CZ20003229A3 - Sloučenina a její použití, farmaceutická kompozice a její použití a způsob úpravy aktivity, izolace, detekce, stanovení množství a funkce proteinových tyrosinfosfatas - Google Patents

Abstract

Sloučeniny obecného vzorce i, kde Ri, R2 a R4 znamenají libovolnou chemickou skupinu nebo kombinaci chemických skupin, které působíjako ligand jednotky rozeznávající fosfotyrosin, o molekulové hmotnosti nižší nebo rovné 2500 Da, nové kompozice, způsoby jejich použití a metody jejich výroby, přičemž takové sloučeniny jsou farmakologicky použitelné inhibitory proteinových tyrosinfosfatas (PTPas,PTP), jako jePTPlB, jako je PTP1B, TC-PTP, CD45, SHP-1, SHP-2, PTPa, ΡΤΡε, ΡΤΡμ, ΡΤΡδ, ΡΤΡσ, Ρίρζ, ΡΤΡβ, PTPD1, PTPD2, ΡΤΡΗ1, PTP-MEG1, PTP-LAR a HePTP. Tyto sloučeniny se používají při kontrole nebo léčbě širokého rozmezí onemocnění, jako jsou autoimunitní onemocnění, akutní a chronické záněty, osteoporóza, různé formy zhoubného bujení a maligního onemocnění a cukrovka typu I a II.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových látek, nových sloučenin, způsobu jejich použití a způsobů identifikace, kde takové sloučeniny jsou farmaceuticky použitelné inhibitory proteinových tyrosinfosfatas (PTPasy, PTP) , jako jsou PTP1B, TC-PTP, CD45, SHP-1, SHP-2, PTP-cc, ΡΤΡε, ΡΤΡμ, ΡΤΡδ, ΡΤΡσ, ΡΤΡζ, ΡΤΡβ, PTPD1, PTPD2, ΡΤΡΗ1, PTP-MEG1, PTP-LAR a HePTP nebo ligandy fosfotyrosinových jednotek. Tyto látky se používají při léčbě širokého rozmezí onemocnění, jako je autoimunitní onemocnění, akutní a chronické záněty, osteoporóza, různé formy zhoubného bujení a maligní onemocnění a cukrovka typu I a II.

Dosavadní stav techniky

V souladu s definicí in vivo aktivit proteinových tyrosinfosfatas (PTPasy), jako jsou například PTP-α, LAR, TCPTP,. SHP-1, SHP-2, ΡΤΡβ, ΡΤΡβ, CD45, PTP18, HePTP, se zjistilo, že mají hlavní úlohu při vnitrobuněčné úpravě a regulaci základních buněčných signálních mechanizmů, které se podílejí na metabolizmu, růstu, proliferaci a diferenciaci (popisuje se v publikaci Elint et al., The EMBO J. 12: 1937-46, 1993, Fisher et al., Science 253: 401-6, 1991). Nadměrná exprese nebo změněná aktivita tyrosinfosfatas může také způsobit syndromy a postup různých onemocnění (Wiener, et al., J. Nati. cancer Inst. 86: 372-8, 1994, Hunter and Cooper, Ann. Rev. Biochem, 54: 897-930, 1985). Existuje důkaz, který naznačuje, že inhibice uvedených PTPas může pomoci při léčbě různých typů onemocnění, jako jsou cukrovka, autoimunitní onemocnění,

akutní a chronické záněty, osteoporóza, různé formy zhoubného bujení.

Fosforylace proteinů se nyní posuzuje jako důležitý mechanizmus využívaný buňkami pro signály transdukce během různých stádií funkce buněk (popisuje se v publikaci Fisher et al., Science 253: 401-6 (1991), Flint et al., The EMBO J. 12: 1937-46, 1993)). Existují nejméně dvě hlavní třídy fosfatas:

(1) ty, které defosforyluji proteiny (nebo peptidy) a které obsahují fosfátovou skupinu(y) na šeřinu nebo threoninu (nazývají se (Ser/Thr fosfatasy) a (2) ty, které odstraňují fosfátovou skupinu(y) z aminokyseliny tyrosin (nazývají se proteinové tyrosinfosfatasy nebo PTPasy).

PTPasy jsou rodina enzymů, které se mohou rozdělit do dvou skupin: a) vnitrobuněčné nebo PTPasy, které nejsou transmembránové, a b) PTPasy receptorového typu a transmembránové PTPasy.

Vnitrobuněčné PTPasy: Nej známější typ vnitrobuněčných PTPas zahrnuje jedinou konzervativní oblast katalytické fosfatasy, která obsahuje 220-240 aminokyselinových zbytků. Věří se, že oblasti vně domén PTPas mají důležitou úlohu v lokalizaci vnitrobuněčných PTPas subcelulárně (popisuje se v publikaci Mauro, L. J. and Dixon, J. E. TIBS 19: 151-155 (1994)). První izolovanou a charakterizovanou PTPasou byla PTP1B, která se izolovala s lidské placenty (popisuje se v publikaci Tonks, et al., J. Biol. Chem. 263: 6722-6730 (1988)). Krátce po té se PTP1B klonovala (Charbonneau et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 5252-5256 (1989), Chernoff et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2735-2789 (1989)). Další příklady vnitrobuněčných PTPas zahrnují (1) PTPasy T buněk (popisuje se v publikaci Cool et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 86: 5257-5261 (1989)), (2) PTPasy králičího mozku (popisuje se v publikaci Guan et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1501-1502 (1990)), (3) neuronové fosfatasy STEP (popisuje se v publikaci Lombroso et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7242-7246 (1991)), (4) • ·

PTPasy obsahující ezrin-doménu, což jsou PTPMEG1 (popsisuje se v publikaci Guel et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 586757871 (1991)), PTPH1 (popisuje se v publikaci Yang and Tonks,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 5949-5953 (1991)

PTPD1 a

PTPD2 (popisuje se v publikaci Moller et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7477- 7481 (1994)), FAP-l/BAS (popisuje se v publikaci Sáto et al., Science 268: 411-415 (1995), Banville et al., J. Biol. Chem. 269: 22320-22327 (1994), Maekawa et al., FEBS Letters 337: 200-206 (1994)) a PTPasy obsahující oblast SH2: PTP1C/SH-PTP1/SHP-1 (popisuje se v publikaci Plutzky et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 89: 1123-1127 (1992), Shen et al., Nátuře Lond. 352: 736-739 (1991) a PTPlD/Syp/SH-PTP2/SHP-2 (popisuje se v publikaci Vogel et al., Science 259: 1611-1614 (1993), Feng et al., Science 259: 16071611 (1993), Bastein et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 196,: 124-13 (1993)).

Fosfotyrosin-proteinová fosfatasa s nízkou molekulovou hmotností (LMW-PTPasa) vykazuje velmi nízkou shodu sekvence s vnitrobuněčnými PTPasami, které se popisují shora v textu. Tento enzym však patří do rodiny PTPas, která má následující charakteristiky: (i) PTPasy vykazují motiv aktivního místa Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Arg (popisuje se v publikaci Cirri et al., Eur. J. Biochem. 214: 647-657 (1993)), (ii) tento zbytek Cys tvoří během katalytické reakce fosfomeziprodukt, což je podobná situace jako s klasickými PTPasami (popisuje se v publikaci Cirri et al., Eur. J. Biochem.' 214: 647-657 (1993), Chiarugi et al., FEBS Lett. 310: 9-12 (1992)), (iii) sbalené molekuly vykazují překvapující stupeň podobnosti s PTP1B a PTP mikroorganizmu Yersinia (popisuje se v publikaci Su et al., Neture 370: 575-578 (1994)).

PTPasy receptorového typu obsahují a) putativní extrabuněčnou oblast vázající ligand, b) transmembránový segment a c) vnitrobuněčnou katalytickou oblast. Struktury a velikosti putativní extrabuněčné oblasti vázající ligand PTPas • · • · www v · V « · · · ········ • · ······· ···· ··· ··· ·· ·· ·· receptorového typu jsou docela odlišné. Naopak vnitrobuněčné katalytické oblasti PTPas receptorového typu jsou vzájemně velmi homologni a vykazuji také homologii s vnitrobuněčnými PTPasami. Většina PTPas receptorového typu mají dvě tandemově duplikované katalytické domény PTPas.

První identifikovanou PTPasou receptorového typu je (1) CD45/LCA (popisuje se v publikaci Ralph, S. J. , EMBO J. 6: 1251-1257 (1987)) a (2) LAR (Streuli et al., J. Exp. Med. 168:

1523-1530 (1988)), o které se zjistilo, že patří ke třídě enzymů založených na homologii PTP1B (popisuje se v ublikaci Charbonneau et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 5252-5256 (1989)) . CD45 je rodina glykoproteinů s vysokou molekulovou hmotností a je jedním z nejvíce zastoupených glykoproteinů na povrchu leukocytů a ukazuje se, že se exprimují pouze na buňkách krvetvorného systému (popisuje se v publikaci Trowbridge and Thomas, Ann. rev. Immunol. 12: 85-116 (1994)).

Po identifikaci CD45 a LAR, jako členů rodiny PTPas, následuje identifikace a klonování několika různých členů skupiny PTPas receptorového typu. Tak 5 různých PTPas, což jsou (3) PTPa, (4) ΡΤΡβ, (5) ΡΤΡδ, (6) ΡΤΡε a (7) ΡΤΡζ se identifikovaly v jedné dřívější studii (popisuje se v publikaci Krueger et al., EMBO J. 9: 3241-3252 (1990)). Jiné příklady PTPas receptorového typu zahrnují (8) ΡΤΡγ (popisuje se v publikaci Bernea et al., Mol. Cell Biol. 13: 1497-1506 (1995)), které podobně jako ΡΤΡζ (popisují se v publikaci Krueger and Saito et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7417-7421 (1992)) zahrnují v extrabuněčné oblasti doménu podobné karbonové anhydrase, (9) ΡΤΡμ (popisuje se v publikaci Gebbink et al., FEBS Letters 290: 123-130 (1991), (10) PTPk (popisuje se v publikaci Jiang et al., Mol. Cell Biol. 13: 2942-2951 (1993)). Na základě strukturních rozdílů PTPas receptorového typu se mohou rozdělit do dvou subtypů (popisuje se v publikaci Fisher et al·., Science 253: 401-406 (1991)): (I) CD45, (II) LAR, ΡΤΡδ,

• ··

(11) ΡΤΡσ, (III) ΡΤΡβ, (12) SAP-1 (popisuje se v publikaci

Matozaki et al., J. Biol. Chem. 269: 2075-2081 (1994)), (13) PTP-U2/GLEPP1 (popisuje se v publikaci Seimiya et al., Oncogene 10: 1731-1738 (1995), Thomas et al., J. Biol. Chem. 269: 19953-19962 (1994)) a (14) DEP-1, (IV) ΡΤΡα_ΡΤΡε. Všechny PTPasy receptorového typu typ III obsahuji dvě domény PTPas. Postupně se identifikuji nové PTPasy a předpokládá se, že v lidském genomu se nachází více jak 500 různých druhů PTPas. To je blízko k předpovězené velikosti superrodiny proteinových tyrosinkinas (popisuje se v publikaci Hanks and Hunter, FASEB J. 9: 576-596 (1995) ) .

PTPasy jsou bilogickou složkou proteinových tyrosinkinas (PTK). Protože jedna z důležitých funkcí PTPas je řídit snižování aktivity PTK. Nyní se ovšem objevil více komplexní obrázek funkce PTPas. Několik studií ukázalo, že některé PTPasy mohou působit jako pozitivní mediátory buněčné signalizace. Jako například oblast SH2 obsahující SHP-2 pravděpodobně působí jako pozitivní mediátor aktivace Ras stimulované inzulínem (popisuje se v publikaci Noguchi et al., Mol. Cell. Biol. 14: 6674-6682 (1994)) a mitogenní signální transdukce indukované růstovým faktorem (popisuje se v publikaci Xiao et al., J. Biol. Chem. 269: 21244-21248 (1994), zatímco homologní SHP-1 se zdá, že působí jako negativní regulátor proliferace stimulované růstovým faktorem (popisuje se v publikaci Bignon and Siminovitch, Clin. Immunol. Immunopathol. 73: 168-179 (1994)). Jiným příkladem PTPas, jako pozitivních regulátorů, jsou studie, které se navrhly tak, aby došlo k definici aktivity Src-rodiny tyrosinkinas. Několik linií důkazů indikuje, že CD45 pozitivně reguluje aktivaci krvetvorných buněk, pravděpodobně prostřednictvím defosforylace C-terminálního tyrosinu Fyn and Lek (popisuje se v publikaci Chán et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 555-592 (1994)).

Duální specifita proteinových tyrosinfosfatas (dsPTPas) definuje podtřídu v rodině PTPas, které mohou hydrolyzovat fosfát z fosfotyrosinu, stejně jako z fosforserinu/threoninu. dsPTPasy obsahují příznačnou sekvenci PTPas: Cys-Xxx-Xxx-XxxXxx-Xxx-Arg. Alespoň tři dsATPasy vykazují defosforylaci a deaktivaci kinázy regulující extrabuněčný signál proteinové kinázy aktivované (ERK)/mitogenem (MAPK): MAPK fosfatasa (CL100, 3CH134) (popisuje se v publikaci Charles et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5292-5296, (1993)), PAC-1 (popisuje se v publikaci Ward et al., Nátuře 367: 651-654 (1994)), rVH6 (popisuje se v publikaci Mourey et al., J. Biol. Chem. 271: 3795-3802 (1996)). Transkripce dsPTPasy se indukuje různými stimuly, například oxidačním stresem nebo teplotním šokem (Ishibashi et al., J. Biol. Chem. 269: 29897-29902 (1994), Keyse and Emslie, Nátuře 359: 644-647 (1992)) . Dále se mohou podílet na regulaci buněčného cyklu: cdc25 (popisuje se v publikaci Millar and Russell, Cell 68: 407-410 (1992)), KAP (popisuje se v publikaci Hannon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 1731-1735 (1994)). Defosforylace tyrosinu cdc2 duální specifickou fosfatasou, cdc25, je nutná pro identifikaci mitózy v kvasinkách (popisuje se v publikaci Walton and Dixon, Annu. Rev. Biochem. 62: 101-120 (1993)).

PTPasy se původně identifikovaly a získávaly se z buněčných a tkáňových lyzátů za použití různých umělých substrátů a proto jejich přirozená funkce defosforylace nebyla dobře známa. Protože fosforylace tyrosinu tyrosinkinasami je obvykle spojena s buněčnou proliferaci, buněčnou transformací a buněčnou diferenciací. Předpokládá se, že PTPasy se také spojily s těmito jevy. Tato asociace se protvrdila v případě mnoha PTPás. PTP1B, což je fosfatasa, jejíž struktura se nedávno zjistila (popisuje se v publikaci Barford et al., Scinece 263: 1397-1404 (1994)), se podílí na zrání oocytů vyvolaném inzulínem (popisuje se v publikaci Flint et al., The EMBO J. 12: 1937-46, 1993)) a naznačuje se, že nadměrná *··· '9. 9 9 • 9 9

9'9 9 · · exprese tohoto enzymu se může podílet na zhoubném bujení prsu a vaječníků spojené s p!85^{c_erb 82} (popisuje se v publikaci

Wiener et al et al., Am Mechanizmus schopností , J. Nati. cancer Inst. J. Obstet. Gynecol. oocytů vyvolaný

86: 372-8 (1994), Weiner

170: 1177-883 (1994)).

inzulínem koreluje se zraní

PTPlB blokovat aktivaci S6 kinasy. Spojení s rakovinou je důkaz, který naznačuje, že nadměrná exprese PTP1B statisticky koreluje se zvýšeným množství pl85^{c_erb 82} při zhoubném bujení prsu a vaječníků. Úloha PTP1B při etiologii a progresi onemocnění není známa. Inhibitory PTP1B mohou proto pomoci vyjasnit úlohu PTPlB při zhoubném bujení a v některých případech umožňují terapeutickou léčbu jistých forem zhoubného buj ení.

V současné době se zkoumá aktivita řady jiných nově diskutovaných fosfatas. Dvě z nich SHP-1 a Syp/PTPlD/SHPTP2/PTP2C/SHP-2 se mohou použít při aktivaci odezvy vyvolané růstovým faktorem získaným z destiček a epidermálním růstovým faktorem (popisuje se v publikaci Li et al., Mole. Cell. Biol. 14: 509-17 (1994)). Protože oba růstové faktory se podílejí na normálních buněčných postupech, stejně jako na stádiích onemocnění, jako je zhoubné bujení a arterioskleróza, vyslovila se hypotéza, že inhibitory těchto fosfatas budou také vykazovat účinnost při terapii. Látky podle vynálezu, které vykazují inhibiční aktivitu proti různým PTPasám se uplatňují při léčbě nebo kontrole shora v textu uvedených onemocnění.

PTPasy: signalizační dráha receptorů inzulinu/cukrovka

Inzulín je důležitý regulátor různých metabolických procesů a hraje klíčovou úlohu při kontrole obsahu glukosy v krvi. Defekty spojené se syntézou nebo signalizací inzulínu vedou ke vzniku onemocnění cukrovky. Navázání inzulinu na jeho receptory způsobuje autofosforylaci několika tyrosinových zbytků ve vnitrobuněčné části b-podjednotky. Tři tyrosinové • · • ♦ ·· zbytky umístěné blízko sebe (oblast tyrosin 1150) se musí také fosforylovat, aby se získala plná aktivita inzulínového receptorů tyrosinkinasy (IRTK), která přenáší signál dále fosforylací tyrosinu jiných buněčných susbtrátů, které zahrnují substrát-1 inzulínového receptorů (IRS-1) (popisuje se v publikaci Wilden et al., J. Biol. Chem. 267: 16660-16668 (1992), Myers and White, Diabetes 42: 643-650 (1993), Lee and

Piích, Tůn. J. Physiol. 266: C319-C334 (1994), White et al., J.

Biol. Chem. 263: 2969-2980 (1988)). Strukturální základ funkce tyrosinového tripletu se upřesnil v krystalografické studii IRTK pomocí rentgenového záření, které ukazuje, že tyrosin1150 vykazuje autoimunní vlastnosti v jeho nefosforylovaném stádiu (popisuje se v publikaci Hubbard et al., Nátuře 372: 746-754 (1994)).

Několik studií jasně indikuje, že aktivita autofosforylovaného IRTK může být obrácena defosforylací in vitro (popisuje se v publikaci Goldstein, Receptor 3: 1-15 (1993), Mooney and

Anderson, J. Biol. Chem. 264: 6850-6857 (1989)) fosforylovanou oblastí tyrosin-1150, který je nejcitlivějším cílem proteinové tyrosinfosfatasy (PTPasa) ve rovnání s di- a monofosforylovanými formami (King et al., Biochem. J. 275:

(1991)). Je proto pokušením spekulovat, že tyto tyrosin-tripletu řídí přepínání aktivity IRTK. Ukazuje se, že IRTK se reguluje defosforylací zprostředkovanou PTP in vivo (popisuje se v publikaci Khan et al., J. Biol. Chem. 264: 12931-12940 (1989), Faure et al., J. Biol. Chem. 267: 1121511221 (1992), Rottenberg et al., J. Biol. Chem. 266: 8302-8311 (1991°)). Těsné spojení PTPas se signalizační drahou inzulínu je dále dokázáno zjištěním, že inzulin odděleně reguluje aktivitu PTPasy v krysích krevních buňkách (popisuje se v publikaci Meyerovitch et al., Biochemistry 31: 10338-10344 (1992)) a v játrech krys s onemocněním alloxanový diabetes (popisuje se v publikaci Boylan et al., J. Clin. Invest. 90: 174-179 (1992)).

413-418 funkce • · · · φ • · · '· . Φ

Relativně málo je známo o identitě PTPas, které se podílejí na regulaci IRTK. Avšak existence PTPas s aktivitou k inzulínovému receptorů se může demonstrovat, jak se indikuje shora v textu. Když se k celým buňkám přidá silný inhibitor PTPasy peroxovanadičnan, je možné získat skoro plnou inzulínovou odezvu v adipocytech (Fantus et al., Biochemistry 28: 8864-8871 (1989), Eriksson et al., Diabetologia 39: 235242 (1995)) a v kosterním svalu (popisuje se v publikaci

Leighton et al., Biochem J. 276: 289- 292 (1991)). Navíc jisté studie ukazují, že nová třída sloučenin peroxovanadia působí in vivo jako potentní hypoglykemické látky (popisuje se v publikaci Posner et al.,). Ukázalo se, že dvě z těchto sloučenin jsou více potentními inhibitory defosforylace inzulínového receptorů než receptor EGF.

Zjistilo se, že všude přítomně exprimovaná oblast SH2 obsažená v PTPase SHP-2 (popisuje se v publikaci Vogel et al., Science 259: 1611-1614 (1993)) se spojuje s IRS-1, defosforyluje ho, ale zjevně ne se samotným IR (popisuje se v publikaci Kuhne et al., J. Biol. Chem. 268: 11479-11481 (1993), Kuhne et al., J.

Biol. Chem. 269: 15833-15837 (1994)).

Předchozí studie naznačila, že PTPasy jsou zodpovědné za regulaci IRTK patří do třídy asociovaných s membránou (popisuje se v publikaci Faure et al., J. Biol. Chem. 267: 11215-11221 (1992)) a glykosylované molekuly (Haring et al.,

3298-3306 (1984), Sále, Adv. Prot.

Biochemistry 23 Phosphatases 6:

al,., et

Hashimato

159-186 (1991)).

předpokládá, že LAR může hrát úlohu ve fyziologické regulaci inzulínových receptorů v neporušených buňkách (Hashomato et al., J. Biol. Chem. 267: 13811-13814 (1992)). Svého závěru dosáhl porovnáním rychlosti defosforylace/deaktivace izolovaného IR za použití rekombinantního PTP1B stejně jako cytoplazmatických domén LAR a PTPa. Antisense inhibice se používá ke studiu účinku LAR na inzulínovou signalizaci u linie krvetvorných buněk krys (popisuje se v publikaci Kulas ·· ···· » · · • ··♦ et al·., J. Biol. Chem. 270: 2435-2438 (1995)). Suprese množství proteinu LAR o přibližně 60 % je doprovázena zvýšením autofosforylace vyvolané inzulínem přibližně o 150 %. Avšak pozorovalo se pouze střední zvýšení aktivity IRTK o 35 %, zatímco aktivita fosfatidylinositol-3-kinasy závislé na inzulínu (PI 3 kinasa) se podstatně zvýšila o 350 %. Redukované množství LAR nezměnilo základní množství IRTK tyrosinové fosforylace ani aktivitu. Autoři spekulují, že LAR by mohl specificky defosforylovat tyrosinové zbytky, které jsou kritické pro aktivaci PI 3-kinasy buď v případě samotného inzulínu nebo v případě dalšího substrátu vyskytujícího se dále v signalizační dráze.

Zatímco předchozí zprávy indikují úlohu PTPa při transdukci signálu prostřednictvím aktivace src (popisuje se v publikaci Zheng et al., Nátuře 359: 336-339 (1992), den Hertog et al. , EMBO J. 12: 3789-3798 (1993)) a interakci s GRB-2 (den Hertog et al., EMBO J. 13: 3020-3032 (1994), Su et al., J. Biol. Chem. 269: 18731-18734 (1994)), současné studie naznačují funkci uvedené fosfoatasy a její blízce příbuzné ΡΤΡε, jako negativní regulátory inzulínového receptorového signálu (Moller et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7477- 7481 (1994)). Tato studie také indikuje, že PTPasy receptorového typu mají podstatnou úlohu při regulaci IRTK, zatímco vnitrobuněčné PTPasy mají pouze malou, ne-li žádnou aktivitu, směrem k inzulínovému receptorů. Zatímco se ukazuje, že cílem negativní regulační aktivity PTPas a a ε je samotný receptor, účinek snižující aktivitu vnitrobuněčné TC-PTP se zdá být způsoben utlumením funkce signálu aktivovaného IR. Ačkoli PTP1B a TC-PTP jsou blízce příbuzný, PTP1B má pouze malý vliv na patern fosforylace buněk ošetřených inzulínem. Obě PTPasy mají odlišné strukturní rysy, ' které stanovují jejich subbuněčnou lokalizaci a tím také jejich přístup k definovaným buněčným substrátům (popisuje se v publikaci Frangione et al., Cell 68: 545-560 (1992), Faure and Posner et al., Glia 9: 31111

-· · « · » · • · · • ···

314 (1993)). Protože nedostatek aktivity PTP1B a TC-PTP vůči IRTK může alespoň z části vysvětlit skutečnost, že se společně nenachází na aktivovaném inzulínovém receptoru. Na podporu tohoto jevu se PTP1B a TC-PTP vyloučily jako kandidáti PTPas spojených s IR v hepatocytech nalezených na základě subbuněčné lokalizační studie (Faure et al., J. Biol. Chem. 267: 1121511221 (1992)).

Prokázalo se na základě studie, že transmembránová PTPasa CD45, která je pravděpodobně specifická pro krvetvorné buňky, negativně reguluje tyrosinkinasu inzulínového receptoru v lidské buněčné linii myelomu U266 (Kulas et al., J. Biol. Chem. 271: 755- 760 (1996)).

V mnoha případech myši upravené metodou „knock-out (K.O) jsou vhodné pro vysvětlení důležitosti specifických genů. Na základě výsledků uvedených shora v textu se může předpokládat, že zvláště LAR K.O. myši, ΡΤΡα K.O. myši a PTP1B K.O. myši by mohly poskytnout důležité informace ve vztahu k inzulínové signalizaci. Dvě skupiny vědců vyvtořily LAR K.O. myši (popisuje se v publikací Schaapveld et al., Developmental Biology 188: 134-146 (1997), Skarnes et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 92: 6592-6596 (1995)). Goldstein a jeho spolupracovnicí analyzovaly LAR K.O. myší popsané v publikaci Skarnes et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 92: 6592-6596 (1995) a ukázaly, že tyto myši vykazují předem zjištěné defekty v homeostáze glukosy (popisuje se v publikaci Ren et al., Diabetes 47: 493-497 (1998)). Kontrolní myši v této studii vykazují odlišný genetický původ ve srovnání K.O. myšma. Jiné studie, kde se používají LAR K.O. myši vytvořené způsobem popsaným v publikaci Schaapveld et al., Developmental Biology 188: 134-146 (1997), nepotvrdily výsledky získané v publikaci Ren et al., Diabetes 47: 493-497 (1998), A.R. Soresen et al., Diabetologia 40 (Suppl. 1): 556-556 (1997)).

V jisté studii myši PTP1B K.O. myši (to je myši PTP1B -/-) se porovnaly s myšma +/+ a +/- stejného genetického původu • · »·· * ·· ·» ·· • · * ·· · · · » » • ··· · · · · ·.»» 4 • ·· · · · · · · · · • · ·»···»· ···· 4·· ··* «· ·· 4« (popisuje se v publikaci Elchebly et al., Science 283: 15441548 (1999)). V této pozdější studii (popisuje se v publikaci

Elchebly et al., Science 283: 1544-1548 (1999)) se zjistilo, že rozdělení genu, který kóduje PTPlB vede k produkci zdravých myší, které ve stádiu krmení, vykazovaly množství glukosy v krvi slabě nižší a koncentrace inzulínu, byla přibližně poloviční ve srovnání s koncentrací zjištěnou u myší PTP1B+/+. Dále testy tolerance inzulínu a glukosy ukazují zvýšenou citlivost na inzulin u myší PTP K.O.. Při aplikaci krmení s vysokým obsahem tuku myši PTPlB-/- a PTP1B-/+ nezvýšily svou tělesnou hmotnost a zůstaly citlivé na inzulin. Naopak myši PTP1B+/+ značně zvýšily tělesnou hmotnost a staly se rezistentní na inzulin. Analýza stupně tyrosinové fosforylace insulinového receptoru a substráty-1 pro inzulinoý receptor (IRS-1) ukázala zvýšenou fosforylaci těch proteinů u PTP-/myší (játra a svaly) v porovnání s myšma PTPlB +/+. Všechna tato zjištění jsou v souladu s poznámkou, že PTPlB pravděpodobně má hlavní úlohu jako negativní regulátor signalizační dráhy receptoru inzulínu. Na základě těchto výsledků lze říci, že PTP-1B je potencionálním terapeutickým cílem pro léčbu cukrovky typu 2 a obezity (Elchebly et al., Science 283: 1544-1548 (1999)).

PTPasy: somastatin

Somastatin inhibuje několik biologických funkcí, které zahrnují buněčnou proliferaci (popisuje se v publikaci Lamberts et al., Molec. Endocrinol. 8: 1289-1297 (1994)).

Zatímco část antiproliferačních aktivit somastatinu jsou sekundární vzhledem k jeho inhibici vylučování hormonu a růstových faktorů (například růstový hormon a epidermální růstový faktor), jiné antiproliferační účinky somastatinu jsou způsobeny přímým účinkem na cílové buňky. Analogy somatostinu inhibují rozšíření zhoubného bujení pankreasu pravděpodobně prostřednictvím stimulace jediné PTPasy nebo subsady PTPas, ·» φφφφ » · * • ··· •Φ ΦΦ ► ·’Φ Φ » φφ φ spíše než obecnou aktivací množství PTPas v buňkách (Liebow et al., Proč, Nati. Acad. Sci. USA 86: 2003-2007 (1989), Colas et al., Eur. J. Biochem. 207: 1017-1024 (1992)). V určité studii se zjistilo, že somastatinová stimulace receptorů somatostatinu SSTR1, ale nikoli SSTR2, stabilně exprimovaných v buňkách CHO-K1 může stimulovat aktivitu PTPasy a že tato stimulace je citlivá na toxin černého kašle. Zbývá zjistit, zda inhibiční účinek somastatinu na vylučování hormonu a růstového faktoru je způsoben podobnou stimulací aktivity PTPas v buňkách produkujících hormon.

PTPasy: imunitní systém/autoimunita

Několik studií naznačuje, že PTPasa receptorového typu CD45 má kritickou úlohu ne pouze při iniciaci aktivace T buněk, ale také pro udržování signalizační kaskády zprostředkované receptorem T buněk. Tyto studie so popisují v publikaci Weiss A, Ann. Rev. Genet. 25: 487-510 (1991), Chán et al . , Annu. Rev. Immunol. 12: 555-592 (1994), Trowbridge and Thomas, Annu. Rev. Immunol. 12: 85-116 (1994)).

CD45 je jeden z nejvíce zastoupených povrchových buněčných glykoproteinů a exprimuje se pouze v krvetvorných buňkách. Ukázalo se, že CD45 je jeden z kritických komponentů signálního transdukčního mechanizmu lymfocytů. Zvláště důkaz naznačuje, že CD45 fosfatáza má důležitou úlohu v proliferaci stimulované antigenem T lymfocytů, po té, co se antigen naváže na receptor T buňky (popisuje se v publikaci Trowbridge, Ann. Rev. Immunol. 12: 85-116 (1994)). Několik studií naznačuje, že aktivita PTPasy CD45 hraje důležitou úlohu při aktivaci Lek, což je člen rodiny Src proteinových tyrosinkinas, které jsou specifické pro lymfocyty (Mustelin et al., Proč. Nati. Acad Sci. USA 86: 8959-8963 (1989)). Tito autoři vyslovily hypotézu, že fosfatázová aktivita CD45 aktivuje Lek defosforylací C-terminálního tyrosinového zbytku, který může naopak být spojen s aktivací T-buňky. V jistých studiích se

zjistilo, že rekombinant p561ck je specificky spojen s rekombinantnim cytoplazmatickým doménovým proteinem CD45, ale nikoliv s cytoplazmatickou doménou příbuznou PTPaa (popisuje se v publikaci (Nag et al., J. Biol. Chem. 271: 1295-1300 (1996)). Interakce p561ck-CD45 se zdá být zprostředkována prostřednictvím interakcí oblasti SH2, které nejsou běžné a které nevykazují fosfotyrosin. V nezralých T buňkách se vyskytuje jiný člen rodiny Src proteinových tyrosinkinas Fyn, který se jeví být selektivním susbtrátem pro CD45 ve srovnání s Lek a Syk (Katagiri et al., J. Biol. Chem. 270: 27987-27990 (1995)).

