CZ20004181A3

CZ20004181A3 - Sloučenina zahrnující nukleosid s 2',4'-můstkem a oligonukleotid od ní odvozený

Info

Publication number: CZ20004181A3
Application number: CZ20004181A
Authority: CZ
Inventors: Guangyi Wang
Original assignee: Icn Pharmaceuticals
Priority date: 1999-05-24
Filing date: 1999-05-24
Publication date: 2001-05-16

Abstract

Sloučenina obecného vzorce I s 2',4'-můstkem, připravená cyklizaci C2'a C4'nukleosidu pomocí spojovače nebo spojovací molekuly, přičemž symboly X, Y, Z, Rb R2 a R3 mají specifický význam. Tyto nové nukleosidy mají žádoucí uzavřený sacharidový záhyb a jsou užitečné jako farmaceutické přísady. Oligonukleotidy, obsahující tyto nové nukleosidy, které jsou užitečné pro přípravu terapeutických a diagnostických sloučenin na bázi oligonukleotidů.

Description

Oblast techniky

Předmětem vynálezu je nukleosid a oligonukleotidová analoga a způsoby jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

Nukleosidy a nukleotidová analoga byly dlouho používány jako farmaceutické přísady proti řadě virů a karcinomů. V současné době je řada nukleosidů a nukleotidových analogů v klinických zkouškách pro některá onemocnění.

V buňkách jsou nukleosidy a nukleotidy fosforylovány nebo jsou ještě dále fosforylovány na odpovídající nukleosidtrifosfáty. Nukleosidtrifosfáty slouží jako inhibitory DNA nebo RNA polymeráz. Nukleosidtrifosfáty mohou být také začleněny do DNA nebo RNA přičemž zasahují do elongace DNA nebo RNA.

Aktivní nukleosidová analoga jsou obecně v cílové buňce fosforylována snadno. Příslušné nukleosidtrifosfáty mají vyšší afinitu ke katalytickým místům polymeráz a soutěží jako substrát polymeráz s přirozenými nukleosidtrifosfáty.

Určitá nukleosidová analoga pracují na úrovni nukleosidu nebo monofosfátu. Jednu skupinu nadějných nukleosidových analogů tvoří nukleosidy s konformačně uzavřenými sacharidovými skupinami. Je uváděno, že určité konformačně uzavřená karbocyklická nukleosidová analoga vykazují významnou aktivitu vůči HCMV, HSV a EBV (Siddiqui a kol. Nucleosides Nucleotides 1996, 15, 235 až 250; Marquez a kol., J. Med. Chem. 1996, 39, 3739 až 3747). Konformačně uzavřený karbocyklický AZT-5 -trifosfát byl uveden jako ekvivalentní inhibitor HIV reverzní transkriptázy (Marquez a kol., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 2780 až 2789). Byly připraveny rovněž další nukleosidy s bicyklickými sacharidovými skupinami, ale nebyla u nich zjištěna nebo uvedena žádná aktivita (Chao a kol. Tetrahedron 1997, 53, 1957 až 1970; Okabe a kol. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 2203 až 2206, Hong a kol. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 225 až 228).

U konformačně uzavřených nukleosidů je očekáván pozitivní dopad na protisměrné oligonukleotidy. Oligonukleotidy jakožto účinná protisměrná terapeutika byly objeveny a prozkoumány během posledních dvou desetiletí. Oligonukleotidy jsou schopny tvořit dihelix nebo trihelix s komplementární DNA nebo RNA a mají schopnost zacílit specifické sekvence

v genomu viru nebo karcinomu. Specifická vazba oligonukleotidů na DNA nebo RNA, které jsou předmětem zájmu, by mohla inaktivovat funkci, spojenou s DNA nebo RNA jako je replikace, transkripce a translace. Virové cykly nebo nádorové procesy tudíž mohou být přerušeny, zatímco normální buněčné cykly ovlivněny nebudou.

Protože přirozené oligonukleotidy jsou labilní vůči buněčným a extracelulárním nukleázám, bylo velké úsilí věnováno studiu modifikací oligonukleotidů, zejména takovým modifikacím, které byly zaměřeny na zvýšení odolnosti vůči nukleázám a na zvýšení vazebné afinity. Oligonukleotidy, obsahující určité bicyklické nukleosidy, byly uvedeny proto, aby byla demonstrována zvýšená nukleázová stabilita (Leumann a kol. Bioorg. Med. Chem. Letts. 1995, 5, 1231 až 1234; Altmann a kol. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2331 až 2334, 7625 až 7628). Nedávno byl syntetizován a začleněn do oligonukleotidů 2'-(7,4'-C-methylenribonukleosid, který má uzavřený sacharidový záhyb na 3-konci. Hybridizační studie ukazují, že konformačně uzavřené nukleosidy mohou významně zvyšovat hybridizaci modifikovaných oligonukleotidů s komplementární RNA a DNA (Obika a kol. Tetrahedron Lett, 1997, 38, 8735 až 8738; Koshkin a kol. Tetrahedron 1998, 54, 3607 až 3630).

Nové konformačně uzavřené nukleosidy s bicyklickými sacharidovými skupinami jsou tedy žádané. Tyto nové nukleosidy by měly být užitečné v antivirových, protinádorových a jiných terapiích. Dále by oligonukleotidy, obsahující tyto nové modifikované nukleosidy, měly mít žádoucí stabilitu vůči buněčným nukleázám a velkou vazebnou afinitu k nukleovým kyselinám. Tyto oligonukleotidy by tedy měly být velmi užitečné v léčení a diagnostice.

Podstata vynálezu

Jsou popsány konformačně uzavřené bicyklické sacharidové nukleosidy, které mají běžný geometrický tvar a způsoby přípravy těchto nukleosidů s konformačně uzavřeným bicyklickým sacharidem. Jsou poskytovány nukleosidy, které mají bicyklické sacharidové skupiny a oligonukleotidy podle obecného vzorce T;

(I)

kde X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří O, S, CH₂, NR, C=O, C=CH₂ nebo nic, kde R je vybráno ze skupiny, kterou tvoří vodík, alkyl, alkenyl, alkynyl, acyl; Ri je vybráno ze skupiny, kterou tvoří adenin, cytosin, guanin, hypoxanthin, uráčil, thymin, heterocykly, H, OCH3, OAc, halogen, sulfonát; R2, R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří H, OH, DMTO, TBDMSO, BnO, THPO, AcO, BzO, OP(NiPr₂)O(CH₂)₂CN, OPO3H, PO₃H, difosfát, trifosfát; R₂ a R3 mohou být dohromady PhCHO2, TIPDSO₂ nebo DTBSO2.

U nových nukleosidů, které jsou zde popsány, se předpokládá, že budou užitečné v antivirových, protinádorových a jiných terapiích. Oligonukleotidy, složené z těchto modifikovaných nukleosidů, mají žádoucí fyziologickou stabilitu a vazebnu afinitu, což je činí užitečnými v léčení a diagnostice.

Jsou poskytovány konformačně uzavřené nukleosidy, které mají sacharidový záhyb na 3'-konci a způsoby jejich přípravy. Postupy používané pro přípravu dříve uvedených bicyklických nukleosidových analogů nemohou být na zde popsaná nová nukleotidová analoga aplikovány. Popsaná analoga vznikla z úspěšného spojení mezi C2'a C4' pozicemi na ribóze nukleosidových analogů.

Zde používaná zkratka „Ac“ znamená acetyl; zkratka „Bn“ znamená benzyl; zkratka Bz“ znamená benzoyl; zkratka „DMT“ znamená dimethoxytrityl; zkratka „THP“ znamená tetrahydropyranyl; zkratka „TBDMS“ znamená t-butyldimethylsilyl; zkratka „TIPDS“ znamená tetraisopropyldisilyl a zkratka „DTBS“ znamená di(t-butyl)silyl.

Syntéza ribofuranózových derivátů s 2, 4 - můstkem

Ι-α-methylarabinóza 1, připravená podle publikovaného postupu (Tejima a kol. J. Org. Chem. 1963, 28. 2999 až 3003), byla chráněna zbytkem 1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl (TIPS) na 03 a 05 za vzniku sloučeniny 2, která byla pomocí působení DMSO/DCC/TFA převedena na keton 3. Následná Wittigova reakce a odstranění TIPS poskytly alken 4 ve velice dobrém výtěžku.

Sloučenina 4 byla chráněna zbytkem t-butyldimethylsilyl (TBS) na 05 a benzylem(Bn) na 03 a vznikla sloučenina 5. Hydroborace sloučeniny 5 byla provedena pomocí 9-BBN a výsledkem byl výlučně 2-deoxy-2-hydroxymethylový derivát 6 a to ve výborném výtěžku.

2-deoxy-2-hydroxymethylový derivát 6 byl podroben tritylaci s 4,4'-O-dimethoxytritylchloridem (DMT) a TBS byl odstraněn pomocí tetrabutylamoniumfluoridu (TBAF) za vzniku sloučeniny 7.

Schéma 1

(’7) (6) (s]

Sloučenina 7 byla oxidována na aldehyd 8, který byl podroben působení formaldehydu a hydroxidu sodného za vzniku 4-hydroxymethylderivátu 9 ve výborném výtěžku. Mesylace sloučeniny 9 a následné odstranění DMT vedlo ke vzniku sloučeniny 10. Cyklizace provedená pomocí NaH v THF a následné odstranění mesylu poskytly bicyklický sacharid 11. Působení acetanhydridu v přítomnosti DMAP na sloučeninu 11 vedlo ke vzniku sloučeniny 12, přičemž působení směsi acetanhydrid/kyselina octová v přítomnosti kyseliny sírové vedlo ke vzniku sloučeniny 13, ve které má acetoxyskupina na Cl ve srovnání s methoxyskupinou ve sloučenině 11 obrácenou orientaci (1 -β).

Schéma 2

BnO (n) <// OMe

Syntéza bicyklonukleosidů s 2', 4 - můstkem

Bicyklonukleosidy, mající sacharidový zbytek s 2',4-můstkem, byly syntetizovány kondenzací silylovaných nukleosidových baží a bicyklických cukrů, což je ukázáno níže. Kondenzací sloučeniny 13 s bis(trimethylsilyl)thyminem vznikl produkt 14, α-anomer, ve výborném výtěžku. Působení BCI3 na sloučeninu 14 vedlo k odstranění současně acetylu a benzylu za vzniku bicyklického a-thymidinu 15.

(ΐή (is)

Kondenzace sloučeniny 13 a 6-chlor-9-trimethylsilylpurinu poskytla směs a- a β-purinových nukleosidů 16 a 17 (poměr α:β 1:1 až 2:3), které mohou být separovány chromatograficky.

