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol, 1:693-702; Davis, J.M. Arakawa, T. Strickland, T.W. Yphantis, D.A. (1987) Characterization of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Biochemistry, 26:2633-8; Delorme, E. Lorenzini, T. Giffín, J. Martin, F. Jacobsen, F. Boone, T. Elliott, S. (1992) Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin. Biochemistry, 31:9871-6; Recny, M.A. Scoble, H.A. Kim, Y. (1987) Structural characterization of natural human urinary and recombinant DNA-derived erythropoietin. Identification of des-arginine 166 erythropoietin. J. Biol. Chem, 262:17156-63; Sasaki, H. Bothner, B. Dell, A. Fukuda, M. (1987) Carbohydrate structure of erythropoietin expressed in Chinese hamster ovary cells by a human erythropoietin cDNA J. Biol. Chem, 262:12059-76; Sasaki, H. Ochi, N. Dell, A. Fukuda, M. (1988) Site-specific glycosylation ofhuman recombinant erythropoietin: analysis of glycopeptides orpeptides at each glycosylation site by fast atom bombardment mass spectrometry. Biochemistry, 27:8618-26; Takeuchi, M. Inoue, N. Strickland, T.W. Kubota, M. Wada, M. Shimizu, R. Hoshi, S. Kozutsumi, H. Takasaki, S. Kobata, A. (1989) Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86:781922).V buňkách CHO je exprimovaný rekombinantní erythropoetin glykosylován podobně jako v lidských buňkách, proto jsou CHO buňky využívány k produkci erythropoetinu použitelného ve farmacii (Browne, J.K. Cohen, A.M. Egrie, J.C. Lai, P.H. Lin, F.K. Strickland, T. Watson, E. Stebbing, N. (1986) Erythropoietin: gene cloning, protein structure, and biological properties. Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol, 1:693-702; Egrie, J.C. Browne, J. Lai, P. Lin, F.K. (1985) Characterization of recombinant monkey and human erythropoietin Prog. Clin. Biol. Res, 191:339-50). Hlavní nevýhoda současného způsobu přípravy erythropoetinu spočívá v obecně vysoké finanční i pracovní náročnosti práce s tkáňovými kulturami, která se pak odráží ve výsledné vysoké ceně rekombinantního erythropoetinu. Z hlediska požadavků na výši produkce je erythropoetin produkovaný v mléčné žláze myši a králíka vhodným modelovým proteinem pro ověření námi navrhované strategie pro přípravu a testování funkce genových konstruktů. Jelikož ke stimulaci přeměny primitivních zárodečných buněk v kostní dřeni na proerythroblasty nejsou zapotřebí relativně vysoké dávky lidského erythropoetinu, je v tomto konkrétním případě a v případě dalších podobně účinných stimulačních faktorů transgenní králík nejen optimálním testovacím, ale současně i cílovým produkčním organizmem.
Přenos DNA
Pro přenos cizorodé DNA do savčích buněk a následné produkci transgenních zvířat se nejčastěji využívá metoda mikroinjekce geneticky manipulované DNA do samčího prvojádra oplozeného oocytu (Brínster, R.L. Chen, H.Y. Trumbauer, M.E. Avarbock, M.R. (1980) Translation of globin messenger RNA by the mouše ovum. Nátuře, 283:499-501; Brehm, G. Brenic, H.M. Goodman, R.C. Selden, F. Kraublish, H. (1985) Production of transgenic mice, rabbits and pigs by microinjection into pronuclei Zuchthygiene, 20: 251-252; Costantini, F. Lacy, E. (1982)
Gene transfer into the mouše germ-line. J. Cell. Physiol. Suppl, 1:21926; Gordon, J.W. Ruddle, F.H. (1981) Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouše pronuclei. Science, 214:12446 ·· · · • · 4 4 4 4
4 4 4 4
4 4 · · « • · · · · · · · « · ··
6; Hogan, B. Constantini, Lacy Ε (1986) Manipulating the mouše embryo, laboratory manual. N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory), nebo se k přenosu využije takový přístup, kdy se nejprve oplozené savčí oocyty zbaví jádra (tzv. enukleace oocytů) a pak se do nich vpraví buněčné jádro přenosem z normálních nebo geneticky manipulovaných savčích buněčných linií, a to zejména pluripotentních embryonálních kmenových (ES) buněk nebo terminálně diferencovaných, avšak reprogramovatelných jader fibroblastoidního původu (metoda nukleární transplantace, součást tzv. klonování) (McGrath, J. Solter, D. (1983) Nuclear transplantation in the mouše embryo by microsurgery and cell fusion. Science, 220:1300-2; McGrath, J. Solter, D. (1983) Nuclear transplantation in mouše embryos. J. Exp. Zool, 228:355-62; McGrath, J. Solter, D. (1984) Maternal Thp lethalityin the mouše is a nuclear, not cytoplasmic, defect. Nátuře, 308:550-1; McGrath, J. Solter, D. (1984) Completion of mouše embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell, 37:179-83; Surani, M.A. Bartoň, S.C. (1983) Development of gynogenetic eggs in the mouše: implications for parthenogenetic embryos. Science, 222:1034-6; Surani, M.A. Bartoň,
S.C. Norris, M.L. (1984) Development of reconstituted mouše eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nátuře, 308:548-50). Při použití obou způsobů je přenesena exogenní DNA do buněčného jádra, kde je jadernými reparativními mechanismy náhodně zabudována do hostitelského genomu. Tímto způsobem není možné kontrolovat místo integrace v genomu hostitele ani počet vnesených kopií zvoleného genu. Výhodou metody využívající nukleární transplantace je možnost identifikovat a genomově charakterizovat klon vhodný k přípravě transgenního zvířete již při in vitro kultivaci transfektovaných buněk. Tím odpadne časová ztráta vzniklá nutnou generační dobou potřebnou k vyhledání pozitivních transgenních jedinců běžně získaných mikroinjikační technikou.To vede k zefektivnění přípravy transgenního zvířete, neboť odpadne rozsáhlé testování mnoha narozených jedinců.