Studie za použití transgenních myší s mutací vykazovaly nedostatek zralých T buněk. Tyto myši nevykazovaly odpověď na antigenní změnu s typickou odezvou zprostředkovanou T buňkami (popisuje se v publikaci Kishihara et al., Cell 74: 143-56 (1993)). Inhibitory fosfatasy CD45 proto musí být velmi účinná terapeutická činidla v podmínkách, které jsou spojeny s autoimunitním onemocněním.

Fosfatasa CD45 se také jeví být podstatná při degranulaci žirných buněk zprostředkovanou protilátkami (ppopisuje se v publikaci Berger et al., J. Exp. Med. 180: 471-6 (1994)). Tyto studie se také uskutečnily s myšmi, které byly CD45 deficitní. V tomto případě degranulace zprostředkovaná IgE se demonstrovala v myších T buňkách divokého typu, ale nikoli T buňkách, které jsou CD45-deficitní. Tyto data naznačují, že inhibitory CD45 mohou také hrát úlohu při symptomatickém nebo terapeutickém ošetření alergických poruch.

Jiné nedávno zkoumané PTPasy indukovatelná proteinová tyrosinfosfatasa specifická pro mízní žlázy (HePTP) se také účastnily při imunitní odezvě. Tato fosfatasa se exprimuje v obou zbývajících typech lymfocytů B a T, ale nikoli v krvetvorných buňkách. Po stimulaci těchto buněk množství mRNA pocházející z genu HePTP se zvyšuje 10 až 15 krát (Zanke et al., Eur. J. Immunol. 22: 235-239 (1992)). V obou typech • · ·· buněk T a B HePTP může fungovat během potvrzené stimulace, aby se modulovala imunitní odezva prostřednictvím defosforylace specifických zbytků. Jeho přesná role však stále není definována.

Zdá se, že SHP-1 specifické pro krvetvorné buňky působí jako negativní regulátor a hraje důležitou úlohu při vývoji krvetvorných buněk. Tak fosfatasa SHP-1 má důležitou roli při regulaci erytropoetinové signalizační dráhy, která je zesílena u myší tím, že chybí intaktní SHP-1 (popisuje se v publikaci Schultz et al., Cell 73: 1445-1454). V souladu se shora zmiňovanou důležitou funkcí fosfatasy CD45, HePTP a SHP-1 mohou být selektivními inhibitory PTPasy jak imunosupresory tak imunostimulátory, stejně jako inhibitory a stimulanty krvetvorného systému. Jedna studie popisuje potencionální inhibitory PTPas, jako imunomodulátory tím, že demonstrují kapacitu inhibitory PTPas založených na vanadiu, kterým je BMLOV, indukovat zjevnou selektivní apoptózu B buněk ve srovnání s T buňkami (Schieven et al., J. Biol. Chem. 279: 29824-29831 (1995)).

PTPasy: interakce buňka-buňka/zhoubné bujení

Fokální adhezivní plaky, což je jev in vivo, při kterém se tvoří specifické kontaktní body, když fibroblasty rostou na vhodných substrátech, napodobují alespoň částečně buňky a jejich přirozené okolí. Několik fokálních adhezních proteinů se fosforyluje na tyrosinových zbytcích, když se fibroblasty spojují na základě adherence na extracelulární matrici (popisuje se v publikaci Gumbiner, Neuron 11, 551-564 (1993)).

Aberující tyrosinová fosforylace těchto proteinů vede Důvěrná asociace mezi PTPasami a je podpořena nalezením několika s N-terminálními oblastmi podobnými k transformaci buněk, fokálními adhesemi vnitrobuněčných PTPas ezrinu. Jsou to například PTPMEG1 (popisuje se v publikaci Gu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 5867-5871 (1991)), » · · · · • · • · ··

PTPH1 (Yang and Tonks, proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 59495953 (1991)) a PTPD1 (Moller et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7477-7481 (1994)). Oblast podobná ezrinu vykazuje podobnost s několika proteiny, které působí pravděpodobně jako vazby mezi membránou a cytoskeletem. Zjistilo se, že PTPD1 se fosforyluje a asociuje s c-src in vitro a vyslovila se hypotéza o regulaci fosforylace fokálních adhezi (popisuje se v publikaci Moller et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7477- 7481 (1994)) .

PTPasy mohou bránit působení tyrosinkinas, které zahrnují ty odpovědné za fosforylaci fokálních adhezivních proteinů a mohou proto fungovat jako přirozené inhibitory transformace. TC-PTP a zvláště zkrácená forma tohoto enzymu (popisuje se v publikaci Cool et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 72807284 (1990)) může inhibovat transformační aktivitu v-erb a vfms (popisuje se v publikaci Lammers et al., J. Biol. Chem. 268: 22456-22462 (1993), Zander et al., Oncogene 8: 1175-1182 (1993)). Zjistilo se, že transformace onkogenní formou genu HER2/neu se potlačí ve fibroblastech NIH 3T3 nadměrnou expresí PTPlB (popisuje se v publikaci Brown-Shimmer et al., Cancer Res. 52: 478-482 (1992)).

Zjistilo se, že síla exprese PTPlB se zvýší v savčí buněčné linii transformované genem neu (popisuje se v publikaci Zhay et al., Cancer Res. 53: 2272-2278 (1993)). Blízký vztah mezi tyrosinkinasou a PTPasami při vývoji zhoubného bujení je dále dokázán zjištěním, že PTPsse silně exprimuje v myších prsních nádorech v transgenních myší, které nadměrně exprimují c-neu a v-Ha-ras, ale nikoli c-myc nebo int-2 (poposuje se v publikaci Elson and Leder, J biol. Chem. 270: 26116-26122 (1995)). Dále lidský gen kódující PTPg se mapoval v chromozomové oblasti 3p21, která se často deletuje ve zhoubném bujení ledvin a plic (popisuje se v publikaci LaFlorgia et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 5036-5064 (1991)).

• · ··

Zdá se být podstatné, že PTPasy se jeví být zahrnuty při řízení růstu fibroblastů. V jisté studii se zjistilo, že buňky Swiss 3T3 sklizené ve vysoké hustotě obsahují PTPasy spojené s membránou, jejichž aktivita je v průměru 8 krát vyšší než je aktivita buněk sklizených při nízké nebo střední hustotě (popisuje se v publikaci Pallen and Tong, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 6996-7000 (1991)). Vyslovila se hypotéza, že inhibice závislá na hustotě buněčného růstu zahrnuje regulované zvýšení aktivity PTPas. V souladu s touto skutečností nové PTPasy receptorového typu vázané s membránou DEP-1 vykazují zvýšenou (>=10 krát zvýšenou) sílu exprese se zvyšující hustotou buněk lidských embryonních plicních fibroblastů WI-38 a v buněčné linii fibroblastů AG1518 (popisuje se v publikaci Ostman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 9680-9684 (1994)).

Dvě blízce příbuzné PTPasy receptorového typu PTPk a ΡΤΡμ mohou zprostředkovat interakce homofilních buněk, když se exprimují v neadherentních hmyzích buňkách, což naznačuje, že PTPasy mohou mít normální fyziologickou funkci při signalizaci buňkabuňka (popisuje se v publikaci Gebbink et al., J. Biol. Chem. 268: 16101-16104 (1993), Brady-Kalnay et al., J. Cell Biol. 122: 961-972 (1993), Sap et al., Mol. Cell Biol. 14: 1-9 (1994)). Je zajímavé, že PTPk a ΡΤΡμ spolu navzájem nereagují navzdory jejich strukturální podobnosti (Zondag et al. , J. Biol. Chem. 270: 14247-14250 (1995)). Ze studií popsaných shora v textu je zjevné, že PTPasy mohou hrát důležitou úlohu při regulaci normálního buněčného růstu. Jak se uvádí shora v textu, jisté studie indikují, že PTPasy mohou také fungovat jako pozitivní mediátory vnitrobuněčné signalizace, čímž indukují nebo zesilují mitogenní odezvy. Zvýšená aktivita jistých PTPas může proto vést k buněčné transformaci nebo k vytvoření nádorů. Při jedné studii se zjistilo, že nadměrná exprese PTPa vede ke transformaci fibroblastů krysího embrya (popisuje se v publikaci Zheng et al., Nátuře 359: 336-339

(1992)). Navíc se zjistilo, že nové PTP, SAP-1 se silně exprimují v buňkách zhoubného bujení pankreasu a tlustého střeva a rekta. SAP-1 se mapoval na chromozomu 19 v oblasti ql3.4 a může být karcioembryogenního antigenu mapovaného na 19ql3.2 (Uchida et al., J. Biol. Chem. 269: 12220-12228 (1994)). Dále dsPTPasa cdc25 defosforyluje cdc2 při Thrl4/Tyr15, čímž funguje jako pozitivní regulátor mitózy (popisuje se v publikaci Hunter, Cell 80: 225-236 (1995)). Inhibitory specifických PTPas vykazují jasnou terapeutickou hodnotu při léčbě jistých forem zhoubného bujení.

PTPasy: agregace destiček

Jisté studie indikují, že PTPasy jsou zahrnuty v destičkové agregaci. Aktivace destiček indukovaná agonistou vede ke štěpení PTP1B katalyzovaném kalpainem, což dvojnásobně stimuluje aktivitu PTPasy (Frangioni et al., EMBO J. 12: 48434856 (1993)). Štěpení PTP1B vede subbuněčné relokalizaci enzymu a korelátů s transicí z reversibilní na irreverzibilní destičkovou agregaci v plazmě bohaté na destičky. Navíc se zjistilo, že oblast SH2 obsahující PTPasy, SHP-1/SH-PTP1 translokuje cytoskeleton v destičkách po stimulaci trombinem způsobem závislém na agregaci (popisuje se v publikaci Li et al., FEBS Lett. 343: 89-93 (1994)).

Ačkoli některé detaily ve shora uvedených dvou studiích nejsou zcela jasné, zjistilo se, že PTP1B a SHP-1 má důležitou funkční úlohu v destičkové agregaci (popisuje se v publikaci Ezumi et al., J. Biol. Chem. 270: 11927.11934 (1995)). V souladu s dalším pozorováním ošetření destiček s inhibitorem PTPas peroxovanadičnanem vede k podstatnému zvýšení tyrosinfosforylace, vylučování a agregace (popisuje se v publikaci Pumiglia et al., Biochem. J, 286: 441-449 (1992)).

PTPasy: osteoporóza • · ··

Rychlost tvořeni kostí je dána aktivitou a počtem osteoblastů, což je dáno osteoblastových rychlostí proliferace a diferenciace progenitorových buněk. Histomorfometrické studie indikují, že počet osteoblastů je primární determinanta rychlosti tvoření kostí u lidí (popisuje se v publikaci Gruber et al., Minerál Electrolyte Metab. 12: 246-254 (1987), Lau et al., Biochem J. 257: 23-36 (1989)). Kyselé fosfatasy/PTPasy se mohou podílet na negativní regulaci proliferace osteoblastů. Tak se zjistilo, že fluorid, který má fosfatázovou inhibiční aktivitu zvyšuje spinální kostní hustotu při osteoporóze zvýšením proliferace osteoblastů (popisuje se v publikaci Lau et al., Biochem J. 257: 23-36 (1989)). V souladu s tímto pozorováním se zjistilo, že osteoblastové kyselé fosfatasy s aktivitou PTPasy jsou silně citlivé k mitogenním koncentracím fluoridu (popisuje se v publikaci Lau et al., J. Biol. Chem. 260: 4653-4660 (1985), Lau et al., J. Biol. Chem. 262: 13891397 (1987), Lau et al., Adv. Protein Phosphatases 4: 165-198 (1987)). Také se zjistilo, že množství PTPasové aktivity vázané na membránu se dramaticky zvyšuje, když se buněčná linie UMR 106.6 podobná osteoblastům kultivovala na kolagenové matrici typ I ve srovnání s nepotaženými destičkami pro tkáňové kultury. Protože signifikantní zvýšení aktivity PTPas se pozorovalo u fibroblastů, jejichž růst závisí na hustotě (popisuje se v publikaci Pallen and Tong, Proč. Nati. Acad. Sci. 88: 6996-7000 (1991)). Může se spekulovat, že zvýšení aktivity PTPas přímo inhibuje růst buněk. Mitogenní působení fluoridu a jiných inhibitorů fosfatas (molybdenan a vanadičnan) se pak může vysvětlit jejich inhibicí kyselých fosfatas/PTPas, které negativně regulují proliferaci buněk osteoblastů. Komplex podstaty působení PTPas při tvorbě kostí je dále naznačen jistou identifikací nových PTPas receptorového typu, které jsou regulovány příštítným tělískem. Jde o OST-PTP, která se exprimuje v kostech a ve varlatech (popisuje se v publikaci Mauro et al., J. Biol. Chem. 269:

30659-30667 (1994)). OST-PTP pozitivně reguluje diferenciace a tvoření matrice primárních osteoblastů. Může se vyslovit hypotéza, že inhibitory PTPas mohou předcházet diferenciaci prostřednictvím inhibice OST-PTP nebo jiných PTPas, což vede k pokračující proliferaci. To bude v souladu se shora uvedenými účinky fluoridu a s pozorováním, že inhibitor ortovanadičnan tyrosinfosfatasy zvyšuje proliferaci osteoblastů a tvoření matrice (popisuje se v publikaci Lau et al., Endocrinology 116: 2463-2468 (1988)). Navíc se pozorovalo, že vanadičnan a peroxovanadičnan zvyšuje růst buněčné linie UMR106 podobné osteoblastům. Vanadyl a peroxovanadičnan jsou silnější stimulatory buněčného růstu ve srovnání s vanadičnanem. Pouze vanadičnan je schopen regulovat buněčnou diferenciaci, která se měří buněčnou alkalickou fosfatázovou aktivitou (Cortizo et al., Mol. Cell. Biochem. 145: 97-102 (1995)).

PTPasy: mikroorganizmy

Dixon a jeho spolupracovníci upoutaly pozornost skutečností, že PTPasy mohou být klíčovým elementem pro patogenní vlastnosti mikroorganizmu Yersinia (popisuje se v publikaci Clements et al., Molecular Microbíology 5: 2617-2620 (1991)). Toto zjištění je spíš překvapující, protože tyrosinfosfát není přítomen v bakteriích. Rod Yersinia obsahuje 3 druhy Y. pestis (odpovědný za černý mor), Y. pseudotuberculosis a Y. enterocolitica (způsobující enteritidu a mezenterickou lymfadenitidu). Je zajímavé, že duálně specifická fosfatasa

VH1 se identifikovala ve viru Vaccinia (popisuje se v publikaci Guan et al., Nátuře 350: 359-263 (1991)). Tato pozorování indikují, že PTPasy mohou mít kritické role při mikrobiální a parazitické infekci a dále kladou důraz na inhibitory PTPas, jako nových putativních léčebných principů infekčních onemocnění.

• · · · » 9

Podstata vynálezu

Jak se popisuje shora v textu^ PTPasy jsou podstatné elementy při různých buněčných signalizačních procesech. Inhibitory nebo modulátory těchto enzymů nebo daná sada pTPas nebo dokonce jedna specifická PTPasa se proto považují za kandidáty pro výrobu léku. Do této doby se však v literatuře popisuje pouze omezená sada inhibitorů. Některý z nejsilnějších inhibitorů jsou analogy tyrosinfosforylovaných peptidu a proto nejsou vhodné jako kandidáty pro orální použití.

I. vanadičnan a peroxovanadičnan.

Vanadičnan a peroxovabadičnan indukují v buňkách a ve zvířatech účinky podobné inzulínu. Při některých klinických studiích vanadičnany vykazují pozitivní účinky u lidí trpících cukrovkou typu II. Mechanizmus působení na úrovni buněk probíhá prostřednictvím PTPas. Zjistilo se, že peroxovanadičnan (což jsou komplexy vanadičnanu a peroxidu vodíku) jsou irreverzibilním inhibitorem PTPas prostřednictvím xidace aktivních míst katalytického cysteinu (popisuje se v publikaci Huyer et al., J. Biol. Chem. 272: 843-851 (1997)). Dále účinky jsou velmi citlivé na použité složky testu, jako je EDTA a redukční činidla (například dithiothreitol, DTT). Je nutné poznamenat, že sloučeniny založené na vanadičnanu peroxovanadičnanu inhibují široké rozmezí PTPas. Je možné, že mechanizmus působení, to znamená oxidace aktivních míst cysteinu, bude způsobovat podstatné problémy při vývoji látek, které selektivně inhibují specifické PTPasy. Dále, toxickým účinkům inhibitorů založených na vanadičnanu a peroxovanadičnanu se bude pravděpodobně předcházet jejich použití při léčbě chronického onemocnění, jako je cukrovka.

II. bifosfonáty » · · · » · • · · · · · · · · ···· ··· «·· ·· ·* ··

Bisfosfonáty se úspěšně využívají jako terapeutická činidla pro léčbu poruch kostí, jako je osteroporéoza a Pagetova nemoc. Bisfosfonáty inhibují resorpci osteoklastů, která vede k řídnutí kostí a čistý výtěžek hustoty minerálů kostí (popisuje se v publikaci Roden and Fleisch, J. Clin. Invest. 97: 2692-2696 (1996)). V současné době se věří, že mechanizmus působení na buněčné úrovni je prostřednictvím inhibiční aktivity bisfosfonátů vůči PTPasám (v osteoklastech) (popisuje se v publikaci Skorey et al., J. Biol. Chem. 272: 22472-22480 (1997), Opas et al., Biochemical Pharmacology 54: 721-727 (1997)). Zjistilo se však, že inhibiční účinek alendronatu je velmi ciltivý na použité složky testu, jako je EDTA a DTT. Dále se prokázalo, že inhibice je závislá na čase. Mechanizmus působení na biochemické úrovni se prokázalo prostřednictvím oxidace katalytického cysteinu v aktivním místě (popisuje se v publikaci Skorey et al., J. Biol. Chem. 272: 22472-22480 (1997)). Je nutné poznamenat, že bifosfonáty inhibují široké rozmezí PTPas. Je zřejmé, že mechanizmus působení, to znamená oxidace aktivního místa cysteinu, bude způsobovat problémy, při vývoji látek založených na bisfosfonátech, které selektivně inhibují specifické PTPasy.

III. Sloučeniny zlata al. , Biochemical Ukazuje se, že AuTM inhibuje interakce aktivním místem působí

Pharmacology 54: 703-711 PTPasy prostřednictvím

Ukázalo se, že thiomalatozlatnan sodný (AuTM), který se úspěšně používá při léčbě autoimunitních a zánětlivých poruch jako inhibitor PTPas (Wang et

1997) jeho nukleofilního cysteinu v těchto enzymech. Dithiothreitol může naopak u látek podle vynálezu bránit nebo skoro úplně bránit uvedené inhibici. Stejně jako v případě bisfosfonátů, jestliže sloučeniny zlata se používají pro přípravu selekčních inhibitorů, došlo k podstatným problémům.

Inhibitory popsané shora v textu nejsou selektivní. Je pravděpodobné, že některé z pozorovaných toxických účinků nebo vedlejších účinků jsou způsobeny alespoň z části nedostatkem selektivity.

Existuje nutnost vytvoření obecného, kompetetivního inhibitoru PTPasy, který není peptid, nebo je smíšeného typu, nebo sloučeniny, která se může použít pro další optimalizaci silných a selektivních inhibitorů.

Za použití PTPlB a syntetického peptidu fosforylovaného ³³P a značeného biotinem jako substrátu se vyvinul scintilační přibližný test s vysokou průchodností (SPA-Amersham). Tento peptidový substrát, který odpovídá aktivační smyčce inzulínové receptorové kinasy, to je Thr-Arg-Asp-Ile-Tyr-Glu-Thr-tyr-TyrArg-Lys-NH₂ se fosforyloval ³³P na tyrosinových zbytcích za použití tyrosinkinázy receptoru inzulínu. Zkoumala se knihovna sloučenin a zaznamenala se řada zásahů. Překvapivě jeden z těchto zásahů, kyselina oxalyl-aminobenzoová prokázala, že působí jako klasický, kompetitivní, reverzibilně působící místně řízený inhibitor (popisuje se dále v textu). Kyselina 2-(oxalyl-amino)benzoová se poprvé popisuje v publikaci Friedlaender et al., Chem. Ber., 14, 1921 (1881)). Navzdory tomu, že tato látka je známa po desítky let, neexistuje žádná zpráva popisující aktivitu inhibující PTPasu.

Nejdříve se analyzoval způsob inhibice kyseliny 2-(oxalylamino) benzoové a jejích analogů za použití klasické metodologie kinetiky enzymů v klidovém stádiu, jak se popisuje v publikaci R. A. Copeland, Enzymes - A Practical Introduction to Structure, Mechanism and Data Analysis, VCH Publishers, lne., New York, 1996 (obrázek č. 1). Obrázky žádným způsobem neomezují předmětnou věc vynálezu. Zvláště se vynález neomezuje na klasické, kompetitivní inhibitory.

Z obrázku č. 1 je patrné, že některé látky podle vynálezu (například kyselina oxalylaminobenzoová) se chovají jako reverzibilní, klasický kompeteivní inhibitor fosfatasy PTP1B (lineární vztah mezi koncentrací inhibitoru a zjevnou hodnotou

Km (obrázek č. 1 (B) nemá vliv na hodnotu V_max (obrázek č. 1 (O). Zjistilo se, že hodnota Ki je přibližně 30 μΜ. Výpočet hodnoty Ki se popisuje detailněji dále v textu a také se popisuje v příkladu v sekci definice.

Také se zkoumal vliv složek použitých v testu, o kterých se ví, že mají podstatný vliv na inhibici jiných inhibitorů PTPas, jak se popisuje shora v textu. EDTA se přidala do testovacího pufru a dithiothreitol se nahradil glutathionem (obrázek č. 2).

Z obrázku č. 2 je zřejmé, že inhibitory podle vynálezu na rozdíl od inhibitorů popsaných shora v textu nejsou citlivé na konstituenty použité v testu, jako je EDTA a redukční činidlo (lineární vztah mezi koncentrací inhibitoru a zjevnou hodnotou. K_m (obrázek č. 2 (B) , nemá vliv na hodnotu V_max (obrázek č. 2 (C)) . Zjistilo se, že hodnota Ki je přibližně 50 μΜ. Reversibilní podstata procesu inhibice je jasně indikována skutečností, že hodnota V_max je nezávislá na koncentraci inhibitoru.

Na obrázku č. 3 se ukazuje, že některé z látek podle vynálezu nevykazují žádné znamení časové závislosti. To opět dokazuje reverzibilní podstatu inhibice.

Aby bylo možné přesněji identifikovat chemické elementy definující inhibični aktivitu PTPasy použila se analýza nových chemických analogů. Analogy kyseliny 2-(oxalyl-amino)benzoové si udržují v podstatě stejný profil enzymatické kinetiky. To í

znamená, že se chovají jako klasické kompetitivní inhibitory. Tak sloučeniny podle vynálezu se mohou odvodit změnami elementů, které jsou nutné pro navázání/inhibici/modulaci aktivních míst PTPas a/nebo jiných molekul s rozeznávacími jednotkami pTyr za použití postupů, které jsou dobře známy v oboru.

Příklady enzymatického kinetického chování analogů kyseliny 2(oxalyl-amino)benzoové jsou ukázány na obrázku č. 4 a 5. Překvapivě tyto nové látky si ponechávají klasický kompetitivní způsob inhibice, který je možný pozorovat u kyseliny 2-(oxalyl-amino)benzoové. Na základě této skutečnosti je zřejmé, že odborník může vytvořit nové analogy původní sloučeniny, které stále působí jako inhibitory proteinových tyrosinfosfatas. Odborník může přidat substituenty ke kyselině 2-(oxalyl-amino)benzoové, čímž se změní síla a selektivita k jiným preferovaným sloučeninám podle vynálezu. Takové nové sloučeniny mohou být inhibitory nebo modulátory proteinových tyrosinfosfatas nebo jiných molekul s rozeznávací jednotkou pTyr a mohou být klasickými, kompetitivními inhibitory nebo inhibitory smíšeného typu. Vynález dále popisuje způsob přípravy neselektivních a selektivních inhibitorů a modulátorů molekul, které obsahují pTyr rozeznávací jednotky, které zahrnují proteinové tyrosinfosfatasy.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou dále upravovat, aby působily jako předchůdce léků.

Velmi známým problémem při vývoji léků je skutečnost, že takové inhibitory enzymů mohou být velmi silný a selektivní v biochemických testech, ale přitom nejsou aktivní in vivo. Tento nedostatek biodostupnosti může být způsoben řadou různých faktorů, jako slabá nebo žádná absorpce ve střevech, v prvním stupni metabolizmu v játrech, nebo látka je špatně pohlcována buňkami. Ačkoli faktory stanovující biodostupnost nejsou zcela jasné, ve vědecké literatuře existuje řada příkladů, které jsou dobře známy v oboru, jak modifikovat sloučeniny, které jsou účinné a selektivní v biochemických testech, ale přitom vykazují nízkou nebo žádnou aktivitu in vivo, na léky, které jsou biologicky aktivní. Vynález dále popisuje úpravu sloučenin podle vynálezu, které se nazývají „původní sloučeniny, připojením chemických skupin, které zlepší biologickou dostupnost uvedených látek takovým e e c e e ' c f f. ft r - c c f * ” ' * způsobem, že se umožní, aby buňky nebo savci pohltily dané sloučeniny. Příklady uvedených modifikací, které neovlivňují rozsah vynálezu, zahrnují změnu jedné nebo více karboxyskupin na estery (například methylestery, ethylestery, acetoxymethylestery nebo jiné acyloxymethylestery). Sloučeniny podle vynálezu, původní sloučeniny, jako jsou sloučeniny upravené připojením chemických skupin se nazývají „upravené sloučeniny. Uvedené chemické skupiny mohou nebo nemusí být zřejmé z nároků vynálezu. Jiné příklady upravených sloučenin, které v žádném případě neomezují rozsah vynálezu, jsou sloučeniny, které vytvářejí v určitém místě kruhovou strukturu. Tyto sloučeniny se nazývají „cyklické sloučeniny. Tyto sloučeniny se po pohlcení do buněk nebo savců hydrolyzují ve stejné specifické poloze v molekule za vzniku sloučenin podle vynálezu. Původní sloučeniny se pak nazývají „necyklické sloučeniny . Aby se předešlo chybám, rozumí se, že pozdější původní látky v mnoha případech budou obsahovat jiné cyklické nebo hetrocyklické struktury, které nebudou po pohlcení do buněk nebo savců hydrolyzovat. V obecném případě uvedené upravené sloučeniny nebudou vykazovat v biochemických testech podobné chování jako původní sloučenina. To znamená, že se nebudou chovat jako odpovídající sloučenina podle vynálezu, která neobsahuje navázané chemické skupiny nebo uvedené úpravy. Uvedené upravené sloučeniny nemusí být dokonce v biochemických testech aktivní. Po pohlcení do buněk nebo do savců .se však tyto chemické skupiny upravených látek mohou naopak odstranit spontánně nebo endogenními enzymy nebo enzymovýmy systémy za vzniku sloučenin podle vynálezu tedy původních sloučenin. „Pohlcení se definuje jako způsob, který povede k podstatné koncentraci sloučeniny uvnitř buňky nebo ve zvířeti. Po pohlcení sloučeniny do buněk nebo savců a po odstranění uvedené zachycené chemické skupiny nebo po hydrolýze uvedené cyklické sloučeniny, mohou mít sloučeniny stejnou strukturu jako původní sloučeniny, čímž se obnoví ; i : z { ^; ;

jejich aktivita a stávají se aktivní v buňkách a/nebo in vivo po pohlcení. Existuje řada způsobů, které jsou dobře známy v oboru, které se mohou použití k ověření, že připojené chemické skupiny po pohlcení sloučeniny buňkami nebo savci odstranily nebo že se cyklická sloučenina se hydrolyzovala. Savčí buněčná linie, kterou je možné získat z instituce American Tissue Type Collection nebo z jiných vládních nebo komerčních zdrojů, se inkubovala s uvedenou upravenou látkou. Po inkubaci při podmínkách, které jsou dobře známy v oboru, se buňky vhodně promyjí, lyžují a lyzát se izoluje. Musí se do experimentu zahrnout vhodná kontrola, která je dobře známa v oboru. Pro extrakci a čištění sloučeniny z uvedeného lyzátu je možné použít řadu různých postupů, které jsou dobře známy v oboru. Na uvedené sloučenině může nebo nemusí zůstat připojená chemická skupina a uvedená cyklická sloučenina se může nebo nemusí hydrolyzovat. Podobně se může použít řada různých postupů, které jsou dobře známy v oboru, které strukturálně a chemicky charakterizují uvedenou čištěnou sloučeninu. Protože čištěná sloučenina se izolovala z uvedeného buněčného lyzátu a protože byla pohlcena do uvedené buněčné linie, porovnání uvedené strukturně a chemicky charakterizované látky s původní neupravenou látkou (to je sloučenina bez zachycené chemické skupiny nebo necyklická sloučenina) ihned poskytne odborníkovi informaci, zda byla přichycená chemická skupina v buňce odstraněna nebo jestli se cyklická sloučenina hydrolyzovala. Uvedená čištěná látka se může vystavit analýze kinetiky enzymů, jak se popisuje ve vynálezu. V případě, že kinetický profil je podobný profilu původní sloučeniny bez uvedené připojené chemické skupiny, ale je liší se od uvedené upravené sloučeniny, pak je zřejmé, že uvedená chemická skupina se odstranila nebo uvedená cyklická sloučenina se hydrolyzovala. Podobné metody se používají k analýze sloučenin podle vynálezu na zvířatech a u savců.

- ; - : · - ·;'; ;

Preferovaným pro-lékem jsou acetoxymethylestery látek podle vynálezu, které se mohou připravit následujícím obecným postupem (popisuje se v publikaci C. Schultz et al., The Journal of Biological Chemistry, 1993, 268, 6316-6322). Karboxylové kyselina (1 ekvivalent) se suspenduje v suchém acetonitrilu (2 ml na 0,1 mmol). Přidal se diisopropylamin (3,0 ekvivalenty) následován bromomethylWacetátem (1,5 ekvivalentu). Směs se míchala v dusíku přes noc při teplotě místnosti. Acetonitril se odstranil za sníženého tlaku, přičemž vzniká olej, který se ředil ethylacetátem a promyl se vodou (3x). Organická vrstva se sušila bezvodým síranem hořečnatým. Po filtraci následuje odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku a vzniká surový olej. Produkt se čistil chromatografickou kolonou na silikagelu za použití vhodného systému rozpouštědla.

Definice

Termín „signální transdukce je souborný termín používaný k definici všech buněčných procesů, které umožňují aktivaci dané buňky a tkáně. Příklady signální transdukce, které v žádném případě neomezují předmětnou věc vynálezu, jsou buněčné jevy, které se vyvolávají polypeptidovými hormony a růstovými faktory (například inzulín, růstové faktory podobné inzulinu I a II, růstový hormon, epidermální růstový faktor, růstový faktor získaný s destiček) , cytokiny (například interleukinyj, komponenty exťrabuněčné matrice a interakce buňkabuňka.

Termíny „jednotky rozeznávající tyrosin/jednotky rozeznávající tyrosinfosfát/jednotky rozeznávající pTyr se definují jako oblasti proteinů nebo glykoproteinů, které vykazují afinitu k molekulám, jenž obsahují fosforylované tyrosinový zbytky (pTyr). Příklady jednotek rozeznávaných pTyr, které v žádném případě neomezují rozsah vynálezu, jsou: PTPasy, oblasti SH2 a PTB. Dále u některých PTPas podobných receptoru nebo u PTPas c c· — ^: ~ ' receptorového typu druhá doména (C-terminální doména) s nějvětší pravděpodobností nevykazuje katalytickou aktivitu. Zdá se, že druhá doména CD45 nepůsobí jako aktivní PTPasa (Kashio et al., J. Biol. Chem. 273, 33856-22863 (1998)). Zdá se, že druhá doména CD45 má důležitou úlohu jako jednotka rozeznávaná fosfotyrosinem, což je důležité pro vylučování interleukinu-2 a použití substrátu TCRz in vivo (Kashio et al., J. Biol. Chem. 273, 33856-22863 (1998)). Druhá doména CD45 v tomto případě může hrát podobnou úlohu jako oblast SH2 a proto působí jako jednotka rozeznávající fosfotyrosin. Ačkoli to nebylo formálně dokázáno, jiné molekuly, které jsou podobné PTPasám, jako je IA-2 a IA-2b mohou působit jako jednotky rozeznávající pTyr.