Působení amoniaku v methanolu na sloučeniny 17 a 16 a následná hydrogenolýza vedly ke vzniku adenosinových analogů 18 a 19. Hydrogenolýza vyžadovala velké množství katalyzátoru a také prodlouženou dobu reakce a to z důvodu větší stérické překážky na cukerném zbytku. Působení merkaptoethanolu v přítomnosti methoxidu sodného na sloučeniny 16 a 17, následované hydrogenolýzou vedlo k výtěžku inosinových analogů 20 a 21.

(ΐδ)Χ = ΝΗ₂ (ls)x = NH₂ (2θ)Χ = ΟΗ (2l)x = 0H

Výsledkem kondenzace sloučeniny 13 se silylovaným N²-acetylguaninem byl α-guanosinový derivát 22 jakožto hlavní produkt (30 %), malé množství β-izomeru a N -spojené produkty. Působení amoniaku v methanolu na α-guanosinový derivát a následná hydrogenolýza vedly ke vzniku bicyklického a-guanosinu 23.

(22)

Jak je popsáno výše vedly kondenzační reakce ke zisku buď výlučně α-nukleosidu nebo ke zisku směsi a- a β-nukleosidů, aniž by byly upřednostňovány β-anomery. Ve snaze zvýšit poměr β-nukleosidů byly testovány odlišné podmínky kondenzace. Teplota měla na poměr a- a β-anomerů malý vliv. Avšak spojovací činidlo a funkční skupina na Cl cukru neměly na poměr a- a β-nukleosidů žádný podstatný vliv.

Kondenzace sloučeniny 12 s bis- nebo tri(trimethylsilyl)pyrimidiny v přítomnosti chloridu cíničitého poskytla β-nukleosidy jakožto hlavní produkty v dobrém výtěžku. Reakce sloučeniny 12 a silylovaného thyminu tedy poskytla thymidinový derivát 24 s poměrem β:α

~4;1. Kondenzace sloučeniny 12 se silylovaným uracilem a T^-benzoylcytosinem poskytla odpovídající nukleosidy 25 a 26, přičemž poměr β;α byl v obou reakcích ~9;1. Působením chloridu boritého na sloučeniny 24 až 26 byly získány pyrimidinové bicyklonukleosidy 27 až 29. V případě cytidinového derivátu byla benzoylová skupina ve sloučenině 29 odstraněna pomocí amoniaku za vzniku sloučeniny 30. Alternativní cesta (není uvedena) pro přípravu sloučeniny 30 vychází ze sloučeniny 28, která byla acetylována na 03 a 05 ', následovala reakce s triazolem a působení amoniaku. Touto cestou byla získána sloučenina 30 ve středně velkém výtěžku.

(24) X = OHY = Me (25) X = OH,Y = H 26)X = NHBz, Y = H (27) X = OHY = Me (28) X = OH,Y = H (29) X = NHBz, Y = H (30) X = NH₂,Y = H

Rovněž byla testována kondenzace sloučeniny 12 se silylovánými puriny a s chloridem cíničitým jakožto spojovacím činidlem. Na rozdíl od reakcí s pyrimidiny nebyly výtěžkem kondenzace silylovaného 6-chloropurinu se sloučeninou 12 pouze a- a β-nukleosidy 16 a 17, ale také Nespojený produkt (není uveden). Podobně byla výsledkem kondenzace silylovaného N -acetylguaninu se sloučeninou 12 směs tří produktů, N -spojeného β-nukleosidu 31 (42 %), žádoucího β-nukleosidu 32 (10 %) a a-nukleosidu 22 (6 %). Jestliže však byl silylovaný N²-acetylguanin v přítomnosti trimethylsilytriflátu zahřát s Nespojeným produktem 31, byl tento produkt částečně přeměněn na N⁹-spojený produkt, a- a β-bicyklonukleosidy 22 (~22 %) a 32 (~25 %). Separovaná sloučenina 32 byla podrobena stejnému postupu jako sloučenina 22 za vzniku bicyklického β-guanosinu 33.

Stereochemická stanovení derivátu 2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu 11 a bicyklonukleosidů, které vznikají při kondenzaci bicyklických sacharidů se silylovanými nukleosidovými bázemi, mohou být provedena NOE protonovým NMR. Jak naznačuje stick-ball model, směřuje rigidní dioxabicyklo[3,2,l]oktanový kruhový systém protony (Hl a H2 ) na Cl' a C2' α-bicyklonukleosidů tak, aby byly paralelní, zatímco Hl'a H2'v β-bicyklonukleosidech směřuje na opačné strany. Například torzní úhel Hl -Cl-C2 -H2' bicyklického a-thymidinu 15

po geometrické optimalizaci je 37 ⁰ a v souladu s tím byla získána spojovací konstanta 3,9 Hz v protonovém NMR. Torzní úhel H1-CT-C2-H2' vbicyklickém β-thymidinu 27 je 96 ° po geometrické optimalizaci a jak bylo očekáváno nebylo zjištěno žádné párování mezi HT a H2'. Proton na CT ve všech měřených β-bicyklonukleosidech je jediný vrchol. Na druhé straně ve všech měřených α-bicyklonukleosidech je proton na CT jeden z páru se spojovací konstantou ~ 4.0 Hz.

Stereochemická stanovení bicyklonukleosidů byla dále potvrzena rentgenovou krystalografií bicyklických thymidinů 15 a 27. Ribózový kruh dioxabicyklo[3,2,l]oktanové cukerné skupiny v obou sloučeninách zaujímá typický sacharidový záhyb na C3-konci, zatímco šestičlenný kruh v sacharidu zaujímá židličkovou formu. Thy minová báze v obou sloučeninách má protisměrnou orientaci.

Syntéza fosforamiditů bicyklonukleosidů s 2,4-můstkem

Bicyklický β-thymidin 27, bicyklický β-Ν%εηζογ1ο>^ΐη 29 a bicyklický β-Ν -acetylcytidin 29 byly chráněny pomocí DMT a poté byly přeměněny na příslušné fosforamidity. Vzhledem ke stérické překážce byla nutná delší doba reakce.

····« · · ·· ·

<34)X = OH, Y = Me (35)X = NHAc, Y = H (36X = NHBz, Y = H (37) X = OH, Y = Me (38) X = NHAc, Y = H (39JX = NHBz, Y = H

Příklady provedení vynálezu

Syntetické postupy, použité pro přípravu popsaných sloučenin, mohou být také použity pro syntézu dalších nárokovaných sloučenin. Předmětný vynález zahrnuje, aniž by tím však byl jakýmkoliv způsobem limitován, sloučeniny, připravené prostřednictvím následujících příkladů. Čísla v závorkách, která v příkladech následují za názvy sloučenin, odpovídají číslům struktur v kapitole podrobný popis vynálezu.

Příklad 1 Příprava l-a-methyl-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyl-l,3-disiloxandiyl)-D-ribofuranózy (2) a-methylarabinóza byla připravena podle publikovaného postupu (Tejima, S; Fletcher, Jr. H.G. J. Org. Chem. 1963, 28, 2999 až 3003) a separována od svého β-anomeru (minoritní produkt) chromatografií na silikagelu. Do míchaného roztoku a-methylarabinózy (19,27 g, 119,9 mmol) v bezvodém pyridinu (200 ml) o teplotě 0 °C byl přidán l,3-dichlor-l,l,3,3-tetraisopropyldisiloxan (38,4 ml, 119,9 mmol). Vzniklý roztok byl míchán při teplotě 0 °C po dobu 1 h a poté při laboratorní teplotě po dobu 1,5 h. Roztok byl ochlazen na 0 °C a byla přidána voda (20 ml). Směs byla míchána 10 min. a naředěna EtOAc. Vodná vrstva byla extrahována EtOAc. Spojená organická vrstva byla vysušena (Na2SO4) a zahuštěna do suché formy. Po chromatografii na silikagelu v systému 15% EtOAc v hexanu bylo získáno 42,7 g (88 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvého sirupu.

Příklad 2 Příprava 2-C, 2-O-didehydro-a-methyl-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyl-l, 3-disiloxandiyl)-D-ribofuranózy (3)

Do míchaného roztoku l-a-methyl-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyl-l,3-disiloxandiyl)-D-ribofuranózy (42,6 g, 104,9 mmol) a DCC (43,4 g, 209,8 mmol) v bezvodém DMSO (250 ml) a étheru (100 ml) při teplotě 0 °C pod argonem byl přidán roztok kyseliny trifluoroctové (4,04 ml, 52,5 mmol) a pyridinu (8,44 ml, 105 mmol) v DMSO (30 ml). Vzniklá reakční směs byla zahřáta na laboratorní teplotu, míchána po dobu 5 h a poté byla ochlazena na 0 °C. Byla přidána kyselina šťavelová (21,3 g, 236 mmol) v methanolu (60 ml) a poté následoval přídavek vody (30 ml). Výsledná směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 1 h, precipitát byl zfiltrován a důkladně promyt hexanem. Filtrát byl dále naředěn hexanem, promyt 5 x vodou, vysušen (Na2SO4) a zahuštěn do suché formy. Po chromatografii na silikagelu v 2% MeOH v systému methylenchlorid-hexan (1:2) bylo získáno 37,6 g (89 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvého sirupu; ’HNMR (CDC1₃) δ 1,00 až 1,12 (m, 28H, TIPDS), 3,47 (s, 3H, OCH₃), 4,05 až 4,19 (m, 3H, H4, H5a, H5b), 4,51 (dd, J = 9,3 Hz, 1,5 Hz, ΙΗ, H3), 4,89 (t, J = 1,5 Hz, 1H, Hl).

Příklad 3 Příprava 2-deoxy-2-methylen-l-a-methyl-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyl-l,3-disiloxandiyl)-D-riboíuranózy

Do míchané suspenze methyltrifenylfosfoniumbromidu (21,5 g, 60,1 mmol) ve bezvodém étheru (1380 ml) při laboratorní teplotě pod argonem byl přidán roztok t-pentoxidu sodného (5,97 g, 54,0 mmol) v bezvodém benzenu (50 ml). Výsledná žlutě zbarvená směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 6 h a poté byla ochlazena na -10 °C. Poté byl přidán roztok 2-C,2-O-didehydro-a-methy 1-3,5-O-( 1,1,3,3 -tetraisopropy 1-1,3 -disiloxandiy l)-D-ribofuranózy (12,1 g, 30,1 mmol) v étheru (35 ml). Reakční směs byla míchána při teplotě -10 °C po dobu 1 h, poté byla 2x promyta solným roztokem, vysušena (Ť^SCL) a zahuštěna. Po chromatografii na silikagelu s použitím 5% EtOAc v hexanu bylo získáno 11,0 g (91 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvého sirupu; ^lH NMR (CDC1₃) δ 1,00 až 1,12 (m, 28H, TIPDS), 3,45 (s, 3H, OCH₃), 3,73 (dt, J = 9,0 Hz, 3,0 Hz, ΙΗ, H4), 4,02, 4,03 (2s, 2H, H5), 4,62 (dt, J = 9,0 Hz, 2,7 Hz, ΙΗ, H3), 5,27 (m, 1H, Hl), 5,32 až 5,36 (m, 2H, H2 ).