Dokonalejší alternativou vpravování exogenní DNA do genomu hostitele je využití cíleného vpravení genomového fragmentu využitím homologní rekombinace mezi genovým lokusem genomu savčí embryonální kmenové buňky (nebo savčího fibroblastu) a cizorodou rekombinantní DNA ve formě vektoru. Jadernými enzymy navozená rekombinace vede k zacílení mutace do genomu s kontrolou místa integrace a počtu vložených kopií. (Doetschman, T. Gregg, R.G. Maeda, N. Hooper, M.L. Melton, D.W. Thompson, S. Smithies, O. (1987) Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouše embryonic stem celíš Nátuře, 330:576-8; Mansour, S.L. (1990) Gene targeting in murine embryonic stem celíš: introduction ofspecific alterations into the mammaiian genome. Genet. Anai. Tech. Appi, 7:219-27; Robertson, E.J. (1991) Using embryonic stem celis to introduce mutations into the mouše germ line. Biol. Reprod, 44:238-45). Tímto přístupem lze cíleně směrovat transgen nebo kontrolované vpravovat mutaci pro ztrátu funkce endogenu, tzv. „gene knock-out„.
Konstrukce expresních vektorů pro produkci proteinů v mléčné žláze
Klíčovým krokem při přípravě geneticky manipulovaných zvířat je sestrojení expresního vektoru pocházejícího z bakteriální plasmidové DNA, ke které se připojí požadovaný savčí gen, určený k produkci terapeutického proteinu. K navození genomové exprese jsou připojeny ke kódujícím sekvencím manipulovaného genu další sekvence DNA pocházející ze savčích genů specificky exprimovaných v dané tkáni. Výsledný expresní vektor je tak velice komplexní molekula DNA, kde jsou propojeny jednotlivé části rozdílného původu v jeden funkční celek. Způsob, jakým se vyjádří strukturní gen, závisí na vzájemných interakcích s okolím místa integrace v genomu příjemce a na funkčnosti připojených společně přenesených regulačních sekvencích.
Pro produkci cizorodých transgenních proteinů s terapeutickým využitím v humánní medicíně je vhodným orgánem mléčná žláza savců. Z tohoto důvodu se zájem soustředil na studium regulačních oblastí genů, které kódují důležité mléčné proteiny, jako jsou pLactoglobulin, aLactalbumin pCasein a kyselý protein mléčné syrovátky (WAP). Regulační sekvence těchto genů jsou používané ke konstrukci expresních vektorů, k řízení produkce cizorodých genů v mléčné žláze zvířat. Pro přípravu transgenního zvířete je používán obvykle gen, jehož produkt v mléce daného druhu zvířete tvoří hlavní proteinovou složku a současně je v organizmu zvířete produkován specificky pouze v mléčné žláze. (Devinoy, E. Hubert, C. Jolivet, G. Thépot, D. Clergue, N. Desaleux, M. Dion, M. Servely, J.L. Houdebine, L.M. (1988) Recent data on structure ofrabbit milk protein genes and on the mechanism ofthe hormonal control of their expression . Reprod. Nutr. Develop, 28:1145-64; Hennighausen, L.G. Sippel, A.E. (1982) Characterization and cloning of the mRNAs specific for the iactating mouše mammary gland. Eur. J. Biochem, 125:131-41; Hobbs, A.A. Richards, D.A. Kessler, D.J. Rosen, J.M. (1982) Complex hormonal regulation ofrat casein gene expression. J. Biol. Chem. 257:3598-605). Výběr regulační oblasti genu pro mléčný protein, která bude využita v konstrukci expresního vektoru, se tak obvykle řídí typem cílového produkčního zvířete. Dominantním proteinem produkovaným specificky v mléčné žláze myši a králíka a dalších hlodavců je (WAP) ( Campbell, S.M. Rosen, J.M. Hennighausen,
L.G. Střech-Jurk, U. Sippel, A.E. (1984) Comparison ofthe whey acidic protein genes ofthe rat and mouše. Nucleic. Acids. Res, 12:8685-97. Grabowski, H. Le Bars, D. Chene, N. Attal, J. Maliénou-N'Gassa, R. Puissant, C. Houdebine, L.M. (1991) Rabbit whey acidic protein concentration in milk, sérum, mammary gland extract and culture medium. J. Dairy Sci. 74: 4143-54; Hennighausen, L.G. Sippel, A.E. Hobbs, A. A. Rosen, J.M. (1982) Comparative sequence analysis ofthe mRNAs coding for mouše and rat whey protein. Nucleic Acids Res. 10:3733-44; Piletz, J.E. Heinlen, M. Ganschow, R.E. (1981) Biochem ical characterization of a novel whey protein from murine milk. Biol. Chem, 256:11509-16). Regulační sekvence tohoto genu jsou proto vhodné pro přípravu expresních vektorů kontrolujících produkci proteinů v mléčné » ·« · • · » · • · žláze těchto zvířat ( Kolb, A.F. Gunzburg, W.H. Albang, R. Brém, G. Erfle, V. Salmons, B. (1994) Negative regulátory element in the mammary specific whey acidic protein promotér. Cell. Biochem. 56:24561). V současné době již byla úspěšně klonována celá řada genů do různých expresních vektorů s promotorovými sekvencemi mléčných proteinů včetně vektorů, kde jsou využity regulační sekvence z WAP genu (Andres, A.C. Shoenenberger, C.A. Groner, B. Hennighausen, L. LeMeur, M. Gerlinger, P. (1987) Ha -ras oncogene expression directed by a milk protein gene promotér: tissue specificity, hormonal regulation and tumor induction in transgenic mice. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84:1299-1303;; Devinoy, E. Thépot, D. Stinnakre, M.G. Fontaine,M. L. Grabowski, H. Puissant, C. Pavirani, A. Houdebine, L.M. (1994) High level production of human growth hormone in the milk of transgenic mice: the upstream region ofthe rabbit whey acidic protein (WAP) gene targets transgene expression to the mammary gland. Transgenic. Res, 3:79- 89; Gordon, K. Lee, E. Vitale, J.A. Smith, A.E. Westphal, H. Hennighausen, L. (1992) Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouše milk Biotechnology, 24:425-8; Gunzburg, W.H. Salmons, B. Zimmermann, B. Muller, M. Erfle, V. Brém, G. (1991)
A mammary -specific promotér directs expression of growth hormone not only to the mammary gland, but also to Bergman glia celíš in transgenic mice. Mol. Endocrinol, 5:123-33; Limonta, J. Pedraza, A. Rodriguez, A. Freyre, F.M. Barral, A.M. Castro, F.O. Lleonart, R. Gracia, C.A, Gavilondo, J.V, de la Fuente, J. (1995) Production of active anti-CD6 mouse/human chimeric antibodies in the milk of transgenic mice. Immunotechnology, 1:107-13; Limonta, J.M. Castro, F.O. Martinez, R. Puentes, P. Ramos, B. Aguilar, A. Lleonart, R.L. de la Fuente, J. (1995) Transgenic rabbits as bioreactors for the production of human growth hormone. J. Biotechnol, 40:49-58; Pittius C. W. Heninghausen, L. Lee, E. Westphal, H. Nichols, E. Vitale, J. Gordon, K. (1988) A milk protein gene promotér directs the expression of human tissue plasminogen activator cDNA to the mammary gland in transgenic mice. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 5874-8; Reddy, V.B. Vitale, J.A. Wei, C. Montaya -Zavala, M.