Termín „proteiny s jednotkami, které rozeznávají fosfotyrosin se definují jako proteiny nebo glykoproteiny, které obsahují jednotky rozeznávající fosfotyrosin.

Termín „ligand se definuje jako molekula nebo sloučenina, která se váže na jinou molekulu. Příklad ligandu, který v žádném případě neomezuje rozsah definice, je molekula, která není peptidem s molekulovou hmotností rovné nebo menší než je 2 500 Da, která se váže na protein nebo glykoprotein.

Termín „ligand jednotky rozeznávající fosfotyrosin se definuje jako molekula, která se váže na jednotku(y) rozeznávající fosfotyrosin proteinu nebo glykoproteinů s jednotkami, které rozeznávají fosfotyrosin. Nelimitující příklady ligandů jednotek rozeznávajících fosfotyrosin zahrnují inhibitory PTPasy a/nebo modulátory PTPasy. Jiným příkladem ligandu jednotek rozeznávajících fosfotyrosin je sloučenina, která se váže na oblast SH2 a/nebo oblast PTB.

Termín „PTPasa definuje enzymy s kapacitou defosforylovat proteiny obsahující pTyr nebo glykoproteiny. Příklady PTPas, které neomezují předmětnou věc vynálezu, jsou „klasické PTPasy (vnitrobuněčné PTPasy (například PTP1B, TC-PTP, PTP1C, PRP1D, PTPD1, PTPD2) a PTPasy receptorového typu (například

C ΓPTPa, ΡΤΡε, ΡΤΡβ, CD45, ΡΤΡγ, ΡΤΡκ, ΡΤΡμ) , fosfatasy s duální specifitou (VH1, VHR, cdd25) , LMW-PTPasy nebo kyselé fosfatasy. Seznam v současné době známých klasických a jiných PTPas uvedených v databázi GenBank je uveden v tabulce č. 1 (s uvedenými čísly uložení).

- _{r r}. f. r· l~ p e C C ^Γ Γ·? · λ ' ' ' _r_ ř. - e r ^r t? *“ _r - r·. v. ·:: Z' ³¹ ’ ^p L/ '-A

Tabulka č. 1: Seznam PTPas (částečná cDNA nebo cDNA plné délky) jméno číslo uložení bovinní

bPTPBA14	U20807
kuřecí
cLAR		L32780
cPTPlB		U8S410
cPTPalpha		Z32749,L22437
cPTPcryp2		U65891
cPTPgamma		U38349
cPTPlambda		L13285, Z219S0
cPTPsyp		U38S20
cPTPzeta		L27625
lidský
hCD45	Y00638	Y000S2 p08575
hchPTPl	U42361
hGLEPPl	U20489
HLAR	Y00815
hLCPTP	D11327
hLyPTPl	AF001846
hLyPTP2	AF001847
hMEGl	M68941
hMEG2	M83738
hPCPTPl	DS4053	U42361
hPEST	D13380	M93425
hPTPlB	M31724	M33S89
hSHPl	M74903	X6205S M77273	X82817* X82818**
hSHP2	X70766	L08807 D13540	L03535
hPTPlE	U12128	D21209 D21210	D21211
hPTPalpha	M34668	X54130 X54890 ,	X53364
hPTPBDPl	X79568
hPTPbeta	X54131
hPTPchlg	U77917	U77916*
hPTPCOMl	Z79693
hPTPDl	X79510
hPTPD2	X82676
hPTPdelta	X54133	L38929
hPTPDEPl	U10886	D37781
hPTPEC	X82635	E09724*
hPTPepsilon	X54134

T. t-r-CČ r r

jméno číslo uložení

hPTPFMI	X95712
hPTPgatnma	L09247	X54132
hPTPHl	M64572
hPTPKE	M64322
hPTPIA2	L18983	Z48226
hPTPIA2beta	U65065
hPTPIAR	AF007555	L76258
hPTPICA512	X62899
hPTPkappa	L77886	Z70660
hPTPLX	X80289
hPTPmu	X58288
hPTPPCP2	X97198
hPTPpi	U81561
hPTPPNPl	X79676
hPTPpsi	U60289	U73727
hPTPrho	AF043644	AL024473	A1022239	AQ02047
hPTPRO	U71075
hPTPS31	132035	132036	132037 132038	132039
hPTPSAPl	D15049
hPTPsigma	U35234	U40317	U41725
hPTPU2	Z48541
hPTPzeca	M93426	X54135	U88967
hTCPTP	M25393	M81478	M80737
hPTP-af007118	AF007118
hchPTP	U42361
myší
mCD45	M14342	M92933	M33482
mDPZPTP	D28529
mLAR	Z37988
mMEG2	AÍ013490
mPEP	M90388
mPEST	X86781
mPTPlB	M97590	024700
mPTPIC	M68902	M90339
mPTPID	L08663	D84372
mPTP35	X74438
mPTP36	D31842
mPTPalpha	M33671	M36033

Γ · jméno číslo uloženi ·

mPTPbeta	X58289
mPTPBL	Z32740
mPTPBR7	D31898
mPTPbyp	D45212
mPTPdelta	013903	E09890	E09891	E09892
mPTPepsilon	U35368	O3G758	083484	U62387 U40280
mPTPesp	U36488
mPTPFLPl	U52523	U49853
mPTPftpl	D88187
mPTPgamma	L095S2
mPTPGMCl	AF073998	AF073999
mPTPGMCl	AF073998	AF073999
mPTPHA2	L40595
ΠΡΤΡΙΑ2	U11812
mPTPKl	U3S124
mPTPkappa	L10106
mPTPlambda	U55057
mPTPmu	X58287
mPTPNP	U57345
mPTPP19	X63440	S36169
mPTPphi	037467	037466	037465
mPTPRIP	D83966
mPTPRLIO	D37801	D83072
mPTPNU3	X82268
mPTPT9	D28530	D28531*
mPTPSL	Z30313	Z23058
mPTPtestis	D64141
mSTEPSl	028217	S80329	028216
mTCPTP	S52655	M81477	M80739

krysí

rCBPTP	M10072	Y00065
rLAR	L11586	U00477	X83546 X83S05
rLCPTP	028356
rPC12PTPl	014914
rPTP- E10496	E10496
ΓΡΤΡ-Ε09723	E09723
ΓΡΤΡ1Β	M33962
rPTPID	009307	OOS963

rPTP20 U69673 r r p

jméno	číslo uložení
rPTP2E	U17971	U18293
rPTPalpha	L01702
rPTPBEMl částečná	cds	D45412
rPTPBEM2	D45413
ΓΡΤΡΒΕΜ3	D45414
rPTPD30 celá cds		U28938
rPTPDEPl	U40790
rPTPepsilon	D78610	D78613
rPTPGMCl	AF063249
rPTPICA105	X92563	D38222
ΓΡΤΡΝΕ6	U734S8	250735
rPTPOST	L36884
rPTPPl	L19180
rPTPPS	L19181
rPTPpsi	U66566
rPTPsigma	L11587	L12329
rPTPzeca	U09357
rRKPTP	D38072
rSTEP	S49400
rSHPl	U77038
rTCPTP	X58828
rPTPTD14	AF077000
králičí
rabPTP-oc	U32S87

jiné PTPasy podobné VH1

hCLIOO	X68277	S46269
hMKP-2	U48807
hMKP-4	Y08302
hPAC-1	U23853	L11329
hPTEN	U93051	AF000731	AF000732 AF000733
	AF000734
hPTPpystl	X93920
hPTPpyst2	X93921
hPTPTH2	AF019083

jméno číslo uložení , r, c e e c e «? r, c oř

hTYPl	S80S32
hVHl	???
hVH2	U21108
hVH5	U27193
hVHR	???
mERP	S64851
mI29-PACl	U09268
mMKP-1	X61940
mNTTPl	X95518
mPAC-1	L11330
mPRL-1	U84411
mSty	U11054
mSTYX	U34973
mVHl	X61940
myxotnaPTP	L31960
nostocPTP	L11392
raccPTP	L13165
rCLIOO	S81478	X84004
rMKP-2	U23438
RPRL-1	L27843
ru02553	U02553
rVH6	U42627
shopePTP-	L32180
yVHl	L04673
hPRL3	AF041434

LMW
bPTPlmw	M83656
hRBClmw	M83653	M83654
yLMPTPl	L33929
yLTPl	U11057	L48604
cdc25- rodina

hPTPcdc25a hPTPcdc2Sb2 hcdc!4B

M81933

ZS8092

AF023158 n *

I jméno číslo uložení neklasifikované savčí PTPas'

hPTPCAAXl	U48296
hPTPCAAX2	U48297
hPTPC!P2	L25876
hPTPCdil	U02681
hPTPICAAR	Y085S9
hPTPTEPl	U96180
hPTPkiaaO283	AB006621
hPTPPRL-1	AF0511G0
hPTPPRL-3	AF041434
hPTP_put at ive_	AF007118
mPTP-IFl	Y17345
mPTP-IF2	Y17344
mPTP-IF2P	Y17343
Mikrobiální PTPas
autovPTP	M967G3
salmPTP	US3293
strepPTP	U37580

jaderné polyhedrové viry

Rachiplusia npvPTP

AF068270 c c c c f r Γ C í~ ^r jiní eukaryonti (to je Drosophila, kvasinky, houby, xenopus, atd.

Arabidopsis thaliana atPTPl AF055635 atPTPl-exons-introns AJ006309

Caenorhabditis elegáne ceCosinid cePTP2 cePTP6 cePTPclr-1 cePTPPRL-1

Z80216

AF015882

Z70284

AF047880

AF063401 r r- e e c

Drosophila
dLAR	M27700
dPTPlOD	M804G5	M80538
dPTP4E	L20894
dPTPGlF	L11253	L14849	L11252
dPTP69D	M27699
dPTP99A	M80464	M80539	M81795
dPTPcork	U19909
dPTPPRL-1	AF047880	AF047881

L11251

Dictyostelium diseoideum 1'

dictPTP	L07125
dictPTP2	L15420
dictPTP3	U38197
Emericella nidulans
fPTPncdc25	XG4G01	S37934

Tritrichomonas foetus

triPTP.pep	U6S070
Schizoaaccharomyces	pombe
yPTPl	Z73100
yPTPcand	L01038
yPTPMSGS	D17548
yPTPpypl	M63257
yPTPpyp2	X59599	S51320
yPTPpyp3	X69994	S5138S
yPTPtrna	X7S077

Yersinea cerivisiae
yscPTP yscPTP2	M64062 M38723
yscPTP3	AF006304
Xenopus
XCD45	AF024438
XPTP-SH2	U15287
xPTPalpha	U09135
xPTPXl	L33098
xPTPXlO	- L33099

M82872

Hirudo medicinaliS hmLarl AF017084 'hraLar2 AF017083

Piaum sativum hrášek peaPTPl AJ00S589

Glyciue nax sója soybeanPTPl AJ00S308

Termín „modulátor PTPasy je sloučenina, která způsobuje změnu aktivity PTPasy. Modulátory PTPasy mohou tvořit PTPasy méně aktivní nebo více aktivní. Modulátory PTPas se mohou podle definice vázat na aktivní místo PTPas nebo na oblasti mimo aktovní místo PTPas (nazývají se alosterické modulátory). Jiný nelimitující příklad modulátoru PTPas je sloučenina, která mění substrátovou specifitu PTPas.

Termín „oblast PTPasy se definuje jako část molekuly PTPasy celé délky, která v typickém případě, ale ne vždy, vykazuje charakteristickou enzymatickou aktivitu. To znamená kapacitu defosforylovat proteiny a glykoproteiny obsahující pTyr. Oblast PTPasy klasických PTPas bude v typickém případě obsahovat 220 až 350 aminokyselinových zbytků a odpovídat aminokyselinovým zbytkům označených čísly 30 až 270 PTP1B. Oblasti PTPas se mohou exprimovat v eukaryontním nebo v prokaryontním expresívním systému buď jako samotné oblasti nebo jako část fúzního proteinu.

Termín „oblasti SH2 znamená domény Src homologie 2 (SH2) a jsou to nekatalytické proteinové moduly, které se vážou na proteiny obsahující pTyr (fosfotyrosinový zbytek). To znamená oblasti SH2 jsou jednotky rozeznávající pTyr. Oblasti SH2, které obsahují přibližně 100 aminokyselinových zbytků se nacházejí v řadě různých molekul, které se podílejí na procesu signalizační transdukce. Následuje neomezující seznam proteinů, které obsahují oblasti SH2: Src, Hek, Lek, Syk, Zap70, SHP-1, SHP-2, STÁT, Grb-2, Shc, p85/Pl3K, Gap, vav (popisuje se v publikaci Russel et al., FEBS Lett. 304: 15-20 (1992), Pawson, Nátuře 373: 573-580 (1995), Sawyer, Biopolymers (Peptide Science) 47: 243-261 (1998)).

Strukturální požadavky interakcí mezi oblastí SH2/proteinu pTyr se analyzují se syntetickými, tyrosinfosforylovanými peptidy a dále se hodnotí krystolagrafií rentgenovými paprsky a NMR. Motiv FLVRES (jednopísmenný kód pro aminokyseliny) tvoří část vazebné kapsy v případě pTyr. Navíc jiné vazebné e r kapsy mají důležitou úlohu v definici afinity a selektivity. Tak oblast Src SH2 hydrofobní kapsy se váže na aminokyselinu v poloze odpovídající třem zbytkům C-konce od zbytku pTyr (to je pYR3). Řada studií ukazuje důležitost zbytků umístěných na C-konci od zbytku pTyr (popisuje se v publikaci Pawson, Nátuře 373: 573-580 (1995)).

Stanovení ligandů, které se váží na oblasti SH2.

Vyvinula se řada metod, dobře známých v oboru, které se používají pro hodnocení navázání ligandů, které neobsahují žádný fosfát, na oblasti SH2. Jeden příklad, který neomezuje rozsah vynálezu se popisuje v publikaci Yao et al., J. Med. Chem. 42: 25-35 (1999)). Autoři publikace používaly pro stanovení inhibiční kapacity ligandů, které neobsahují fosfát, na vazebnou doménu Grb2 SH2 (IC50) metodu povrchové plazmonové rezonance (IC50). Rekombinantní oblast GST-Grb2 se inkubovala s různým množstvím ligandu, což umožnilo překročit fosfopeptid SHC vázaný na povrchu, DDPSpYVNVQ (jednopísmenný aminokyselinový kód, kde pY indikuje fosfotyrosin). Množství rovnovážného navázání (Ru(max)) se stanovilo a porovnávalo se sekvencí ligandu. Shora uvedený fosfopeptid SHC DDPSpYVNVQ slouží jako kontrola. Podobně, navázání ligandu se může stanovit pro jiné domény SH2 za použití vhodných na povrch vázaných tyrosinfosforylovaných peptidů, které jsou dobře známy v oboru.

V několika dalších laboratořích se vyvinuly jiné nelimitující přístupy pro hodnocení peptidových ligandů vázajících se na domény SH2 (popisuje se v publikaci Fantl et al., Cell 69: 413-423 (1992), Ward et al., J. Biol. Chem. 271) a odhad navázání nepeptidových ligandů na domény SH2 s malými změnami, které jsou dobře známy v oboru.

Termín „oblasti PTB. V současné době se v shc identifikoval nový _vtyp jednotky rozeznávající pTyr (PTP doména = oblast vázající se na fosfotyrosin), který je adaptorovým proteinem (popisuje se v publikaci Kavanaugh and Williams, Science 266:

c ec c cr · c c r r <·. r r· f r r p r

0 ,,·< ' ' ' ‘ ^r

1862-1865). Oblasti PTB jsou delší než oblast SH2 (přibližně 190 zbytků). V publikaci Kavanaugh and Williams, Science 268: 1177-1179 (1995), Laminet et al., J. Biol. Chem. 271: 264-269 (1996)) se popisují nově vyvinuté testy pro navázání ligandu na oblast shc PTB.

Termín „rodina PTPas se definuje jako skupina PTPas, které jsou si příbuzné svoji strukturou. Jeden přijatelný způsob jak definovat rodinu PTPas je založen na primárních strukturách PTPas vně domén PTPas nebo jejich celkovou strukturou (popisuje se v publikaci Fisher et al., (1991) Science 253: 401-406, . B. J. Goldstein (1995) v Protein Profile, v. 2. n. 13, Academie Press Ltd., London.. Nelimitující příklady rodin PTPas definované takovým způsobem jsou:

a) PTPasy obsahující oblast SH-2, rodiny SHP: SHP-1, SHP-2

b) rodina PTPlB: PTPlB, TC-PTP

c) rodina PTP obsahující oblast ezrinu: PTPH1, PTPD1, PTPD2, PTPMEG

d) rodina PTP-BAS

e) PTPasy obsahující sekvenci prolin-kyselina glutamová-serinthreonin (PĚST): ΡΤΡ-ΡΕΞΤ, PEP

f) PTPasy obsahující velmi malé vysoce glykosylované extrabuněčné oblasti, rodina ΡΤΡα: ΡΤΡα, ΡΤΡε

g) PTPasy receptorového typu s jednou vnitrobuněčnou oblastí PTP, rodina ΡΤΡβ: ΡΤΡβ, DEP-1, GLEPP-1, SAP-1

h) PTPasy obsahující extrabuněčné oblasti s doménami podobnými ímunoglobulinu a oblasti podobné fibronektinu III, rodina PTP-LAR: PTP-LAR, ΡΤΡσ, ΡΤΡδ

i) PTPasy obsahující extrabuněčné oblasti s doménami MAM, rodina ΡΤΡμ: ΡΤΡμ, ΡΤΡκ

j) PTPasy obsahující extrabuněčné oblasti podobné karbonovým anhydrasám, rodina ΡΤΡξ: ΡΤΡξ, ΡΤΡγ

k) rodina IA-2

l) rodina ΡΤΡψ « · 4··9 • · • ··· • · · · · · ♦ · · · « « » ·· ··*···»· • * ··· ···· ···· ··· *«· * · »· ··

m) rodina CD45

Je nutné poznamenat, že ne všechny PTPasy je možné zařadit do rodin.

V alternativním případě se pTPasy mohou rozdělit do rodin na základě uspořádání primární sekvence (popisuje se v publikaci Goldstein, Receptor 3: 1-15 (1993). Pro provedení takového uspořádání je vhodné použít počítačové programy, které jsou dobře známy v oboru (například se uvádí GCG University of Wisconsin). Další analýza se provedla s počítačovými programy, jako je CLUSTALX, který vytváří tzv. fylogenní strom. Příklad uvedeného fylogenního stromu je na obrázku č. 7. Je nutné poznamenat, že shora popsané způsoby rozdělení PTPas do rodin vykazují podstatný přesah. Preferované definice PTPas do rodin je později založen na primárním sekvenčním uspořádání PTPas, protože je pravděpodobné, že tato definice se naopak může použít k ustanovení testů, které umožní vyvinout inhibitory a modulátory PTPas, které selektivně reagují s danou rodinou PTPas nebo s členy specifické rodiny (to jsou selektivní inhibitory).

Termín „ modulace buněčných procesů se definuje jako kapacita sloučenin podle vynálezu 1) buď zvýšit nebo snížit normání nebo abnormální signální transdukci, 2) iniciovat normální signální transdukci a 3) iniciovat abnormální signální transdukci.

Termín „úprava signální transdukce zprostředkované pTyr/modulace aktivity modulů s jednotkami rozeznávajícími pTyr se definuje jako kapacita sloučenin podle vynálezu 1) zvýšit nebo snížit aktivity proteinů nebo glykoproteinů s jednotkami rozeznávajícími pTyr (například PTPasy, domény SH2 nebo domény PTB) nebo 2) snížení nebo zvýšení asociace molekuly obsahující pTyr s proteinem nebo glykoproteinem s jednotkami rozeznávajícími pTyr buď prostřednictvím přímého působení na rozeznávací místo pTyr nebo prostřednictvím nepřímého mechanizmu. Příklady modulace signální transdukce

• · « ·

Φ 9 9 ·· zprostředkované pTyr/modulace aktivity molekul s jednotkami rozeznávajícími pTyr, které neomezují rozsah vynálezu, jsou: a) inhibice aktivity PTPasy vedoucí ke zvýšení nebo ke snížení signální transdukce buněčných procesů, b) inhibice aktivity PTPas, která vede k iniciaci normální nebo abnormální aktivity, c) stimulace aktivity PTPas vedoucí ke zvýšení nebo snížení signální trandukce buněčných procesů, d) stimulace aktivity PTPas vedoucí k iniciaci normální nebo abnormální buněčné aktivity, e) inhibice navázání oblastí SH2 nebo oblastí PTB na proteiny nebo glykoproteiny s pTyr vedoucí ke zvýšení nebo snížení buněčných procesů, f) inhibice navázání oblastí SH2 nebo PTB na proteiny nebo glykoproteiny s pTyr vedoucí k iniciaci normální nebo abnormální buněčné aktivity. Termín „subjekt se definuje jako libovolný druh savce, zahrnující člověka.

Definice inhibice PTPas podle vynálezu

Sloučenina se definuje jako inhibitor PTPas, jestliže jsou splněny následující kriteria: a) inhibični kapacita se musí stanovit způsobem, který se popisuje dále v textu a hodnota inhibični konstanty Ki musí být nižší než 1 000 μΜ, b) alespoň jedna PTPasa se musí inhibovat sloučeninami podle vynálezu. Pro analýzy je možné použít libovolné PTPasy. Nelimitující příklady PTPas jsou: PTP1B, SHP-1, SHP-2, PTP-PEST, PTPa, ΡΤΡμ, LAR, CD45. Další příklady jsou dány v tabulce 1. Navíc je možné použít libovolnou PTPasu, která zde není nutně uvedená.

Stanovení konstant inhibitorů

Stanovení kosntant inhibitorů (hodnoty Ki) se může uskutečnit podle řady různých experimentálních postupů, které zahrnují prudké ochlazení fluorescence inhibitoru. Avšak ve všech případech pro účely hodnocení sloučenin podle vynálezu se musí

3 • · ··

tyto metody doplnit postupy, které měří účinek sloučenin na katalytickou aktivitu enzymů. Podmínky takových testů jsou uvedeny dále v textu.

PTPasy

PTPasy používané při analýzách se mohou exprimovat jako neporušené molekuly nebo jako oblasti PTPas.

Podmínky testů

Podmínky testů se vybraly tak, aby se zaručila stabilita enzymů, to znamená, že enzymy si musí v nepřítomnosti substrátu ponechat během testu alespoň 50 % počáteční aktivity.

Pufrové systémy

Za účelem analýzy sloučenin podle vynálezu se může vybrat libovolný pufrový systém. Preferované pufry používané pro analýzu inhibice nebo modulace PTPas se uvádějí na seznamu dále v textu.

Pufr 1

100 mM NaAc (sodiumacetát) pH 5,5

0,1 % BSA (albumin bovinního séra) mM DTT (dithithreitol)

Pufr 2

100 mM NaAc pH 5,5 mM NaCl

0,1 % BSA mM DTT

Pufr 3

100 mM NaAc pH 5,5 mM NaCl

0,1 % BSA mM GSH (glutathion) mM EDTA

Pufr 4 mM HEPES pH 7,0

100 mM NaCl

0,1 % BSA mM DTT

Pufr 5 mM HEPES pH 7,0

100 mM NaCl

0,1 % GSH mM EDTA

Pufr 6 mM MES pH 6,0

150 mM NaCl mM DTT

0,1 % BSA

Pufr 7 (konstantní iontová síla pufru se popisuje v publikaci Ellis and Morrison (1982) Methods Enzymol. 117: 301-342) mM Tris mM Bis-Tris

100 mM acetát rozmezí pH 4,5 až 9,0 redukční činidlo může nebo nemusí být přítomno (DTT, GSH, 2.merkaptoethanol) nosičové proteiny mohou nebo nemusí být přítomny (například BSA, želatina) • · ··

Doba reakce

Preferuje se aby doba reakce byla mezi 2 až 60 minutama.

Reakční teplota

Pro analýzu sloučenin podle vynálezu je možné vybrat libovolnou reakční teplotu, která je dobře známa v oboru. Preferované teploty se pohybují v následujícím rozmezí: 4 až 37 °C.

Substráty

Substráty užívané při reakci se mohou vybrat ze skupiny zahrnující a) p-nitrofenylfosfát (pNPP), b) tyrosinfosforylované peptidy, c) přirozené substráty (například autofosforylovaný inzulínový receptor) nebo jeho části (například autofosforylovanou tyrosinkinasovou oblast receptoru inzulínu). Když pNPP se používá jako substrát, enzymatická reakce je následována měřením optické hustoty při vlnové délce přibližně 405 nm. V případě popsaném v odstavci b) a c) enzymatickou reakci může následovat měření uvolněného fosfátu nebo spektrofotometrické/fluorometrické metody podle postupů dobře známých v oboru.

Koncentrace sloučeniny a substrátu

Aby se zajistila optimální stanovení konstant inhibitoru, koncentrace substrátu a inhibitoru musí kolísat nezávisle na dalších skutečnostech.

Rozmezí koncentrací substrátu musí kolísat s preferovaným maximem, konečná koncentrace v testu je alespoň desetkrát vyšší než hodnota K_m stanovená pro stejný enzym za stejných podmínek. Minimální konečná koncentrace testu se přednostně rovná koncentraci, při které se stanovila hodnota K_m enzymu za stejných podmínek.

Mohou se použít alespoň 2 rozdílné koncentrace inhibitorů. Koncentrace budou záviset na aktuálních sloučeninách, ale musí

6

se vybrat takovým způsobem, že nelineární regresní analýza umožňuje stanovení konstant inhhibitorů s přesností, která je pro odborníka přijatelná.

Výpočet konstant inhibitoru, Ki

Definice

Symbol V_o je počáteční rychlost. Je to rychlost reakce odpovídající času 0.

Symbol K_m se definuje jako koncentrace substrátu používaného k získání počáteční rychlosti odpovídající 50 % maximálně získatelné rychlosti (V_max) při úplné substrátové saturaci enzymu. K_m se měří bez přidání inhibitoru.

Symbol V_max je maximální získatelná počáteční rychlost (limitující rychlost) stanovená při úplné saturaci substrátu. Symbol K_app je zjevná hodnota K_m stanovená v přítomnosti inhibitoru.

Symbol V_app je zjevná hodnota V_max stanovená v přítomnosti inhibitoru.

Termín „kompetitivní inhibitory se definují jako sloučeniny, které se vážou na vazebné místo enzymu, na které se váže substrát. Opravdové kompetitivní inhibitory, které se také nazývají klasické kompetitivní inhibitory zvyšují hodnotu K_app, aniž ovlivňují hodnotu V_max.

Termín „smíšený typ inhibitorů se definuje jako inhibitory, které ovlivňují jak K_m tak V_max.

Termín „nekompetitivní inhibitory se definují jako inhibitory, které zvyšují hodnotu V_app aniž vykazují libovolný účinek na hodnotu K_m.

V souladu s klasickými kinetikami podle Michaelise-Mentena konstanta kompetitivních inhibitorů Ki se může vypočítat z následující rovnice (rovnice 1) κ,,,ρ’ΐις,/κ,ΓΡί + κ.

kde [i] je koncentrace inhibitoru.

Kompetitivni část Ki inhibitorů smíšeného typu Κ_±ο, se může vypočítat z rovnice (rovnice 2)

Nekompetitivní část Ki inhibitorů smíšeného typu KiU se může vypočítat podle rovnice (rovnice 3)

KjU=i/(V_maxA/_app-1)

Hodnoty Ki pro danou sloučeninu se mohou vypočítat buď použitím lineárních transformačních postupů nebo nelineární regrese, která vyhovuje klasickým enzymatickým kinetickým modelům podle Michaelise Mentena, jak se definuje shora v textu, přičemž se předpokládá inhibice smíšeného typu nebo kompetitivni inhibice. Preferované sloučeniny podle vynálezu patří k třídě kompetitivních inhibitorů nebo inhibitorů smíšeného typu.

Další informace o definicích shora uvedených enzymatických kinetických parametrů se mohou nalézt v učebnici o enzymatických kinetikách. Nelimitující příklady takových učebnic jsou a) Copeland R. A. Copeland, Enzymes - A Practícal Introduction to Structure, Mechanism and Data Analysis, VCH Publishers, lne., New York, 1996, b) M. Dixon and E.C. Webb, Enzymes, 2^nd edition, Longmans, London, 1996, c) A. CornishBowden, Fundamental of Enzyme Kinetics, Portland Press, 1995.

Výpočet konstant inhibitorů-příklad

Výpočet hodnot Ki se stává více srozumitelným na základě vysvětlení příkladu.

PTP1B se inkubovalo se sloučeninou podle vynálezu (popisuje se v příkladu 2).

Zkrázená forma PTP1B odpovídající N-terminálním 321 aminokyselinám se exprimovala v mikroorganizmu E. coli a čistila se až do dasažení zjevné homogenity za použití publikovaných postupů, které jsou dobře známy v oboru. Enzymatické reakce se provádějí za použití standardních podmínek v podstatě stejným způsobem, jak se popisuje v publikaci Burke et al., Biochemistry 35, 15989-15996 (1996)). Testovací podmínky jsou následující.

Pro tyto experimenty se použila polovina destičky s 96 prohlubněmi. Jako substrát se použil p-nitrofenylfosfát (pNPP) (uvedeno v tabulce č. 2). Použily se následující hodnoty konečných koncentrací pNPP v testu 10 mM (přidalo se do každé prohlubně v řadě A) , 5 mM (přidalo se do každé prohlubně v řadě B) , 2,5 mM (přidalo se do každé prohlubně v řadě C) , 1,25 mM (přidalo se do každé prohlubně v řadě D) , 0,63 mM (přidalo se do každé prohlubně v řadě E) , 0,31 mM (přidalo se do každé prohlubně v řadě F) , 0,16 mM (přidalo se do každé prohlubně v řadě G) . Do prohlubní v řadě H se napřidal žádný »

substrát (do těchto prohlubní se přidal objem testovacího pufru odpovídající objemu pNPP). Kyselina 3-(oxalylamin)naftalen-2-karboxylová rozpuštěná v DMSO (příklad 2) se pužil jako inhibitor a jeho konečné koncentrace v tesu byly následující: 100 μΜ (přidalo se do všech prohlubní ve sloupci 1), 33,3 μΜ (přidalo se do všech prohlubní ve sloupci 2), 11,1 μΜ (přidalo se do všech prohlubní ve sloupci3), 3,7 μΜ (přidalo se do všech prohlubní ve sloupci 4). Místo inhibitoru se do prohlubní ve sloupci 5 a 6 přidal tetsovací pufr (stejný objem jako je objem inhibitoru se přidal do prohlubní ve sloupci 1 až 4). Testovací pufr obsahoval (konečná koncentrace v testu): 100 mM acetát sodný pH 5,5, 50 mM NaCl, 5 mM glutathion, 1 mM EDTA a 0,1 % albumin bovinního séra. Reakce se zpustila přidáním enzymu PTP1B. Do pruhlubní v sloupci 6 se místo enzymu přidal testovací pufr (stejný objem enzymu ve sloupci 1 až 5). Celkový objem v každé prohlubni byl 100 μΐ. Tento objem zahrnuje 10 μΐ inhibitoru rozpuštěného v DMSO nebo 10 μΐ DMSO přidaného do kontrolních prohlubní, do kterých se nepřidal inhibitor. Teplota byla 25 °C. Po 60 minutách se pidal NaOH a ϊ · · ·· · · Β Β Β Β · · • · Β φ · · · · * « φ

Β BBB ··· Β · Β'/ φ

Β · · Β Β Β · Β ·'· • · Β Β Β Β Β Β ·

ΒΒΒΒΒΒΒ Β Β Β ΒΒ ΒΒ ·· absorbance se měřila při vlnové délce 405 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka č. 2: Absorbance měřená při vlnové délce 405 nm

	1	2 3 4 5 6
A B C D E F G H	1.226	1.369	1.445	1.461	1.469	0.124
0.929	1.172	1.33	1.35	1.429	0.084
0.623	0.971	1.17	1.25	1.311	0.064
0.426	0.718	0.948	1.047	1.139	0.053
0.254	0.45	0.651	0.755	0.837	0.048
0.142	0.266	0.394	0.454	0.501	0.044
0.095	0.159	0.226	0.259	0.287	0.044
0.043	0.041	0.044	0.042	0.043 j	0.044

Výpočet hodnoty K_x

Skutečná data z tabulky č. 2 jsou uvedena při uspořádání testu v tabulce č. 3.