Příklad 4 Příprava 2-deoxy-2-methylen-l-a-methyl-D-ribofuranózy (4)

Do míchaného roztoku 2-deoxy-2-methylen-l-a-methyl-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyl-l,3-disiloxandiyl)-D-ribofuranózy (35,0 g, 87,1 mmol) v THF (200 ml) byl přidán 1,0 M TBAF v THF (180 ml). Vzniklý roztok byl ponechán stát 1 h při laboratorní teplotě. THF byl odpařen a vzorek byl chromatografován na silikagelu s použitím 10% EtOH v methylenchloridu. Bylo získáno 14,6 g (88 %) požadované sloučeniny ve formě sirupu.

Příklad 5 Příprava 3-O-benzyl-5-O-(t-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2-methylen-l-a-methyl-D-ribofuranózy (5)

Roztok 2-deoxy-2-methylen-l-a-methyl-D-ribofuranózy (13,7 g, 85,5 mmol) a TBDMS-C1 (13,5 g, 89,6 mmol) v bezvodém pyridinu (130 ml) byl ponechán stát při laboratorní teplotě po dobu 15 h. Poté byl roztok ochlazen na teplotu 0 °C, byla přidána voda (2 ml) a vzniklá směs byla míchána 1 h při laboratorní teplotě, poté byla zahuštěna na poloviční objem, zředěna EtOAc, promyta solným roztokem, vysušena (Na2SO4) a zahuštěna do suché formy. Důkladně vysušený preparát byl rozpuštěn v THF (70 ml) a byl přidán do míchané směsí NaH (60% v minerálním oleji, 5,6 g, 140 mmol) v THF (350 ml) při teplotě 0 °C. Po 40 min. míchání při laboratorní teplotě byl přidán benzylbromid (10,75 ml, 90,5 mmol). Reakční směs byla míchána po dobu 4 h, poté byla ochlazena na 0 °C, následoval pozvolný přídavek vody (2 ml) a poté 10% AcOH ve vodě a to až do té doby, dokud nebylo dosaženo pH 7. Směs byla naředěna EtOAc, promyta solným roztokem a poté zředěným uhličitanem sodným, vysušena (Na2SO4) a zahuštěna do suché formy. Chromatografií na silikagelu s použitím 0 až 10% EtOAc v hexanu bylo získáno 23,8 g (76 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvé kapaliny; ’H NMR (CDCb) δ 0.01 (s, 3H, SiCH₃), 0,02 (s, 3H, S1CH3), 0,85 (s, 9H, t-Bu), 3,41 (s, 3H, OCH₃), 3,60 až 3,72 (m, 2H, H5a, H5b), 4,20 (dd, J = 8,7 Hz, 4,5 Hz, IH, H3), 4,57, 4,66 (AB, J = 12,0 Hz, 2H, Bn), 5,22 (t, J = 1,2 Hz, IH, Hl), 5,38 (t, J = 1,5 Hz, IH, H2a ), 5,43 (m, J = 1,2 Hz, IH, H2b ), 7,23 až 7,37 (m, 5H, Bn); anal. spočítáno pro C20H32O4SÍ. C, 65,89; H, 8,85. Nalezeno: C, 65,92; H, 9,22.

Příklad 6 Příprava 3-O-benzyl-5-O-(t-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2-hydroxymethyl-l-a-methyl-D-ribofuranózy (6)

Do míchaného roztoku 3-0-benzyl-5-O-(t-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2-methylen-l-a-methyl-D-ribofuranózy (5,28 g, 14,50 mmol) pod argonem byl přidán 9-BBN (0,5 M v THF, ml). Vzniklý roztok byl míchán při teplotě okolí po dobu 1 h, poté při teplotě 40 °C přes noc. Následovalo ochlazení na laboratorní teplotu a převedení směsi do baňky, obsahující boritan sodný-tetrahydrát (13,39 g, 87 mmol) ve vodě (85 ml) a ethanol (85 ml). Výsledná směs byla intenzivně míchána při teplotě 50 °C po dobu 4 h, ochlazena na 0 °C, zneutralizována AcOH na pH 8 a zahuštěna na malý objem. Tento objem byl naředěn vodou (20 ml) a třikrát extrahován methylenchloridem. Spojená organická vrstva byla dvakrát promyta solným roztokem, vysušena (NažSOJ a zahuštěna do suché formy. Po chromatografii na silikagelu v systému EtOAc- hexan (1:2) bylo získáno 5,17 g (93 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvého sirupu; ’H NMR (CDC1₃) δ 0.03 (s, 6H, S1CH3), 0,87 (s, 9H, t-butyl), 2,34 až 2,43 (m, IH, H2), 3,39 (s, 3H, OCH3), 3,48 (dd, J = 10,5 Hz, 6,0 Hz, IH, H5a), 3,60 (dd, J = 10,5 Hz, 3,6 Hz, IH, H5b), 3,88 (d, J = 7,2 Hz, 2H, H2), 3,98 (dd, J = 7,2 Hz, 2,7 Hz, IH, H3), 4,17 (m, IH, H4), 4,44, 4,66 (AB, J = 12,3 Hz, 2H, Bn), 4,95 (d, J = 5,4 Hz, IH, Hl), 7,23 až 7,36 (m, 5H, Bn); anal. spočítáno pro C20H34O5SÍ: C, 62,79; H, 8,96. Nalezeno: C, 62,92; H, 9,21.

Příklad 7 Příprava 3-č?-benzyl-2-deoxy-2-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-l-a-methyl-D-ribofuranózy (7)

Roztok 3-<9-benzyí-5-(?-(t-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2-hydroxymethyl-l-a-methyl-D-ribofuranózy (6,60 g, 17,28 mol) a DMT-C1 (7,03 g, 20,74 mmol) v bezvodém pyridinu (50 ml) byl ponechán stát při laboratorní teplotě přes noc a poté byla reakce ukončena přídavkem vody (8 ml). Výsledný roztok byl ponechán stát 10 min a poté byl zředěn EtOAc, třikrát promyt solným roztokem, vysušen (Na₂SO4) a zahuštěn. Byl získán preparát 9, který byl rozpuštěn v THF (52 ml). Byl přidán TBAF (1,0 M v THF, 26 ml) a vzniklý roztok byl ponechán stát při laboratorní teplotě po dobu 30 min. THF byl odpařen a zbylý vzorek byl chromatografován na silikagelu v systému EtOAc-hexan (1:1) za vzniku 9,28 g (94 %) požadované sloučeniny ve formě bílé pěny; 'Η NMR (CDC1₃) δ 2,33 až 2,42 (m, IH H2), 3,26 až 3,63 (m, 7H, H5a, H5b, H2a', H2b', OCH₃), 3,79 (d, J = 1,2 Hz, 6H, DMT), 3,91 (dd, J = 7,5 Hz, 2,4 Hz, IH, H3), 4,13 (m, IH, H4), 4,41, 4,50 (AB, J = 12,9 Hz, 2H, Bn), 5,05 (d, J = 5,1 Hz, IH, Hl), 6,78 až 6,85 (m, 4H, DMT), 7,14 až 7,47 (m, 14H, Bn, DMT); anal. spočítáno pro C35H38O7: C, 73,66; H, 6,71. Nalezeno: C, 73,57; H, 6,76.

• · · · · • ·

Příklad 8 Příprava 3-č>-benzyl-2-deoxy-2-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-5-C,5-O-didehydro-1 -a-methyl-D-ribofuranózy (8)

Do míchaného roztoku 3-O-benzyl-2-deoxy-2-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-l-a-methyl-D-ribofuranózy (9,18 g, 16,16 mmol) a DCC (10,0 g, 48,49 mmol) v bežvodém DMSO (60 ml) při teplotě 10 °C byl přidán roztok kyseliny trifluoroctové (0,622 ml, 8,08 mmol) a pyridinu (1,95 ml, 24,24 mmol) v DMSO (15 ml). Výsledná reakční směs byla míchána při teplotě 10 °C po dobu 1 h, poté při laboratorní teplotě po dobu 6 h a poté byla ochlazena na 0 °C. Po přídavku vody (8 ml) byla směs míchána přes noc a naředěna EtOAc. Precipitát byl zfiltrován a důkladně promyt EtOAc. Spojený filtrát byl 5 x promyt solným roztokem, vysušen (Na2SO4) a zahuštěn do suché formy. Po chromatografii na silikagelu v systému EtOAc-hexan (1:1) bylo získáno 8,26 g (90 %) požadované sloučeniny ve formě bílé pěny.

Příklad 9 Příprava 3-<9-benzyl-2-deoxy-2-(4,4 '-dimethoxytrityloxymethyl)-4-C-hydroxy-methyl-1 -a-methyl-D-ribofuranózy (9)

Do míchaného roztoku 3-O-benzyl-2-deoxy-2-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-5-C,5-<9-didehydro-1-a-methyl-D-ribofuranózy (8,0 g, 14,08 mmol) a formaldehydu (37% ve vodě, 85 ml) v dioxanu (420 ml) při teplotě 0 °C byl v průběhu 15 min. po kapkách přidán vodný roztok NaOH (2,0 M, 210 ml). Výsledný zakalený roztok byl míchán pri laboratorní teplotě 2 dny, aby se vyčeřil. Po ochlazení na 0 °C byl roztok zneutralizován 10% kyselinou octovou na pH 8, zahuštěn na malý objem, zředěn vodou (100 ml) a třikrát extrahován methylenchloridem. Spojená organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena (Na2SO4) a zahuštěna do suché formy. Chromatografií na silikagelu s použitím 4 až 5% ethanolu v methylenchloridu bylo získáno 8,11 g (94 %) požadované sloučeniny ve formě bílé pěny; *Η NMR (CDCI3) δ 2,46 až 2,57 (m, ÍH, H2), 3,23 až 3,73 (m, 9H, H5, H4', H2', OCH₃), 3,79 (d, J = 1,8 Hz, 6H, DMT), 4,14 (d, J = 6,9 Hz, ÍH, H3), 4,43, 4,47 (AB, J = 12 Hz, 2H, Bn), 4,97 (d, J = 4,8 Hz, ÍH, Hl), 6,77 až 6,85 (m, 4H, DMT), 7,11 až 7,46 (m, 14H, Bn, DMT).