• * ··< 9 9
Štice, S.L. Balise, J. Robi, J.M. (1991) Expression ofHuman Growth Hormone in the milk oftransgenic mice. Animal Biotechnology, 2:15-29; Thepot. D. Devinoy, E. Fontaine, M.L. Stinnakre, M.G. Massound, M. Kann, G. Houdebine, L.M. (1995) Rabbit wheyacidic protein gene upstream region Controls high -level expression ofbovine growth hormone in the mammary giand of transgenic mice. Mol. Reprod. Dev, 42: 261-7; Tomasetto, C. Wolf, C. Rio, M.C. Mehtali, M. LeMeur, M. Gerlinger, P. Chambon, P. Lathe, R. (1989) Brest Cancer Protein PS2 Synthesis in Mammary Giand of Transgenic Mice and secretion into Milk. Mol. Endocrinol, 89:1579-84; Velander, W.H. Page, R.L. Morcol, T. Russeíl, C.G. Canseco, R. Young, J.M. Drohan, W.N. Gwazdauskas,
F.C. Wilkins, T.D. Johnson, J.L. (1992) Expression ofhuman protein C in the milk of transgenic mice and pigs. Ann. Ν. Y. Acad. Sci, 665:391-403; Yu, S.H. Deen, K.C. Lee, E. Hennighausen, L. Sweet, R.W. Rosenberg,
M. Westphal, H. (1989) Functional human CD4 protein produced in milk of transgenic mice. Mol. Biol. Med, 6:255-61) Hlavní významné sekvenční motivy účastnící se v procesu regulace transkribce byly lokalizovány v oblasti do vzdálenosti 6,3kb od startovního kodonu ATG (Devinoy, E. Malienou -N'Gassa, R. Thepot, D. Puissant, C. Houdebine, L.M. (1991) Hormone responsive elements within the upstream sequences of the rabbit whey acidic protein (WAP)gene direct chloramphenicol acetyl transferase (CAT) reportér gene expression in transfected rabbit mammary celis Mol. Cell. Endocrinol. 81:185-93). Podobným způsobem, s využitím stejných regulačních oblastí, byly konstruovány i vektory k zajištění exprese strukturního genu pro hEPO. (Aguirre, A. Castro-Palomino, N. De la Fuente, J. Castro, F.O. (1998) Expression ofhuman erythropoietin and ofthe endogenous WAP gene in the mammary giand of transgenic rabbits during gestation and lactation. Transgenic. Res, 4:311-7; Massoud, M. Attal, J. Thepot, D. Pointu, H. Stinnakre, M.G. Theron, M.C. Lopez, C. Houdebine, L.M. (1996) The deleterious effects ofhuman erythropoietin gene driven by the rabbits whey acidic protein gene promotér in transgenic rabbits. Reprod. Nutr. Dev, 36, 555-63; Rodriguez, A. Castro, F.O. Aguilar, A. Ramos, B. Del
0 000 0 0Λ 99 99
0 · 0 0 0 0 9 9 9 9 · 0 0 0 0 0 0 • 00 0 000000
000 00 0000
000 00 0000000 00 00
Barco, D. G. Lleonart, R. De la Fuente, J. (1995) Expression ofactive human erythropoietin in mammary gland oflactating transgenic mice and rabbits. Biol. Res, 28:141- 53). Ukazuje se, že v řadě případů fungují regulační oblasti stejně dobře a někdy i lépe v organizmu živočišného druhu odlišného původu, než z kterého pochází gen pro mléčný protein. Důvodem je především skutečnost, že důležitou roli z hlediska kvantity a specifity produkce proteinu hraje počet integrovaných kopií a transkribční aktivita chromatinu v místě integrace. Významnou roli hrají i další regulační sekvence v intronech a ve 3'koncové oblasti (Dále, T.C. Krnacik, M.J. Schmidhauser, C. Yang,C.L-Q. Bissell, M.J. Rosen, J.M. (1992) High- level Expression of the rat Whey acidic protein gene is mediated by elements in the promotér and 3'untranslated region. Mol. And Cell. Biol. 12: 905-914) a také ve větší vzdálenosti proti proudu od ATG (Bischoff, R. Degryse, E. Perraund, F. Dalemans, W. Ali-Hadji, D. Thepot, D. Devinoy, E. Houdebine, L.M. Pavirani, A., (1992) A 17.6 kbp region located upstream of the rabbit WAP gene directs high level expression of a functional human proteinvariant in mose milk. FEBS Letí, 6:265- 8). Tyto regulační sekvence mohou významně ovlivnit jak úroveň exprese, tak pozměnit její tkáňovou specifitu. Introny však mají vliv na expresi genu i v případě, že regulační sekvence neobsahují, jelikož expresní vektory tvořené genomovými sekvencemi genů s introny mají obyčejně vyšší hladiny exprese, než je tomu u vektorů konstruovaných na základě genů přepsaných pomocí reverzní transkribce z mRNA (cDNA) (Brinster, R.L. Allen, J.M. Behringer, R.R. Gelinas, R.E. Palmiter, R.D. (1988) Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proč. Nati. Acad. Sci. US A, 85:836-40; Choi, T. Huang, M. Gorman, C. Jaenisch, R. (1991) A generic intron increases gene expression in transgenic mice. Mol. Cell. Biol, 11:3070-4; Palmiter, R.D. Sandgren,
E.P. Avarbock, M.R. Allen, D.D. Brinster, R.L. (1991) Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:478-82). Na druhou stranu mohou introny pocházející z genu hEPO obsahovat regulační elementy s negativním regulačním účinkem (silencery), které mohou transkribční aktivitu genů tlumit.