Tabulka č. 3

pNPP	Inhib.	noEnž
100.0	33.3	11.1	3.7	0.0	0.0
10.00	1.226	1.369	1.445	1.461	1.469	0.124
5.00	0.929	1.172	1.33	1.35	1.429	0.084
2.50	0.623	0.971	1.17	1.25	1.311	0.064
1.25	0.426	0.718	0.948	1.047	1.139	0.053
0.63	0.254	0.45	0.651	0.755	0.837	0.048
0.31	0.142	0.266	0.394	0.454	0.501	0.044
0.16	0.095	0.159	0.226	0.259	0.287	0.044
0	0.043	0.041	0.044	0.042	0.043	0.044

Měření absorbance se musí nejdříve upravit na libovolnou hodnotu OD₄₀5 získanou z kontrolní prohlubně H6, jak se uvádí v tabulce č. 4.

Tabulka č. 4:

pNPP	Inhib ·	noEnz
100.0	33.3	11.1	3.7	0.0	0.0
10.00	1.182	1.325	1.401	1.417	1.425	0.08
5.00	0.885	1.128	1.286	1.306	1.385	0.04
2.50	0.579	0.927	1.126	1.206	1.267	0.02
1.25	0.382	0.674	0.904	1.003	1.095	0.009
0.63	0.21	0.406	0.607	0.711	0.793	0.004
0.31	0.098	0.222	0.35	0.41	0.457	0
0.16	0.051	0.115	0.182	0.215	0.243	0
0	-0.001	-0.003	0	-0.002	-0.001	0 .

Hodnoty v prohlubních Hl až H5 indikovaly libovolnou barvu (OD45) získanou ze samotného inhibitoru. V uvedeném příkladu v případě inhibitoru nevniká žádná hodnota OD450· Hodnoty ve sloupci 6 indikují hodnoty OD450 způsobené absorbancí susbtrátu. Proto opravené hodnoty OD450 v tabulce č. 4 se musí dále upravit pro absorbanci při vlnové délce 405 nm, které působí jako inhibitor a/nebo substrát, jak je zobrazeno v tabulce č. 5.

Tabulka č. 5:

pNPP	Inhib ♦	noEnz
100.0	33.3	11.1	3.7	0.0	0
10.00	1.103	1.248	1.321	1.339	1.346	0
5.00	0.846	1.091	1.246	1.268	1.346	0
2.50	0.56	0.91	1.106	1.188	1.248	0
1.25	0.374	0.668	0.895	0.996	1.087	0
0.63	0.207	0.405	0.603	0.709	0.79	0
0.31	0.099	0.225	0.35	0.412	0.458	0
0.16	0.052	0.118	0.182	' 0.217	0.244	0
0	0	0	0	0	0	0

Opravené hodnoty v tabulce č. 5 se nyní používají pro výpočet hodnot Ki inhibitoru pro každou analyzovanou koncentraci inhibitoru (100, 33,3, 11,1 a 3,7 μΜ) . Klasické grafy podle Michaelis Menten zobrazující tyto data jsou uvedeny na obrázku č. 4 (A). Za použití nelineární regresní analýzy dat v tabulce

č. 5 se pro každou koncentraci inhibitoru (tabulka č. 6) vypočítaly zjevné hodnoty K_m (vykádřeno v mM, K_app a zjevná hodnota V_max) .

Tabulka č. 6

	100	33.3	11.1	3.70	0
IIlil * Kapp Vapp	4.30 1.57	1.53 1.44	0.89 1.47	0.69 1.46	0.59 1.50

Tyto data jsou znázorněna graficky na obrázku č. 4 (B) a (C).

Za použití dat v tabulce č. 6 a rovnice 1 (popisuje se shora v textu) hodnoty Ki se mohou vypočítat v případě každé koncentrace inhibitoru (tabulka č. 7).

Tabulka č. 7:

Inhibitor.feon centr. (hM)

100.0 33.3 11.1 3.7

Ki (PM)

16.0 21.1 22.5 23.0

Zdá se, že hodnoty Ki jsou většinou stejné bez ohledu na koncentraci inhibitoru. Když se tato skutečnost kombinuje s faktem, že inhibitor nemění hodnotu V_max, pak je možné shrnout, že uvedený inhibitor je klasický kompetitivní inhibitor. To dále ilustruje výpočet kompetitivní části Ki (KiC) předpokládající inhibici smíšeného typu a použití rovnice č. 2 (popisuje shora v textu). Jestliže inhibitor je smíšený typ, pak vypočtené hodnoty Kj_c by se měly podstatně lišit od hodnot Ki v tabulce č. 7. Hodnoty Ki v případě inhibitoru se uvádějí v tabulce č. 8:

'· · · · · ·

Tabulka č. 8:

Jlnhibitor.concentr	(μΜ)	100.0	33.3	11.1	3.7
IKic	17.0	19.8	21.1	19.9

Je zřejmé, že hodnoty KiC v tabulce č. 8 jsou ve většině případů identické s hodnotami Ki v tabulce č. 7.

Termín selektivita inhibitoru se definuje jako vlastnost sloučeniny inhobovat nebo modulovat jistou PTPasu nebo jisté PTPasy účiněji ve srovnání s jinými PTPasami. Selektivní inhibitor může inhibovat pouze jednu PTPasu nebo pouze jednu rodinu PTPas. Jiné selektivní inhibitory však také zahrnují sloučeniny, které inhibují sadu několika PTPas nebo rodin PTPas účiněji než jinou sadu PTPas nebo rodin PTPas.

Příklad selektivity, který v žádném případě neomezuje rozsah vynálezu, je kompetitivní inhibitor, který vykazuje hodnotu Ki 50 μΜ ve srovnání s PTPlB a hodnotu Ki 500 μΜ nebo více proti ΡΤΡα. Příklad selektivního modulátoru, který v žádném případě neomezuje rozsah vynálezu, je modulátor, který způsobuje dvojnásobné zvýšení aktivity SHP-1 aniž ovlivňuje aktivitu ΡΤΡα.

Aby bylo možné dále ilustrovat použití různých PTPas při hodnocení síly inhibitoru, předkládá se krátký popis, jak připravit a exprimovat jiné konstrukce PTP. Uvedený popis umožní expresi a čištění jiných domén PTPas, které se mohou použít při hodnocení síly, stejně jako selektivity (popisuje se shora v textu) inhibitorů PTPas. Vhodné zdroje tkání a buněk nebo buněčných linií se používají k izolaci RNA (celková nebo mediátorvá- RNA). Jako neomezující příklady se RNA může jater, svalů skeletu, tukové tkáně a leukocytů, za použití standardních postupů (popisuje se v publikaci Ausubel F.M., et al., (Eds.) Short protocols in molecular biology, 2^nd edition: A compendium of methods from Current Protocols in molecular Biology. John izolovat z placenty, periférních krevních ► Φ ··* < • · • φ ·· • Φ ·· » '·»;' · > Φ Φ&- φ

Wiley and Sons, lne. New York ISBN 0-471-57735-9 (1992),

Ausubel, Frederick M. Current Protocols on CD-ROM Userš Guide, Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons, lne. (1998), cDNA se připravila z vhodné RNA. Taková cDNA naopak slouží jako templát polymerázové řetězcové reakce (PCR). Je nutné dále poznamenat, že vhodné templáty cDNA se mohou získat z komerčních zdrojů, jako například u firmy Clontech (1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303). Metoda PCR se používá při přípravě cDNA odpovídající následujícím oblastem PTPas (popisuje se v publikaci Ausubel et al., (Eds.) Short protocols in molecular biology, 2^nd edition: A compendium of methods from Current Protocols in molecular Biology. John Wiley and Sons, lne. New York ISBN 0471-57735-9 oblast 1 a restrikční (1992)): PTP1B, oblast 1 PTPa, oblast 1 ΡΤΡβ, 2 CD45. V oligonukleotidech se nacházejí vhodná místa, což umožňuje klonování do vhodných expresívních vektorů. V těchto příkladech, které v žádném případě neovlivňují rozsah vynálezu, se použily expresívní vektory (Pharmacia). V případě vhodného klonování do expresívních vektorů (nejsou uvedeny) se do některých konstrukcí (označeny jak (M) ) přidal N-terminální methionin (Met-M). Všechny sekvence se potvrdily sekvenováním obou řetězců. Další detaily jsou uvedeny v tabulce č. 9. Informace o oligonukleotidech užívaných při PCR a číslech uložení v databázi GenBank pro specifické PTPasy umožňují odborníkovi získat cDNA kódující tyto specifické oblasti PTPas. Po začlenění do vhodných expresívních vektorů kódujících shora uvedené fúzní proteiny glutathion-S-transferasy (GST). Noční kultury se ředily 1:25 a nechaly se růst po dobu 3 hodin při teplotě 37 °C. Exprese fúzních proteinů GST se pak vyvolala přidáním isopropyl-l-thio-b-D-galaktopyranosidasy a kultura se nechala růst po dobu dalších 3 hodin při teplotě místnosti. Fúzní proteiny GST se čistily podle instrukcí výrobce (Pharmacia) s minimálními úpravami. Krátce všechny kroky *· ·»·· · ·· ·· *·

čištění se provedly přibližně při teplotě 4°C. Buněčné pelety se suspendovaly (5 ml/g) v lyzačním pufru (50 mM imidazol, 5 mM EDTA, 0,1 % b-merkaptoethanol, 10 % glycerol, 10 gg/ml aprotinu, 0,1 % lysozymu a ImM PMSF, pH 7,2) mícháním po dobu 1 hodiny až do dosažení lyže za tlaku dusíku (> 14 MPa) při distribuci buněk Parr. Do lyzátu se přidal Triton X-100 (0,1%) a míchání pokračovalo po dobu 1 hodiny a pak následovala centrifugace při 40 000 ot./min. po dobu 30 minut. Supernatant se aplikoval na glutathionsefarosovou kolonu (Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy GST ekvilibračním pufrem (50 mM imidazol, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl a 10 % glycerol, pH 7,2) a na počátku se promyla stejným pufrem. Směr proudu se změnil a promývání pokračovalo promývacím pufrem (50 mM Tris, 1 mM EDTA a 10 % glycerol, pH8) . Nakonec se vázaný protein eluoval 10 mM glutathionem v promývacím pufru. Fúzní protein CD45 se dále čistil na kolonách G25 a MonoQ (Pharmacia). Čištěné oblasti PTP se skladovaly při teplotě -80 °C až do použití. Bezprostředně před použitím se enzymatické přípravky vhodně naředily.

Mělo by se poznamenat, že podobné metody, které jsou dobře známy v oboru, se mohou použít pro získání katalytických oblastí modulů uvedených v tabulce I. Uvedené fúzní proteiny GST-PTPasy se použily k odhadu síly a selektivity inhibitoru PTPas v podstatě, jak se popisuje v případě PTP1B shora v textu. Aby se mohly dále tyto testy ilustrovat, uvedl se neomezující příklad použití oblasti 1 PTPa. Podobné procedury se mohou použít i v případě jiných domén PTPas. Tento experiment se provedl na polovině destičky s 96 prohlubněmi, jako substrát se použil p-nitrofenylfosfát (pNPP). V testu se použily následující konečné koncentrace pNPP: 20 mM, 10 mM, 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM, 0,63 mM, 0,31 mM. Jako inhibitor se použila sloučenina 5-(1,3-dioxo-l, 3-dihydro-isoindol-2ylmethyl) -2- (oxalyl-amino) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylová kyselina rozpuštěná v dimetylsulfoxidu (DMSO) a ···· použila se v testu v následujících konečných koncentracích: 200 μΜ, 66,6 μΜ, 22,2 μΜ, 7,4 μΜ. Do vhodných kontrolních prohlubní se místo enzymu přidal testovací pufr, jak se popisuje detailněji pro PTP1B shora v textu. Testovací pufr (konečná koncentrace v testu) obsahuje 100 mM acetát sodný pH 5,5, 50 mM NaCl, 5 mM glutathion, 1 mM EDTA a 0,1 % albumin bovinního séra. Reakce se odstartovaly přidáním enzymu GSTPTPa doména 1 ( konečné ředění 1 : 100 000) . Celkový objem testu je v každé prohlubni 100 μΐ, což zahrnuje 10 μΐ inhibitoru rozpuštěného v DMSO nebo 10 μΐ DMSO přidaného do kontrolních prohlubní, do kterých se nepřidal inhibitor. Teplota reakce byla 25 °C. Po 60 minutách se přidalo do každé prohlubně 10 μΐ 0,5 M roztoku hydroxidu sodného (v 50 % (objem) etanolu) a měřila se absorbance při vlnové délce 405 nm. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 6A. Vypočtená hodnota K± je 4 μΜ (střední hodnota). Obrázek č. 6B ukazuje výsledky, kdy stejná látka (5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-2(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H-theino[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina) se testovala proti PTPa (konečné ředění 1 : 2 000) v pufru, který obsahuje: 50 mM HEPES pH 7,0, 100 mM NaCl, 5 mM glutathion, 1 mM DTA a 0,1 % albumin bovinního séra. Po 60 minutách se do každé prohlubně přidalo 20 μΐ 0,5 M roztoku hydroxidu sodného a odečítala se absorbance při vlnové délce 405 nm. Podmínky se popisují na obrázku č. 6A. Vypočtená hodnota Ki při těchto podmínkách je přibližně 70 mM (střední hodnota).

94	• 494	4 44		4 4.	• 4
• 9	4	• 4 4 4	4	•	4»	4
4	• 44	4 4 4	4	4	•5.	4
•						•
•	•	• 4 4 • 44 44	4	• 44	• • 4	•

o σ

ř—* V (Λ rt +

hj

Ό

O m

*

Oí

X

I

Jx σι

-ί

l.

Ol οι co co

I co oi

Ol o

o o

CD hO

O PJ §

§ § Š 3 5 3 5 * o o o o w

O w

I 8

O C5 =1 _

1 š ξ 5 o 3 o > o 7¹ -l O

O · ω

Ό —I tl xa o

σ i—¹ (1) cn rt

T3 n

O ¹ σ

H*

Q) cn

T3 —I Ό R *0

-I

O

Ό

H

Ό

OJ

Ul o

Tabulka

XJ

O m

X

I

Ol

X l

ro •σ

Q m

Ol

X t

N5

Ό

O m

x

I

H

T3

O m

O<

ΙΟ co

CO _Λ co o —,k

OJ u

U o

K o

N>

XI

K>

o

O) .k co co co

N3

ÍU

H· o

π

Ω<

co o>

i

O o

ro

X cn «u co

O P3 ž O

O o

o =1 o

£ ř>

o >

o

H

O

Ω >

co	03	co
*«4		K>
CO	CO	1 —X
		o
N>	Ol	Ol
Ol	co	M
-4

X	X	2
Ol	Ol	CO
4X	4X	«X
M	«X	**q
CO	co	ho
•U	o	-U

ω o oi > * O O > O O >

s

S o o O H £ o ?

-i >

a >

o o

$ o

o o :> o > o > -í o -I o > o >

o >

Ω =1

O

-H

Ω

Ω<

Ό

H' rt

Ω<

C ?r i-*

Φ o

rt

Ha

O o

CD m

Ci	cn	Ό ř
$ Ω	CG	K< H' 3
a	o
	o
	o	Π3
	Ή	O
	Ci
o	Ci	TS
o	o
>	o	hl
o	o	H* g
3 o	o $	Φ H

o >

> 3 o Ci w

- >

-I «!

h o g 8 § 3 o > a o o o

Ci o

o

7J a

<

φ •n (0

CD

Ό

O

7J •a “M φ

Cn <y>

I:

Termín „selektivní inhibitor se definuje jako inhibitor, který vykazuje selektivitu.

Termín „neselektivní inhibitor se definuje jako inhibitor, který nevykazuje selektivitu.

Termín „selektivní modulátor se definuje jako modulátor, který vykazuje selektivitu.

Dále se popisuje koncept selektivních a neselektivních inhibitorů PTPas, například neselektivní a selektivní inhibitor se uvádí v tabulce č. 10. Je nutné zdůraznit, že příklady v tabulce č. 10 nejsou určeny pro omezení rozsahu vynálezu.

Tabulka č. 10: Analýza selektivity inhibiotrů PTPas. Testovací podmínky jsou v podstatě stejné jako ty používané na obrázku č. 4. Uvedená čísla jsou hodnoty Κι (μΜ) .

	sloučenina z příkladu 82	sloučenina z příkladu 83
PTP1B	10	2
PTP-LAR	1 000	>1 000
ΡΤΡε	50	1 000
CD45	50	300
ΡΤΡβ	30	>1 000

Z tabulky č. 10 je zřejmé, že sloučenina podle příkladu 82 je příklad neselektivního inhibitoru, zatímco sloučenina příkladu 83 se chová jako selektivní inhibitor. Je nutné poznamenat, že sloučenina v příkladu 83, když se testuje proti jiným PTPasam, se může chovat jako inhibitor. Podél definice sloučenina podle příkladu 83 je selektivní inhibitor, což se odvodilo ze skutečnosti, že inhibuje PTP1B s malým účinkem na jiné PTPasy testované v tabulce č. 10. Na základě definice sloučenina podle vynálezu popsaná v příkladu 82 je neselektivním inhibitorem na základě jeho inhibiční kapacity proti několika ·· ·· » · · ♦ ► · ·> ·

I · ·ν ' 9 > · · · ·· ·· uhlovodíkové nesaturované

PTPasám a dokonce se uvažuje, že vykazuje slabou aktivitu proti PTP-LAR.

Termín chemické skupiny se definují jako libovolný jediný atom nebo libovolná skupina kovalentně vázaných atomů nebo libovolná molekula zahrnující jeho libovolný radikál.

Termíny „halogen nebo „halo zahrnuje fluorin, chlorin, bromin a jodin.

Termín „alkyl zahrnuje přímý saturovaný řetězec Cx~C₆ a C₂-C₆ nesaturované alifatické uhlovodíkové skupiny, Οχ-Οβ větvené saturované a C₂-C6 nesaturované alifatické skupiny, C₃-C₆ cyklické saturované a C₅-C₆ alifatické uhlovodíkové skupiny a Cx-C₆ saturované alifatické uhlovodíkové skupiny s přímým řetězcem nebo s větveným řetězcem a nesaturované alifatické uhlovodíkové skupiny C₂-C₆ s přímým řetězcem substituované s C₃-C₆ cyklickými saturovanými a nesaturovanými alifatickými uhlovodíkovými skupinami, ktreé mají specifikovaný počet uhlíkových atomů. Například tato definice zahrnuje, ale není omezena na methyl (Me), ethyl (Et) , propyl (Pr), butyl (Bu), pentyl, hexyl, heptyl, ethenyl, propenyl, butenyl, penentyl, hexenyl, isopropyl isobutyl (i-Bu), terCrbutyl (t-Bu), sefeybutyl isopentyl, neopentyl, cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cyklopentenyl, cyklohexenyl, methylcyklopropyl, ethylcyklohexenyl, butenylcyklopentyl a podobně.

Termín „substituovaný alkyl znamená alkylskupinu, jak se definuje shora v textu, kde substituenty se nezávisle vybraly ze skupiny zahrnující halo, kyano, nitro, trihalomethyl, karbamoyl, hydroxy, COR5, Cx-Cgalkyl, Cx-C₆alkyloxy, aryloxy, arylCx-C₆alkyloxy, thio, Cx-Cgalkylthio, arylthio,

C₆alkylthio, NR₇R₈, Cx-C₆alkylamino, arylamino,

C₈alkylamino, di (arylCx-C₈alkyl) amino, Cx-C₈alkylkarbonyl, aryl Ci-C₈alkylkarbonyl, Cx-C₈alkyl-karboxy, arylCx-C₈alkylkarboxy, Cx-C₆alkylkarboxy, Cx-C₆alkylkarbonylamino, -Cx-C₆alkylaminoCORxx, arylCx-C₆alkylkarbonylamino, tetrahydrofuranyl, (i-Pr), (s-Bu), arylCxarylCx* · · ·· ···· • · • · ·· v

·· e • · • w • · · «·· ·· »· *· • · · • · · • » · • · · · *· ·« morfolinyl, piperazinyl, -CONR₇R₈, -Ci-C6alkylCONR₇R8 nebo saturovaný nebo částečně saturovaný cyklický 5, 6 nebo 7 členný amin nebo laktam, kde Rn je hydroxy, Ci-Cgalkyl, aryl, arylCi-C₆alkyl, Ci-Cgalkyloxy, aryloxy, arylCi-C₆alkyl a R₅ se definuje jako shora v textu nebo NR₇R₈, kde R₇, R₈ se definuje jako shora v textu.

Termín „alkyloxy (například methoxy, ethoxy, propyloxy, allyloxy, cyklohexyloxy) reprezentuje „alkylskupinu jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku připojených prostřednictvím kyslíkového můstku. Termín „alkyloxyalkyl reprezentuje „alkyloxyskupinu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má stejný počet atomů uhlíku.

Termín „aryloxy (například fenoxy, naftyloxy a podobně) znamená arylskupinu, jak se definuje shora v textu připojenou prostřednictvím kyslíkového můstku.

Termín „arylalkyloxy (například fenethyloxy, naftyloxy a podobně) reprezentuje „arylalkylskupinu, jak se definuje dále v textu, která je připojená prostřednictvím kyslíkového můstku.

Termín „arylalkyloxyalkyl reprezentuje „arylalkyloxy skupinu jak se definuje shora v textu připojenou prostřednictvím „alkylskupiny definované shora v textu, která má určený počet atomů uhlíku.

Termín „arylthio (například fenylthio, naftylthio a podobně) znamená arylskupinu, jak se definuje dále v textu připojenou prostřednictvím sirného můstku.

Termín „alkyloxykarbonyl (například metylformiát, etylformiát a podobně) reprezentuje alkyloxyskupinu, jak se definuje shora v textu připojenou prostřednictvím karbonylové skupiny.

Termín „arylalkyloxykarbonyl (například benzylformiát, fenyletylformiát a podobně) reprezentuje arylalkyloxyskupinu, jak se definuje shora v textu připojenou prostřednictvím karbonylové skupiny.

• · · ·

Termín „alkyloxykarbonylalkyl reprezentuje alkyloxykarbonylovou skupinu, jak se definuje shora v textu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má shodný počet atomů uhlíku.

Termín „arylalkyloxykarbonylalkyl reprezentuje arylalkyloxykarbonylovou skupinu, jak se definuje shora v textu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má určený počet atomů uhlíku. Termín „alkylthio (například methylthio, ethylthio, propylthio, cyklohexenylthio a podobně) reprezentuje alkylskupinu, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku, které jsou připojeny sírovým můstkem.

Termín „arylalkylthio (například fenylmethylthio, fenylethylthio a podobně) reprezentuje aryalkylovou skupinu, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku, které jsou připojeny prostřednictvím sírového můstku. Termín „alkylthioalkyl reprezentuje alkylthioskupina připojená prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku.

Termín „arylalkylthioalkyl reprezentuje arylalkyíthioskupinu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku.

Termín „alkylamino (například methylamino, diethylamino, butylamino, N-propyl-N-hexylamino, (2-cyklopentyl)propylamino, hexenylamino, pyrrolidinyl, piperidinyl a podobně) reprezentuje jednu nebo dvě alkylové skupiny, jak se definuje shora v textu, které mají stanovený počet atomů uhlíku připojených prostřednictvím aminového můstku. Dvě alkylskupiny se mohou spojit dohromady dusíkem, ke kterému jsou připojeny za vzniku saturovaného, částečně saturovaného nebo aromatického cyklického, bicyklického nebo tricyklického kruhového systému, který obsahuje 3 až 14 atomů uhlíku a 0 až 3 další heteroatomy vybrané ze skupiny obsahující dusík, .·*··

kyslík nebo síru, přičemž kruhový systém se může substituovat alespoň jedním Ci-C₆alkyl, aryl, arylCi~C₆alkyl, hydroxy, oxo, Ci-C₆alkyloxy, Ci-C₆alkyloxyCi-C₆alkyl, NR₆R₁₀, Ci-C₆alkylaminoCi-C₆alkylsubstituentem, kde alkyl- a arylskupina se substituovala, jak se definuje v sekci definice a R₉ a ^Ri₀ se definuje shora v textu.

Termín „arylalkylamino (například benzylamino, difenylethylamino a podobně) reprezentuje jednu . nebo dvě arylalkylskupiny, jak se definuje shora v textu, které mají určitý počet atomů uhlíku připojených prostřednictvím aminového můstku. Dvě arylalkylskupiny se mohou spojit dohromady dusíkem, ke kterému jsou připojeny za vzniku saturovaného, částečně saturovaného nebo aromatického cyklického, bicyklického nebo tricyklického kruhového systému, který obsahuje 3 až 14 atomů uhlíku a 0 až 3 další heteroatomy vybrané ze skupiny obsahující dusík, kyslík nebo síru, přičemž kruhový systém se může substituovat alespoň jedním Ci-Cgalkyl, aryl, arylCi-Cgalkyl, hydroxy, oxo, Ci-Cgalkyloxy, Ci-C₆alkyloxyCi-C6alkyl, NR₆Rio< Ci-C₆alkylaminoCi-C₆alkylsubstituentem, kde alkyl- a arylskupina se substituovala, jak se definuje v sekci definice a R₉ a ^Ri₀ se definuje shora v textu. Termín „alkylaminoalkyl reprezentuje alkylaminoskupinu připojenou prostřednictvím alkylaskupiny, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku. Termín „arylalkylaminoalkyl reprezentuje arylalkylaminoskupinu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku.

Termín „arylalkyl (například benzyl, fenylethyl) reprezentuje arylovou skupinu, jak se definuje dále v textu připojenou prostřednictvím alkylu, který má stanovený počet atomů uhlíku nebo substituovanou alkylskupinu, jak se definuje shora v textu.

Termín „alkylkarbonyl (například cykloaktylkarbonyl, pentylkarbonyl, 3-hexenylkarbonyl) reprezentuje * · · · .· alkylovouskupinu, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku připojených prostřednictvím karbonylové skupiny.

Termín „arylalkylkarbonyl (například fenylcyklopropylkarbonyl, fenylethylkarbonyl a podobně) reprezentuje arylalkylskupinu, jak se definuje shora v textu, která má určitý počet atomů uhlíku připojených prostřednictvím karbonylové skupiny.

Termín „alkylkarbonylalkyl reprezentuje alkylkarbonylovou skupinu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má určený počet atomů uhlíku. Termín „arylalkylkarbonylalkyl reprezentuje arylalkylkarbonylovou skupinu připojenou prostřednictvím alkylové skupiny, jak se definuje shora v textu, která má určený počet atomů uhlíku.

Termín „alkylkarboxy (například heptylkarboxy, cyklopropylkarboxy, 3-pentenylkarboxy) reprezentuje alkylkarbonylovou skupinu, jak se definuje shora v textu, kde karbonyl je naopak připojen prostřednictvím kyslíkového můstku.

Termín „arylalkylkarboxy fenylcyklopropylkarboxy a (například podobně) benzylkarboxy, reprezentuj e arylalkylkarbonylovou skupinu, jak se definuje shora v textu, kde karbonyl je naopak připojen prostřednictvím kyslíkového můstku.

Termín „alkylkarboxyalkyl reprezentuje alkylkarboxyskupinu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která obsahuje uvedený počet atomů uhlíku.

Termín „arylalkylkarboxyalkyl reprezentuje arylalkylkarboxyskupinu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má uvedený počet atomů uhlíku. Termín „alkylkarbonylamino (například hexylkarbonylamino, cyklopentylkarbonylaminomethyl, methylkarbonylaminofenyl) reprezentuje alkylkarbonylovou skupinu, jak se definuje shora v textu, kde karbonyl je naopak připojen na atom dusíku aminoskupiny. Samotný atom dusíku se může substituovat alkylovou nebo arylovou skupinou.

Termín „arylalkylkarbonylamino (například benzylkarbonylamino a podobně) reprezentuje arylalkylkarbonylovou skupinu, jak se definuje shora v textu, kde karbonyl je naopak připojen na atom dusíku aminoskupiny. Samotný atom dusíku se může substituovat alkylovou nebo arylovou skupinou.

Termín „alkylkarbonylaminoalkyl reprezentuje alkylaminokarbonylaminoskupinu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku. Atom dusíku se může samotný substituovat alkylovou nebo arylovou skupinou.

Termín „arylalkylkarbonylaminoalkyl reprezentuje arylalkylkarbonylaminoskupinu připojenou prostřednictvím alkylskupiny, jak se definuje shora v textu, která má stanovený počet atomů uhlíku. Atom dusíku se může samotný substituovat alkylovou nebo arylovou skupinou.

Termín „alkylkarbonylaminoalkylkarbonyl reprezentuje alkylaminokarbonylaminoalkylskupinu připojenou prostřednictvím karbonylskupiny. Atom dusíku se může samotný substituovat alkylovou nebo arylovou skupinou.

Termín „aryl reprezentuje nesubstituovanou, mono-, di- nebo trisubstituovanou monocyklickou, polycyklickou, biarylovou a heterocyklickou aromatickou skupinu kovalentně připojenou v libovolné poloze kruhu schopnou vytvořit stabilní kovalentní vazbu, jisté preferované body připojení jsou pro odborníka zjevné (například 3-indolyl, 4-imidazolyl). Arylové substituenty se nazávisle vybraly ze skupiny obsahující halo, kyano, nitro, trihalomethyl, Ci-C₆alkyl, aryl, arylCi-C₆alkyl, hydroxy, COR5, Ci-C₆alkyloxy, Ci-C₆alkyloxyCi-C6alkyl, aryloxy, arylCi-Cealkyloxy, arylCi-CealkyloxyCi-Cgalkyl thio, C_x-C₆alkylthio, Ci-C₆alkylthioCi-C6alkyl, arylthio, arylC_x~C₆alkylthio, arylCi-CealkylthioCh-Cgalkyl, NR₈R₉, C_x-

9 »*		··		• ·
• · ·	*	•		•	•
• *		•	•	•	•
					•
• · ··· ··	•	• • ·	•	• • ·	•

• « · ·· · • · · • · · ·

Ci-C₆alkylamino, Ci-C₆alkylaminoCi-C6alkyl, arylamino, arylCx-Cgalkylamino, arylCi-C6alkylaminoCi-C₆alkyl, di (arylCi-Cgalkyl) aminoCi-C₆alkyl, Ci-C₆alkylkarbonyl,

Ci-C₆alkylkarbonylCi-C₆alkyl, arylCi-Cgal kyl karbonyl, arylCi-C₆alkylkarbonylCi-C₆alkyl, C_x-C6alkylkarboxy,

Ci-C₆alkylkarboxyCi-C₆alkyl, arylCi-C₆alkylkarboxy, arylCi-CgalkylkarboxyCi-Cgalkyl, karboxyCi-Cgalkyloxy,

Ci-C₆alkylkarbonylamino, Ci-C6alkylkarbonylaminoCi-C₆alkyl, -karbonyl NR7Ci-C₆alkylCORn, arylCi-C_salkylkarbonylaminoCi~C₆alkyl, -CONR₈Rg nebo -Ci-C₆alkyl-CONR₈R9, kde R₇, R₈, R_g a Rn se definuje jako shora v textu a alkyl a ryl skupiny se substituovaly, jak se definuje v sekci definic.