Přiklad 10 Příprava 3-<9-benzyl-2-deoxy-2-hydroxymethyl-5-č)-mesyl-4-mesyloxymethyl-l-a-methyl-D-ribofuranózy (10)

Do míchaného roztoku 3-(9-benzyl-2-deoxy-2-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-4-C-hydroxymethyl-l-a-methyl-D-ribofiiranózy (7,80 g, 13,0 mmol) v bežvodém pyridinu (60 ml)

1» · · · ·* při teplotě 0 °C pod argonem byl po kapkách přidáván methansulfonylchlorid (3,03 ml, 39 mmol). Výsledná reakčni směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 45 min., poté byla ochlazena na 0 °C a zředěna přídavkem vody (5 ml). Vzniklá směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 15 min., naředěna EtOAc, třikrát promyta solným roztokem, vysušena (Na2SO4) a zahuštěna. Výsledkem byla bílá pěna, která byla rozpuštěna v AcOH-voda (80:20, 400 ml). Vzniklý roztok byl ponechán stát při laboratorní teplotě po dobu 2 h a poté byl naředěn vodou (200 ml) a zahuštěn na objem asi jedné čtvrtiny. Byla přidána voda (100 ml) a směs byla zahuštěna do suché formy. Chromatografií na silikagelu v systému EtOAc-hexan (3:1 až 1:0) bylo získáno 5,32 g (90 %) požadované sloučeniny ve formě polotuhé látky; ’H NMR (CDCfa) δ 2,43 až 2,54 (m, IH, H2), 3,01 (s, 3H, OMs), 3,03 (s, 3H, OMs), 3,41 (s, 3H, OCH₃), 3,81 (d, J = 4,8 Hz, 2H, H2 ), 4,01, 4,04 (AB, J = 10,5 Hz, 2H, H4 ), 4,21 (d, J = 7,5 Hz, IH, H3), 4,30, 4,50 (AB, J = 1,8 Hz, 2H, H5), 4,56, 4,63 (AB, J = 12,0 Hz, 2H, Bn), 4,99 (d, J = 5,1 Hz, IH, Hl), 7,30 až 7,42 (m, 5H, Bn); ); anal. spočítáno pro C17H27O10S2: C, 44,82; H, 5,97. Nalezeno: C, 44,68; H, 6,00.

Příklad 11 Příprava (JS, 3S, 4R, &S)-8-benzyloxy-l-hydroxymethyl-3-methoxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (11)

Do míchané směsi NaH (60% v minerálním oleji, 1,83 g, 22,90 mmol) v bezvodém THF (200 ml) byl přidán roztok 3-č?-benzyl-2-deoxy-2-hydroxymethyl-5-č?-mesyl-4-mesyloxymethyl-l-a-methyl-D-ribofuranózy (5,20 g, 11,45 mmol) v THF (30 ml). Výsledná reakčni směs byla míchána při 55 °C po dobu 42 h a poté byla reakce ukončena přídavkem vody při teplotě 0 °C. THF byl odpařen a byl přidán vodný NaOH (0,5 M, 250 ml). Vzniklá směs byla zahřívána pod refluxem po dobu 24 h, ochlazena na 0 °C, zneutralizována zředěnou kyselinou chlorovodíkovou na pH 8 a 4x extrahována methylenchloridem. Spojená organická vrstva byla vysušena (Na2SO4) a zahuštěna do suché formy. Po chromatografii na silikagelu v systému EtOAc-hexan (2:1 až 1:0) bylo získáno 3,16 g (98 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvého sirupu; 'HNMR (CDCI3) δ 2,32 (m, IH, H2), 3,41 (d, J = 11,4 Hz, IH, H4a ), 3,46 až 3,60 (m, 2H, 5H, H5, OCH₃), 3,91 (d, J = 11,1 Hz, IH, H4b ), 3,92 (dd, J = 10,8 Hz, 2,4 Hz, IH, H2a ), 4,01 (d, J = 5,4 Hz, IH, H3), 4,04 (d, J = 10,5 Hz, IH, H2b ), 4,58, 4,64 (AB, J = 12,0 Hz, Bn), 5,07 (d, J = 3,9 Hz, IH, Hl), 7,28 až 7,40 (m, 5H, Bn).

Příklad 12 Příprava (IR, 3S, 4R, Y5)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-methoxy-2,6-dioxabicyklo [3,2,1] oktanu (12)

Roztok (1S, 3S, 4R, &S)-8-benzyloxy-l-hydroxymethyl-3-methoxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (1,60 g, 5,71 mmol), acetanhydridu (1,08 ml, 11,42 mmol) a DMAP (2,09 g, 17,13 mmol) v bezvodém methylenchloridu (10 ml) byl míchán při laboratorní teplotě po dobu 2 h, poté byl ochlazen na 0 °C a zředěn methanolem (4 ml). Směs byla míchána 15 min. při laboratorní teplotě, poté byla zředěna methylenchloridem, promyta solným roztokem a poté 10% NaHCO₃, vysušena (Na₂SO₄) a zahuštěna do suché formy. Chromatografií na silikagelu v systému ethylacetát-hexan (1:1) bylo získáno 1,82 g (99 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvého sirupu; NMR (CDC1₃) δ 2,02 (s, 3H, OAc), 2,33 (m, 1H, H2), 3,50 (d, J = 10,8 Hz, 1H, H4a), 3,57 (s, 3H, OCH₃), 3,86 až 4,04 (m, 5H, H2a', H2b', H3, H4b^r, H5a), 4,14 (d, J = 12,0 Hz, 1H, H5b), 4,50, 4,64 (AB, J = 12,0 Hz, 1H, Bn), 5,09 (d, J = 3,9 Hz, 1H, Hl), 7,29 až 7,42 (m, 5H, Bn); anal. spočítáno pro C17H22O6: C, 63,34; H, 6,88. Nalezeno C, 63,41; H, 6,94.

Příklad 13 Příprava (IR, 3S, 4R, &S)-3-acetoxy-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (13)

Do míchaného roztoku (1S, 3S, 4R, S5)-8-benzyloxy-l-hydroxymethyl-3-methoxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (600 mg, 2,14 mmol) ve směsi kyseliny octové (6,0 ml) a acetanhydridu (0,6 ml) při teplotě 0 °C byla po kapkách přidávána koncentrovaná kyselina sírová (57 μΐ, 1,07 mmol). Výsledná směs byla míchána při teplotě 0 °C po dobu 10 min. a při laboratorní teplotě po dobu 2 h. Po ochlazení na 0 °C byl roztok naředěn EtOAc, 3 x promyt solným roztokem a poté 10% uhličitanem sodným, vysušen (Na₂SO4) a zahuštěn do suché formy.

Chromatografií na silikagelu v systému EtOAc-hexan (2:3) bylo získáno 696 (93 %) požadované sloučeniny (β-anomer) a 31 mg (3 %) α-anomeru, oba ve formě bezbarvého sirupu. β-anomer po několika dnech při laboratorní teplotě vykrystalizoval; t.t.. 55 až 58 °C; ’H NMR (CDC1₃) δ 2,03 (s, 3H, OAc), 2,08 (s, 3H, OAc), 2,36 až 2,39 (m, 1H, H2), 3,49 (d, J = 10,8 Hz, H4a), 3,73 (d, J= 11,1 Hz, 2,7 Hz, 1H, H2a ), 3,89 (d, J = 11,1 Hz, 1H, H4b'), 4,01 (d, J = 11,1 Hz, 1H, H2b ), 4,03 (d, J = 9,3 Hz, 1H, H5a), 4,14 (d, J = 5,1 Hz, 1H, H3), 4,55 (d, J = 9,6 Hz, 1H, H5b), 4,55, 4,64 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,39 (s, 1H, Hl), 7,29 až 7,42 (m, 5H, Bn); anal. spočítáno pro C18H22O7: C, 61,70; H, 6,33. Nalezeno C, 61,74; H, 6,46.

Příklad 14 Příprava (JR, 3S, 4R 55)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(thymin-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (14)

Směs thyminu (189 mg, 1,5 mmol) a bezvodého síranu amonného (15 mg) vHMDS (6 ml) byla zahřívána pod refluxem přes noc. Po odstranění HMDS, byl zbytek odpařen s bezvodým m-xylenem, vysušen pod vakuem po dobu 30 min. a rozpuštěn v roztoku (IR 3S, 4R, &S)-3-acetoxy-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (306 mg, 0,87 mmol) v 1,2-dichlorethanu (5 ml). Do tohoto míchaného roztoku pod argonem byl po kapkách přidáván trimethylsilyltriflát (0,38 ml) v 1,2-dichlorethanu (2 ml). Výsledný roztok byl zahříván 2 h pod refluxem, ochlazen na 0 °C, zředěn chloroformem a zneutralizován 10% NaiCOs (10 ml). Organická vrstva byla odddělena a vodná vrstva byla dvakrát extrahována chloroformem. Spojená organická vrstva byla vysušena (Na2SO4) a zahuštěna do suché formy. Krystalizaci z EtOAc-CHi-Ch byla získána požadovaná sloučenina (303 mg, 83 %) ve formě bezbarvé pevné látky; t.t. 198 až 200 °C; Ή NMR (CDC1₃) δ 1,94 (d, J = 1,2 Hz, IH, ArCH₃), 2,04 (s, 3H, OAc), 2,93 (m, IH, H2 ), 3,50 (dd, J = 11,8 Hz, 2,1 Hz, IH, H2a), 3,59 (d, J = 11,4 Hz, IH, H4a), 4,016 (d, J = 11,7 Hz, IH, H4b), 4,022 (d, J = 12,6 Hz, IH, H5a'), 4,09 (d, J = 12,0 Hz, IH, H2b), 4,11 (d, J = 4,5 Hz, IH, H3 ), 4,27 (d, J = 12,6 Hz, IH, H5b), 4,53, 4,70, (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 5,88 (d, J = 3,6 Hz, IH, H1'), 7,30 až 7,42 (m, 5H, Bn), 7,74 (d, J = 1,5 Hz, IH, H6), 8,79 (s, IH, NH); anal. spočítáno pro C21H24N2O7: C, 60,57; H, 5,81; N, 6,73. Nalezeno C, 60,55; H, 5,84; N, 6,69.