• ·♦ • ♦ ·· ·· ·· • ·· · · « · · · • · · · · · · • · · ······ • · · · · · · · ·* ······· ·· ··
Výsledky různých autorů přinášejí celou řadu poznatků, ze kterých nelze v současné době vyvodit jednoznačné závěry. Ukazuje se, že oblast promotoru do vzdálenosti 6,3-kb proti proudu od ATG obsahuje hlavní regulační elementy, které jsou schopné vzájemně s regulačními sekvencemi intronů a 3'nepřekládané oblasti WAP genu zabezpečit vysokou a tkáňově specifickou expresi. Pokud je však strukturní oblast WAP genu nahrazena strukturní genomovou částí, nebo (cDNA) jiného genu, dochází obyčejně ke snížení exprese, která je do značné míry závislá na transkribční aktivitě chromatinu v okolí místa integrace a na počtu kopií transgenu v genomu. Často také dochází ke změně tkáňové specifity vedoucí k nežádoucí (ektopické) expresi přeneseného genu i v dalších tkáních mimo mléčnou žlázu. Tak může cizorodý protein negativně ovlivnit zdravotní stav zvířete (Massoud, M. Attal, J. Thepot, D. Pointu, H. Stinnakre, M.G. Theron, M.C. Lopez, C. Houdebine, L.M. (1996) The deleterious effects of human erythropoietin gene driven by the rabbits whey acidic protein gene promotér in transgenic rabbits. Reprod. Nutr. Dev, 36, 555-63.) Základním požadavkem na expresní vektory, které jsou používány ke genovým manipulacím u vývojově vyšších organizmů, je vedle výše produkce požadovaného proteinu také zacílení exprese genu určeného pro produkci požadovaného proteinu do dané tkáně hostitelského zvířete. Společným znakem vektorů, které využívají promotorové sekvence králičího genu pro WAP k řízení exprese genu pro lidský erythropoetin, je, že strukturní gen pro erythropoetin ve formě genomové DNA nebo cDNA sekvence je vklonován do místa mezi kódující sekvence strukturního genu WAP. Výhodou je, že není nijak narušena regulační funkce 5'koncové oblasti genu WAP a že introny řídícího genu se mohou podílet na kontrole genové exprese. Profil exprese lidského erytropoetinu v mléčné žláze králíka by měl odpovídat přirozené expresi genu pro WAP.
Značnou nevýhodou většiny takových vektorů je skutečnost, že při spojení genů dochází k produkci fúzního proteinu. Nelze předem odhadnout, jaký vliv mohou mít aminokyseliny části WAP na aktivitu lidského erytropoetinu a jaký vliv by měly na aktivitu erythropoetinu • · · 9 • ·
9
9 ·
• * • · • ·· technologické postupy zaměřené na jejich odstranění. Těmto komplikacím lze předejít způsobem podle vynálezu pro konstrukci hybridních vektorů pro přípravu transgenních zvířat využitím zabudování restrikčního motivu pro místa Notl a Ncol do sekvenčního konsenzu Kozákové. Z těchto důvodu jsou tyto vektory dále vyvíjeny a jsou současně hledány a připojovány další sekvenční motivy a možnosti propojení genových částí, jak bylo navrženo i původci tohoto vynálezu, které mohou ovlivnit transkribční a translační aktivitu vnesené DNA v genomu hostitele a její překlad do RNA.
Konsensus Kozákové pro translační iniciační místo
Model pro mechanismus regulace translace u eukaryot, tzv. „scanning mechanism for initiation of translation“, byl navržen Marylin Kozákovou před více než 20 lety (Kozák, M. Shatkin, A.J. (1978) Identification of features in 5' terminál fragments from retrovirus mRNA which are important forribosome binding. Cell,13:201-12; Kozák, M. Shatkin, A.J. (1979) Characterization of translational initiation regions from eukaryotic messenger RNAs. Methods. Enzymol, 60:360-75). Tento model předpokládá, že malá podjednotka eukaryotického ribosomu (40S), která nese RNA s navázaným methioninem (Met-RNA), se nejprve váže k 5’konci metylací upravené messenger RNA, a poté migruje po RNA molekule až po dosažení úvodního „favorizovaného“ kodonu AUG (triplet adenin -uráčil -thymin), kdy se migrace zastaví a zahájí se vlastní proces translace. Tento model postuluje nutnost dvou základních faktorů pro výběr favorizovaného prvního AUG, a to jednak pozici v blízkosti 5’konce RNA a dále kontext, tedy informační obsah sekvencí v blízkosti startovního AUG. Důkaz „pravidla pro první AUG“ byl demonstrován Kozákovou v roce1987, kdy analýzou sekvencí v okolí startovního AUG u 699 RNA různých obratlovců dokázala, že „pravidlo pro první AUG“ platí pro 90-95% testovovaných typů RNA a kdy poprvé představila nukleotidový sled GCCGCCA/GCCAUGG za sekvenční konsesnsus pro iniciaci translace u vyšších eukaryot (Kozák, M. (1987) At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in • · 4 · • · mammalian cells. J. Mol. Biol, 196:947-50) (viz Příloha 1). V dalších experimentech s použitím místně-směrované mutageneze na modelu genu pro preproinsulin vnášeným do opičích CV-1 buněk ledvin transformovaných mutantním virem SV-40 (COS) buněk ukázala Kozáková význam pozic G+4 a dalších nukleotidů v sekvenčním konsensu v pozicích -1 až -6 (Kozák, M. (1986) Bifunctional messenger RNAs in eukaryotes. Cell, 47:481-3; Kozák, M. (1986) Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes. Proč. Nati. Acad. Sel. USA, 83:2850-4; Kozák, M. (1987) At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol, 196:947-50; Kozák, M. (1980) Influence of mRNA secondary structure on binding and migration of40S ribosomal subunits. Cell, 19:79-90). Důležitost purinu v pozici -3 byla vedle cílené mutageneze potvrzena objevem typu thalassemie, u které změna v sekvenci z CACCAUG na CCCCAUG drasticky potlačuje iniciaci translace a-globinu ( Morlé, F. Lopez, B. Henni, T. Godet, J. (1985) alpha-Thalassaemia associated with the deletion oftwo nucleotides at position -2 and -3 preceding the AUG codon. EMBO J, 4:1245-50). Purin v pozici -3 (obvykle A) je nejkonzervativnějším nukleotidem u všech eukaryotických RNA včetně obratlovců, a dále u hub (Paluh, J.L. Orbách, M.J. Legerton, T.L. Yanofsky, C. (1988) The cross-pathway control gene of Neurospora crassa, cpc-1, eneodes a protein similarto GCN4 ofyeast and the DNA-binding domain of the oneogene v-jun-eneoded protein. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85:3728-32.) a rostlin ( Heidecker, G. Messing, J. (1987) A method for cloning full-length cDNA in plasmid vectors. Methods. Enzymol, 154: 28-41). Cílená mutace v pozici -3 ovlivňuje translaci více než bodová mutace kteréhokoli jiného nukleotidu v sekvenčním konsensu (Kozák, M. (1986) Influences ofmRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:2850-4). Dalšími studiemi bylo zjištěno, že je-li přítomen adenin v pozici -3, mají již pozice dalších nukleotidů jen vedlejší vliv na účinnost iniciace translace, avšak v nepřítomnosti purinu v pozici -3 je pro účinnou translaci kritická přítomnost guaninu G+4 a « ·« · «« ·· • · · · • · · · • 9 9 9
9 9 9
99 zvyšuje se úloha nukleotidů v dalších pozicích, zejména v pozicích -6 a -9 (Kozák, M. (1987) At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammaiian cells. J. Mol. Biol, 196:947-50). Z praktických důvodů navrhla autorka rozlišovat iniciační kodon na silný a slabý dle pozic -3 a +4 ( Kozák, M. (1989) Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eucaryotic cell-free translation systems. Mol. Cell. Biol, 9:5073-80; Kozák, M. (1989) Circumstances and mechanisms ofinhibition of translation by secondary structure in eucaryotic mRNAs. Mol. Cell. Biol, 9:5134-42). Z těchto důvodů je výhodné připravit expresní vektor propojením 5'koncových regulačních sekvencí se strukturním genem v oblasti startovního kodonu adeninthymin-guanin (ATG), jak se povedlo původcům tohoto vynálezu .
Podstata vynálezu
Některé uvedené nevýhody dosavadního stavu, týkající se způsobů konstrukce expresních vektorů a způsobů přípravy rekombinantního erythropoetinu, odstraňuje způsob přípravy expresních vektorů k produkci terapeutických proteinů v transgenních zvířatech podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že ke spojení genového úseku zahrnujícího regulační oblast promotoru s genovým úsekem, který zahrnuje strukturní části genu kódujícího požadovaný protein, využívá sekvenční motiv pro restrikční endonukleázu Not I nebo Ncol. Ten je vytvořený modifikací původního translačního konsenzu Kozákové v oblasti mezi nukleotidy -9 až +4 za vzniku hybridního rekombinantního expresního vektoru k produkci terapeutických proteinů.
Podstata vynálezu dále spočívá v tom, že ke spojení vybraných genových úseků je modifikován translační konsenzus Kozákové genů pro králičí kyselý protein mléčné syrovátky a lidský erythropoetin vložením sekvenčního motivu pro restrikční endonukleázu, zejména Not I v oblasti mezi nukleotidy -9 až +4, za vzniku expresního vektoru • ··· • · · · · · · · • · · · ···©·· © · · · © ···· ©·· ·© ··· ···· ·© ·· prWhEBS-BNX k produkci lidského erythropoetinu v mléčné žláze transgenních organizmů.
Dále podstata vynálezu spočívá v primární nukleotidové struktuře DNA vektoru prWhEBS-BNX, připravené způsobem podle vynálezu, a všech dalších vektorů, které jsou modifikací odvozeny od tohoto původního vektoru prWhEBS-BNX.
Rovněž eukaryontní buňky nesoucí ve svém genomu nukleotidovou primární strukturu hybridních genů pocházejících z expresních vektorů, které jsou připraveny způsobem podle vynálezu, jsou také podstatou vynálezu.
Podstatou vynálezu jsou také transgenní organizmy, nesoucí ve svém genomu nukleotidovou primární strukturu hybridních genů pocházejících z expresních vektorů, připravených způsobem podle vynálezu.
Způsob přípravy expresních vektorů podle vynálezu využívá skutečnost, že motiv kódující aminokyselinu methionin je univerzálním tripletem pro všechny eukaryotické geny a dále, že pro sekvenční motiv Kozákové je známý tzv. optimalizovaný sekvenční konsensus pro nejúčinnější translační účinnost. Tyto skutečnosti daly vzniknout myšlence, že by bylo možné připravit univerzálně použitelnou sekvenci blízkou optimální variantě s uměle instalovanými restrikčními místy, vhodnými ke klonování expresních vektorů. V takových expresních vektorech by bylo možné propojovat promotorové regulační sekvence přímo s prvním ATG tripletem zvoleného genu.
Z hlediska použitelnosti restrikčních míst pro klonování delších fragmentů jsou konstrukčně zajímavá pouze taková, která se vyskytují v hostitelské genomové DNA pouze vzácně. Jedním z takových enzymů je Ncol, který rozeznává 6ti místné restrikční místo CCATGG, nacházející se také v optimalizované variantě konsensu Kozákové.
• ··«
99 99
9 9 9 9
9 9 9 9
9 9 9 9 9 • · · · 9
999 99 99
Další, ještě výhodnější z hlediska klonování, je restrikční místo Not I (GCGGCCGC, viz Příloha 1), které se zřídka vyskytuje v savčím genomu, a to s průměrnou frekvencí výskytu 1: 106 párů baží. Po zavedení tohoto restrikčního motivu do konsensu Kozákové dojde k minimální modifikaci optimalizovaného konsensu, která podstatně nesníží translační účinnost při syntéze produktu.
Způsob podle vynálezu nápaditě využívá sekvenční motiv Kozákové k cílené modifikaci primární nukleotidové sekvence DNA vedoucí k instalaci restrikčního místa pro Notl nebo Ncol unikátně, nebyl dosud využit a vede k přípravě univerzálního vektoru regulujícího produkci proteinů do mléčné žlázy savce s významně zjednodušenou možností výměny strukturního genu pro produkci zvoleného proteinu. Způsob podle vynálezu tak umožňuje rychlejší přípravu expresního vektoru k produkci řady terapeutických proteinů, což povede k širokému využití v praxi a zkrácení doby nutné pro vývoj expresních vektorů.