Definice arylu zahrnuje, ale není omezena na fenyl, bifenyl, indenyl, fluorenyl, naftyl(1-naftyl, 2-naftyl), pyrrolyl/

2-pyrrolyl), pyrazolyl(3-pyrazolyl), imidazolyl (1-imidazolyl,

2- imidazolyl, 4-imidazolyl, 5-imidazolyl), triazolyl (1,2,3-triazol-l-yl, 1,2,3-triazol-2-yl, 1,2,3-triazol-4-yl,

1,2,4-trazol-3-yl), oxazolyl(2-oxazolyl, 4-oxazolyl, 5-oxazolyl), isoxazolyl (3-isoxazolyl, 4-isoxazolyl, 5-isoxazolyl), thiazolyl(2-thiazolyl, 4-thiazolyl, 5thiazolyl), thiofenyl (2-thiofenyl, 3-thiofenyl, 4-thiofenyl, 5-thiofenyl), furanyl (2-furanyl, 3-furanyl, 4-furanyl, 5-furanyl), pyridyl (2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 5-pyridyl), pyrimidinyl (2-pyrimidinyl, 4-pyrimidinyl, 5-pyrimidinyl, 6-pyrimidinyl), pyrazinyl, pyridazinyl (3-pyridazinyl, 4-pyridazinyl, 5-pyridazinyl), chinolyl (2-chinolyl, 3-chinolyl, 4-chinolyl, 5-chinolyl, 6-chinolyl, 7-chinolyl, 8-chinolyl), isochinolyl (1-isochinolyl,

3- isochinolyl, 4-isochinolyl, 5-isochinolyl, 6-isochinolyl, 7-isochinolyl, 8-isochinolyl), benzo[b]furanyl, (2-benzo[b]furanyl, 3-benzo[b]furanyl, 4-benzo[b]furanyl, 5-benzo[b]furanyl, 6-benzo[b]furanyl, 7-benzo[b]furanyl,

2,3-dihydro-benzo[b]furanyl (2-(2,3-dihydro-benzo[b]furanyl),

65,

r« · » ·		• ·	« ·		• ·
•	• · ·	•			•i-	•
• · ·	• *	•	•		•	«
						•
•	• · • · ·	• • ·	• • ·	•	• 9 ·	•

3- (2,3-dihydro-benzo[b]furanyl), 4-(2,3-dihydro-benzo[b]furanyl) , 5- (2,3-dihydro-benzo[b]furanyl) , 6-(2,3-dihydro-benzo[b]fura- nyl) , 7 - (2,3-dihydro-benzo[b]f uranyl) ) , benzo[b]thiofenyl (2-benzo[b]thiofenyl, 3-benzo[b]thiofenyl,

4- benzo[b]thiofenyl, 5-benzo[b]thiofenyl, 5-benzo[b]thiofenyl, 6-benzo[b]thiofenyl, 7-benzo[b]thiofenyl) , 2,3-dihydro-benzo[bjthiofenyl (2-(2,3-dihydro-benzo[b]thiofenyl) , 3-(2,3-dihydro-benzo[b]thiofenyl) , 4- (2,3-dihydro-benzo[b]thiofenyl) ,

5- (2,3-dihydro-benzo[b]thio- fenyl), 6-(2,3-dihydro-benzo[b]thiofenyl), 7-(2,3-dihydro-benzo[b]thiofenyl), 4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiofenyl (2- (4,5,6, 7-tetrahydrobenzo[b]thio-f enyl), 3-(4,5,6,7-tetrahydřo-benzo[b]thiofenyl), 4-(4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiofenyl) , 5-(4,5,6, 7-tetrahydrobenzo[b]thiofenyl) , 6- (4,5, 6,7-tetrahydro benzo[b]thiofenyl) , 7-(4,5,6,7tetrahydrobenzo[b]thiofenyl) ) , 4,5,6, 7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyridyl (4-(4,5,6,7-tetrahydro- thieno[2,3-c]pyridyl),

5-4,5, 6,7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyri- dyl), 6-(4,5,6,7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyridyl) , 7-(4,5,6, 7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyridyl)), indolyl (1- indolyl, 2- indolyl, 3-indolyl, 4-indo lyl, 5-indolyl, 6-indolyl, 7-indolyl), indazole (1-indazolyl,

3- indazolyl, 4-indazolyl, 5-indazolyl, 6-indazolyl, 7-indazolyl), benzimidazolyl (1- benzimidazolyl, 2-benzimidazolyl,

4- benzimidazolyl, 5-benzimidazolyl, 6-benzimidazolyl, 7-benzimidazolyl, 8-benzimidazolyl), benzoxazolyl (1-benzoxazolyl,

2- benzoxazolyl), benzothiazolyl (1-benzothiazolyl, 2-benzothiazolyl, 4-benzothiazolyl, 5-benzothiazolyl, 6-benzothiazolyl, 7-benzothiazolyl)), karbozyl (1-karbozyl, 2-karbozyl,

3- karbozyl, 4-karbozyl) , 5H-dibenz[b, f]azepin (5H-dibenz[b, f]azepin-l-yl, 5H-dibenz[b, f]azepin (5H-dibenz[b, f]azepin-2-yl, 5H-dibenz[b, f]azepin (5H-dibenz[b, f]aze-pin-3-yl, 5H-dibenz[b, f]azepin (5H-dibenz[b, f]azepin-4-yl, 5H-dibenz[b, f]azepin (5H66 • ··· dibenz[b, f]azepin-5-yl, 10, ll-dihydro-5H-dibenz[b, f]azepin (5Hdibenzfb, fjazepin, 10, ll-dihydro-5H-dibenz[b, f]azepin (5H-dibenz [b,f]a zepin-l-yl, benz[b, f]azepin-2-yl, benz[b, f]azepin-3-yl, benz[b, f]azepin-4-yl,

10, ll-dihydro-5H-dibenz[b, f]azepin (5H-di10, ll-dihydro-5H-dibenz[b, fjazepin (5H-di10,ll-dihydro-5H-dibenz[b, fjazepin(5H-di10,ll-dihydro-5H-dibenz[b, fjazepin(5H-dibenz[b, fJazepin-5-yl) , piperidinyl (2-piperidinyl, 3-piperidinyl, 4- piperidinyl), fenylpyrimidinyl (2-fenylpyrimidinyl, 4-fenylpyrimidinyl, 5-fenylpyrimidinyl, 6-fenylpyrimidinyl), fenylpyrazinyl, fenylpyridazinyl (3-fenylpyridazinyl, 4-fenylpyridazinyl, 5- fenylpyridazinyl).

Termín „arylkarbonyl (například 2-thiofenylkarbonyl, 3-methoxyanthrylkarbonyl, oxazolylkarbonyl) reprezentuje arylovou skupinu, jak se definuje shora v textu, která je připojena prostřednictvím karbonylové skupiny.

Termín „arylalkylkarbonyl (například (2,3-dimethoxyfenyl)propylakarbonyl, (2-chloronaftyl)pentenyůkarbonyl, imidazolylcyklo-pentylkarbonyl) reprezentuje arylalkylovou skupinu, jak se definuje shora v textu, kde alkylová skupina je naopak připojena prostřednictvím karbonylu.

Sloučeniny podle vynálezu, které mají asymetrická centra se mohou objevovat jako racemáty, racemické směsi a jako individuální enantiomery nebo diastereoizomery se všemi izomírními formami, které se jsou zahrnuty ve vynálezu, stejně jako jejich směsi.

Vynález také popisuje farmaceuticky přijatelné soli sloučenin podle vynálezu, kde je přítomna ve struktuře bazická nebo kyselá skupina. Jestliže je přítomen kyselý substituent, jako je -COOH, 5-tetrazolyl a P(O) (OH)₂, mohou ho tvořit amonné soli, sole sodíku, draslíku, vápníku a podobně. Jestliže je přítomna bazická skupina, jako je amino- nebo bazický heteroarylradikál, jako je pyridyl, kyselá sůl, jako je hydrochlorid. hydrobromid, acetát, maleát, palmoát,

•	· ·	·· *	• · •	• • •
• · · • ·	*	• *
•	• ·	•	•	•	•	•
	• · · ··			• ·	• ·

methansulfonát, p-toluensulfonát a podobně, může s^ použít jako dávková forma. Také v případě, že je přítomna skupina COOH nebo P(O)(OH)₂, mohou se použít farmaceuticky přijatelné estery. Jsou to například methyl, tert-butyl, pivaloyloxymethyl a podobně a tyto estery jsou vhodné při použití při nepřerušovaném uvolňování a produkci pro-léků, protože je u nich možné upravit rozpustnostnebo hydrolyzační charakteristiky.

Navíc některé sloučeniny podle vynálezu mohou tvořit solváty s vodou nebo s běnými organizkými rozpouštědly. Takové solváty jsou předmětem vynálezu.

Termín „terapeuticky účinné množství znamená množství léku nebo farmaceutického činidla, které vyvolá biologickou nebo medicínskou odezvu tkáně, systému, zvířete nebo člověka.

Překvapivě se ukázalo, že sloučeniny obsahující jisté strukturální fragmenty vykazují inhibiční nebo modulační kapacitu proti jedné nebo více PTPasnbeo jiným molekulám s jednotkou(ami), které rozeznávají fosfotyrosin.

Vynález se vztahuje na sloučeniny, které splňují následující 3 kritérie:

1) vykazují strukturu reprezentovanou vzorcem I:

kde R, R₂ a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin,

2) působí jako ligand jednotky rozeznávající fosfotyrosin, přičemž se upřednostňuje inhibitor nebo modulátor jedné nebo více PTPas nebo proteiny, které obsahují domény SH2 a

«	·· » • t	·· • *	·· » *	• <· t ·
«	• · ·»·	• • ·	• · • *	• · • ·

3) mají molekulovou hmotnost nižší nebo rovnou 2 500 Da.

V preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem II

kde R, R₂ a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R_x je přednostně vodík.

V jiném přeferovaném provedení vynálezu musí sloučenina splňovat všechny z následujících 3 kriterií:

1) musí vykazovat strukturu reprezentovanou vzorcem III:

kde Ri, R₂, R₃ a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R₃ a R₅ se mohou vzájemně kovalentně vázat,

2) musí působit jako ligand jednotky rozeznávající fosfotyrosin, přičemž se upřednostňuje inhibitor nebo modulátor jedné nebo více PTPas nebo proteiny, které obsahují domény SH2 a

3) mají molekulovou hmotnost nižší nebo rovnou 2 500 Da.

V preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem IV:

• ·

• · * ·	•	··		• ·	• ·
•	·· ·	•	«	&		•4
• ··	• ·	•	•	♦	·
						•
•	• · • · ·	• ··	•	• • ·	• • ·	·'

kde Ri, R₃ a R₄ a R5 je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R₃ a R₅ se mohou vzájemně kovalentně vázat a R je přednostně vodík.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem V:

kde Ri, R₃, R₄ a R₅ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R₃ a R5 se mohou vzájemně kovalentně vázat a R je přednostně vodík.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem VI;

kde R₃, R₄ a R₅ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R₃ a R₅ se mohou vzájemně kovalentně vázat a R je přednostně vodík.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem VII:

> ·» · •	• · ·	·· •		·· ··	♦4
• · ·	φ ·	•	•		• 4»
•	• ·	•	•	·’ ·-	•
··-·	• · ·	• *

A

kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci VII reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a Ri, R₂, R₃, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem VIII·.

kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci VIII reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a Ri, R₂, R3, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a symbol R je přednostně vodík.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem IX :

COOR^

y-COR₂ kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci IX reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a Ri, R₂, R3, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem X '· ·« ^«·· * · * .···*.

kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci X reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a R₂, R₃, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem XI’·

kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci XI reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a R, R₃, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R je přednostně vodík.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem XII:

R1 R4 O

R3^^N/o·'

R2 O

	·· * • ·	• · • •	• *'4	·· • ·
9 «	•
•	• · • · ·	• ··	• • ·	•	• · ··

kde R je chemická skupina schopná být donorem protonu a/nebo akceptorem protonu, upřednostňuje se -COOH, 5-tetrazolyl, -NH₂ a R, R₂, R3, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu mají strukturu reprezentovanou vzorcem XX (XX)

kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci 1 reprezentuje fenyl, bifenyl, indenyl, fluorenyl, fluorenyl-9-on, naftyl, pyridyl, pyridazinyl, pyrimidyl nebo pyrazinyl nebo symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci 1 reprezentuje indolyl, benzo[b]thiofenyl, benzo[b]furanyl, indazolyl, benzo[b]isoxazolyl, benzimidazolyl, benzthiazolyl, benzoxazolyl, 9H-thieno[2,3-c]chromenyl, 4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiofenyl, 4,5,6, 7-tetrahydrobenzo[2, 3-b]pyridyl,

4.5.6.7- tetrahydrothieno[2,3-b]pyridyl, 4,5,6,7-tetrahydro thieno[2,3-b]pyridyl, 4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-b]pyranyl,

4.7- dihydro-5H-thieno[2,3-b]thiopyranyl nebo 4,5,6,7-tetrahydro-4,7-ethanonthieno[2,3-b]pyridyl nebo symbol A je spolu s dvojnou vazbou ve vzorci 1 fyranyl, thiofenyl, pyrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothioazolyl, 1,2,3-oxadiazolyl, fyrazanyl nbeo 1,2,3-triazolyl, nebo symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci 1 je fůro• fc

..

% · · *	• ··	·· ··
» »	♦ · »	•	» J>·
• ···	• ·	•	• ·	•
				•
•	• · ···	• ··	• · · ·· ··	•

[2,3-b]pyridyl, thieno[2,3-b]pyridyl, pyrolo[2,3-b]pyridyl, furo[2,3-c]pyridyl, thieno[2,3-c]pyridyl, pyrrolo[2,3-c]pyridyl, furo[3,2-c]pyridyl, thieno[3,2-c]pyridyl, pyrolo[3,2-c]pyridyl, furo[3,2-d]pyridyl, thieno[3,2-d]pyridyl, pyrolo[3,2-d]pyridyl, furo[2,3-d]pyrimidyl, thieno[2, 3-d]pyrimidyl, pyrrolo[2, 3-d]pyrimidyl, fura[2,3-b]pyrazinyl, thieno[2,3-b]pyrazinyl, pyrrolo[2,3-b]pyrazinyl, furo[2,3-c]pyridazinyl, thieno[2,3-c]pyridazinyl, pyrrolo[2,3-c]pyridazinyl, furo[2,3-c]pyridazinyl[2,3-c]pyridazinyl, thieno[2,3-c]pyridazinyl, pyrrolo[2,3-c]pyridazinyl, thieno[2,3-c]pyridazinyl, pyrolo[2,3-c]pyridazinyl, chinolizinyl, chinolinyl, isochinolinyl, chinolinyl, ftalazinyl, chinazolinyl, chinoxalinyl, 1,8-naftylridinyl, chromanyl, thiochromanyl, isochromanyl, isothiochromanyl, 2,3-dihydrothieno[2,3-b]furanyl, 4,6-dihydrothieno[2,3-c]furanyl, 2,3-dihydrothieno[3,2-b]furanyl, 4,5-dihydrothieno[2,3-b]thiof enyl,

4,6-dihydrothieno[3, 4-b]thiofenyl, 5, 6-dihydrothieno[3,2-b]thiofenyl, 4,5-dihydrothieno[2, 3-b]pyrrolyl, thieno[3,2-d]isothiazolyl, thieno[3,2-d]thiazolyl, thieno[3,2-c]pyrrolyl-4,6-dion, lH-thieno[2,3-d]imidazolyl, 6H-thieno[2,3-b]pyrrolyl,

5, 6-dihydro-4H-thieno[2,3-c]pyrrolyl nebo 4H-thieno[2,3-b]pyrrolyl.

Symboly R_x a R₂ se nazávisle vybraly ze skupiny zahrnující COR₅, ORé, CF₃, nitro, kyano, SO₃H, SO₂NR₇R₈, PO(OH)₂, CHFPO(OH)₂, CF₂PO(OH)₂, C(=NH)NH₂, NR₇R₈ a následující pětičlenné heterocykly

H ,N.

N N

Λ

OH ^Hl? o »4 »··« • 4 4 444

N S=O Λ°	O'V°H S'V°H Λ Λ-Γ
>r0H	hn;Voh <v°h Λν >°
0
Hfo /*N
R3, Rie a RX7	jsou vodík, halo, r
Ci-C6alkyl,	aryl, arylCi-C6alkyl

N'V°^H

Λ° n'ⁿV^sh

Λ°

Η »ν°

Ν Η alkyl, Ci-C₆alkylkarbonyl, aryloxykarbonyl, arylCi-Cgalkyloxykarbonyl, Ci-C₆alkyloxyC, Ci-C₆alkyloxyCi-C₆alkyl, aryloxy, arylCi-C₆alkyloxy, arylCi-C₆alkyloxyCi-C₆alkyl, thio, Ci-C₆alkylthio, Ci-C₆alkylthioCi-C₆alkyl, arylthio, arylCh-Cgalkylthio, arylCi-C₆alkylthioCi-C₆alkyl, NR₇R₈, Ci-C₆alkylaminoCi-C₆alkyl, arylCi-C₆alkylaminoCi-C₆alkyl, di (arylCi-C₆alkyl) aminoCi-C₆alkyl, Ci-C₆alkylkarbonyl, Ci-C₆alkylkarbonylCi-C₆alkyl, arylCi-C₆alkylkarbonyl, arylCi-C6alkylkarbonylCi-C₆alkyl, Ci-C₆alkylkarboxy, Ci-C₆alkylkarboxyCi-C6alkyl, arylkarboxy, arylCi-C₆alkylkarboxyCi-Cgalkyl, Ci-Cgalkylkarbonylamino, Ci-C6alkylkarbonylaminoCiC₆alkyl, karbonylNR₇Ci-C₆alkylCORn, arylCi-C₆alkylkarboxyCiC₆alkyl, karboxyCi-C₆alkyloxy, Ci-C₆alkylkarbonylamino, C_x-C6alkylkarbonylaminoCi-C₆alkyl, -karbonylNR₇Ci-C6alkylCORn, arylCiC₆alkylkarbonylamino, arylCi-C₆alkylkarbonylaminoCi-C₆alkyl, CONR₇R₈ nebo -Ci-C₆alkyl-CONR₇R₈, kde alkyl- a arylskupiny se substituovaly a R_X1 je NR₇R₈ nebo Ci~C₆alkyl-CONR₇R₈ nebo v případě, že R_X6 a R₁₇ je vodík, R₃ je

A-B-C-D-Ci-C₆alkyl, kde symbol A je Ci-C₆alkyl, aryl nebo arylCi-C₆alkyl, symbol B je amino, thio, SO, SO₂ nebo oxo, symbol C je Ci-C₈alkyl, amino,

• · · • · symbol D je chemická vazba, amino nebo Ci-C₆alkyl, kde alkylová a arylová skupina se substitu. jí nebo

R.

kde R12, R13 a R_i4 jsou nezávisle vodík, Ci-Cgalkyl, aryl, arylCiCgalkyl a alkylová a arylová skupina se substituovaly, symbol R₄ znamená vodík, hydroxy, Ci-Cgalkyl, aryl nebo arylCi“Cgalkyl, NR7R8, Cx-Cgalkyloxy, kde alkylová a arylová skupina se substituovaly, symbol R5 znamená hydroxy, Ci-Cgalkyl, aryl, arylCi-Cgalkyl, CF₃, NR₇R₈, kde alkylová a arylová skupina se substituovaly, symbol R₅ znamená vodík, Ci-C₆alkyl, aryl, arylCi-Cgalkyl, kde alkylová a arylová skupina se substituovaly

Symbol R₇ a R₈ se nezávisle vybral ze skupiny zahrnující vodík, Ci-C₆alkyl, aryl, arylCi-Cgalkyl, Ci-C₆alkylkarbonyl, arylCi-Cgalkylkarbonyl, aryloxykarbonyl, C!-C₆alkylkarboxy nebo arylCi-Cgalkylkarboxy nebo arylCi-C₆alkylkarboxy, kde alkylová nebo arylová sekupina se substituovaly nebo

R₇ a R₈ jsou dohromady s dusíkem, ke kterému jsou připojeny za vzniku saturovaného, částečně saturovaného nebo aromatického cyklického, bicyklického nebo třicyklického kruhového systému, který obsahuje od 3 do 14 atomů uhlíku a od 0 do 3 dalších heteroatomů vybraných ze skupiny dusík, kyslík a síra, kruhový systém se často substituuje alespoň jedním za skupiny zahrnující Ci-C6alkyl, aryl, arylCi-C₆alkyl, hydroxy, oxo, Ci~ -C₆alkyloxy, arylCi-Cgalkyloxy, Ci-CealkyloxyCi-Cgalkyl, NR₉Ri₀ nebo Ci-C₆alkylkaminoCi-C6alkyl, kde symbol R9 a R10 se nezávisle vybraly ze skupiny zahrnující vodík, Ci-C₆alkyl, aryl, arylCx-C₆alkyl, Ci-Cgalkylkarbonyl, arylCi-Cealkylkarbonyl, aryloxykarbonyl, Ci-Cgalkylkarboxy nebo arylCi76 ·« «·»· » « « • · ·* arylová skupina se kde alkylová

-Cgalkyl karboxy, substituovaly.

R₇ a R₈ je nezávisle saturovaný nebo částečně saturovaný cyklický 5, 6, nebo 7 členný amin, imid nebo laktam.

Sloučeniny podle vynálezu mohou upravovat nebo inhibovat aktivitu proteinové tyrosinfosfatasy nebo jiné molekul, která obsahuje jednotku(y) rozeznávající fosfotyrosin prostřednictvím různých mechanizmů působení. Příklady takových mechanizmů působení, které v žádném případě neomezují předmět vynálezu jsou a) klasická kompetitivní inhibice, b) nekompetitivní inhibice, c) inhibice smíšeného typu, jak se definuje shora v textu.

Vynález se dále vztahuje na sloučeniny, které se po pohlcení do buněk nebo savců uchovávají strukturu, jak se popisuje shora v textu.

V jednom preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu působí jako klasické kompetitivní inhibitory jedné nebo více PTPas.

V jiném preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podél vynálezu působí jako inhibitory smíšeného typu jedné nebo více PTPas.

V jednom preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu v podstatě působí jako inhibitor jedné nebo více PTPas, které se podílejí na regulaci signalizační dráhy tyrosinkinasy.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu v podstatě inhibují nebo upravují signalizační dráhy receptor-tyrosinkinasa prostřednictvím interakce s jedním nebo více regulačními PTPasami, přednostně signalizační dráhy insulinového receptorů, receptor IGF-I a/nebo jiní členové rodiny receptorů inzulinu, rodina EGF-receptoru, rodina receptorů růstového faktoru získaného z destiček, rodina receptorů nervového růstového faktoru, rodina receptorů růstového faktoru hepatocytů, rodina receptorů růstových *· φφφφ * φ

Φ·

φφ •φ φφ • » φ φ φ φ φ φ φ • · φ φφ φφ hormonů a/nebo členi jiných rodin tyrosinkinas receptorového typu.

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu v podstatě inhibují nebo upravují nereceptorovou tyrosinkinasovou signalizaci prostřednictvím úpravy jednoho nebo více regulačních PTPas, upřednostňuje se úprava členů rodiny src kinas nebo jiných vnitrobuněčných kinas.

V jiném preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu v podstatě inhibují nebo upravují aktivitu jedné nebo více PTPas, které negativně regulují signalizační transdukční dráhu.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu inhibují nebo modulují aktivitu jedné nebo více PTPas, které pozitivně regulují signalizační transdukční dráhu, přednostně CD45.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu inhibují nebo modulují aktivitu jedné nebo více PTPas, které pozitivně regulují signalizační transdukční dráhu v buňkách imunitního systému.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu inhibují nebo modulují aktivitu jedné nebo více PTPas, které negativně regulují signalizační transdukční dráhu.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu inhibují nebo modulují aktivitu jedné nebo více PTPas, prostřednictvím navázání na aktivní místo uvedené PTPasy(as) nebo nebo na jiná místa, které negativně ovlivňují navázání substrátu na uvedenou PTPasu(y). Tato sloučenina se nazývá alosterický modulátor.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu inhibují nebo modulují aktivitu jedné nebo více PTPas, prostřednictvím navázání na aktivní místo uvedené interakce se strukturami umístěnými vně aktivních míst enzymů. Upřednostňuje se doména SH2.

• » • · • · • · *· ·*·» • · • ···

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu inhibují nebo modulují aktivitu jedné nebo více PTPas, prostřednictvím navázání sloučeniny podle vynálezu na doménu SH2 nebo domény PTB signalizačních molekul, které nejsou PTPasy.

V jednom provedení vynálezu se sloučeniny podle vynálezu charakterizují tím, že jsou selektivními inhibitory PTPas nebo sloučenin, které jsou selektivními ligandami jednotek rozeznávajícími fosfotyrosin. Sločenina podle vynálezu může být například selektivní pro zde nepopsanou PTPasu nebo přednostně pro PTPasy uvedené v tabulce č. 1.

V jiném preferovaném provedení vynálezu se sloučeniny podle vynálezu charakterizují tím, že jsou neselektivními inhibitory PTPas, jako jsou inhibitory nebo modulátory alespoň čtyř PTPas nebo 4 rodin PTPas.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro rodinu ΡΤΡα.

V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro ΡΤΡα.

V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro rodinu ΡΤΡε.

V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro CD45.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro rodinu ΡΤΡβ.

V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro ΡΤΡβ.

V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro PTP-DEP1.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro rodinu PTP-LAR.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro PTP-LAR.

V j ednom vynálezu

V jednom vynálezu

V j ednom vynálezu

V j ednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V jednom vynálezu

V j ednom vynálezu

V jednom vynálezu

• · · 7 9 .···· • ·	• · · • · • ·	• · · · « • · 9 · 9 9 9 9 9 9
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro ΡΤΡσ.
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro ΡΤΡδ.
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro rodinu ΡΤΡμ. preferovaném provedení vynálezu selektivní pro ΡΤΡμ.	j sou	sloučeniny	podle
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro ΡΤΡκ. preferovaném provedení vynálezu selektivní pro rodinu PTPlB.	j sou	sloučeniny	podle
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro PTPlB.
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro TC-PTP. preferovaném provedení vynálezu selektivní pro rodinu SHP-PTP.	j sou	sloučeniny	podle
preferovaném provedení vynálezu selektivní pro SHP-1.	j sou	sloučeniny	podle
preferovaném provedení vynálezu selektivní pro SHP-2.	j sou	sloučeniny	podle
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro rodinu ΡΤΡξ.
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro ΡΤΡγ.
preferovaném provedení vynálezu	j sou	sloučeniny	podle
selektivní pro rodinu PTP-PEST. preferovaném provedení vynálezu selektivní pro rodinu PTPH1.	j sou	sloučeniny	podle
preferovaném provedení vynálezu	jsou	sloučeniny	podle

selektivní pro PTPH1.

• ···· · ·· ·· ·· * · · · · · ···« • · · · · · · · · · · • ·· ·»······ * * · ···· ····· ··· ·· «· ··

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro PTPD1.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro PTPD2.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro PTPMEGl.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro rodinu IA-2.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro IA-2.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro ΙΑ-2β.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro rodinu ΡΤΡψ.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro ΡΤΡψ.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro PTPp.

V jednom preferovaném provedení vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu selektivní pro ΡΤΡφ.

V jednom preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují molekulovou hmotnost menší než 1 000 Da a upřednsotňuje se více než 100 Da.

V jednom preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu Ki menší než 200 μΜ proti jedné nebo více PTPas.

V jednom preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu Ki menší než 2 μΜ proti jedné nebo více PTPas.

V jednom preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu Ki menší než 100 μΜ proti jedné nebo více PTPas.

• ·· ·

V jiném preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu Ki menší než 2 μΜ proti jedné nebo dvěma PTPasam nebo rodinám PTPas a hodnotu Ki větší než 50 μΜ proti jedné nebo dvěma PTPasam nebo rodinám PTPas.

V jiném preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu Ki menší než 100 μΜ proti jedné nebo dvěma PTPasám nebo rodinám PTPas a hodnotu Ki větší než 10 μΜ proti jedné nebo dvěma PTPasam nebo rodinám PTPas.

V jiném preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu IC₅₀ menší než 200 M proti jedné nebo více molekul s jednotkou(ami) rozeznávajícími fosfotyrosin.

V jiném preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu IC50 menší než 2 M proti jedné nebo více molekul s jednotkou(ami) rozeznávajícími fosfotyrosin.

V jiném preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu IC₅o menší než 100 nM proti jedné nebo více molekul s jednotkou(ami) rozeznávajícími fosfotyrosin.

V jednom preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu působí jako inhibitory jedné nebo více PTPas, například proteinové tyrosinfosfatasy, která se podílí na regulaci signalizační dráhy tyrosinkinasy. Preferovaná provedení zahrnují úpravu signalizačních drah receptortyrosinkinasy prostřednictvím interakce s regulačními PTPasami. Jsou to například signalizační dráhy inzulínového receptorů, rodina EGF-receptoru, rodina receptorů růstového faktoru získaného z destiček, rodina receptorů nervového růstového faktoru, rodina receptorů růstového faktoru hepatocytů, rodina receptorů růstových hormonů a/nebo členi jiných rodin tyrosinkinas receptorového typu. Dále preferoavanými provedeními vynálezu je modulace nereceptorové tyrosinkinasové signalizace prostřednictvím regulačních PTPas, například modulace členů rodiny Srckinas a jiné nereceptorové tyrosinkinasy. Jeden typ preferovaného provedení vynálezu se vztahuje k modulaci aktivity PTPas, které negativně regulují signalizační transdukční dráhy. Příkladem, který v žádném případě neomezuje předmět vynálezu, je SHP-1, který negativně reguluje erythropoietinovou signalizační cestu. V jiném typu preferovaného provedení vynálezu se popisuje modulace aktivity PTPas, které pozitivně regulují signalizační transdukční dráhu. Příkladem, který v žádném případě neomezuje předmět vynálezu, je CD45, který defosforyluje tyrosinkinasu rodiny Src a čímž má pozitivní úlohu při signalizaci v buňkách, které pocházejí ze systému krvetvorby. Jeden typ preferovaného inhibitoru CD45 se používá při regulaci aktivity lymfocytů, které zahrnují T- a/nebo B-lymfocyty.

V preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu působí jako modulátory nebo inhibitory aktivního místa jedné nebo více PTPas. V jiném preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu modulují aktivitu jedné nebo více PTPas prostřednictvím interakce se strukturami umístěnými vně aktivních míst enzymů. Upřednostňuje se domény SH2. Dále preferované provedení vynálezu zahrnují úpravu signalizační transdukční dráhy prostřednictvím navázání sloučenin podle vynálezu na domény SH2 nebo PTB signalizačních molekul, které nejsou PTPasy.

V preferovaném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu jsou selektivní inhibitory, které jsou více jak 10 krát silnější proti jedné rodině PTPas než proti jiné rodině PTPas.

V jednom provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu se mohou použití pro kontrolu, léčbu nebo předcházení cukrovky typu I, cukrovky tupu II, porušené tolerance cukrovky, rezistence na inzulín, obezity, disfunkcí imunity zahrnující autoimunitu a AIDS, onemocnění s poruchami koagulačního systému, alergické onemocnění, osteoporéoza, poruchy proliferace, které zahrnují zhoubné bujení a lupénku, onemocnění se zvýšenou nebo sníženou syntézou a účinky růstových hormonů nebo cytokinů, které regulují uvolnění nebo odezvu na růstový hormon, onemocnění

mozku zahrnující Alzheimerovu nemoc a schizophrenii a infekční onemocnění.

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu se využívají při kontrole, léčbě nebo prevenci cukrovky typu I, cukrovky typu II, porušenou toleranci cukrovky, rezistencí na inzulin a/nebo obezitu.

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu se mohou použít při kontrole, léčbě nebo prevenci disfunkcí imunity, jako je revmatoidní artritida, systémový lupus erythematosus.

V jiném provedení vynálezu se sloučeniny podle vynálezu se mohou použít jako imunosupresory.

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podél vynálezu se mohou použít při kontrole a léčbě stavů s imunními dysfunkcemi, které zahrnují AIDS.

V jednom provedení sloučeniny podle vynálezu se mohou použit pro kontrolu, léčbu nebo prevenci aelrgických onemocnění, která zahrnují astma a alergická onemocnění kůže.

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu se mohou použít při kontrole, léčbě nebo prevenci poruch proliferace, které zahrnují zhoubné bujení.

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu se mohou použít při kontrole, léčbě nebo prevenci osteoporézy.

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu se mohou použít při kontrole, léčbě nebo prevenci lupénky.

V jiném provedení vynálezu se sloučeniny mohou použít při kontrole, léčbě nebo prevenci onemocnění se sníženou nebo zvýšenou syntézou nebo účinky růstového hormonu, onemocnění se sníženou nebo zvýšenou syntézou hormonů nbeo cytokinů, které regulují uvolnění nebo odezvu růstového hormonu.

V jiném provedení vynálezu se sloučeniny podle vynálezu mohou použít při kontrole, léčbě nebo prevenci onemocnění s poruchami koagulačního systému.

• « · · · · « « · φ ··» • · » ·· ·· ·· • * » * · « » * · · · Φ φ φ · · é · · • · t · · b • ·· ·· ·· vynálezu se mohou onemocnění mozku,

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle použít při kontrole, léčbě nebo prevenci která zahrnují Alzheimerovu nemoc a schizofrenii.