Příklad 15 Příprava (75, 35, 4R, <5^,5)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-3-(thymin-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (15)

Do roztoku (JR 3S, 4R 55)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(thymin-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu v bezvodém methylenchloridu (3 ml) při teplotě 10 °C byl přidáván chlorid boritý (1,0 M v CH2CI2, 6 ml). Výsledná reakční směs byla míchána při teplotě v rozmezí 15 °C až laboratorní teplota přes noc a poté byla ochlazena na 0 °C. Po kapkách byl přidán methanol (1,5 ml) a výsledná směs byla míchána 15 min. při teplotě 0 °C, poté následoval přídavek triethylaminu (2 ml). Rozpouštědlo bylo odpařeno a sraženina byla důkladně extrahována horkým acetonem. Acetonový roztok byl vysušen (Na2SC>4) a zahuštěn do suché formy. Chromatografií na silikagelu s použitím 10% methanolu v chloroformu bylo získáno 99 mg sloučeniny 20 ve formě bílé pěny. Krystalizaci z acetonu bylo získáno 95 mg (93 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvé pevné látky; t.t. 225 až 226 °C; NMR (DMSO-dr,) δ 1,76 (d,

J = 0,9 Hz, 1H, ArCH₃), 2,45 (m, 1H, H2 ), 3,25 (dd, J = 11,4 Hz, 2,1 Hz, 1H, H2a), 3,32 až

3,52 (m, 2H, H5'), 3,53 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H4a), 3,72 (d, J = 11,1 Hz, 1H, H4b), 3,93 (d, J = 11,1 Hz, 1H, H2b ), 4,16 (m, 1H, H3 ), 4,84 (t, J = 6,0 Hz, 1H, OH), 5,74 (d, J = 4,2 Hz, 1H, Hl'), 5,84 (d, J = 3,9 Hz, 1H, OH), 7,76 (d, J = 1,2 Hz, 1H, H6), 11,32 (s, 1H, NH); MS m/z 285 (MH⁺); anal. spočítáno pro C₁₂H₁₆N₂O₆; C, 50,70; H, 5,67; N, 9,85. Nalezeno: C, 50,85; H, 5,68; N, 9,75.

Příklad 16 Příprava (IR, 3R, 4R, <55)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(6-chloropurin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (17) a (IR, 3S, 4R, &S)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(6-chloropurin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (16)

Směs 6-chlorpurinu (246 mg, 1,6 mmol) a HMDS (8,0 ml) byla refluxována pod argonem po dobu 2 h. HMDS byl odpařen a zbytek byl sušen pod vakuem po dobu 30 min. a poté byl rozpuštěn v roztoku (IR, 3S, 4R, &S)-3-acetoxy-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (302 mg, 0,83 mmol) vbezvodém 1,2-dichlorethanu (5,0 ml). Poté následoval přídavek trimethylsilyltriflátu (0,38 ml, 2,25 mmol) v 1,2-dichlorethanu (2,0 ml). Výsledná směs byla zahřívána pod refluxem a pod argonem 45 min. Další postup byl stejný jako je uvedeno výše. Chromatografií na silikagelu v systému EtOAc-hexan (1:1) byly získány (IR, 3S, 4R, &S)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(6-chloropurin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktan (122 mg, α-anomer) a (IR, 3R, 4R, &S^T)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(6-chloropurin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktan (157 mg, β-anomer), obavě formě bezbarvé pevné látky. Celkový výtěžek byl 75 %. ct-isomer: ; Ή NMR (CDC1₃) δ 2,05 (s, 3H, OAc), 2,89 (m, 1H, H2 ), 3,23 (dd, J = 12,0 Hz, 2,4 Hz, 1H, H2a), 3,72 (d, J = 11,7 Hz, H4a), 4,09 (d, J = 12,3 Hz, 2H, H4, H5a), 4,13 (d, J = 13,2 Hz, 1H, H2b), 4,24 (d, J = 4,8 Hz, H3 ), 4,29 (d, J = 12,3 Hz, 1H, H5b ), 4,60, 4,74 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,50 (d, J = 4,2 Hz, 1H, Hl), 7,32 až 7,44 (m, 5H, Bn), 8,69 (s, 1H, H8), 8,78 (s, 1H, H2). β-isomer: t.t. 124 až 125 °C (EtOAc-hexan); Ή NMR (CDC1₃) δ 2,05 (s, 3H, OAc), 2,90 (m, 1H, H2'), 3,55 (d, J = 11,1 Hz, H4a), 3,95 až 4,03 (m, 2H, H2a, H4b), 4,18 až 4,24 (m, 3H, H5', H2b), 4,32 (d, J = 4,8 Hz, H3 ), 4,47, 4,63 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,52 (s, 1H, Hl'), 7,24 až 7,35 (m, 5H, Bn), 8,40 (s, 1H, H8), 8,72 (s, 1H, H2); anal. spočítáno pro C₂iH₂iN₄O₅Cl.: C, 56,70; H, 4,76; N, 12,59. Nalezeno: C, 56,36; H, 4,56; N, 12,37.

Příklad 17 Příprava (IR 3S, 4R &S)-l-acetoxymethyl-3-(N²-acetylguanin-9-yl)-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (22)

Směs N²-acetylguaninu (193 mg, 1,0 mmol) a síranu amonného (20 mg) v pyridinu (1,0 ml) a HMDS (5,0 ml) byla refluxována pod argonem po dobu 3 h. Vzniklý čirý roztok byl zahuštěn a odpařen spolu s xylenem (10 ml, vysušen sodíkem). Zbytek byl vysušen pod vakuem při teplotě 50 °C po dobu lha rozpuštěn v roztoku (IR 3S, 4R VSj-3-acetoxymethyl-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (175 mg, 0,5 mmol) vbezvodém 1,2-dichlorethanu (5,0 ml). Následoval přídavek trimethylsilyltriflátu (0,27 ml, 1,5 mmol) v 1,2-dichlorethanu (1,0 ml). Výsledný roztok byl míchán při laboratorní teplotě pod argonem po dobu 30 min., poté byl zahříván 2 hod na 70 až 75 °C, ochlazen na teplotu 0 °C a zneutralizován 10% uhličitanem sodným (10 ml). Výsledná směs byla míchána 15 min. a poté byla oddělena organická vrstva. Vodná vrstva byla dvakrát extrahována chloroformem. Spojená organická vrstva byla vysušena (Na2SO4) a zahuštěna do suché formy. Chromatografií na silikagelu s použitím 10% ethanolu v CHCb-EtOAc (1:1) byla získána požadovaná sloučenina (72 mg, 30 %) a to ve formě bezbarvé pevné látky; t.t. 249 °C (rozklad, EtOAc); ^JH NMR (CDCb) δ 2,01 (s, 3H, OAc), 2,29 (s, 3H, NAc), 2,75 (m, 1H, H2 ), 3,29 (dd, J = 11,7 Hz, 1,8 Hz, 1H, H2a'), 3,66 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H4a), 4,03 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H4b), 4,05 (d, J - 11,7 Hz, 1H, H2b'), 4,70 (d, J = 12,3 Hz, 1H, H5a), 4,13 (d, J = 4,8 Hz, H3 ), 4,23 (d, J = 12,3 Hz, 1H, H5b ), 4,53, 4,67 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,17 (d, J = 4,2 Hz, 1H, Hl), 7,28 až 7,40 (m, 5H, Bn), 8,32 (s, 1H, H8), 9,80 (s, 1H, NH), 12,12 (s, 1H, NH).

Příklad 18 Příprava (JS, 3R 4R VSj-3-(adenin-9-yl)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-2,6-dioxabicyklo[3,2, ljoktanu (18)

Roztok (IR 3R 4R VSj-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(6-chloropurin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (100 mg, 0,225 mmol) ve směsi dioxanu (20 ml) a 30% vodného hydroxidu amonného (20 ml) byl zahříván v ocelové tlakové láhvi při 100 °C po dobu 16 h. Rozpouštědla byla odpařena a zbytek byl rozpuštěn v methanolu. Následoval přídavek 20% hydroxidu paladnatého na aktivním uhlí (~ 50% voda, 3 x 250 mg, přidáno každý den). Hydrogenolýza byla prováděna při laboratorní teplotě za tlaku vodíku 55 psi po dobu 4 dnů. Katalyzátor byl odfiltrován a promyt methanolem. Spojený methanolový roztok byl zahuštěn a zbytek byl podroben chromatografii na silikagelu s použitím 20% methanolu v methylenchloridu. Výsledkem byla požadovaná sloučenina (39 mg, 59%) ve formě bezbarvé « · · · « pevné látky, která byla z methanolu krystalizována; t.t. 250 °C (rozklad); *H NMR (DMSO-dé + D₂O): δ 2,53 (m, ΙΗ, H2 ), 3,33 (d, J = 11,1 Hz, ÍH, H2a), 3,40 (d, J = 12,3 Hz, ÍH, H5a ),

3,50 (d, J = 12,6 Hz, ÍH, H5b), 3,69 až 3,76 (m, 2H, H2b, H4a), 4,05 (d, J = 10,2 Hz, H4b), 4,45 (d, J = 5,1 Hz, ΙΗ, H3 ), 6,26 (s, ÍH, Hl), 7,28 (m, 2H, NH₂), 8,12 (s, ΙΗ, H8),

8,33 (s, ÍH, H2); MS: 294 (MHj; anal. spočítáno pro Ci₂Hi₅N₅O₄; C, 49,14; H, 5,16; N, 23,88. Nalezeno: C, 49,01; H, 4.97; N, 23,92.

Příklad 19 Příprava (JS, 3S, 4R, 55)-3-(adenin-9-yl)-8-hydroxy-1-hydroxymethy 1-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (19)

Podobný postup jako je uveden v příkladu 18 poskytl z (77?, 35, 4R, 55)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(6-chloropurin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (100 mg) požadovanou sloučeninu (43 mg, 65 %) jako bezbarvou pevnou látku. 'H NMR (CD3OD): δ 2,71 (m, ÍH, H2 ), 3,13 (dd, J = 11,7 Hz, 2,4 Hz, ÍH, H2a ), 3,57 (d, J = 12,6 Hz, ÍH, H5a), 3,64 (d, J= 11,1 Hz, H4a ), 3,68 (d, J = 12,3 Hz, ÍH, H5b ), 3,96 (d, J = 11,1 Hz, ÍH, H4b), 4,14 (d, J = 11,7 Hz, ÍH, H2b), 6,39 (d, J = 4,2 Hz, ÍH, Hl), 8,04 (s, ΙΗ, H8), 8,44 (s, 1H, H2); MS m/z 294 (MH⁺).