Následující příklady provedení slouží lepšímu porozumění vynálezu, aniž by ho však omezovaly.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Subklonovártí 5'oblast genu rWAP z DASHII fágů genomové knihovny do plazmidů prW5'BS-KE
Králičí WAP gen s přilehlými regulačními oblastmi byl izolován z DASH II fágů genomové králičí knihovny.
Na genomové DNA izolované z králičí svaloviny obvyklým způsobem (Sambrook, J. Fritsch, E.F. Maniatis , T. (1989) Molecular cloning :laboratory manual -2nd ed. Cold. Spring. Harbor. Laboratory Press.) byla připravena pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) reakce sonda WAP 2ex/3ex 587 bp dlouhá (viz příloha 2 a 4). Tento fragment ····
4· • · • ·· *·· «· #8 • · · · • · · · • » ·> 8 • · · · * * 4 4
DNA je komplementární se sekvencí genu pro králičí WAP v oblasti mezi počátkem druhého exonu a koncem třetího exonu strukturního genu. V PCR byly použity nukleotidové sekvence primerů. 5’CGG GAT CCT CAT GTG CCC CGA GCC CAG CTC TT3’ z počátku druhého exonu genu WAP jako forward primer a
5’CGG GAT CCG GGT TCC AGA TAG CGC ATG GCG AC3’ z konce třetího exonu WAP jako reverzní primer. Oba primery byly opatřeny na 5'konci restrikčním místem pro BamHI restrikční endonukleázu. Amplifikovaný fragment byl izolován z gelu , štěpen restrikční endonukleázou BamHI a ligací vklonován do vektoru pBluescript II KS+ (pBS). Schopnost klonovaného DNA fragmentu WAP genu specificky hybridizovat s králičím WAP lokusem byla ověřována Southernovou hybridizací (viz Příloha 5). Genomová DNA byla štěpena třemi dvojicemi restrikčních enzymů a poté frakciována na 0,7% m/v agarózovém gelu, blotována a fixována na nylonový filtr. Hybridizací s označeným DNA fragmentem WAP genu se podařilo detekovat celkem tři fragmenty Xhol-Xhol 4,8kb, Xhol-Sacl 3,1 kb a Xhol-Kpnl 2,6kb .
Ověřená sonda byla využita k vyhledávání fágových klonů nesoucích úseky WAP genu. Z ploten o průměru 150mm byly otisknuty plaky na nylonové membrány a za standartních podmínek kultivovány v hybridizačním roztoku. Takto se podařilo identifikovat a izolovat fágový klon nesoucí úplný strukturní gen pro WAP s přilehlými 10 kb dlouhou 5' a 4,8 dlouhou 3'koncovými sekvencemi (viz příloha 6).
Po restrikční analýze λ Fága DASH II obsahujícího kompletní sekvenci králičího WAP genu s jeho přilehlými regulačními sekvencemi byl pomocí restriktáz EcoRI a Kpnl izolován na 0,5% m/v agaróze 10kb dlouhý 5'koncový fragment a ligací vklonován do vektoru pBS Výsledný vektor získal označení prW5'BS-KE (viz Příloha 7).
···· • · 4 40 • ··
0· * 4 • · • 9 • · <44 ···· • 4 R*
4 · · • 4 · · • 4 4 9 4
9 4 · ·· 44
Příklad 2
Subklonování strukturní části hEPO genu z FIXU fágů genomové knihovny do plazmidů phEBS-HB
Lidský strukturní gen pro erythropoetin (EPO) byl izolován z FIX II fágů genomové lidské knihovny.
Na genomové DNA izolované ze vzorku lidské krve obvyklým způsobem (Sambrook, J. Fritsch, E.F. Maniatis , T. (1989) Molecular cloning: laboratory manual -2nd ed. Cold. Spring. Harbor. Laboratory Press.) byla připravena pomocí PCR reakce sonda EPO 2ex/3ex 3343 bp dlouhá. Tento fragment DNA je komplementární se sekvencí lidského EPO genu v oblasti mezi počátkem druhého exonu a koncem třetího exonu strukturního genu (viz Příloha 4).
V PCR byly použity nukleotidové sekvence primerů.
(5’TGT GAC AGC CGA GTC CTG CAG AGG3’z počátku druhého exonu EPO genu jako forward primer a 5’CAA GCT GCA GTG TTC AGC ACA GCC3’ z konce třetího exonu EPO jako reverzní primer.
Oba primery byly opatřeny na 5'konci restrikčním místem pro Pst I restrikční endonukleázu. Amplifikovaný fragment byl izolován z gelu , štěpen restrikční endonukleázou Pstl a ligací vklonován do vektoru pBS Schopnost klonovaného EPO fragmentu specificky hybridizovat s lidským EPO lokusem byla ověřována na Southern blotech (viz Příloha 5). Genomová DNA byla štěpena třemi dvojicemi restrikčních enzymů a poté frakciována na 0,7 %m/v agarozovém gelu, blotována na nylonový filtr a hybridizována s radioaktivně značenou sondou. Podařilo se detekovat celkem tři fragmenty BamHI- HindiII, Sací- Smál a Pstl. Ověřená sonda byla využita k vyhledávání fágových klonů nesoucích úseky EPO genu. Z ploten o průměru 150mm byly otisknuty plaky na nylonové membrány a za standartních podmínek kultivovány v hybridizačním roztoku. Takto se podařilo identifikovat a izolovat fágový klon nesoucí úplný strukturní gen pro EPO (viz Příloha 6).
Po restrikční analýze λ Fága FIX II obsahujícího kompletní sekvenci lidského EPO genu s jeho přilehlými regulačními sekvencemi byl pomocí
restriktáz BamHI a Hindi11 izolován na 0,5% m/v agaróze 5,2 kb dlouhý fragment obsahující kompletní sekvenci lidského EPO genu s jeho přilehlými regulačními sekvencemi a ligací vklonován do vektoru pBS Výsledný vektor získal označení phEBS-HB (viz Příloha 7).
Příklad 3
Instalování Notl restrikčního místa do translačního konsenzu Kozákové rWAP a hEPO genů.