V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu se mohou použít pří kontrole, léčbě nebo prevenci infekčních nemocí. Sloučeniny podle vynálezu se mohou dále použít při výrobě léků pro kontrolu, léčbu nebo prevenci shora uvedených onemocnění a poruch.

Jiné preferované provedení vynálezu zahrnuje použití sloučenin podle vynálezu při úpravě interakcí buňka-buňka, stejně jako interakce matrice a buňky.

Vynález dále popisuje farmaceutické kompozice obsahující jako aktivní složku alespoň jednu sloučeninu podle vynálezu ve spojení s farmaceutickým nosičem nebo ředidlem. Farmaceutická kompozice může obsahovat alespoň jednu sloučeninu podle vynálezu kombinovanou se sloučeninami, které vykazují různou aktivitu. Jsou to například antibiotika nebo jiný farmaceuticky aktivní materiál.

Jako v preferovaném provedení podle vynálezu sloučeniny podle vynálezu se mohou použít jako terapeutická činidla inhibující nebo upravující jednu nebo více PTPas, které se podílejí na regulaci signalizační dráhy tyrosinkinasy inzulínového receptoru u pacientů s cukrovkou typu I, s cukrovkou typu II, s poruchou tolerance glukosy, rezistence na inzulín a obezity. Dále preferovaná provedení zahrnují použití sloučenin podle vynálezu při kontrole poruch s obecnými nebo specifickými poruchami aktivity PTPas, například poruchy proliferace, jako je lupénka a neoplázie. V jiném provedení vynálezu sloučeniny podle vynálezu se mohou použít ve farmaceutických přípravcích při kontrole osteoporózy.

Preferovaná provedení podle vynálezu dále zahrnují použití sloučenin podle vynálezu ve farmaceutických přípravcích za účelem zvýšit vylučování nebo působení růstového hormonu a jeho analogů nebo somatomedinů, které zahrnují IGF-1 a IGF-2 ·

• · » ·· · « • · * ··· úpravou aktivity jedné nebo více PTPas nebo jiných molekul, které vykazují afinitu k fosfotyrosinu, který se podílí na řízení nebo indukci působení těchto hormonů nebo libovolné regulaci molekul.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít ve farmaceutických přípravcích při kontrole různých poruch imunitního systému, buď jako stimulant nebo supresor normálních nebo porušených imunních funkcí, které zahrnují autoimunitní reakce. Další provedení podle vynálezu zahrnuje použití sloučenin podle vynálezu při kontrole . alergických reakcí, například astma, kožních reakcí, zánětu spojivek.

V jiném provedení podle vynálezu se sloučeniny podle vynálezu mohou použít ve farmaceutických přípravcích vhodných při imunosupresi. Neomezující příklad takového použití je spojení s řízením transplantace orgánů a/nebo tkáně.

V jiném provedení vynálezu se sloučeniny podle vynálezu mohou použít ve farmaceutických přípravcích při prevenci nebo indukci destičkové agregace.

V jiném provedení podle vynálezu se sloučeniny podle vynálezu mohou použít ve farmaceutických přípravcích při kontrole infekčních onemocnění. Sloučeniny podle vynálezu se mohou zvláště použít při řízení infekčních poruch, které jsou způsobené mikroorganizmem Yersinia a jinou bakterií stejně jako poruchy způsobené viry nebo jinými mikroorganizmy. Sloučeniny podle vynálezu se mohou dále použít při řízení nebo prevenci onemocnění zvířat, která zahrnují komerčně dostupná zvířata.

Vynález dále popisuje způsob izolace PTPas prostřednictvím afinitních čistících postupů založených na použití imobilizovaných sloučenin podle vynálezu. Takové metody dobře známé v oboru se mohou použít při identifikaci nových PTPas nebo jiných molekul s jednotkami, které rozeznávají fosfotyrosin. Sloučeniny podle vynálezu se mohou imobilizovat spojením s pevnou fází. Vzorek tkáně vzorek z buněčné linie

			·* ···· « ·· • ♦ · · * · « •··· · · · • · · · • * · * é	·· ·· • % · »
		86	* · · * • · · 4» · * · · ·
připravený	jako	lyzát způsobem	dobře známým	·· «· v oboru může
procházet	pevnou	fází spojenou se	sloučeninou podle vynálezu.

Po vhodném promytí, které je navržené tak, aby se odstranil materiál, který se nespecificky váže na uvedenou pevnou fázi za použití standarních postupů, které jsou dobře známy v oboru. Většina PTPas nebo jiných molekul s jednotkami rozeznávajícími fosfotyrosin se budou vázat na sloučeniny podle vynálezu spojené s pevnou fází. Uvedené PTPasy nebo jiné molekuly s jednotkami rozeznávájícími fosfotyrosin se mohou naopak uvolnit postupem, který je dobře znám v oboru a dále se aminokyselinové sekvence podrobí analýze podle standardních postupů, které jsou dobře známy v oboru. Zpětnou translací uvedené aminokyselinové sekvence do nukleotidové sekvence se může dedukovat odpovídající cDNA za použití vhodného genetického kódu. Uvedená nukleotidová sekvence se může použít k navržení a zpracování ekvivalentního oligonukleotidu, který se naopak může použítk identifikaci částečných nebo celých klonů cDNA z vhodných knihoven cDNA, které kódují protein nebo glykoprotein odpovídající nebo podobný izolované PTPase nebo molekule s jednotkami rozeznávajícími pTyr. Uvedený oligonukleotid nebo klon(y) izolované cDNA se mohou podobně použít k izolaci genomových klonů, které odpovídají odpovídající cDNA uvedeným klonům cDNA. Uvedená částečná cDNA nebo cDNA plné délky se mohou začlenit do vhodných vektorů a exprimované a čištěné proteiny se budou zpracovávat postupy, které jsou dobře známy v oboru. Uvedené čištěné proteiny, zvláště PTPasy, se mohou použít k další analýze inhibiční kapacity a selektivity sloučenin podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu.

Vynález dále popisuje sloučeniny podle vynálezu spojené s vhodnou pevnou matricí, jako Wang- nebo Rink-pryskyřice.

Vynález dále popisuje způsob izolace proteinu nebo glykoproteinu, který vykazuje afinitu pro sloučeninu podle

• φ φ

• φ · • φ φ φ · · ·♦ « vynálezu pocházející z biologického vzorku. Tento způsob zahrnuje:

• kontakt sloučeniny podle vynálezu imobilizované spojením s vhodnou pevnou matricí s uvedeným biologickým vzorkem za účelem vytvoření komplexu navázáním uvedené imobilizované sloučeniny na uvedený protein nebo glykoprotein.

• odstranění nevázaného materiálu z uvedeného biologického vzorku a izolací uvedeného komplexu a • extrakci uvedeného proteinu nebo glykoproteinu z uvedeného komplexu.

Vynález dále popisuje způsob izolace proteinové tyrosinfosfatasy s afinitou pro sloučeninu podle vynálezu z biologického vzorku, který obsahuje • kontakt sloučeniny podle vynálezu imobilizované spojováním s vhodnou pevnou matricí s uvedeným biologickým vzorkem za účelem vytvoření komplexu navázáním uvedené imobilizované sloučeniny na uvedenou proteinovou tyrosinfosfatasu.

• odstranění nenavázaného materiálu z uvedeného biologického vzorku a izolace uvedeného komplexu • extrakci uvedené proteinové tyrosinfosfatasy.

Vynález dále popisuje způsob izolace proteinu, který obsahuje oblast Src-homologie 2 nebo protein obsahující oblast vázající fosfotyrosin, který vykazuje afinitu sloučeniny podle vynálezu z biologického vzorku, který zahrnuje:

• kontakt sloučeniny podle vynálezu imobilizované na vhodné pevné matrici s uvedeným biologickým vzorkem za účelem vytvořit komplex imobilizované sloučeniny navázáním na uvedený protein obsahující oblast Src-homologie 2 nebo na protein, který obsahuje oblast vázající fosfotyrosin, • odstranění nenavázaného materiálu z uvedeného biologického vzorku a izolace uvedeného komplexu,

k. Μ» Μ • ··· * · • * ·· » · ·«·.··. ί * * » » » 1 > · 4 « · · · i • * % · · · , ··· *· ·· ·· • extrakci uvedené proteinu, který obsahuje oblast Src homologie 2 nebo proteinu, který obsahuje oblast vázající fosfotyrosin z uvedeného komplexu.

Vynález také popisuje sloučeninu podle vynálezu spojenou s fluorescenční nebo radioaktivní molekulou.

Vynález dále popisuje způsob spojení fluorescenční nebo radiaktivní molekuly se sloučeninou podle vynálezu, který zahrnuje:

• kontakt uvedené sloučeniny s uvedenou fluorescenční nebo radioaktivní molekulou v reakční směsi za vzniku komplexu.

• odstranění materiálu, který není zahrnut v komplexu a izolace uvedeného komplexu z uvedené reakční směsi.

Vynález dále popisuje způsob detekce proteinové tyrosinové fosfatasy nebo jiných molekul s jednotkami rozeznávajícími fosfotyrosin v buňce nebo v subjektu za použití sloučeniny podle vynálezu spojené s fluorescenční nebo radioaktivní molekulou, která obsahuje • kontakt uvedené buňky nebo jejího extraktu nebo biologického vzorku z uvedeného subjektu nebo zavedení uvedené sloučeniny injekcí do uvedeného subjektu za účelem vytvořit komplex uvedené sloučeniny s uvedenou proteinovou tyrosinfosfatasou nebo uvedených molekul s jednotkou rozeznávající fosfotyrosin.

• detekci uvedeného komplexu, přičemž se detekuje přítomnost uvedené proteinové tyrosinfosfatasy nebo uvedených jiných molekul s jednotkou rozeznávající fosfotyrosin.

Vynález dále popisuje způsob kvantifikace množství proteinových tyrosinfosfatas nebo jiných molekul s jednotkami rozeznávajícími fosfotyrosin v buňce nebo v subjektu za použití sloučeniny podle vynálezu spojené s fluorescenční nebo radioaktivní molekulou, která obsahuje:

• kontakt uvedené buňky nebo jejího extraktu nebo biologického vzorku z uvedeného subjektu nebo zavedením uvedené sloučeniny uvedenému subjektu injekcí za účelem vytvořit il»» < % φ

• * φ

komplex uvedené sloučeniny podle vynálezu s proteinovou tyrosinfosfatasou nebo uvedených molekul s jednotkou(ami) rozeznávájícími fosfotyrosin.

• měření množství uvedeného komplexu, čímž se detekuje přítomnost uvedené proteinové tyrosinfosfatasy nebo uvedených molekul s jednotkou(ami) rozeznávajícími fosfotyrosin.

Vynález také zahrnuje způsob stanovení funkce dané proteinové tyrosinfosfatasy nebo skupiny proteinových tyrosinfosfatas n-ebo uvedených molekul s jednotkami rozeznávajícími fosfotyrosin v buňkách nebo v subjektu za použití sloučeniny podle vynálezu spojené s fluorescenční nebo radioaktivní molekulou, která zahrnuje:

• kontakt uvedené buňky nebo jejího extraktu nebo biologického vzorku z uvedeného subjektu, který se provádí zavedením uvedené sloučeniny subjektu injekcí za účelem produkovat komplex s uvedenou proteinovou tyrosinfosfatasou a uvedených molekul s jednotkami rozeznávajícími fosfotyrosin.

• měření biologických účinků vyvolaných uvedeným komplexem.

Farmakologické metody

Z důvodů uvedených shora v textu bude dávka kolísat v závislosti na aplikace použité sloučeniny podle vynálezu, na módu aplikace a na požadované terapii. V obecném případě se však správné výsledky dosáhnou za použití dávky v přibližném rozmezí 0,5 mg až 1 000 mg, upřednostňuje se přibližně 1 mg až 500 mg sloučenin podle vynálezu. Vhodné je aplikovat uvedenou dávku jedenkrát až pětkrát denně ve formě nepřerušovaného uvolňování. Obvykle formy dávky vhodné pro orální aplikaci obsahují přibližně 0,5 mg až 1 000 mg, přednostně 1 mg až 500 mg sloučenin podle vynálezu smíchaných s farmaceutickým nosičem nebo ředidlem.

•Φ φφφ » φ φ • φφφ

»··· ···

Sloučeniny podle vynálezu se mohou aplikovat ve formě farmaceuticky přijatelných kyselých adičních solí nebo, když je to možné jako sole kovu nebo sole Ci_₆alkylamonia. Takové formy solí vykazují přibližně stejný stupeň aktivity, jako volné formy kyselin.

Tento vynález také popisuje farmaceutické kompozice obsahující sloučeninu podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelné sole a obvykle takové kompozice také obsahují farmaceutický nosič nebo ředidlo. Kompozice obsahující sloučeniny podle vynálezu se mohou připravovat běžnými metodami a vyskytují se v běžných formách, jako jsou kapsule, tablety, roztoky nebo suspenze.

Použitý farmaceutický nosič může být pevný nebo kapalný nosič. Příklady pevných nosičů jsou laktosa, terra alba, sacharosa, talek, želatina, agar, pektin, arabská guma, stearát hořečnatý a kyselina stearová. Příklady kapalných nosičů jsou syrup, olej buráků, olivový olej a voda.

Podobně nosič nebo ředidlo může zahrnovat zpožďující materiál, jako je glycerylmonostearát nebo nebo glyceryl distearát samotný nebo smíšený s voskem.

Jestliže se pro orální aplikaci použije pevný nosič, přípravek je možné lisovat do tablet, umístit do pevných želatinových kapsulí jako prášek nebo je ve formě peletky nebo ve formě pastylky nebo bonbonu. Množství pevného nosiče bude kolísat v širokém rozmezí, ale v obvyklém případe bude v rozmezí 25 mg až přibližně 1 g. Jestliže se použije kapalný nosič, přípravek musí být ve formě syrupu, emulze, měké želatinové kapsule nebo sterilního injektovatelného roztoku, jako je vodná nebo nevodná kapalinová suspenze nebo roztok.

V obecném případě se sloučeniny podle vynálezu připravují ve formě jednotkové dávky, která obsahuje 10 až 200 mg aktivní složky spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem v jednotkové dávce.

4« 444·

4· « Β

Φ·4 < · * • Β • ♦ 4 · · · · ·4 44 4

4# · 4 4 # • 4 Β · · « | « 4 · · 4 « • > a a · · ·♦· ·· ·· «

Dávka sloučeniny podle vynálezu je 1 až 500 mg/den, například 100 mg v jedné dávce, které se aplikuje objektu, například lidem.

Typická tableta, která se může připravit běžnou metodou přípravy tablet obsahuje jádro:

aktivní sloučeninu (vyskytuje se jako volná nebo ve formě soli) 100 mg koloidní oxid křemičitý (Areosil®) 1,5 mg celulosa (mikrokrystalická) (Avicel®) 70 mg upravená celulosová guma (Ac-Di-Sol®) 7,5 mg stearát hořečnatý potah:

HPMC přibližně 9 mg *Mywacett®9-40 T přibližně 0,9 mg * jedná se o acylovaný monoglycerid užívaný jako plastizační činidlo pro potažení filmem.

Jako způsob aplikace se může využít libovolná cesta, kterou se účinně transportuje aktivní sloučenina do vhodného nebo požadovaného místa působení, jako je orální nebo parenterální způsob aplikace, například rektální, transdermální, podkožní, intranasální, intramuskulární, povrchový, intravenózní, intrauretální oční roztok nebo mast. Preferuje se orální způsob aplikace.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1: Analýza kinetiky enzymů v klidovém stádiu. Fosfatáza PTP1B se inkubovala na destičkách s 96 prohlubněmi v různých koncentracích substrátu para-nitrofenylfosfát (pNPP) a inhibitoru 2-(oxalylamino)benzoová kyselina (při konečných koncentracích 0, 7,4, 22,2, 66,7 a 200 μΜ) . Pufr obsahuje 100 mM acetát sodný pH 5,5, 50 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 0,1 % » ·· »

» » *» » • * · · a · • * » · » (hmotn./objem) albuminu bovinního séra. Doba inkubace je 45 minut. Inkubace probíhala při teplotě 25 °C. Přidal se hydroxid sodný a absorbance se odečítala při vlnové délce 405 nm. A) grafy podle Michaelise Mentena, B) graf zjevné hodnoty Km vztaženo ke koncentraci inhibitoru, C) graf zjevné hodnoty Vmax relativní ke koncentraci inhibitoru. Další detaily jsou uvedeny v sekci definice. Exp. č. 1230-5.

Obrázek č. 2: Analýza kinetiky enzymů v klidovém stádiu. Podmínky analýzy jsou stejné, jako se uvádějí v případě obrázku č. 1 s výjimkou, že pufr obsahuje (konečná koncentrace) 100 mM acetát sodný pH 5,5, 50 mM NaCl, 5 mM glutathion, 1 mM EDTA a 0,1 % albumin bovinního séra. Doba inkubace byla 60 minut. Exp, 1167-3.

Obrázek č. 3: Časový průběh experimentů: A) PTP1B se inkuboval na destičkách s 96 prohlubněmi při teplotě místnosti s 2,5 mM para-nitrofenolfosfátu (pNPP), který je obsažen v pufru. Sloučenina 2-(oxalylamino)benzoová kyselina se přidala v takovém množství, aby konečná koncentrace v testu byla 250, 125 a 62,5 μΜ. Reakce se spustily přidáním enzymu a zastavily se v určeném časovém intervalu přidáním NaOH. Absorbance při vlnové délce 405 nm se nakonec měřila ve všech prohlubních. B) Stejně jako v A) s výjimkou, že EDTA se přidalo v množství, aby konečná koncentrace byla 1 mM.

Obrázek č. 4: Analýza kinetiky enzymů v klidovém stádiu. Fosfatáza PTP1B se inkubovala na destičkách s 96 prohlubněmi v různých koncentracích substrátu para-nitrofenylfosfát (pNPP) a inhibitoru 2-(oxalylamino)benzoová kyselina (při konečných koncentracích 0, 3,7, 11,1, 33,3 a 100 μΜ) . Pufr obsahuje 100 mM acetát sodný pH 5,5, 50 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 0,1 % (hmotn./objem) albuminu bovinního séra. Doba inkubace je 60 minut. Inkubace probíhala při teplotě 25 °C.

Přidal se hydroxid sodný a absorbance se odečítala při vlnové délce 405 nm. A) grafy podle Michaelise Mentena, B) graf zjevné hodnoty Km relativní ke koncentraci inhibitoru, C) graf zjevné hodnoty Vmax se vztahují ke koncentraci inhibitoru.

Další detaily jsou uvedeny v sekci definice.

Obrázek č.5: Analýza kinetiky enzymů v klidovém stádiu.

Fosfatáza PTP1B se inkubovala na destičkách s 96 prohlubněmi v různých koncentracích substrátu para-nitrofenylfosfát (pNPP) • · ··· ·» *· • $ · % • > 4» '· • · a · a inhibitoru 2-(oxalylamino)-4,5, 6, 7-tetrahydrobenzo[b]thiofen-3-karboxylová kyselina (při konečných koncentracích 0, 18,5, 55,6, 166,7 a 500 μΜ) . Pufr obsahuje 100 mM acetát sodný pH 5,5, 50 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 0,1 % (hmotnost/objem), 0,1 % (hmotnost/objem) albuminu bovinního séra. Doba inkubace je 60 minut. Inkubace probíhala při teplotě 25 °C. Přidal se hydroxid sodný a absorbance se odečítala při vlnové délce 405 nm. A) grafy podle Michaelise Mentena, B) graf zjevné hodnoty Km relativní ke koncentraci inhibitoru, C) graf zjevné hodnoty Vmax relativní ke koncentraci inhibitoru. Další detaily jsou uvedeny v sekci definice.

Obrázek č: 6: Analýza kinetiky enzymů v klidovém stádiu.

A) graf podle Michaelise Mentena.

Fosfatasa PTPa se inkubovala na destičkách s 96 prohlubněmi při různých koncentracích substrátu para-nitrofenylfosfát (pNPP) a inhibitoru 5-(1,3-dixo-l,3-dihydro-isoindol-2ylmethyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylová kyselina (při konečných koncentracích 0, 7,4,

22,2, 66,7 a 200 μΜ). Pufr obsahuje 100 mM acetát sodný pH 5,5, 50 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 0,1 % (hmotn./objem) albuminu bovinního séra. Doba inkubace je 60 minut. Inkubace probíhala při teplotě 25 °C. Pak se do každé prohlubně přidalo 10 μΐ hydroxidu sodného (v 50 % (objem) etanolu) a absorbance se odečítala při vlnové délce 405 nm. B)grafy podle Michaelise Mentena.

Fosfatasa PTPa se inkubovala na destičkách s 96 prohlubněmi při různých koncentracích substrátu para-nitrofenylfosfát

Φ Γφ φ φφ· φ

«« »Φ • φφ φ ♦ ·»φ φ·· φ· • Φ ··

Φ Φ

Φ Φ Φ Φ φ Φ (ρΝΡΡ) a inhibitoru 5-(1,3-dixo-l,3-dihydro-isoindol-2ylmethyl) -2- (oxalyl-amino) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3•karboxylová kyselina (při konečných koncentracích 0, 37,

111,1, 333,3 a 1000 μΜ). Pufr obsahuje 50 mM HEPES pH 7,0, 100 mM NaCl, 5 mM glutathion, 1 mM EDTA, 0,1 % (hmotn./objem) albuminu bovinního séra. Doba inkubace je 60 minut. Inkubace probíhala při teplotě 25 °C. Pak se do každé prohlubně přidalo 20 μΐ hydroxidu sodného (v 50 % (objem) etanolu) a absorbance se odečítala při vlnové délce 405 nm. Další detaily se uvádějí v sekci definice.

Na obrázku č. 7 je zobrazena homologie uspořádání více sekvencí oblasti I PTPasy založené na třech bazích.

Příklady provedení vynálezu

Definice:

TLC je chromatografie na tenké vrstvě. CDC1₃ je deuterochloroform. CD3OD je tetradeuterochloroform a DMSO-d₆ je hexadeuterodimetylsulfoxid. Struktury sloučenin se potvrdily buď elementární analýzou nebo NMR. Posuny v ¹H NMR (δ_Η) se uvádějí v jednotkách ppm, jako vnitřní referenční standard se používá tetramethylsilan. M.p. je teplota tání udává se ve °C a není upravován. Kolonová chromatografie se provedla za použití metody popsané v publikaci W.C. Still et al., J. Org. Chem. 43: 2923 (1978) a silikagelu 60 od firmy Merck (č. kat. 9385) . Analýzy pomocí HPLC se provádí za použití 5 μπι kolony C18 4x 250 mm eluované různými směsi vody a acetonitrilu, průtok je Iml/min, jak se popisuje v experimentální sekci. Sločeniny používané jako počáteční materiál jsou buď známé sloučeniny nebo sloučeniny , které je možné připravit způsoben dobře známým v oboru.

Wang-pryskyřice je polystyren se 4-hydroxymethylfenoletherovým linkerem.

2-aminothiofeny se připravily podle publikace Gewald et al., Chem. Ber. 99: 94 (1966). 3-aminothiofen se připravil podle publikace H. Hartmann and J. Liebscher, Synthesis 275 (1984).

Příklad 1:

CK.OH

OH

2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina

K míchanému roztoku kyseliny o-aminobenzoové (20,1 g, 0,15 mol) v suchém tetrahydrofuranu (250 ml) se přidal po kapkách ethyloxalylchlorid (10 g, 0,073 mol). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 15 minut, filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 16,4 g (94 %) 2(ethoxyoxalyl-amin)benzoové kyseliny ve formě oleje.

K roztoku shora popsané kuseliny benzoové (10 g, 0,042 mol) v etanolu (350 ml) se přidal roztok hydroxidu sodného (3,7 g, 0, 092 mol) ve vodě (100 ml). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 60 hodin. Přidala se koncentrovaná kyselina chlorovodíková v množství, kdy jodnota pH je 1 a sraženina se filtrovala a promyla se vodou ( 3 x 100 ml), diethyletherem (3x80 ml) a sušila se vakuu za vzniku 7,1 g (81 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě pevné látky.

* ··· • 9 9

M.p.: 214 - 215°C:

vypočteno pro C9H7NO5, 0,2 H₂O,

C 51,68 % H, 3,37 % N, 6,70 % zj ištěno:

C 50,96%, H 3,32 %, N 6,52 %.

Podobným způsobem, který se popisuje v příkladu 1, se připravily následující sloučeniny.

Příklad 2:

o

3-(oxalyl-amino)naftalen-2-karboxylová kyselina M.p.: 227 - 228°C: vypočteno pro C13H9NO5,

C 60,24 % H, 3,50 % N, 5,40 % zjištěno:

C 59,98%, H 3,46 %, N 5,25 %.

Příklad 3:

°V^0H o

Η Π

OH

3-(oxalyl-amino)-5-jodobenzoová kyselina

Φ' φ 'φ • ···

MS(ES): m/z = 326 (Μ+1) vypočteno pro C9H6NIO5, 0,75 χ Η₂Ο, C 31,01 % Η, 2,17 % Ν, 4,02 % z j ištěno:

C 31,14%, Η 2,33 %, Ν 3,76 %.

Příklad 4:

OH

4-(oxalyl-amino)bifenyl-3-karboxylová kyselina

K suspenzi methylesteru 5-bromo-2-aminobenzoové kyseliny (3,0 g, 13,04 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)paladium(0) (0,5 g,

0,44 mmol), toluen (40 ml) a 2 N vodným uhličitanem sodným (14,8 ml) se přidal roztok kyseliny fenylborové (2,2 g, 17,73 mmol) v methanolu (10 ml) při teplotě místnosti. Výsledná reakční směs se zahřívala na teplotu odtoku po dobu 4 hodin. Pak se ochladila a ředila vodou (50 ml). Nerozpustná hmota se odfiltrovala a fáze se separovaly. Vodná fáze se extrahovala ethylacetátem (100 ml) a kombinované organické fáze se promyly vodou (2 x 80 ml), ředěným vodným amoniakálním (80 ml) a saturovaným vodným chloridem sodným (80 ml). Organická fáze se sušila (MgSO₄) , filtrovala se odpařila se ve vakuu za vzniku surového methylesteru kyseliny 4-aminobifenyl-3-karboxylové, který se čistil na silikagelu (1 1) za použití směsi kyseliny

ethylacetátu a heptanu (1:3) jako eluentu. Čisté frakce se sebraly a odpařily se ve vakuu za vzniku 2,7 g (91%) methylesteru kyseliny 4-aminobifenyl-3-karboxylové.

Methylesteru kyseliny 4-aminobifenyl-3-karboxylové se přeměnil na sloučeninu uvedenou v nadpisu podobným způsobem jak se popisuje v příkladu 1.

M.p.: 223 - 224°C:

vypočteno pro C15H11NO5, 0,5 x H₂0

C 61,23 % H, 4,11 % N, 4,76 % zjištěno:

C 60,96%, H 4,01 %, N 4,62 %.

Příklad 5:

OH

Br

4-bromo-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 Mhz, CD₃OD) δ 8,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H) , 8,25 (s,

1H), 7,80 (d, J = 7,5 Hz, 1H).

MS: ESI (-) : 288 [M-l (⁸¹Br) ) , 287 M-l(⁸Br))].

Příklad 6:

OH »' ·«

4,5-dimethoxy-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 Mhz, CD₃OD) δ 8,42 (s, 1H) , 7,60 (S, 1H) , 3,95 (S,

3H) , 3,86 (s, 3H) .

MS: ESI (-) : 268 [M-l].

Příklad 7:

5-nitro-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,90 (d, J = 7,5 Hz, 2H) , 8,42 (s,

1H)

MS: ESI (-) : 253 [M-l].

Příklad 8:

nitro-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 Mhz, CD₃OD) δ 9,60 (s, 1H) , 8,36 (m, 1H) , 8,02 (m,

1H) .

MS: ESI (-) : 253 [M-l].

Příklad 9:

100

»»	«•Wi	9 ♦·	• fc	9-9
• ♦		· i	•	• 9 »
«	··♦	9 9 9	é	•1» ·
•
•	•	9: · ·	9	· 9
		··· ··	* *	9 ·'

5-chloro-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 Mhz, CD₃OD) δ 8,72 (d, J = 7,5 Hz, 1H) , 8,10 (s,

1H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, 1H).

MS: ESI (-) : 242 [M-1(³⁵C1)], 244 [M-1(³⁷C1)].

Přiklad 10:

4-chloro-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 Mhz, CD₃OD) δ 8,80 (s, 1H) , 8,10 (d, J = 7,5 Hz,

1H), 7,22 (d, J = 7,5 Hz, 1H).

MS: ESI (-) : 242 [M-1(³⁵C1)], 244 [M-1(³⁷C1)].

Přiklad 11:

3-methyl-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 Mhz, DMSO-d₆) δ 2,2 (s, 3H) , 7,2-7,7 (m, 3H) , 10,5 (s, 1H), 12,9 (s, 1H).

MS: ESI (-) : 242 [M-1(³⁵C1)], 244 [M-1(³⁷C1)].

9

101

9 9 99 9 • · · • ··· • · ί

··

Příklad 12

4,5-difluor0-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,03 (m, 1H), 12,55 (s, 1H, NHCO).

Příklad 13

N-(2-karbamoyl-fenyl)-oxalamová kyselina ^XH NMR (300 MHz, DMSO-d_e) δ 7,20 (t, 1H) , 7,55 (t, 1H) , 7,73 (bs, 1H, CONH₂), 7,83 (d, 1H) , 8,30 (bs, 1H, CONH₂) , 8,52 (d, 1H) , 12,9 (s, 1H, NHCO).

Příklad 14:

O

2-(ethoxyoxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 1,33 (t, 3H) , 4,30 (q, 2H) , 7,24 (t, 1H), 7,65 (t, 1H), 8,03 (d, 1H) , 8,56 (d, 1H) , 12,6 (s, 1H, NHCO) .

Příklad 15

Cl

Λ OH o o

102

6-chloro-2-(oxalyl-amino)benzoová ^XH NMR (400 MHz, DMSO-dg) δ 10,68 1H), 7,43 (t, J = 9 HZ, 1H), 7,27

Příklad 16:

• 4 ····	* ··		·· 4«
• * ·	·· 4	•	• 4 ·	4
• ···	*= 4	•	• · «	4
				•
9 4	• 4 ··· ··		«· ··	··

kyselina (bs, 1H) , 8,06 (d, J = 9 Hz, (d, J = 9 Hz, 1H).

3-methoxy-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9,98 (bs, 1H) , 7,37-7,25 (m, 3H) ,

3,80 (s, 3H).

Příklad 17:

2-(oxalyl-amino)tereftalová kyselina

F NMR. (400 MHz, DMSO-dg) δ 7,28 (s, 1H) , 8,22 (s, J = 9 Hz,

1H) , 7,75 (d, J = 9Hz, 1H) .

Příklad 18:

5-fluoro-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 7,50 (m, 1H) , 7,25 (m, 1H) .

MS m/z 227,2 (M-l).

103 ·· «··· • · · • ·»· » φ · • Φ· *· · » • · · • * · ··· ·· ·· • · ♦ • · · ·«· ·· «·

Příklad 19:

3,5-dibroro-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,08 (s, 1H), 8,05 (s, 1H). MS m/z 366, 1 (M-l) .

Příklad 20:

Λ-οη '-riQ-lí OH i cro

3,5-dijodo-2-(oxalyl-amino)benzoová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,45 (s, 1H) , 8,25 (m, 1H) .

MS m/z 460,1 (M-l).

Příklad 21:

2-(oxalyl-amino)-5-(3-thiofen-3-yl-isooxazol-5-yl)-benzoová kyselina

Roztok thiofen-3-karboxaldehyd (2,0 g, 18 mmol) v 1,4-dioxan (6 ml) se přidal hydroxylaminchlorid (1,24 g, 18 mmol) a triethylamin (2,5 ml, 18 mmol). Směs se sonikovala po dobu 30 minut a míchala se se při teplotě místnosti po dobu 116 hodin a při teplotě 35 °C po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo se

·· ···· • · · • ···	• ·· ·· · · • · ·	·· « · • ·	• · • ·
104.:.....·	• · · ··· ··	• ·	• · ··

104 odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v dichloromethanu a promyl se vodou , sušil se (MgSO₄) , filtorval se a odpařil se ve vakuu za vzniku 1,97 g (87 %) thiofen-3-karbaldehydoximu ve formě oleje.