Příklad 20 Příprava (75, 37?, 4R, 55)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-3-(hypoxanthin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (20)

Do roztoku (77?, 3R, 4R, 55)-3-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(6-chloropurin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (150 mg, 0,34 mmol) a merkaptoethanolu (0,19 ml, 2,7 mmol) v methanolu (20 ml) byl přidán methoxid sodný (0,37 ml 5,4 M v methanolu, 2,0 mmol). Výsledný roztok byl zahříván 6 hod pod refluxem, ochlazen na laboratorní teplotu, zneutralizován 10% AcOH na pH

7. Methanol byl odpařen a zbytek byl naředěn 1,0 M NaHCOg (15 ml). Následovala extrakce 10% methanolem v chloroformu tak dlouho, dokud vodná fáze obsahovala produkt. Spojená organická vrstva byla vysušena (Na₂SO₄) a zahuštěna do suché formy. Chromatografií na silikagelu s použitím 10 až 15% methanolu v chloroformu bylo získáno 109 mg (84 %) inosinového derivátu (není uveden) ve formě bezbarvé pevné látky, z čehož 100 mg (0,26 mmol) bylo rozpuštěno v methanolu, následoval přídavek 20% hydroxidu paladnatého na aktivním uhlí (50% voda, 600 mg). Hydrogenolýza byla prováděna při laboratorní teplotě za tlaku vodíku 50 psi po dobu 3 dnů. Katalyzátor byl odfiltrován a promyt methanolem. Spojený methanolový roztok byl zahuštěn a zbytek byl chromatografován na silikagelu s použitím 20 až 25%

methanolu v methylenchloridu. Výsledkem bylo 61 mg (61 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvé pevné látky, která byla ze systému methanol-ethylacetát krystalizována; t.t. 220 °C (rozklad); NMR (DMSO-de): δ 2,52 (m, 1H, H2 ), 3,30 až 3,55 (m, 3H, H5', H4a), 3,69 (dd, J = 11,1 Hz, 2,7 Hz, 1H, H2a), 3,73 (d, J = 10,8 Hz, H4b ), 4,05 (d, J = 10,8 Hz, 1H, H2b ), 4,40 (m, 1H, H2b), 5,03 (t, J = 6,0 Hz, 1H, OH), 5,74 (d, J = 4,2 Hz, 1H, OH), 6,24 (s, 1H, Hl'), 8,06 (s, 1H, H8), 8,30 (s, 1H, H2), 12,40 (s, 1H, NH); MS m/z 295 (MH⁺).

Příklad 21 Příprava (1S, 3S, 4R, #5')-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-3-(hypoxanthin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (21)

Do roztoku (IR 3S, 4R &V)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(6-chloropurin-9-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (120 mg, 0,27 mmol), merkaptoethanolu (0,15 ml, 2,1 mmol) v methanolu (16 ml) byl přidán methoxid sodný (1,62 mmol, 0,30 ml 5,4 M v methanolu). Pro přípravu požadované sloučeniny byl použit podobný postup jako je popsán v příkladu 20. Výsledkem postupu bylo 37 mg (47 %) požadované sloučeniny ve formě hydroskopické pevné látky; ’Η NMR (DMSO-de): δ 2,52 (m, 1H, H2 ), 3,06 (dd, J = 11,7 Hz, 2,4 Hz, 1H, H2a''), 3,34 až 3,53 (m, 2H, H5 ), 3,56 (d, J - 11,1 Hz, 1H, H4a ), 3,79 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H4b), 3,98 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H2b), 4,31 (d, J = 4,5 Hz, 1H, H3 ), 4,89 (br, 1H, OH), 5,99 (br, 1H, OH),

6,28 (d, J = 4,2 Hz, 1H, H1'), 8,03 (s, 1H, H8), 8,27 (s, 1H, H2), 12,30 (br, 1H, NH).

Příklad 22 Příprava (1S, 3S, 4R, &Y)-3-(guanin-9-yl)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (23)

Podobný postup jako je uveden v příkladu 18 poskytl z (IR, 3S, 4R &S)-l-acetoxymethyl-3-(N²-acetylguanin-9-yl)-8-benzyloxy-2,6-bioxabicyklo[3,2,l]oktanu (100 mg) požadovanou sloučeninu (41 mg, 66 %) ve formě skoro čistě bílé pevné látky. ’H NMR (DMSO-de + D₂O): δ 2,42 (m, 1H, H2 ), 3,15 (dd, J = 11,4 Hz, 2,1H, 1H, H2a3,34 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H5a ), 3,47 (d, J = 12,6 Hz, 1H, H5b ), 3,51 (d, J = 12,0 Hz, 1H, H4a), 3,77 (d, J = 10,8 Hz, 1H, H4b'), 3,98 (d, J = 11,7 Hz, 1H, H2b”), 4,23 (d, J = 4,8 Hz, 1H, H3 ), 4,80 (br, 1H, OH), 5,90 (br, 1H, OH), 6,05 (d, J = 4,2 Hz, 1H, Hl), 6,52 (br, 2H, NH₂), 7,93 (s, 1H, H8), 12,30 (br, 1H, NH); MS m/z 310 (MH).

Příklad 23 Příprava (IR, 3R, 4R, 8S)- l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3 -(thymin- l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (24)

Reakce byly stejné jako jsou uvedeny v postupu příkladu 14 až na to, že jako spojovací činidlo byl použit chlorid cíničitý (IV) (0,45 ml) a sacharidovým substrátem byl (IR, 3S, 4R 8S)~ -l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-methoxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktan (202 mg, 0,63 mmol). Chromatografií na silikagelu s použitím 5% EtOH v CH2CI2 byla získána směs (233 mg, 89 %) požadované sloučeniny (β-anomer) a jejího α-anomeru (poměr β:α, asi 4:1) ve formě bezbarvé pevné látky; ^!H NMR (CDCI3) β-anomeru (ze spektra směsi a a β-anomerů) δ 1,93 (d, I = 0,9 Hz, ÍH, ArCH₃), 2,05 (s, 3H, OAc), 2,66 (m, ÍH, H2), 3,48 (d, J = 11,1 Hz, H4a'), 3,86 až 4,12 (m, 5H, H2a, H2b , H3, H4b, H5a), 4,26 (d, J = 12,6 Hz, H5b), 4,44, 4,64, (AB, J = 11,4 Hz, 2H, Bn), 6,06 (s, ÍH, Hl), 7,26 až 7,42 (m, 5H, Bn), 7,59 (d, J = 1,2 Hz, ÍH, H6), 8,94 (s, ΙΗ,ΝΗ).

Příklad 24 Příprava (IR, 3R 4R, &S’)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(uracil-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (25)

Podobným postupem, jako je popsán v příkladu 23, byla po chromatografíi na silikagelu s použitím 5% EtOH v methylenchloridu získána z (IR, 3S, 4R &S)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-methoxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (230 mg, 0,71 mmol) a ze silylovaného uracilu (2,0 mmol) směs (267 mg, 87 %) požadované sloučeniny a jejího α-anomeru (poměr β:α asi 9:1) ve formě bezbarvé pevné látky. Požadovaná sloučenina (β-anomer) byla částečně separována chromatografií na silikagelu; t.t. 145 až 147 °C (EtOAc-hexan); ^lH NMR (CDCI3) δ 2,02 (s, 3H, OAc), 2,67 (m, ÍH, H2), 3,49 (d, J = 11,4 Hz, ÍH, H4a ), 3,86 až 3,97 (m, 3H, H2a , H3, H4b), 4,08 (d, I = 12,3 Hz, ÍH, H5a), 4,09 (d, J = 10,5, ÍH, H2b), 4,25 (d, I = 12,3 Hz, 1H, H5b), 4,44, 4,64, (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,05 (s, ÍH, Hl ), 7,26 až 7,40 (m, 5H, Bn), 5,69 (d, I = 8,1 Hz, ÍH, H5), 7,79 (d, I = 8,4 Hz, ÍH, H6), 8,92 (s, ÍH, NH); anal. spočítáno pro C20H22N2O7; C, 59,69; H, 5,51; N, 6,96. Nalezeno: C, 59,45; H, 5,56; N, 6,91.

Příklad 25 Příprava (IR, 3R, 4R, &S)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(N⁴-benzoyl cytosin-1-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,1] oktanu (26)

Podobným postupem, jako je popsán v příkladu 23, bylo po chromatografíi na silikagelu s 5% EtOH v methylenchloridu získáno z reakce (IR, 3S, 4R &S)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy22

-3-methoxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (645 mg, 2,0 mmol) se silylovaným N⁴-benzoylcytosinem (4,0 mmol) 910 mg (90 %) požadované sloučeniny (β-anomer) ve formě bezbarvé pevné látky; t.t. 173 až 174 °C (EtOAc); ’H NMR (CDCb) δ 2,07 (s, 3H, OAc), 2,83 (m, ÍH, H2 ), 3,51 (d, J = 11,1 Hz, H4a'), 3,86 (d, J = 5,4 Hz, ÍH, H3 ), 3,97 (d, J = 11,1 Hz, ÍH, H4b), 3,99 až 4,13 (m, 3H, H2a, H2b, H5a'), 4,27 (d, J = 12,3 Hz, ÍH, H5b'), 4,38, 4,61, (AB, J = 11,4 Hz, 2H, Bn), 6,15 (s, ÍH, Hl), 7,24 až 7,38 (m, 5H, Bn), 7,50 až 7,66 (m, 4H, H5, Bz), 7,90 (m, 2H, Bz), 8,28 (d, J = 7,5 Hz, ÍH, H6), 8,84 (br, ÍH, NH); anal. spočítáno pro C27H27N3O7: C, 64,15; H, 5,38; N, 8,31. Nalezeno: C, 64,10; H, 5,20; N, 8,43.

Příklad 26 Příprava (JS, 3R, 4R, &S)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-3-(thymin-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (27)

Do roztoku směsi (IR, 3R, 4R, &S)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(thymin-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu a jeho α-anomeru (asi 4:1, 200 mg, 0,48 mmol) v bezvodém methylenchloridu (4 ml) při teplotě 0 °C byl přidán chlorid boritý (1,0 M VCH2CH2, 8 ml). Výsledná reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 8 h, při teplotě 15 °C přes noc a poté byla ochlazena na 0 °C. Po kapkách byl přidán methanol (5,0 ml), následovalo přidávání 1,0 M NaOMe v MeOH tak dlouho, až bylo dosaženo pH 8. Roztok byl separován a sraženina byla důkladně extrahována 20% methanolem v methylenchloridu. Spojený filtrát byl vysušen (Na2SO₄) a zahuštěn do suché formy. Chromatografií na silikagelu s použitím 10 až 15% methanolu v ethylacetátu byla získána požadovaná sloučenina (78 mg), směs požadované sloučeniny a jejího a-anomeru (24 mg) a a-anomer (23 mg), vše ve formě bezbarvé pevné látky. Celkový výtěžek byl 91 %. Krystalizaci požadované sloučeniny ze systému methanol-ethylacetát byla získána krystalická pevná látka; t.t. 217 až 218 °C; ’H NMR (DMSO-de) δ 1,75 (d, J = 1,2 Hz, ÍH, ArCH₃), 2,24 (m, ÍH, H2 ), 3,20 (d, J = 10,8 Hz, ÍH, H4a), 3,33 až 3,58 (m, 3H, H2a, H5 ), 3,66 (d, J = 10,8 Hz, H4b), 3,97 (d, J = 10,5 Hz, ÍH, H2b), 4,14 (m, ÍH, H3 ),

5,24 (t, J = 5,1 Hz, ÍH, OH), 5,67 (d, J = 2,4 Hz, ÍH, OH), 5,82 (s, ÍH, Hl), 7,95 (d, J = 0,9 Hz, ÍH, H6), 11,32 (s, ÍH, NH); MS m/z 285 (MH⁺); anal. spočítáno pro C12H16N2O6; C, 50,70; H, 5,67; N, 9,85. Nalezeno: C, 50,65; H, 5,57; N, 9,73.