Zvolená strategie při konstrukci hybridního genomového úseku mezi rWAP a hEPO je založena na cílené instalaci restrikčního místa v motivu pro translační konsenzus Kozákové v blízkosti startovního kodonu ATG. Tato cílená změna bází je možná s využitím techniky PCR s koncově modifikovanými primery, které jsou na svém 3'konci komplementární s cílovou sekvencí genu a na 5'konci nesou instalované restrikční místo. Pomocí dvojice primerů je k jednomu z nich (komplementárnímu k translačnímu konsenzu Kozákové) připojena sekvence s motivem pro restrikční endonukleázu Notl. Pomocí PCR je generována oblast proti proudu od ATG genu rWAP s modifikovaným translačním konsenzem Kozákové. Stejným přístupem zrcadlově je připravena modifikovaná oblast hEPO genu po proudu od ATG. Obě části jsou následně spojeny přes modifikovaný translační konsenzus a propojeny se zbývajícími částmi rWAP promotoru a hEPO kódující oblastí genu v požadovaný hybridní gen pro cílenou expresi v buňkách mléčné žlázy.
Restrikční analýzou bylo ověřeno, že Notl restrikční místo v oblasti použitých genomových úseků EPO a WAP není přítomno. Je tedy vhodným místem ke konstrukci četných rekombinantních vektorů WAP/EPO.
Postup instalace Notl do sekvence Kozákové ve WAP genu vedl přes vytvoření umělého fragmentu WAP genu pomocí PCR s následujícími primery:
rW-824 (5' CCA ggA AgC TgC gAg gAg CtC TgT gCC TgA 3') rW-26Notl (5' CgC ATg gCg gCC gCT ggT Agg CTg gTg gTg 3')
• · ·
Upravený fragment EPO genu s Notl místem v sekvenci Kozákové byl vytvořen pomocí PCR s touto dvojicí primerů: hE+1Notl ( 5' AAg AAt gCg gCC gCC ATg ggg gTg CaC ggT gAg Tac TCg 3') hE+998 ( 5' CAA gTC gCA gTg TTC AgC ACA gCC 3')
Oba amplifikované fragmenty byly izolovány z gelu, restrikčně testovány a upraveny k ligaci: WAP fragment byl štěpen Notl a Sací enzymy, EPO fragment byl štěpen dvojicí Notl a Kpnl. Notl- modifikovaný EPO fragment byl vklonován do hostitelského pracovního vektoru pBS za vytvoření vektoru phEPOBS-KN (viz Příloha 8). Do téhož hostitelského vektoru byl rovněž subklonován modifikovaný WAP fragment a konstrukt byl označen jako vektor prWAPBS-NS (viz příloha 8).
Příklad 4
Klonování a propojení fragmentů rWAP a hEPO genů s instalovaným Notl restrikčním místem.
Do vektoru phEPOBS-KN byl instalován PCR-generovaný Notlmodifikovaný fragment rWAP genu, a to přes nově vytvořené Notl místo v Kozak-sekvenci EPO a přes Sací místo v polylinkeru vektoru. Vektor dostal označení prWAPhEPOBS-KNS (viz Příloha 9). Vzniklý WAP/EPO fúzní fragment Sacl-(Notl)-Kpnl o velikosti 1070 bp se stal základem k vytvoření cílového hybridního konstruktu.
Vektor prWBS-KE, nesoucí subklonovanou 5'- nepřepisovanou regulační část králičího WAP genu, byl linearizován pomocí Kpnl enzymu v místě383 od ATG startu a následně ligován s 1070 bp dlouhým Kpnl-(Notl)Kpnl spojovacím fragmentem izolovaným z prWAPhEPOBS-KNS. Fúze těchto fragmentů vytvořila vektor prWhEPOBS-KNKE o velikosti 14 kb. Vektor phEBS-HB, nesoucí celou kódující část lidského EPO genu, byl linearizován pomocí Kpnl enzymu v místě +687 od ATG startu a následně ligován s 1070 bp dlouhým Kpn-(Notl)-Kpnl spojovacím fragmentem izolovaným z prWAPhEPOBS-KNS. Fúze těchto fragmentů vytvořila vektor prWAPhEBS-KNKB o velikosti 9 kb. Z tohoto vektoru byl následně vyštěpen 4,8 bp dlouhý Notl-BamHI fragment obsahující • · ·· ·· • · · · · • · · · · « · · · · · kompletní strukturní gen pro hEPO s instalovaným Notl místem v sekvenci Kozákové a tento fragment byl vložen do hostitelského vektoru pBS za vzniku phEBS-BN. Do Xbal místa tohoto konstruktu byl poté vpraven 8 kb velký Xbal-Xbal fragment izolovaný z prWhEPOBSKNKE vektoru. Výsledný řekombinantní konstrukt, nazvaný prWhEBSBNX (viz Příloha 10), byl restrikčně testován a částečně sekvenován (viz Příloha 11). Velikost celého vektoru je 16 kb a hybridní rWAP-hEPO gen je možné izolovat z vektoru štěpením s EcoRI a Hindlll enzymy.
Identifikace transgenních myší
Pro identifikaci transgenních myší byl testován systém primerů, využívaný již dříve k přípravě sond, jejichž specifita byla ověřena hybridizací s lidskou genomovou DNA. Bylo ověřeno, že testované primery na negativní myší DNA neumožňují při PCR amplifikaci žádnému fragmentu.
Průmyslová využitelnost
Modifikace translačního konsenzu Kozákové genu rWAP způsobem podle vynálezu je využitelná ke snadné konstrukci expresních vektorů určených k produkci transgenních proteinů. Vektor prWhEBS-BNX připravený popsaným způsobem podle vynálezu je možné použít k expresi EPO ve vhodných transfekovaných eukaryotických buňkách a nebo v mléčné žláze transgenních organizmů.
• · • © • · • ·
Objasnění příloh
Příloha č.1
Primární nukleotidová struktura translačního konsenzu Kozákové genů pro rWAP a hEPO a jejich propojení pomocí modifikace Notl translačního konsenzu kozákové.
Příloha č.2
Příprava sond vhodných k identifikaci fágových klonů nesoucích část primární nukleotidové struktury genu pro rWAP. Sondy byly připraveny pomocí PCR reakce s použitím primerů (podtržené úseky primární sekvence).
Příloha č.3
Příprava sond vhodných k identifikaci fágových klonů nesoucích část primární nukleotidové struktury genu pro hEPO. Sondy byly připraveny pomocí PCR reakce s použitím primerů (podtržené úseky primární sekvence).
Příloha č.4
Elektroforetické zobrazení amplifikace sond použitých k vyhledání fágových klonů nesoucích primární nukleotidovou strukturu genů pro rWAP a hEPO.