K roztoku shora uvedeného thiofen-3-karbaldehydoximu (120 mg, 0,99 mmol) a methylesteru 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5ethynyl-benzoové kyseliny (100 mg, 0,33 mmol) v tetrahydrofuranu (2,5 ml), který se míchal při teplotě místnosti se přidalo 0,75 bělidla (1,3 ml, 0,99 mmol). Roztok se nejdříve míchal při teplotě místnosti po dobu 24 hodin a pak při teplotě 35 °C po dobu 24 hodin. Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v dichlormethanu a promyl se vodou, vysolil se, sušil se (MgSO₄) , filtorval se a odpařil se ve vakuu. Zbytkový film se čistil preparativní TLC za vzniku 21 mg (15 %) methylesteru 2-(terC-butoxyoxalylamino) -5- (3-thiofen-3-yl-isoxazol-5-yl) -benzoové kyseliny ve formě oleje.

XH NMR (400 MHz,	CDC13)	δ 12,75 (s, 1H) ,	8,92	(d, 1H, J	= 11
Hz), 8,59 (s 1H) ,	8,06	(d, 1H, J = 11 Hz)	, 7,	91 (s, 1H),	7,59
(d, 1H, J = 7 Hz)	, 7,28	(d, 1H, J = 7 Hz)	, 6,	90 )s, 1H),	4,07
(s, 3H), 1,65 (s,	9H) .

Methylester kyseliny 2-(tert.-butoxyoxalyl-amino)-5- (3-thiofen3-yl-isoxazol-5-yl)-benzoové (10 mg, 0,023 mmol) se rozpustil ve 20 % kyselině trifluorooctové/dichlormethanu (0,3 ml) a míchal se při teplotě místnosti po dobu 21 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu za vzniku 8,4 mg (98 %) methylesteru kyseliny 2-(oxalyl-amino)-5-(3-thiofen-3-yl-isoxazol-5-yl)-

benzoové ve formě	pevné	látky.
XH NMR (400 MHz,	CD3OD)	δ 12,75	(s,	1H) ,	8,95 (d, 1H, J	= 11
Hz), 8,62 (s 1H) ,	8,18	(d, 1H,	J =	11 Hz)	, 7,75 (m, 1H),	7,65
(m, 1H) , 7,65 (m,	1H), 7	,60 (s,	1H) ,	4,07	(s, 3H).

K roztoku methylesteru kyseliny 2-(oxalyl-amino)-5-(3-thiofen3-yl-isoxazol-5-yl)-benzoové (8,4 mg, 0,023 mmol) v methanolu (1,5 ml) a tetrahydrofuranu (0,5 ml) při teplotě místnosti se • ·

106 přidal 1 N hydroxid litný (90 μΐ, 0,090 mmol). Roztok se míchal po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě. . Roztok se okyselil 1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH = 1 a extrahoval se ethylacetátem.

Kombinované extrakty se promyly solí, sušily se (MgSO₄) , filtrovaly se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 6,4 mg (79 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě pevné látky. ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,75 (d, 1H, J = 11 Hz), 8,70 (s 1H) , 7,95 (s, 1H), 7,82 (d, 1H, J = 11 Hz), 7,70 (m, 1H) , 7,60 (m, 1H) .

MS m/z: 357 (M-l).

Příklad 22:

2-(oxalyl-amino)-5-(3-fenyl-isooxazol-5-yl)-benzoová kyselina K roztoku benzaldehydu (2,0 g, 19 mmol) v 1,4-dioxan (6 ml) se přidal hydroxylaminchlorid (1,3 g, 19 mmol) a triethylamin (2,6 ml, 19 mmol) . Směs se sonikovala po dobu 30 minut a míchala se při teplotě místnosti po dobu 116 hodin a při teplotě 35 °C po dobu 24 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v dichloromethanu a promyl se vodou, sušil se (MgSO₄) , filtroval se a odpařil se ve vakuu za vzniku 1,97 g (84 %) benzaldehydoximu ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CD₃C1) δ 8,18 (s, 1H) , 7,60 (s 2H) , 7,41 (m,

3H) .

K roztoku benzaldehydoximu (120 mg, 0,99 mmol) a methylesteru 2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-5-ethynyl-benzoové kyseliny (100 mg, 0,33 mmol) v tetrahydrofuranu (2,5 ml), který se míchal při teplotě místnosti se přidalo 0,75 bělidla (1,3 ml, 0,99 mmol). Roztok se nejdříve míchal při teplotě místnosti po dobu • · °C po dobu 24 hodin, a zbytek se rozpustil

1Q6 hodin a pak při teplotě 35 Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu v dichlormethanu a promyl se vodou, solí, sušil se (MgSO₄) , filtroval se a odpařil se ve vakuu. Zbytek diethyletherem za vzniku pevného precipitátu, odfiltroval za vzniku 59 mg (42 %) methylesteru 2-(tertbutoxyoxalyl-amino) -5-(3-thiofen-3-yl-isoxazol-5-yl)-benzoové kyseliny ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,75 (s, 1H) , 8,85 (d, 1H, J = 11

Hz), 8,06 (d, 1H, J = 11 Hz), 7,91 (m, 2H), 7,52 (m, 3H), 6,90 (s, 1H), 4,07 (s, 3H), 1,65 (s, 9H).

Methylester kyseliny 2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-5-(3-thiofen3-yl-isoxazol-5-yl)-benzoové (28 mg, 0,07 mmol) se rozpustil ve 20 % kyselině trifluorooctové/dichlormethanu (0,5 ml) a míchal se při teplotě místnosti po dobu 6 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu za vzniku 25 mg (100 %) methylesteru kyseliny 2-amino-5-(3-fenyl-isoxazol-5-yl)-benzoové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,75 (s, 1H) , 8,85 (d, 1H, J = 11

Hz), 8,62 (s 1H), 8,15 (d, 1H, J = 11 Hz), 7,91 (m, 2H) , 7,52 (m, 3H), 6,90 (s, 1H), 4,07 (s, 3H).

K roztoku shora uvedeného methylesteru kyseliny 2-amino-5-(3fenyl-isoxazol-5-yl)-benzoové (12,5 mg, 0,034 mmol) v methanolu (2,5 ml) a tetrahydrofuranu (1,0 ml) při teplotě místnosti se přidal 1 N hydroxid litný (1,4 ml, 0,136 mmol). Roztok se míchal po dobu 12 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě. Roztok se okyselil 1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH = 1 a extrahoval se ethylacetátem. Organické extrakty se promyly solí, sušily se (MgSO₄) , filtrovaly se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 7,7 mg (64 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě pevné látky.

se promyl který se *H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,91 (d, 1H, J = 11 Hz), 8,62 (s 1H) ,

8,15 (d, 1H, J = 11 Hz), 7,91 (m, 2H) , 7,49 (m, 3H) , 7,25 (s,

1H), 4,07 (s, 3H).

LC/MS m/z: 351 (M-l).

Příklad 5.3:

5-ethynyl-2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina

Roztok kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-jodo-benzoové (5,0 g, 12,8 mmol) a N,N-dimethylformamid-di-tertbutyl-acetalu (12 ml, 51,2 mmol) v toluenu (100 ml) se zahřály na teplotu výtoku po dobu 20 hodin. Reakce se ochladila na teplotu místnosti, její koncentrace se zvýšila ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (150 ml) . Fáze ethylacetátu se promyla vodou (3 x 35 ml), solným roztokem (20 ml) a těkavé látky se odpařily ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografií na silikagelu za použití 25 % ethylacetátu/hexanu jako eluentu. Čisté frakce se kombinovaly a ve vakuu se zvýšila jejich koncentrace za vzniku 2,3 gtert-butylesteru kyseliny 2-(tertbutoxyoxalyl-amino)-5-jodo-benzoové ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,54 (d, J = 9 Hz, 1H) , 8,27 (s 1H) ,

7,83 (d, J = 9 Hz, 1H), 1,62 (s, 18H).

Tert-butylester 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-jodo-benzoové (0,83 g, 1,86 mmol), trimethylsilylacetylen (2 ml) a triethylamin (1 ml, 7,44 mmol) se rozpustily v N,Ndimethylformamidu (5 ml) a roztok se promyl argonem. Přidal se dichlorobis(trifenylfosfin)paladium(II) (26 mg, 0,15 mmol) a jodid mědný (4 mg, 0,15 mmol) a reakce se míchala při teplotě 60 °C v atmosféře argonu po dobu 5 hodin) Surová směs se ředila ethylacetátem (40 ml) a promyla se vodou (3 x 10 ml) a

108 solným roztokem (2 x 10 ml) . Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 0,77 g (99 %) tert-butylesteru kyseliny 2-(tertbutoxyoxalyl-amino)-5-trimethylsilanylethyny-benzoové.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,59 (s, 1H) ) , 8,71 (d, J = 9 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 9 Hz, 1H) , 1,62 (s, 9H) , 1,61 (s, 9H) , 0,25 (s, 9H).

TerC-butylester kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5trimethylsilanylethyny-benzoové (0,57 g, 1,37 mmol) se rozpustil tetrahydrofuranu (5 ml) a ošetřil se roztokem 0,9 M fluoridem tetrabutylamonným a kyselinou octovou (2:3) v tetrahydrofuranu (1,7 ml, 1,51 mmol) po dobu 3 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a surový materiál se extrahoval do ethylacetátu (35 ml) . Ethylacetátový extrakt se promyl 1M kyselinou chlorovodíkovou (5 ml), saturovaným uhličatanem sodným (5 ml), solným roztokem (5 ml) a odpařil se ve vakuu za vzniku 0,36 g (76 %) terC-butylesteru kyseliny 2-(terCbutoxyoxalyl-amino)-5-ethynyl-benzoové ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,74 (d, J = 10 Hz, 1H) , 8,12 (s 1H) , 7,65 (d, J = 10 Hz, 1H), 3,08 (s, 1H) , 1,62 (s, 9H) , 1,58 (s, 9H) .

TerC-butylester kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-ethynybenzoové (0,36 g, 1,04 mmol) se ošetřil 50 % kyselinou trifluorooctovou/dichlormethanem (15 ml) při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Reakční směs se koncentrovala ve vakuu a zbytek se promyl vodou a diethyletherem, pak se směs sušila a získalo se 0,21 g (86 %) sloučeniny uvedené v názvu.

^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8,23 (d, J = 10 Hz, 1H) , 8,05 (s 1H), 7,76 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,24 (s, 1H).

LC/MS [M-H]: 232,07

HPLC (254,4 nm) : 3,112s (49 %).

Příklad 24:

Ο.

Φ » φ ·Φ φ • · ·

10.9 φ ·· ·« • · φ φ φφ φφ • · φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

ΟΗ

Μ

Ο ΟΗ

5-(3-dimethylamino-prop-l-ynyl)-2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina

K roztoku kyseliny 5-jodoantranalové (3,0 g, 11,4 mmol) a N,Ndiisopropylethylaminu (4 ml, 22,8 mmol) v bezvodém tetrahydrofuranu (40 ml) se přidal tert-butylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (4,47 g, 22,8 mmol). Reakce se míchala při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Rozpouštědla se odpařila ve vakuu a surová směs se extrahovala do ethylacetátu (70 ml) . Organický extrakt se promyl 1 % kyselinou chlorovodíkovou (2x 15 ml) a solným roztokem (10 ml) a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 2,8 g (63 %) kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-jodo-benzoová ve formě pevné látky.

¹H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 8,57 (d, J = 9 Hz, 1H) , 8,43 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,00 (dd, J = 9 Hz, 2 Hz, 1H),), 1,59 (s, 9H).

K roztoku kyseliny 2-(terč-butoxyoxalyl-amino)-5-jodo-benzoové (2,1 g, 5,37 mmol) v dichloromethanu (15 ml) v atmosféře dusíku se přidal triethylamin (3,75 ml, 26,85 mmol) a N,Ndimethylaminopyridin (0,1 g). Dále se přidal methoxymethylchlorid (1,2 ml, 16,11 mmol) a reakční směs se míchala po dobu 4 hodin a zmenšil se objem na minimum. Tento objem směsi se nanesl na kolonu se silikagelem. Kolona se eluovala směsí 50 % ethylacetát/hexan. Čisté frakce se kombinovaly a zvyšovala se jejich koncentrace za vzniku 1,5 g (64 %) methoxymethylesteru kyseliny 2-(terC-butoxyoxalylamino) -5-jodo-benzoové ve formě pevné fáze.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 8,56 (d, J = 9 Hz, 1H) , 8,42 (s, 1H) , 7,89 (d, J = 9 Hz, 1H),), 5,54 (s, 2H), 3,60 (s, 3H), 1,61 (s, 9H) .

·«

99 99

9 9 9 9 9 · · · 9 9 9·

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

999 99 99 99

Roztok methoxymethylesteru kyseliny 2-(tert-butoxyoxalylamino) -5-jodo-benzoové (0,16 g, 0,37 mmol), triethylaminu (51 μΐ, 0, 37 mmol) a l-dimethylamino-2-propyn (0,12 ml, 1,11 mmol) se připravil do bezvodého acetonitrilu (3 ml) a čistil se argonem. Přidal se dichlorobis(trifenylfosfin)paladium(II) (5 mg, 0,0074 mmol) a jodid mědný (1 mg, 0,0074 mmol) a reakce se míchala při teplotě 60 °C v atmosféře argonu po dobu 18 hodin). Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se znovu rozpustil v ethylacetátu (10 ml) . Organická fáze se promyla 1 % kyselinou chlorovodíkovou (5 ml) a vodná fáze se extrahovala dalším ethylacetátem. Kombinované organické extrakty se promyly solným roztokem (5 ml), sušily se (Na₂SO₄) a koncentrovaly se za vzniku oleje. Surový olej se rozpustil v dichloromethanu a čistil se chromatografií na silikagelu za použití 5% methanol/dichloromethan/0,1 % triethylamin, který se použil jako eluent. Čisté frakce se kombinovaly za vzniku 81 mg (60 %) methoxymethylesteru kyseliny 2-(terCbutoxyoxalyl-amino)-5-(3-dimethylamino-prop-l-ynyl)-benzoové ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,52 (s, 1H) ) , 8,75 (d, J = 9 Hz, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,64 (d, J = 9 Hz, 1H) , 5,53 (s, 2H) , 3,59 (s, 3H), 3,46 (s, 2H), 2,38 (s, 6H), 1,61 (s, 9H).

Methoxymethylester kyseliny 2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-5-(3dimethylamino-prop-l-ynyl)-benzoové (32,3 mg) se ošetřil 50 % kyselinou trifluoroctové/dichloromethanu (3 ml) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Směs se koncentrovala ve vakuu na pevnou fázi a výsledná pevná látka se promyla dichlormethanem, přičemž vzniklo 20 mg (83 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě pevné látky.

^ΧΗ NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8,60 (d, J = 9 Hz, 1H) ) , 8,05 (s, 1H), 7,60 (d, J = 9 Hz, 1H), 4,07 (s, 2H), 2,73 (s, 6H).

Příklad 25:

5-(2-((l-benzylkarbamoyl-3-methyl-butyl)-isopropyl-karbamoyl)vinyl)-2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina

Methoxymethylester kyseliny 5-(2-((l-benzylkarbamoyl-3-methylbutyl)-isopropyl-karbamoyl)-vinyl)-2-(tert-butoxyoxalylamino)-benzoové (0,14 g, 0,22 mmol) se ošetřil roztokem 50 % kyseliny trifluoroctové/dichlormethanem (6 ml) po dobu 2,5 h. Směs se koncentrovala ve vakuu a srážela se z vody. Výsledná krystalická pevná látka se odfiltrovala a sušila se ve vakuu, přičemž vzniklo 0,10 g (85 %) sloučeniny podle názvu ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,76 (d, J - 9 Hz, 1H) ) , 8,31 (s,

1H) ,	7,94 (d,	J =	9 Hz,	1H) , 7,49 (d, J = 16 Hz, 1H) , 7	,46-
7,38	(m, 5H) ,	7,13	(d, J	=16 Hz, 1H), 4,49 (m, 1H), 4,10	(s,
2H) ,	3, 95 (m,	1H) ,	2,49	(m, 1H) , 1,90 (m, 1H) , 1,56 (m,	1H) ,
1,38	(d, J = 7	Hz,	3H) , 0	,97 (d, J = 6 Hz, 6H).

LC/MS [M-H]’: 522,55

Následující sloučeniny se připravily stejným způsobem jak se popisuje v příkladu 1.

Příklad 26:

OH

4-fluoro-2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina • · · · ^XH NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 7,11 (m, 1H) ) , 8,12 (m, 1H) , 8,42 (dd, 1H), 12,62 (s, 1H, NHCO).

Příklad 27:

5-hydroxy-2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina ^XH NMR (300 MHz, DMSO-dg) δ 7,11 (m, 1H) ) , 8,12 (m, 1H) , 8,42 (dd, 1H), 12,62 (s, 1H, NtfCO) .

Příklad 28:

5-methyl-2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina ^ΧΗ NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,20 (s, 1H) ) , 8,51 (d, J = 10 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 2 Hz, 1H) , 7,42 (dd, J =10 Hz, 2 Hz, 1H) , 2,29 (s, 3H).

Příklad 29:

5-(3-oktyl-isoxazol-5-yl)-2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina K roztoku 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-jodo-benzoová (1,8 g,

4,6 mmol) a uhličitanu draselného (1,6 g, 11,5 mmol) v acetonu (15 ml) se přidal jodomethan (3 g) . Reakce se zahřála na

U*3 • β β β teplotu výtoku po dobu 2 hodin, po které se posoudila celkovou tle analýzou. Surová směs se ředila ethylacetátem (75 ml), promyla se vodou (2 x 15 ml) a solným roztokem (10 ml) . Organické fáze se koncentrovaly ve vakuu, přičemž vzniklo 1,8 g (94 %) methylester kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5jodo-benzoové.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,52 (s, IH) ) , 8,53 (d, J = 9 Hz, 1H) , 8,39 (s, IH) , 8,87 (d, J = 9 Hz, IH) , 3,98 (s, 3H) , 1,61 (s, 9H) .

2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-5-jodorozpustil v N,NMethylester kyseliny -benzoové (0,86 g, 8,48 mmol) se -dimethylformamidu (5 ml) a roztok se čistil argonem. Přidal se dichlorobis(trifenylfosfin)paladium(II) (30 mg, 0,042 mmol) a jodid mědný (4 mg, 0,021 mmol) a reakce se míchala při teplotě 60 °C v atmosféře argonu po dobu 3 hodin) . Surová směs se ředila ethylacetátem (40 ml) a promyla se vodou (3 x 10 ml) a solným roztokem (2 x 10 ml). Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 0,8 g (99 %) methylesteru kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-trimethylsilanylethyny-benzoové, která se použila bez dalšího čištění.

Methylester kyseliny 2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-5-trimethyl-silanylethyny-benzoové (0,15 tetrahydrofuranu (2 ml) a fluoridem tetrabutylamonným g, 0,4 mmol) se rozpustil ošetřil se s roztokem 0,9 M a kyselinou octovou (2:3) v tetrahydrofuranu (0,44 ml, 0,4 mmol) po dobu 3 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a surový materiál se extrahoval do ethylacetátu (25 ml). Ethylacetátový extrakt se promyl 1M kyselinou chlorovodíkovou (5 ml), saturovaným uhličitanem sodným (5 ml), solným roztokem (5 ml) a odpařil se ve vakuu za vzniku 0,1 g (83 %) methylesteru kyseliny 2-(tertbutoxyoxalyl-amino) -5-ethynyl-benzoové ve formě oleje.

Roztok methylesteru kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5ethynyl-benzoové (0,1 g, 0,33 mmol) a nonaldoximu (0,15 g,

0,99 mmol) v tetrahydrofuranu (3 ml) se ošetřil bělidlem (0,75 M, 1,3 ml, 0,99 mmol). Roztok se nejdříve míchal při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Analýza Tle vykázala přítomnost počátečního materiálu, tak se reakce zahřála na teplotu 35 °C po dobu 12 hodin. Rozpouštědla se odpařila ve vakuu a surový materiál se rozpustil v ethylacetátu (35 ml), promyl se vodou (2 x 10 ml), solným roztokem (10 ml). Organický extrakt se odpařil ve vakuu, přičemž vzniklo 0,1 g (66%) methylesteru 2(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-(3-octyl-isoxazol-4-yl)-benzoové kyseliny ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 8,89 (d, J = 10 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 10 Hz, 1H), 7,97 (dd, J = 10 Hz, 1H) , 6,41 (s 1H) , 4,02 (s, 3H), 6,41 (s, 1H), 4,02 (s, 3H), 2,73 (t, J = 8 Hz, 2H) , 1,70 (m, 2H), 1,62 (s, 9H), 1,37- 1,25 (bm, 12H) , 0,89 (t, J = 8 Hz, 3H) .

K roztoku methylesteru kyseliny isoxazol-4-yl)-benzoové (9,1 mg, 0,02 mmol) v 50 % methanolu/tetrahydrofuranu (2 ml) se přidal 1 N hydroxid litný (60 μΐ, 0,060 mmol). Roztok se míchal po dobu 48 hodin. Reakce se hodnotila tle analýzou jako neúplná (30 % methanol/dichlormethan) a přidal se další IN hydroxid litný (20 μΐ, 0,020 mmol). Reakce se míchala po dobu 72 hodin. Roztok se okyselil 1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH okolo 0. Smě se koncentrovala ve vakuu a surový extrakt se rozpustil ethylacetátu (20 ml). Organická vrstva se promila solným roztokem (2 x 5 ml) a koncentrovala se ve vakuu, přičemž vzniklo 5,4 mg (70 %) sloučeniny uvedené v názvu v pevné formě.

^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,87 (d, 1H, J = 11 Hz), 8,55 (s 1H) ,

8,04 (d, 1H, J = 10 Hz), 6,74 (s, 1H) , 2,70 (t, 2H, J = 8 Hz),

1,72 (m, 1H), 1,38-1,20 (bm, 12H), 0,90 (t, J = 8 Hz, 3H) .

Příklad 30:

5-(2-((l-benzylkarbamoyl-3-methyl-butyl)-isopropyl-karbamoyl) 2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina

K roztoku isopropylaminu (0,43 ml, 5,0 mmol) v methanolu (5 ml) se přidal isovaleraldehyd (0,54 ml, 5,0 mmol). Po 15 minutách míchání se k roztoku benzylisokyanidu v tetrahydrofuranu (1 M, 5 ml, 5,0 mmol) přidala kyselina akrylová (0,34 ml, 5 mmol). Reakce se míchala při teplotě místnosti po dobu 72 hodin. Těkavé látky se odstranily ve vakuu- a výsledný olej se rozpustil v ethylacetátu (40 ml). Organická směs se promyla 1 N kyselinou chlorovodíkovou (10 ml) a solným roztokem (10 ml), sušila se (Na2SO₄) a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Surový zbytek se čistil chromatografií za použití gradientu od 30 % ethylacetátu/hexan do 50 % ethylacetátu/hexan. Shromáždily se čistá frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu, přičemž vzniklo 1,5 g (100 %) N-(1-benzylkarbamoyl—3-methyl-butyl)-N-isopropylakrylamid ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 8,13 (bs, 1H) , 7,30 - 7,19 (m 5H) , 6,49 (dd, J = 16 Hz, 12 Hz, 1H), 6,25 (d, J = 16 Hz, 1H), 5,66 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,38 (d, J = 6 Hz, 2H) , 4,10 - 4,02 (m,

1H), 2,22 - 2,13 (m, 1H) , 1,76-1,70 (m, 1H) , 1, 62 - 1,54 (m,

2H), 1,25 (d, 3H, J = 7 Hz), 1,20 (d, J = 7 Hz, 3H) , 0,90 (d, J = 7 Hz, 3H).

Roztok N-(l-benzylkarbamoyl-3-methyl-butyl)-N-isopropylakrylamid (0,55 g, 1,74 mmol), methoxymethylester kyseliny 2-(tere-butoxyoxalyl-amino)-5-jodo-benzoové (0,5 g, 1,15 mmol), palladiumacetát (3,0 mg, 0,023 mmol) a tri(o-tolyl)fosfin (10,0 mg, 0,07 mmol) v N,N-dimethylformamidu v atmosféře argonu a zahřál se na teplotu 100 °C za stálého míchání po dobu 3 hodin. Reakce se ochladila na teplotu místnosti a ředila se ethylacetátem (50 ml). Organická fáze se promyla vodou (2 x 15 ml) a solným roztokem (10 ml), sušila se (Na₂SO₄) a odpařila se ve vakuu. Surový olejový materiál se čistil chromatografií za použití 30 % ethylacetátu/hexanu jako eluentu. Sebraly se čištěné frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu, přičemž vzniká 0,15 g (20 %) methoxymethylesteru 5(2-((l-benzylkarbamoyl-3-methyl-butyl)-isopropyl-karbamoyl)vinyl)-2-(tere-butoxyoxalyl-amino)-benzoové kyseliny v olejové formě.

XH NMR (4	00 MHz, CDCI3) δ 12,58	(bs,	1H) , 8,82 (d, J	=	9 Hz,
1H), 8,22	(s, 1H) , 7,80 (d, J =	9 Hz,	. 1H), 7,60 (d, J	=	16 Hz,
1H), 7,30	- 7,22 (m, 5H), 6,80	(d,	J = 16 Hz, 1H),	5,	58 (s,
2H), 4,43	(bs, 2H), 4,21 - 4,15	(m,	1H) , 3,60 (s, 3H)	z	2,21 -
2,16) (m,	1H), 1,82 - 1,78 (m,	1H) ,	1,61 (S, 9H), 1,	61	-1, 58
(m, 1H) ,	1,35 (d, J = 7 Hz, 3H)	Z 1,2	4 (t, J = 7 Hz, 3	»H)	, 0,99
(d, J = 7	Hz, 3H), 0,94 (d, 3H,	J = 7	Hz) .

K roztoku methoxymethylesteru 5-(2-((l-benzylkarbamoyl-3methyl-butyl)-isopropyl-karbamoyl)-vinyl)-2-(terCbutoxyoxalyl-amino)-benzoové kyseliny (10,7 mg, 0,017 mmol) v methanolu (1 ml) se přidalo 5 % paladia/uhlíku (2,2 mg) a výsledná směs se míchala v atmosféře vodíku (0,21 MPa) po dobu 3 hodin. Směs se filtrovala skrz celit a odpařila se ve vakuu. NMR indikovalo, že reakce nebyla úplná, tak se dále podrobila podmínkám hydrogenace po dobu dalších 4 hodin. Směs se filtrovala a odpařila ve vakuu, přičemž se získalo 8,9 mg (83 %) methoxymethylesteru 5-(2-((l-benzylkarbamoyl-3-methylbutyl)-isopropyl-karbamoyl)-ethyl)-2-(terC-butoxyoxalylamino)-benzoové kyseliny ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,41 (s, 1H) , 8,68 (d, J = 9 Hz, 1H), 8,07 (bs, 1H), 7,98 (s 1H), 7,43 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,30 - 7,22 (m, 5H), 7,30 -7,22 (m, 5H), 5,52 (s, 2H), 4,45 - 4,33 (m, 2H) , 3,58 (s, 3H) , 2,95 (t, J = 7 Hz, 2H) , 2,72 - 2, 61 • · ·· u-7 :

(m, 2H) , 2,30 (m, 1H) , 1,62 (s, 9H) , 1,59 (m, 1H) , 1,22 (d, J = 6 Hz, 6H), 0,95 (d, J = 7 Hz, 3H) , 0,99 (d, J = 7 Hz, 3H) . Methoxymethylester 5-(2-((l-benzylkarbamoyl-3-methyl-butyl)isopropyl-karbamoyl)-ethyl)-2-(terC-butoxyoxalyl-amino)benzoové kyseliny (4 mg, 0,0064 mmol) se rozpustil v acetonu (3 ml) a ošetřil se 3 kapkami 1 N kyseliny chlorovodíkové. Reakce se míchala po dobu 2 dní, pak se aceton odpařil ve vakuu. Zbytek se rozpustil v ethylacetátu (10 ml), promyl se solným roztokem (2x2 ml) a odpařil se ve vakuu. Výsledný olej se ošetřil 20 % kyselinou trifluorooctovou/dichloromethanem (3 ml) po dobu 3 hodin). Těkavé látky se odpařily ve vakuu, přičemž vznikly 2 mg (61 %) sloučeniny uvedené v názvu ve ⁴Η NMR (400 MHz, CDC₃OD) δ 8, 1H), 7,51 (d, J = 9 Hz, 1H),

Hz, 1H), 4,14 (s, 2H), 3,73 2,82 - 2,63 (m, 2H), 2,42 (m, 1,26 (d, J = 6 Hz, 3H), 1,10 Hz, 6H) .

Příklad 31:

formě oleje.

,64	(d, J = 9	Hz,	1H), 8,00	(s
7,50	- 7,40 (m	, 5H)	, 4,17 (t,	J
(m,	1H), 2,95	(t,	J = 6 Hz,	2H)
1H)	, 1,80 (m,	1H) ,	1,30 (m,	1H)
(d,	J = 6 Hz,	3H) ,	0,99 (d, J	=

5-(2-((l-karbamoyl-3-methyl-butyl)-isopropyl-karbamoyl)ethyl)-2-(oxalyl-amino)-benzoové kyseliny

5-(2-((l-benzylkarbamoyl-3-methyl-butyl)-isopropyl-karbamoyl)-vinyl)-2-(oxalyl-amino)-benzoová kyselina (33 mg, 0,063 mmol) a 10 % paladium/uhlík se smíchaly v methanolu (3 ml) a výsledná směs se míchala v atmosféře vodíku (0,21 MPa) po dobu

11B ·· ·· φ φ φ φ φ φ · · φ ·

Φ Φ 9 Φ · Φ hodin. Směs se filtrovala skrz celit a těkavé látky se odpařily ve vakuu. Přičemž se získalo 27 mg (99 %) sloučeniny uvedené v názvu.

XH NN	[R (400 MHz, CDC13)	δ 8,64 (d,	J = 9 Hz,	1H)	, 8,00	(s, 1H),
7,98	(s 1H), 7,51 (d,	J = 9 Hz,	1H), 4,17	(t,	J = 8	Hz, 1H),
3,72	(m, 1H) , 2,96 (t,	, J = 6 Hz	, 2H), 2,	82 -	2,63	(m, 2H) ,
2,41	(m, 1H) , 1,80 (m,	1H), 1,30	(m, 1H),	1,25	(d, J	= 6 Hz,
3H) ,	1,13 (d, J = 6 Hz,	3H) , 0,90	(d, J = 6	Hz,	6H) .

LC/MS [M-H]: 435, 66

Příklad 32:

2-((5-merkapto-[l, 3,4]oxadiazol-2-karbonyl)-amino)-benzoová kyselina

K roztoku 2-(ethoxyoxalyl-amino)-benzoové kyseliny (2,0 g, 8,43 mmol) v ethanolu (75 ml) se přidal hydrazinhydrát (0,8 g, 16,86 mmol). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě odtoku po dobu 3 hodin. Pak se ochladila a ředila vodou (200 ml) . Nerozpustná hmota se odfiltrovala, promyla se vodou a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 16 hodin, přičemž vzniklo 1,4 g (69 %) 2-(hydrazinooxalyl-amino)benzoové kyseliny, jako ve formě pevné látky.

K roztoku shora popsané kyseliny 2-(hydrazinooxalylamino) benzoové (1,0 g, 4,15 mmol) v methanolu (20 ml) ochlazeném na teplotu 0 °C se přidal hydroxid draselný (0,5 g, 8,72 mmol) a karbondisulfid (0,7 g, 9,54 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě výtoku po dobu 6 hodin. Do chlazené reakce se přidala voda (100 ml) a směs se okyselila 1 N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH = 1. Nerozpustná hmota • · · ·· · · ···· i & ··· · · · · · · · lit' · · ·· · « e < φ e • · ······· *♦·· ··· ··· ·· ·· ·· se odfiltrovala, promyla se vodou a heptanem a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C. Suchý produkt (0,65 g) se čistil na silikagelu (400 ml) chromatografií za použití 5 % kyseliny octové v ethylacetátu, který se použil jako eluent. Shromáždily se čisté frakce vakuu při teplotě 50 °C po dobu 16 hodin, přičemž vzniklo 0,4 g (36 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě pevné látky.

M.p. : 236 oa237°C:

vypočteno pro C₁₀H7N₃O₄S

C 45,28 % H, 2,66 % N, 15,84 % zj ištěno:

C 45,48%, H 2,66 %, N 15,36 %.