Příklad 27 Příprava (1S, 3R, 4R, &S)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-3-(uracil-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (28)

Podobným postupem, jako je popsán v příkladu 26, bylo po chromatografii na silikagelu s použitím 10% methanolu v methylenchloridu získáno z (IR, 3R, 4R, SXj-l-acetoxymethyl-S-benzyloxy-3-(uracil-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (215 mg, 0,53 mmol) 110 mg (76 %) požadované sloučeniny ve formě bílé pevné látky. Zmíněná sloučenina byla kontaminována malým množstvím α-anomeru. Čistá požadovaná sloučenina byla získána rekrystalizací ze systému aceton-ethylacetát; t.t. 218 až 219 °C; Ή NMR (aceton-de) δ 2,42(m, ΙΗ, H2'), 3,27 (d, J = 10,8 Hz, 1H, H4a'), 3,58 až 3,72 (m, 3H, H2a , H5), 3,83 (d, J = 10,8 Hz, H4b), 4,13 (d, J = 10,5 Hz, 1H, HH2b '), 4,37 (t, J = 5,1 Hz, 1H, OH), 4,42 (m, ΙΗ, H3), 4,88 (d, J = 3,9 Hz, 1H, OH), 5,52 (d, J = 7,8 Hz, ΙΗ, H5), 5,95 (s, 1H, Hl), 8,17 (d, J - 7,8 Hz, ΙΗ, H6), 10,02 (s, 1H, NH); MS m/z 271 (MEČ); anal. spočítáno pro C11H14N2O6: C, 48,89; H, 5,22; N, 10,37. Nalezeno: C, 48,60; H, 5,64; N, 10,21.

Příklad 28 Příprava (75, 3R, 4R, &S)-3-(cytosin-l-yl)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (30)

Podobným postupem, jako je popsán v přikladu 26, bylo po chromatografii na silikagelu s použitím 10% methanolu v methylenchloridu získáno z (IR, 3R, 4R, ó'X)-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-(N⁴-benzoylcytosin-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu 364 mg (65 %) sloučeniny (75, 3R, 4R, 5ó)-3-(N⁴-benzoylcytosin-l-yl)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (760 mg), z čehož 120 mg (0,32 mmol) bylo rozpuštěno v nasyceném roztoku amoniaku v methanolu a roztok byl míchán při laboratorní teplotě po dobu 24 h. Amoniak a methanol byly odpařeny a zbytek byl rozpuštěn ve vodě, následovala důkladná extrakce chloroformem (5x) a poté toluenem (2x). Voda byla odpařena a krystalizací z methanolu bylo získáno 62 mg požadované sloučeniny (45 mg krystalické pevné látky a 17 mg nekrystalické pevné látky); t.t. 250 °C (rozklad); *H NMR (CD3OD) δ 2,33 (m, ΙΗ, H2), 3,31 (d, J = 11,1 Hz, 1H, H4a), 3,57 (d, J - 12,3 Hz, 1H, H5a), 3,65 (d, J = 12,3 Hz, 1H, H5b), 3,78 (dd, J = 10,5 Hz, 2,7 Hz, H2a), 3,84 (d, J = 11,1 Hz, 1H, H4b), 4,14 (d, J = 10,5 Hz, 1H, H2b), 4,20 (d, J = 5,1 Hz, ΙΗ, H3), 5,86 (d, J = 7,5 Hz, ΙΗ, H5), 5,96 (s, 1H, Hl'), 8,22 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H6); MS m/z 270 (MH⁺); anal. spočítáno pro CnHi5N₃O₅; C, 49,07; H, 5,62; N, 15,61. Nalezeno: C, 48,93; H, 5,55; N, 15,64.

Podobně byl připraven (1S, 3R, 4R 8S)-3 -(N⁴-acetylcytosin-l-yl)-8-hydroxy-l -hydroxymethyl-2,6-dioxabicyklo[3,2, ljoktan.

Alternativní postup. Směs (1S, 3R, 4R, &S)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-3-(uracil-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (170 mg, 0,63 mmol), acetanhydridu (2,16 ml, 20,1 mmol) a pyridinu (0,29 ml, 3,5 mmol) v bezvodém DMF (2,5 ml) byla míchána při laboratorní teplotě přes noc, poté byla zředěna methylenchloridem, promyta solným roztokem a 10% NaHCCh, vysušena (NazSCL) a zahuštěna do suché formy. Chromatografií na silikagelu v systému ethylacetát-hexan (2:1) bylo získáno 117 mg (77 %) 3',5'-diacetylového derivátu (75, 3R 4R, #S)-8-acetoxy-l-acetoxymethyl-3-(uracil-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu.

(1S, 3R, 4R &S)-8-acetoxy-l-acetoxymethyl-3-(uracil-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktan (175 mg, 0,58 mmol) byl rozpuštěn v bezvodém pyridinu (1,5 ml) a výsledný roztok byl ochlazen na teplotu 0 °C pod argonem, následoval přídavek 4-chlorofenyldichlorofosfátu (0,29 ml, 1,75 mmol). Výsledný roztok byl zahříván až na laboratorní teplotu a poté byl převeden do lahvičky se septovým uzávěrem, obsahující 1,2,4-triazol (120 mg, 1,75 mmol). Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 3 dnů, naředěna CH2CI2, promyta solným roztokem a 5% NaHCCh, vysušena (Na2SO4) a zahuštěna do suché formy. Zbylá směs byla rozpuštěna v dioxanu (7 ml) a 30% hydroxidu amonném (10 ml). Roztok byl ponechán stát při laboratorní teplotě 16 h a poté byla rozpouštědla odpařena. Zbytek byl chromatografován na silikagelu v systému EtaN-MeOH-CHCfi (5:30:65) a výsledkem bylo 74 mg (55 %) požadované sloučeniny a to ve formě mírně oranžové pevné látky.

Příklad 29 Příprava (IR, 3R 4R, &S)-l-acetoxymethyl-3-(N²-acetylguanin-7-yl)-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (31)

Silylovaná báze byla připravena z N²-acetylguaninu (386 mg, 2,0 mmol) podle postupu, který je popsán v příkladu 17. Poté byla rozpuštěna v roztoku (IR, 3S, 4R RJ-l-acetoxymethyl-8-benzyloxy-3-methoxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (477 mg, 1,48 mmol) v bezvodém 1,2-dichlorethanu (10 ml). Poté následoval přídavek chloridu cíničitého (0,75 ml) v 1,2-dichlorethanu (2,0 ml). Výsledná směs byla zahřívána pod refluxem 3 h, poté při teplotě 70 °C přes noc a pak byla ochlazena na 0 °C. Směs byla zneutralizována 2,0 M uhličitanem sodným, zfiltrována přes celit a důkladně extrahována chloroformem. Spojený filtrát byl vysušen (Na2SO4) a zahuštěn do suché formy. Chromatografií na silikagelu v systému 5% EtOH

v chloroformu bylo získáno 297 mg (42 %) požadované sloučeniny, 73 mg (10 %) Nespojeného β-anomeru požadované sloučeniny a 46 mg (6 %) N⁹-spojeného α-anomeru. Všechny látky byly ve formě bílé pevné látky. Požadovaná sloučenina: t.t. 176 až 178 °C (CH₃Cl-EtOAc); *H NMR (CDC1₃) δ 2,09 (s, 3H, OAc), 2,40 (s, 3H, NAc), 2,78 (m, ΙΗ, H2 ), 3,53 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H4a), 3,99 (d, J = 11,1 Hz, H4b ), 4,03 až 4,18 (m, 4H, H2a , H2b , H3 , H5a), 4,26 (d, J =

12,6 Hz, 1H, H5b), 4,39, 4,58 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,62 (s, 1H, Hl ), 7,22 až 7,40 (m, 5H, Bn), 8,21 (s, ΙΗ, H8), 10,60 (s, 1H, NH), 12,34 (s, 1H, NH); anal. spočítáno pro C2₃H₂₅N₅O₈; C, 55,31; H, 5,05; N, 14,02. Nalezeno: C, 55,35; H, 4,83; N, 13,80.

Přiklad 30 Příprava (IR, 3R, 4R, &S)-l-acetoxymethyl-3-(N²-acetylguanin-9-yl)-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo[3,2, ljoktanu (32)

Stejné množství silylovaného N²-acetylguaninu jako je popsáno v příkladu 29 bylo rozpuštěno v roztoku (IR, 3R, 4R, &S)-l-acetoxymethyl-3-(N²-acetylguanin-7-yl)-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (370 mg, 0,76 mmol) v bezvodém 1,2-dichlorethanu (10 ml) a byl přidán trimethylsilyltriflát (0,54 ml, 3,0 mmol) v 1,2-dichlorethanu (3 ml). Výsledný roztok byl zahříván pod refluxem přes noc. Poté byl přidán další TMSOTf (0,54 ml) a směs byla refluxována další dva dny. Dále bylo pokračováno stejně jako je to popsáno v příkladu 29. Po chromatografii na silikagelu v systému 5% ethanol v chloroformu bylo získáno 104 mg (28 %) neporušeného výchozího materiálu, 91 mg (25 %) požadované sloučeniny a 80 mg (22 %) α-anomeru požadované sloučeniny, vše ve formě bílé pevné látky. Požadovaná sloučenina; t.t. 128 až 131 °C (CH₃Cl-EtOAc); *H NMR (CDCb) δ 2,02 (s, 3H, OAc), 2,30 (s, 3H, NAc), 2,67 (m, ΙΗ, H2), 3,50 (d, J = 10,8 Hz, 1H, H4a ), 3,78 (dd, J = 10,8 Hz, 2,7 Hz, 1H, H2a ), 3,99 (d, J = 10,8 Hz, H4b), 4,12 (d, J = 12,3 Hz, 1H, H5a), 4,14 (d, J = 10,8 Hz, 1H, H2b ), 4,27 (d, J = 12,3 Hz, 1H, H5b), 4,33 (d, J = 5,1 Hz, ΙΗ, H3 ), 4,49, 4,62 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn),

6,25 (s, 1H, Hl ), 7,26 až 7,38 (m, 5H, Bn), 7,83 (s, ΙΗ, H8), 9,0 (s, 1H, NH), 11,95 (s, 1H, NH); MS: m/z 310 (MH); anal. spočítáno pro C2₃H₂5N₅O₈; C, 55,31; H, 5,05; N, 14,02. Nalezeno: C, 55,70; H, 5,00; N, 13,95.