Příloha č. 5
Ověření schopnosti amplfikovaných sond hybridizovat za stringentních podmínek s restrikčně upravenou genomovou DNA vázanou na nylonové membráně pomocí metody Southern blot.
Příloha č. 6
Restrikční mapy izolovaných fágových klonů nesoucích primární nukleotidové struktury genů pro rWAP a pro hEPO, s vyznačením strukturní části genů zobrazující introny a exony (vyznačené široké úseky jsou exony, tenčí úseky jsou introny) a vyznačenými nejdůležitějšími restrikčními místy.
Přílohy č.7 ažč.10
Zjednodušená schémata zobrazující postup restrikčních štěpení fragmentů pocházejících z izolovaných fágových klonů rWAP a hEPOa vektoru pBS a konstrukce finálního expresního vektoru prWhEBS-BNX pomocí modifikace translačního konsenzu Kozákové, vnesením restrikčního místa Notl.
Příloha č.11
Primární nukleotidové struktura kódující oblasti expresního vektoru
Claims (5)
1. Způsob přípravy expresního vektoru k produkci terapeutických proteinů vyznačující se tím, že ke spojení genového úseku zahrnujícího regulační oblast promotoru s genovým úsekem zahrnujícím strukturní části genu kódujícího požadovaný protein využívá sekvenční motiv pro restrikční endonukleázu Not I nebo Ncol vytvořený modifikací původního translačního konsenzu Kozákové v oblasti mezi nukleotidy -9 až +4 za vzniku hybridního rekombinantního expresního vektoru k produkci terapeutických proteinů.
2. Způsob přípravy expresního vektoru podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že ke spojení vybraných genových úseků je modifikován translační konsenzus Kozákové genů pro králičí kyselý protein mléčné syrovátky a lidský erythropoetin vložením sekvenčního motivu pro restrikční endonukleázu zejména Not I v oblasti mezi nukleotidy -9 až +4 za vzniku expresního vektoru prWhEBS-BNX k produkci lidského erythropoetinu v mléčné žláze transgenních organizmů.
3. Primární nukleotidová struktura DNA vektoru prWhEBS-BNX, připravená podle nároku 1 a 2, a všech dalších vektorů, které jsou modifikací odvozeny od tohoto původního vektoru prWhEBS-BNX.
4. Eukaryontní buňky nesoucí ve svém genomu nukleotidovou primární strukturu hybridních genů pocházejících z expresních vektorů, připravených způsobem podle nároku 1 a 2.
5. Transgenní organizmy nesoucí ve svém genomu nukleotidovou primární strukturu hybridních genů pocházejících z expresních vektorů, připravených způsobem podle nároku 1 a 2.
Příloha č.1
Translační konsenzus Kozákové v genech pro rWAP a hEPO a modifikovaný translační konsenzus v hybridním genu rWAP-hEPO ' s motivem pro restrikční enzym Notl.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20004569A CZ293226B6 (cs) | 2000-12-07 | 2000-12-07 | Způsob přípravy DNA expresního vektoru, DNA vektor, eukaryontní buňka a transgenní organismus |
| DE60139300T DE60139300D1 (de) | 2000-12-07 | 2001-12-07 | Verfahren für die Herstellung eines Expressionsvektors zur Produktion von therapeutischen Proteinen in transgenen Tieren |
| EP01128498A EP1217072B1 (en) | 2000-12-07 | 2001-12-07 | Method for the preparation of an expression vector for the production of therapeutic proteins in transgenic animals |
| AT01128498T ATE437231T1 (de) | 2000-12-07 | 2001-12-07 | Verfahren für die herstellung eines expressionsvektors zur produktion von therapeutischen proteinen in transgenen tieren |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20004569A CZ293226B6 (cs) | 2000-12-07 | 2000-12-07 | Způsob přípravy DNA expresního vektoru, DNA vektor, eukaryontní buňka a transgenní organismus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20004569A3 true CZ20004569A3 (cs) | 2002-07-17 |
| CZ293226B6 CZ293226B6 (cs) | 2004-03-17 |
Family
ID=5472752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20004569A CZ293226B6 (cs) | 2000-12-07 | 2000-12-07 | Způsob přípravy DNA expresního vektoru, DNA vektor, eukaryontní buňka a transgenní organismus |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1217072B1 (cs) |
| AT (1) | ATE437231T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ293226B6 (cs) |
| DE (1) | DE60139300D1 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3020273B1 (en) * | 2014-11-17 | 2018-07-04 | Competence Centre on Health Technologies | A method of producing biotechnological drugs using transgenic bovine animals |
-
2000
- 2000-12-07 CZ CZ20004569A patent/CZ293226B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-12-07 AT AT01128498T patent/ATE437231T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-12-07 DE DE60139300T patent/DE60139300D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-07 EP EP01128498A patent/EP1217072B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1217072A3 (en) | 2002-08-28 |
| EP1217072B1 (en) | 2009-07-22 |
| ATE437231T1 (de) | 2009-08-15 |
| CZ293226B6 (cs) | 2004-03-17 |
| DE60139300D1 (de) | 2009-09-03 |
| EP1217072A2 (en) | 2002-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6377095B2 (ja) | 鳥の導入遺伝子についてのマグナム特異的プロモーターを含むベクター | |
| US7378086B2 (en) | Retroviral vector having an ovalbumin promoter | |
| CN102660581A (zh) | 转基因禽类的生产 | |
| US20130131317A1 (en) | Expression of secreted human alpha-fetoprotein in transgenic animals | |
| CN110177878B (zh) | 转基因动物和生物生产方法 | |
| CN1980571A (zh) | 禽类及禽蛋中表达的外源蛋白质 | |
| US7511126B2 (en) | Position-independent and tissue specific expression of a transgene in milk of transgenic animals | |
| EP1217072B1 (en) | Method for the preparation of an expression vector for the production of therapeutic proteins in transgenic animals | |
| AU769622B2 (en) | Tissue specific synthesis of protein in eggs of transgenic hens | |
| HK40005869B (zh) | 转基因动物和生物生产方法 | |
| NZ503901A (en) | Transgenic avians containing replication-defective retroviral vectors and methods for tissue specific synthesis of protein in eggs laid by the avian or female progeny thereof. | |
| HK1121342A (en) | Expression of secreted human alpha-fetoprotein in transgenic animals |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20201207 |