Příklad 31 Příprava (1S, 3R, 4R, &S)-3-(guanin-9-yl)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (33)

Stejným postupem jako je popsán v příkladu 22 bylo po chromatografii silikagelu získáno z (IR, 3R, 4R, &S^r)-l-acetoxymethyl-3-(N2-acetylguanin-9-yl)-8-benzyloxy-2,6-dioxabicyklo- 26

[3,2,l]oktanu (180 mg) 52 mg (45 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvé pevné látky. Krystalizací ze směsi voda-ethanol (9:1) byla získána krystalická pevná látka; t.t. 258 °C (rozklad); ^lH NMR (DMSO): δ 2,45 (m, IH, H2'), 3,31 (d, J = 10,8 Hz, IH, H4a), 3,36 až 3,50 (m, 2H, H5a', H5b), 3,60 (dd, J - 10,2 Hz, 2,7 Hz, IH, H2a), 3,1 (d, J = 11,1 Hz, H4b'), 4,03 (d, J = 10,5 Hz, IH, H2b”), 4,36 (m, IH, H3 ), 4,95 (t, J = 5,7 Hz, IH, OH), 5,70 (d, J = 3,9, IH, OH), 6,06 (s, IH, ΗΓ), 6,55 (br, 2H, NH₂), 7,90 (s, IH, H8), 10,68 (s, IH, NH), 10,68 (s, IH, NH); MS: m/z310(MH⁺).

Příklad 32 Příprava (1S, 3R, 4R, &S)-8-hydroxy-1-(4,4-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(N⁴-acetylcytosin-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (35)

Roztok (1S, 3R, 4R, 5ó)-8-hydroxy-l-hydroxymethyl-3-(N⁴-acetylcytosin-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (200 mg, 0,64 mmol) a 4,4-dimethoxytritylchloridu (548 mg, 0,61 mmol) v bezvodém pyridinu (7 ml) byl ponechán stát při laboratorní teplotě přes noc, poté byl zředěn ethylacetátem, promyt solným roztokem a 10% NaHCO3, vysušen síranem sodným a zahuštěn. Po chromatografii na silikagelu s použitím 10% ethanolu v chloroformu bylo získáno 342 mg (87 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvé pěny.

Podobně byly připraveny (JS, 3R, 4R &S)-8-hydroxy-1-(4,4-dimethoxytrityloxymethy 1)^-(N^benzoyl-cytosin-l-ylj-ž^-dioxabicyklo [3,2,l]oktan (36) a (JS, 3R, 4R, 55)-8-hydroxy-l-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(thymin-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktan (34).

Příklad 33 Příprava (IS, 3R, 4R, &S)-8-hydroxy-l-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(N⁴-acetylcytosÍn-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktan-8-O-(2-kyanoethyl-N,N-diisopropylfosforamidit) (38)

Do míchaného roztoku (JS, 3R, 4R, &S^r)-8-hydroxy-l-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(N⁴-acetyl-cytosin-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktanu (320 mg, 0,52 mmol) a diisopropylethylaminu (0,36 ml, 2,08 mmol) v bezvodém dichlormethanu (6 ml) při teplotě 0 °C pod argonem byl po kapkách přidáván 2-kyanoethyl-N,N-diisopropylchlorofosforamidit (0,23 ml, 1,04 mmol). Výsledný roztok byl míchán při teplotě okolí po dobu 4 h, poté byl ochlazen v ledu, zředěn ethylacetátem, promyt ledovým 10% NaHCCh, vysušen síranem sodným a při teplotě místnosti zahuštěn. Chromatografií na silikagelu v 5% triethylaminu a 5% acetonu v methylenchloridu bylo získáno 376 mg (89 %) požadované sloučeniny ve formě bezbarvé pěny.

Podobně byly připraveny (JS, 3R, 4R, &S)-8-hydroxy-l-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(N⁴-benzoyl-cytosin-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktan-8-O-(2-kyanoethyl-N,N-diisopropylfosforamidit) (39) a (JS, 3R, 4R, &S)-8-hydroxy-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(thymin-l-yl)-2,6-dioxabicyklo[3,2,l]oktan-8-O-(2-kyanoethyl-N,N-diisopropylfosforamidit) (37).

Příklad 34 Příprava oligonukleotidů obsahujících 2,4-bicyklonukleotidy

Tento příklad ilustruje použití bicyklonukleosidových fosforamiditů 37 až 39 pro syntézu oligonukleotidu, obsahujícího bicyklonukleosidy s 2 '-C,4'-C-můstkem. Oligonukleotidy v tomto příkladu byly syntetizovány použitím fosforamiditového přístupu. Modifikované nukleotidy byly syntetizovány standardním postupem (protokol pro ABI 394 Synthesizer od Perkin-Elmer, 1994) až na to, že byly použity koncentrovanější roztoky a prodloužená doba reakce. Roztoky pro modifikované fosforamidity byly 0,13 M což je o 30 % koncetrovanější než ty, které byly použity pro nemodifikované fosforamidity (0,1 M). Pro spojení bylo použito 10 min. pro modifikované fosforamidity a 5 min. pro nemodifikované fosforamidity podobné modifikovaným. Výtěžky spojení pro modifikované fosforamidity jsou srovnatelné s výtěžky pro nemodifikované (98 až 99 %). Modifikované ODN byly přečištěny HPLC na reverzní fázi a charakterizovány hmotnostní spektrometrií.

Následující syntetizované sekvence jsou uvedeny jako příklady.

-d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3'

-d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3 '-d( ATCTCTCCGCTTCCTTTQ-3' '-d( ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3'

-d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3

-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'

-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3

A, C, G a T = nemodifikovaný deoxyribonukleosid

T = thymidin s 2',4'-C-můstkem

C = deoxycytidin s 2',4-C-můstkem

Příklad 35 Hybridizační vlastnosti oligonukleotidu obsahujících bicyklonukleotidy s 2'-C,4-C-můstkem

Hybridizace modifikovaných oligonukleotidů s komplementární DNA a RNA byla studována prostřednictvím měření termodynamických tání (Wang a kol., Nucleosides Nucleotides 1997, 16, 445). Jak může být patrné ztab. 1, modifikace podstatně zvyšují hybridizací sRNA. Pro sekvence obsahující bicyklický thymidin T se zvýšení hodnot Tm pohybuje v rozmezí 2,2 až 3,3 stupňů připadajících na 1 modifikaci. Sekvence obsahující bicyklický cytidin C mají rovněž vyšší hodnoty Tm než nemodifikované oligonukleotidy. V případě sekvence 4 o 2,4 ° vyšší na 1 modifikaci a pro sekvenci 5 o 1,9 ° vyšší na 1 modifikaci. Sekvence 12 obsahuje chybně spojený nukleosid (G uprostřed sekvence je nahrazeno T) a má hodnotu Tm o jedenáct stupňů níže než sekvence 10, což odhaluje sekvenční specifitu. Pro sekvence, ve kterých jsou všechny T a C nahrazeny T a C, byly hodnoty Tm (>90°) dále zvýšeny tak, že nebylo možné získat v měřícím systému přesné hodnoty .

Tabulka 1. Údaje o hybridizací oligonukleotidů obsahujících bicyklonukleosidy s 2 -C-4 -Cmůstkem

Sekvence	Tm °C RNA	Δ Tm °C/Mod.
1.	5 -d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3'	64,4
2.	5 -d( ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3	78,1	+2,8
3.	5 -d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3	~82	+2,2
4.	5 -d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3'	71,7	+2,4
5.	5 '-d( ATCTCTCCGCTTCCTTTQ-3'	77,5	+1,9
6.	5 -d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3	>90
7.	5 -d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'	63,0

Tabulka 1. - pokračování

	Sekvence	Tm °C RNA	Δ Tm °C/Mod.
8.	5 -d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'	69,5	+3,3
9.	5 -d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'	76,2	+3,3
10.	5 -d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'	81,4	+2,3
11.	5 -d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3	>90
12.	5 -d(CTTCCTGTCTTATGGCTTC)-3'	70,3
T =	thymidin s 2',4'-C-můstkem, C = cytidin	s 2',4'-	C-můstkem. Vzorky pro měření Tm

obsahovaly 2,0 μΜ modifikovaný oligonukleotid a 2,0 μΜ buď komplementární DNA nebo RNA v pufru (10 mM fosfátový sodný, 0,1 mM EDTA a 0,1 M NaCI, pH 7,0).

Byla tedy odhalena specifická provedení a aplikace zobrazení a způsobů přípravy nových nukleosidů a oligonukleotidů s bicyklickými sacharidovými skupinami. Odborníkům v dané oblasti by však mělo být zřejmé, že je možno provést řadu modifikací zde popsaného, aniž by tím došlo k odchýlení se od zde uvedeného vynálezeckého pojetí. Předmět vynálezu tudíž není omezen, ale musí být ve smyslu přiložených nároků. Při interpretaci jak specifikace tak i nároků by měly být všechny termíny interpretovány v co nej širším smyslu v souladu s kontextem. Konkrétně termíny „obsahuje“ a „obsahující“ by měly být interpretovány jako vztahující se k prvkům, složkám nebo krokům v nevylučujícím smyslu, který naznačuje, že prvky, složky nebo kroky mohou být přítomny nebo využívány nebo kombinovány s jinými prvky, složkami nebo kroky, které nejsou záměrně uváděny.

řt/MoO-W/J

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina podle obecného vzorce

Y kde X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří O, S, CH₂, NR, ΟΌ, C=CH₂ nebo nic, R je zvoleno ze skupiny, kterou tvoří vodík, alkyl, alkenyl, alkynyl, acyl;

Ri je vybráno ze skupiny, kterou tvoří adenin, cytosin, guanin, hypoxanthin, uráčil, thymin, heterocykly, H, OCH₃, OAc, halogen, sulfonát;

R₂, R₃ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny, kterou tvoří H, OH, DMTO, TBDMSO, BnO, ΊΉΡΟ, AcO, BzO, OP(NiPr₂)O(CH₂)₂CN, OPO₃H, difosfát, trifosfát; R₂ a R₃ mohou být PhCHO₂, ITPDSO₂ nebo DTBSO₂.
2. Sloučenina podle nároku 1, kde X je kyslík; Y je O, S, NH nebo methylen; Z je methylen.
3. Oligonukleotid obsahující alespoň jeden monomer podle nároku 1.
4. Oligonukleotid obsahující alespoň jeden monomer podle nároku 2.
5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že farmaceutickým prostředkem je antivirální prostředek.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že antivirální prostředek má aktivitu proti virusu vybranému ze skupiny zahrnující HIV virus a HBV virus.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že antivirální prostředek má aktivitu proti HIV virusu.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že antivirální prostředek má aktivitu proti HBV virusu.