Příklad 33:

Y^hh í ár/°^H (50 ml při teplotě 0 ethyloxalylchlorid (0,5 g,

g (46	%) 3-
formě	pevné
1,7	mmol)

3-(oxalyl-amino)-isonikotinová kyselina

K míchanému roztoku kyseliny 3-amino-isonikotinové (0,5 g, 3,62 mmol) a triethylaminu (1 ml) v suchém tetrahydrofuranu °C se po kapkách přidával 3,69 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě výtoku po dobu 3 hodin, filtrovala se a těkavé látky se odpařily ve vakuu. Ke zbytku se přidala voda (50 ml) a výsledná směs se extrahovala diethyletherem (2 x 50 ml) . Organická fáze se promyla satutovaným vodným roztokem chloridu sodného (50 ml), sušila se (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu a získalo se 0,4 g (46 (ethoxyoxalyl-amino)-isonikotinové kyseliny ve formě látky.

K roztoku shora popsané isonikotinové (0,4 g, v ethanolu (25 ml) se přidal roztok hydroxidu sodného (141 mg, 3,53 mmol) ve vodě (10 ml). Výsledná reakční směs se míchala

při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě (50 ml) a promyl se diethyletherem (50 ml). Směs se okyselila 1 N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH = 1. Nerozpustná hmota se odfiltrovala a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin. Suchý pevný zbytek se promyl vroucím acetonem (50 ml) po dobu 5 min. , separoval se filtrací a sušil se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 80 mg (22 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě pevné látky.

M.p.: je větší než 250°C:

vypočteno pro C₈H₆N₂O₅

C 45,72 % H, 2,88 % N, 13,33 % z j ištěno:

C 45,62%, H 2,98 %, N 13,04 %.

Příklad 34:

o.

5-(oxalyl-amino)-2,6-dioxo-l,2,3,6-tetrahydro-pyrimidin-4karboxylová kyselina

K roztoku kyseliny 5-aminoorotové (61,1 mg, 0,36 mmol) v tetrahydrofuranu (1 ml) . se přidal tert-butylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (140 mg, 0,71 mmol) a triethylaminu (50 μΐ, 0,36 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 20 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (5 ml) a promyl se 1 % kyselinou chlorovodíkovou (2x2 ml) a pak vodou (2 x 2 ml) . Organická fáze se sušila (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se čistil preparativní TLC (Kieselgel 60F₂₅₄, 0,5 mm, hexan : ethylacetát, 80 : 20), přičemž vzniklo 30 mg (28 %) 5-(terC-butoxyoxalyl-amino)-2,6·· ···· · • · · ·· ·

·· ·· ·· • · · · · • · · · · • · * · · · • · · · · • · · · · · dioxo-l,2,3,6-tetrahydro-pyrinidin-4-karboxylové kyseliny jako pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,80 (s, 9H) , 7,56 (s, 2H) , 8,96 (s, 1H) .

5- (terč-butoxyoxalyl-amino) -2, 6-dioxo-l, 2,3, 6-tetrahydropyrimidin-4-karboxylová kyselina (28 mg, 0,094 mmol) se míchala ve 20 % kyselině triflorooctové v dichlormethanu (1,0 ml) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Reakční směs se odpařila ve vakuu s toluenem do dasažení úplné suchosti, přičemž vzniká 22,6 mg (100 %) 5-(oxalyl-amino)-2,6-dioxo1,2,3,6-tetrahydro-pyrimidin-4-karboxylové kyseliny, jako pevné látky.

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,30 (s, 2H) .

Příklad 35:

N O w

O OH h

N

3-(oxalyl-amino)-pyrazin-2-karboxylová kyselina

K roztoku 3-amino)pyrazin-2-karboxylové kyseliny (64,2 mg, 0,46 mmol) v tetrahydofuranu (1 ml) se přidal tert-butylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (181 mg, 0,92 mmol) a triethylamin (64,3 μΐ, 0,46 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 20 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (5 ml) a promyl se 1 % kyselinou chlorovodíkovou (2x2 ml) a pak vodou (2x2 ml). Organická fáze se sušila (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se promyl diethyletherem ( x 10 ml), přičemž vzniklo 48 mg (39 %) 3(terC-butoxyoxalyl-amino)-pyrazin-2-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

• » · ·

• · * ·« • · * · ·· ^LH NMR ( CDC1₃ + CD3OD) δ 1,70 (s, 9Ή) , 8,02 (d,

8,36 (d, 1H, J = 1,5 Hz).

3-(terC-butoxyoxalyl-amino)-pyrazin-2-karboxylová

1,5 Hz) , kyselina (31,7 mg, 0,12 mmol) se míchala ve 20 % kyselině triflorooctové v dichlormethanu (1,0 ml) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se odpařil s toluenem ve vakuu, přičemž vzniká 25 mg (100 %) 3(oxalyl-amino)-pyrazin-2-karboxylové kyseliny.

^XH NMR (400 MHz, CD₃C1) δ 7,80 (d, 1H, J = 1,5 Hz), 8,15 (d,

1H, J = 1,5 Hz), 8,62 (s, 1H).

Příklad 36:

o

o

O OH

2-(oxalyl-amino)-nikotinová kyselina

K roztoku 3-aminonikotinové kyseliny (61,4 mg, 0,45 mmol) v tetrahydofuranu (1 ml) se přidal terC-butylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (174,2 mg, 0,89 mmol) a triethylamin (62 μΐ, 0,45 mmol) . Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (5 ml) a promyl se 1 % kyselinou chlorovodíkovou (2 x 2 ml) a pak vodou (2 x 2 ml) . Organická fáze se sušila (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek (125 mg) se čistil preparativní TLC (Kieselgel 60F₂₅₄, 1 mm, CH₂Cl₂/MeOH, 80 : 20), přičemž vzniklo 7,9 mg (7 %) 2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-nikotinové kyseliny ve formě pevné látky.

^TH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1,80 (s, 9H) , 7,40(m, 1H) , 8,50 8,70 (m, 2H).

• 9 »4

4 4 4

4 4 4

2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-nikotinová kyselina (7,1 mg, 0,03 mmol) se míchala ve 20 % kyselině triflorooctové v dichlormethanu (0,5 ml) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se odpařil s toluenem ve vakuu, přičemž vzniká 5,6 mg (100 %) 2-(oxalylamino) -nikotinové kyseliny.

^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,40 (m, 1H), 8,50 - 8,70 (m, 2H).

Příklad 37:

Cl

litná sůl kyseliny 6-chloro-5-isopropylamino-3-(oxalyl-amino)pyrazin-2-karboxylové

K roztoku kyseliny 3-amino-6-chloro-5-isopropylamino-pyrázin2- karboxylové (65,4 mg, 0,27 mmol) v tetrahydofuranu (1 ml) se přidal tert-butylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (104,8 mg, 0,54 mmol) a triethylamin (37,4 μΐ, 0,27 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 20 hodin pak následovalo zahřátí na teplotu 50 °C po dobu 1,5 hodiny. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (5 ml) a promyi se 1 % kyselinou chlorovodíkovou (2x2 ml) a pak vodou (2x2 ml) . Organická fáze se sušila (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu, přičemž vzniklo 97 mg (97 %) 3-(ter£butoxyoxalyl-amino)-6-chloro-5-isopropylamino-pyrazin-2karboxylové kyseliny ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CD₃C1) δ 1,50 (d, 6H) , 1,80 (s, 9H) , 4,10 (s, 3H), 4,40 (m, 1H).

3- (tert-butoxyoxalyl-amino)-6-chloro-5-isopropylamino-pyrazin2-karboxylová kyselina (30 mg, 0,1 mmol) se rozpustila

124

v tetrahydrofuranu (1 ml) a při teplotě místnosti se přidal 1 N hydroxid litný (1 ml, 1 mmol) . Reakční směs se míchala po dobu 3 dní při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil ethylacetátu (20 ml) a promyl se vodou (4 x 30 ml). Organická fáze se sušila (Na₂SO₄) , filtrovala, rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu, přičemž se získalo 21 mg (82 %) litné sole kyseliny 6-chloro-5-isopropylamino-3- (oxalyl-amino) -pyrazin-2-karboxylové jako pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1,42 (d, 6H) , 4,50 (m 1H) .

MS m/z: 228 (M-74) .

Příklad 38:

Cl

Vo-Lf //°

N W o O Li litná sůl kyseliny 5,6-dichloro-3-(oxalyl-amino)-pyrazin-2karboxylové

K roztoku kyseliny 3-amino-5,6-dichloro-pyrazin-2-karboxylové (57 mg, 0,26 mmol) v tetrahydofuranu (0,5 ml) se přidal tertbutylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (100,6 mg, 0,513 mmol) a triethylamin (35,8 μΐ, 0,26 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 20 hodin pak následovalo zahřátí na teplotu 40 °C po dobu 4 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (5 ml) a promyl se 1 % kyselinou chlorovodíkovou (2x2 ml) a pak vodou (2x2 ml) . Organická fáze se sušila (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytkový olej se čistil preparativní TLC (Kieselgel 60F₂₅₄, 1 mm, hexan : ethylacetát, 1:1), přičemž vzniklo 23,6 mg (26 %) 3-(tert-butoxyoxalyl125 •amino)-5,6-dichloro-pyrazin-2-karboxylové kyseliny ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CD₃C1) δ 1,58 (s, 9H) , 1,80 (s, 9H) , 3,90 (s, 3H) .

K roztoku 3-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5,6-dichloro-pyrazin-2karboxylové kyseliny (23 mg, 0,07 mmol) v tetrahydrofuranu (0,5 ml) a přidal se 1 N hydroxid litný (0,5 ml). Reakční směs se míchala po dobu 3 dní. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (20 ml) a promyl se vodou (4 x 30 ml) . Organická fáze se sušila (Na₂SO₄) , filtrovala, rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu, přičemž se získalo 14 mg (80 %) litné sole kyseliny 5,6-dichloro-3-(oxalyl-amino)pyrazin-2-karboxylové jako pevné látky.

MS m/z: 290,3 (M-74).

Příklad 39:

2-methyl-4-(oxalyl-amino)-lH-pyrrol-3-karboxylová kyselina K míchanému roztoku terC-butylesteru kyseliny 4-(methoxyoxalyl-amino)-2-methyl-lH-pyrrol-3-karboxylové (2,0 g, 7,09 mmol) v dichlormethanu (20 ml) se přidala kyselina trifluorooctová (10 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a vzniklo 1,6 mg (100 %) 4-(methoxyoxalyl-amino)-2methyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny jako pevné látky.

K roztoku shora popsané pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1,2 g, 5,31 mmol) v ethanolu (100 ml) se přidal roztok hydroxidu sodného (0,47 g, 11,7 mmol) ve vodě (50 ml). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé

126

•	•	··	··		• ·
	• · ·	•	•	*	• ·
	• ·	•	•	•	• ·
•	• ·	•	·'	•	• ·
	• · ·	• ·	• ·		• ·

látky se odpařily ve vakuu zbytek se rozpustil ve vodě (100 vodné fázi se přidala koncentrovaná kyselina chlorovodíková, přičemž se dosáhlo hodnoty pH 1. Suspenze se dichlormethanem (50 ml) a a sušila se ve vakuu při Pevná látka se rozpustila promyla ethylacetátem (50 ml) a sraženina se separovala filtrací teplotě 50 °C po dobu 2 hodin, v isopropanolu (100 ml), filtrovala se a odpařila se ve vakuu, přičemž se získalo 0,4 g (36 %) kyseliny 2-methyl-4-(oxalyl-amino)-lH-pyrrol-3-karboxylové. vypočteno pro CsHg^Os 0,1 x H₂O C 44,91 % H, 3,86 % N, 12,98% zjištěno:

C 45,06%, H 3,89 %, N 12,72 %.

Příklad 40:

H M

O OH kyselina l-benzyl-3-(oxalyl-amino)-lH-pyrazol-4-karboxylová K míchanému roztoku ethylesteru kyseliny 3-amino-lH-pyrazol-4-karboxylová (5,0 g, 0,032 mmol) v triethylaminu (9 ml) v suchém tetrahydrofuranu (150 ml) při teplotě 0 °C se přidal po kapkách ethyloxalylchlorid (5,3 g, 0,039 mol). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Pak se přidala další část ethyloxalylchloridu (5,3 g, 0,039 mol) a reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil ve směsi voda (200 ml) a ethylacetát (200 ml) . Nerozpuštěná hmota se odstranila filtrací a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin. Vzniklo 4,0 g (49 %) ethylesteru 3-(ethoxyoxalyl-amino)-lH-pyrazol-4-karboxylové • φ φ · φ <

127 kyseliny jako pevné látky. Organická fáze se separovala, promyla se saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (100 ml) , sušila se (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu a získalo se 3,7 g (45 %) ethylesteru 3(ethoxyoxalyl-amino)-lH-pyrazol-4-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky. Celkový výtěžek byl 7,7 g (94 %).

K roztoku shora popsané pyrazol-4-karboxylové kyseliny (3,7 g, 0,015 mmol) v suchém N,N-dimethylformamidu (75 ml) se přidal roztok hydroxidu sodného (0,64 g, 0,016 mmol, 60 % v minerálním oleji). Výsledná rekční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 0,5 hodin. K reakční směsi se přidal benzylbromid (2,7 g, 0,016 mol) a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Přidala se voda (100 ml). Reakční směs se extrahovala diethyletherem (2 x 100 ml) . Kombinované organické extrakty se promyly vodou (100 ml) saturovaným roztokem chloridu sodného (2 x 50 ml), sušily se (MgSO₄) , filtrovaly se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek (3,8 g) se čistil na silikagelu (800 ml) za použití směsi ethylacetátu/heptanu (1:1) jako eluentu. Shromáždily se čisté frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 0,9 g (18 %) ethylesteru kyseliny l-benzoyl-3-(ethoxyoxalyl-amino)-1Hpyrazol-4-karboxylové.

Shromáždily se nečisté frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek (l,0g ) se krystalizoval z diethyletheru (30 ml) , separoval se filtrací a sušil se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 2 hodin za vzniku 0,9 g (18 %) ethylesteru kyseliny l-benzoyl-3-(ethoxyoxalyl-amino)-lH-pyrazol-4-karboxylové jako pevné látky. Celkový výtěžek je 1,8 g (36 %).

K roztoku popsaném shora v textu ethylesteru kyseliny 1Hpyrazol-4-karboxylové (0,9 g, 2,61 mmol) v ethanolu (50 ml) se přidal roztok hydroxidu sodného (0,26 g, 6,51 mmol) ve vodě (25 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 60 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě (100 ml) . K vodné fázi se • ·

128 • » · · · * · • · · · * · přidala koncentrovaná kyselina chlorovodíková, přičemž hodnota pH byla 1. Sráženina se separovala filtrací a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin. Získalo se 0,55 g (73 %) kyseliny l-benzyl-3-(oxalyl-amino)-lH-pyrazol-4karboxylové ve formě pevné látky.

M. p. 189 - 191 °C:

vypočteno pro C13HUN3O5 1,7 5 x H₂O

C 48,68 % H, 4,56 % N, 13,10 % zjištěno:

C 48,81%, H 4,17 %, N 12,84 %.

Příklad 41:

4-cyklohexyl-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina K roztoku 4-cyklohexyl-2-(ethoxyoxalyl-amino)-thiofen-3karboxylová kyselina (60 mg, 0,18 mmol) v ethanolu (10 ml) se přidal rozotok 1 N hydroxidu sodného (0,5 ml) ve vodě (5 ml). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. K reakční směsi se přidala koncentrovaná kyselina chlorovodíková a hodnota pH byla 1. Sraženina se odstarnila filtrací a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin. Vzniklo 30 mg (55 %) 4-cyklohexyl-2-(oxalyl-amino)thiofen-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

M. p. větší než 250 °C:

vypočteno pro C13H15NO5S 1,5 x H₂O

C 48,14 % H, 5,59 % N, 4,32 % zj ištěno:

C 47,84%, H 9,92 %, N 4,21 %.

129

Příklad 42:

2-(oxalyl-amino)-4-fenyl-thiofen-3-karboxylová kyselina

K roztoku ethylesteru kyseliny 4-fenyl-2-(ethoxyoxalyl-amino)thiofen-3-karboxylové (2,2 g, 6,33 mmol) v ethanolu (50 ml) se přidal roztok hydroxidu sodného (630 mg, 15,83 mmol) ve vodě (25 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě

místnosti po dobu	18 hodin.	Těkavé látky	se
vakuu a zbytek	se	rozpustil	ve vodě (100	ml)
diethyletherem	(2	x 100 i	ml) . K vodní	fázi

se přidala koncentrovaná kyselina chlorovodíková a hodnota pH byla 1. Výsledná směs se extrahovala diethyletherem (2 x 100 ml). Kombinované organické fáze se promyly saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (100 ml), sušily se (MgSO₄) , filtrovaly se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 0,8 g směsi monomethylesteru a 2-(oxalyl-amino)-4-fenylthiofen-3-karboxylové kyseliny, což se zjistilo NMR. Směs se rozpustila v ve směsi ethanolu (40 ml), vody (20 ml) a hydroxidu sodného (400 mg) a výsledná směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé látky se odstranily ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě (50 ml) a promyl se diethyletherem (50 ml) . K vodné fázi se přidala koncentrovaná kyselina chlorovodíková a hodnota pH byla 1. Sraženina se odstarnila filtrací, promyla se diethyletherem a rozpustila se v 2-propanolu (25 ml). Nerozpuštěná hmota se odstranila filtrací a organická fáze se odpařila ve vakuu. Vzniklo 180 mg (10 %) 2-(oxalyl-amino)-4-fenyl-thiofen-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

M. p. 196 -198 °C:

4 · Β

130 vypočteno pro Ci3HgNO₅S 0,5 H₂O C 52 % H, 3,36 % N, 4,66% zjištěno:

C 52,21%, H 3,44 %, N 4,50 %.

Příklad 43:

0,0 mmol).

filtrovala rozpustil

5- (4 — fluoro-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina

Roztok methylesteru kyseliny 5-(4-fluoro-fenyl)-3aminothiofen-2-karboxylové (1,0 g, 4,0 mmol) a triethylaminu (11,1, 80 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (40 ml) se ochladil na ledu a po kapkách se přidával ethyloxalylchlorid (1,2 g, Po míchání po dobu 2 hodin se reakční směs a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se v dichlormethanu, promyl se 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou . Organická fáze se sušila (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se podrobil chromatografii za použití toluenu/ethylacetátu (19:1) jako eluentu za vzniku 1,19 g (85 %) ethylesteru kyseliny 5—(4 — fluorofenyl)-3-(ethoxyoxalylamino)-thiofen-2-karboxylové.

K roztoku ethylesteru kyseliny 5-(4-fluorofenyl)-3-(ethoxyoxalylamino)-thiofen-2-karboxylové (1,19 g, 3,4 mmol) v methanolu (150 ml) se přidal 2 N hydroxid sodný (20 ml) . Reakční směs se míchala při teplotě 60 °C po dobu 18 hodin. Těkavé látky se odstranily ve vakuu. Zbytek se rozpustil ve vodě a přidala se 1 N kyselina chlorovodíková (pH = 1) a

131

• · · · 9’9 9 9

Φ · · ·' · · produkt se extrahoval směsí dichloromethanu/2-propanolu. Organické fáze se sušily (MgSO₄) , filtrovaly a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Produkt se rekrystalizoval ve směsi methanol/voda za vzniku 619 mg (67 %) 5-(4-fluoro-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

vypočteno pro Ci3H₈FNO₅S 0,5 H₂O C 49,06% H, 2,83 % N, 4,40 % zj ištěno:

C 49,06%, H 2,72 %, N 4,31 %.

Podobným způsobem jako se popisuje v příkladu 43 se připravily následující sloučeniny.

Příklad 44:

HO

5-(4-isobutyl-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina vypočteno pro C17H17NO5S 0,33 x H₂O

C 57,79% H, 5,00 % N, 3,96 % zj ištěno:

C 57,79%, H 5,08 %, N 3,89%.

Příklad 45:

HO

Cl

φφ

132 .

Φ

φφφφ	φ	φφ	φφ	φφ
•	φφ φ	φ	φ φ	φ	φ
φφφ	φ φ	φ	φ φ	φ	φ
					•
φ	φ φ φφφ	φ φφ	φ φ φφ	φ φφ	φ

sodná sůl kyseliny 5-(4-chloro-fenyl)-3-(oxalyl-amino) -thiofen-2-karboxylové M. p. je větší než 250 °C vypočteno pro Ci3H₇CINO₅SNa 1 x H₂O C 42,63% H, 2,52 % N, 3,55 % zj ištěno:

C 42,69%, H 2,48 %, N 3,83%.

Příklad 46:

4-(oxalyl-amino)-[2,3]-bithiofenyl-5-karboxylové M. p. 220 ®^222 °C vypočteno pro C11H7NO5S2 C 44,44% H, 2,37 % N, 4,71 % zjištěno:

C 44,17%, H 2,43 %, N 4,54 %.

Příklad 47:

sodná sůl kyseliny 3-(oxalyl-amino)-5-fenyl-thiofen-2 -karboxylové

M. p. je větší než 250 °C vypočteno pro Ci3H₈NO₅SNa 1,6 x H₂O C 45,64% H, 3,30 % N, 4,09 % zj ištěno:

C 45,25%, H 2,93 %, N 3,92 %.

133 .

9' 9 9

9 9 9

Příklad 48:

ΗΠ

O'Na sodná sůl kyseliny 3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylové M. p. je větší než 250 °C vypočteno pro CvHvNOsSNa 1,5 x H₂O C 31,83% H, 2,67 % N, 5,30 % zj ištěno:

C 32,23%, H 3,14 %, N 5,15 %.

Příklad 49:

OH

O Na sodná sůl kyseliny 4-methyl-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2 karboxylové

M. p. 232 - 234 °C vypočteno pro CgHgNOsSNa 1,5 x H₂O

C 34,54 % H, 3,26 % N, 5,03 % zj ištěno:

C 34,58 %, H 3,30 %, N 4,81 %.

Příklad 50:

o

• > » *

kyselina 3-(oxalyl-amino)-5-(4-fenoxy-fenyl)-thiofen-2-karbo xylová

M. p. 230 °C vypočteno pro C19H13NO6S 1,25 x H₂O

C 56,22% H, 3,85 % N, 3,45 % zj ištěno:

C 56,00 %, H 3,57 %, N 3,39 %.

Příklad 51:

kyselina 5-(4-benzyloxy-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2 karboxylová

M. p. 210 °C vypočteno pro C₂oHi₅N0₆S

C 60,45 % H, 3,80 % N, 3,52 % zjištěno:

C 59,94 %, H 3,79 %, N 4,45 %.

Příklad 52:

kyselina 5-(4-(4-methoxy-fenoxy)-fenyl)-3-(oxalyl-amino) thiofen-2-karboxylová M. p. 215 °C vypočteno pro (A0H15NO7S, 1,5 H₂O

C 54,54 % H, 4,12 % N, 3,18 % zjištěno:

C 54,80 %, H 3,88 %, N 3,15 %.

4 4 iili 9 · 4 4 ···	• 44 94 9 4 • 4 4	94 9 V • 4	44 4 4 4 4
135»’	4	• 4 4	9 4	4 4
		4 4 4 9 9	94	44

Příklad 53:

o

kyselina

-karboxylová

M. p. 205 <**206

5-(4-hydroxy-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2°C vypočteno pro Ci₃H₉NO₆SNai 0,75 x H₂0 C 45,42 % H, 3,08 % N, 4,07 % zjištěno:

C 45,11 %, H 3,16 %, N 3,98 %.

Příklad 54

kyselina

-karboxylová Ke sloučenině

5-(3-nitro-fenyl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-23-nitrofenethylalkohol (102 mg, 0,61 mmol) v dichloromethanu (2,2 ml) při teplotě místnosti v atmosféřě dusíku se přidal roztok Dess-Martin peroxojodnanového 'činidla (285 mg, 0,67 mmol) v dichlormethanu (2,7 ml). Reakce se míchala při teplotě místnosti v atmosféře dusíku po dobu 45 minut, přičemž analýza tle (hexan/ethylacetát, 50/50) indikovala, že reakce je dokončena. Přidal se diethylether (5,0 ml) a pak roztok 10 % siřičitan sodný/saturovaný uhličitan sodný (1:1, 5,0 ml). Po desetiminutovém stání se emulze postupně měnila na jasný heterogenní roztok. Přidal se další dichlormethan a organická fáze se promyla vodou (5 ml), sušila se (MgSO₄) , filtrovala se, odpařila se ve vakuu. Vzniklo 100 mg (100 %) 3-nitrofenyl-acetylaldehydu, jako čistého oleje. Aldehyd se použil bez dalšího čištění v dalším kroku.

• ··* · # · ··'.··

136,· : · ·,, ,, ·· ,·

NMR (400 Mhz, CDC1₃) δ 3,90 (s, 2H) , 7,65 (s, 2H) , 7,65 (d,

2H), 8,20 (s, 1H), 8,25 (m, 1H), 9,90 (s, 1H).

Směs tert-butylkyanoacetatu (67 mg, 0,48 mmol), 3nitrofenylacetaldehydu (86 mg, 0,52 mmol), triethylamin (73 μΐ, 0,52 mmol) a elemantární síra (17 mg, 0,52 mmol) v N,Ndimethylformamidu (0,5 ml) se míchala při teplotě 60 °C po dobu 1,5 hodiny. Po ochlazení na teplotu místnosti se tmavý roztok naředil ethylacetátem a promyl se vodou (3 x 5 ml). Organická vrstva se sušila (MgSO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu, přičemž vznikl surový extrakt tert-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(3-nitro-fenyl)thiofen-3-karboxylové (191 mg) . Čištěním preparativní TLC (hexan/ethylacetát, 80/20) vzniklo 74 mg (49 %) tertbutylesteru kyseliny 2-amino-5-(3-nitro-fenyl)-thiofen-3•karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 Mhz, CDC1₃) δ 1,56 (s, 9H) , 6,05 (s, 2H) , 7,20 (s,

1H), 7,40 (t, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,90 (d, 1H), 8,25 (s, 1H). Roztok terfc-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(3-nitro-fenyl)•thiofen-3-karboxylové (66 mg, 0,21 mmol), tert-butylesteru imidazol-l-yl-oxooctové kyseliny (202 mg, 1,03 mmol) a triethylaminu (40,4 μΐ, 0,21 mmol) v tetrahydrofuranu (0,5 ml) se míchal při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu a promyl se vodou (3 x 5 ml) a solným roztokem (5 mil) . Organická vrstva se sušila (Na₂SO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu, přičemž vznikl surový extrakt. Čištěním preparativní TLC vzniklo 91 mg (98 %) tertbutylesteru kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5- (3nitrofenyl)-thiofen-3-karboxylové ^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,54 (s, 9H) , 1,62 (s, 9H) , 7,50 (s, 1H), 7,55 (t, 1H, J = 8,4 Hz), 7,68 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 8,16 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,45 (s, 1H).

Ms m/z: 447 (M-l).

137

Φ · φφφφ • φ φ • ··· ·· ·♦ ·· » · · ·· ι » · φ φ'.φ ϊ k · · · Φ · 1 » Φ · ·· 4

Φ· ΦΦ ··

Shora popsaný 3-nitrofenyl-thiofen (85 mg, 0,19 mmol) se rozpustil v 20 % roztoku kyseliny trifluorooctové v dichlormethanu (3,0 ml) a míchal se při teplotě místnosti po dobu 6 hodin. Roztok se odpařil ve vakuu s toluenem a získalo se 64 mg (100 %) kyseliny 5-(3-nitro-fenyl)-2-(oxalyl-amino)thiofen-2-karboxylové.

^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,71 (t, 1H, J= 8,25 Hz), 7,8 (s, 1H), 8,1 (d, 1H, J = 7,5 Hz), 8,2 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,86 (m, 1H) .

Ms m/z: 335 (M-l).

Následující příklady se připravily podobným způsobem jak se popisuje v příkladu 54.

Příklad 55:

kyselina 2- (oxalyl-amino)-5-(fenyl-methyl)thiofen-3-karboxylová.

M. p. 230 - 231 °C vypočteno pro C14H11NO5S

C 54,89 % H, 3,63 % N, 4,40% zjištěno:

C 54,94 %, H 3,63 %, N 4,43 %.

Příklad 56:

• ♦ ♦ • · ··	• ·· • · ·	99 99 9 ·ί· · « · · ·	. í·
138 .* · *	· · · ··· ··	• · 9 9 • · · ·

5-naftalen-2-yl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,42 - 7,49 (m, 2H), 7,66 (d, 1H, J = 4,5 Hz), 7,75 (m, 1H), 7,8 . 7,9 (m, 3H) , 8,04 (d, 1H, J = 7,5 Hz) .

Ms m/z: 340 (M-l).

Příklad 57:

2-(oxalyl-amino)-5-fenyl-thiofen-3-karboxylová kyselina M.p.: 238-240 °C ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,3 (t, 1H, J= 4,5 Hz), 7,38 (t, 1H,

J = 4,5 Hz), 7,54 (s, 1H), 7,61 (m, 3H). vypočteno pro C₁₃H₉NO5S 1 x H₂O

C 47,13 % H, 3,04 % N, 4,23 % zj ištěno:

C 47,34 %, H 3,53 %, N 4,20 %.

Příklad 58:

5-(2-fluoro-fenyl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,18 - 7,23 (m, 2H) , 7,63 -7,69 (m,

2H) .

MS m/z: 308 (M-l).

133:

«· Φ·Φ·

•	• ··				• ·
	• · ·	•	•	• ·	•
	• ·	•	•	·· ·	♦
					Φ
•	• ·	•	•	• i	•
	·»· ··			• ·	• ·

Příklad 59:

5-(3-chloro-fenyl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ⁴H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,28 (m, 1H) , 7,38 (m, 1H) , 7,52

7,61 (m, 3H).

MS m/z: 324 (M-l).

Příklad 60:

5-(2,4-dichloro-fenyl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ⁴Η NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,37 (m, 1H) , 7,39 (m, 1H) , 7,52

7,58 (m, 3H).

MS m/z: 358 (M-l).

5-(4-bromo-fenyl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,51 (s, 4H), 7,54 (s, 1H) .

MS m/z: 370 (M-l).

Příklad 62:

5-ethyl-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1,35 (t, 3H, J = 3, 75), 2, 95 (q, 2H) ,

7,05 (s, 1H).

MS m/z: 170,2 (M-73) (-COCOOH), 228,1 (M-l).

Příklad 63:

5-methyl-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 2,6 (s, 3H) , 7,05 (s, 1H) .

MS m/z: 228 (M-l).

141

9999 9 *· * 9 9 ·· 9 9

999 9 9 · • 9 9 9 9 9 · 9 9 9

9·99 999 999 99

9 9

9 9

9 9

9 ·

Příklad 64:

5- (3-methyl-fenyl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 2,39 (s, 3H) , 7,12 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,25 (t, 1H, J= 7,5 Hz), 7,4 (m, 2H), 7,5 (s, 1H).

MS nt/z: 304,232 (M-l).

Příklad 65:

5-dibenzofuran-2-yl-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 7,4 (t, 1H, J = 2 Hz), 7,52 (t, 1H, J= 2 Hz), 7,7 (m, 3H), 7,9 (t, 1H, J = 2 Hz), 8,25 (d, 1H, J = 2 Hz), 8,5 (s, 1H).

MS m/z: 380,5 (M-l).

Příklad 66:

142 sodná sůl kyseliny 5-(2-(4-chlorofenyl)-ethyl)-2-(oxalyl amino)-thiofen-3-karboxylové

M. p. je větší než 250 °C vypočteno pro CisHnNiCliOsSiNai 0,7 5 x H₂O

C 46,28% H, 3,24 % N, 3,60 % zj ištěno:

C 46,17%, H 3,38 %, N 3,40%.

Příklad 67:

2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina

M. p. 225 228 °C vypočteno pro C7H5N1O5S1 1,25 x H₂O

C 35,37% H, 3,18 % N, 5,89 % zjištěno:

C 35,53%, H 2,82 %, N 5,72%.

Příklad 68:

5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-yl-methyl)-2-(oxalylamino) -thiofen-3-karboxylová kyselina

143 • · • ·

K směsi 2-(3-hydroxy-propyl)-isoindol-1,3-dionu (0,2 g, 0,97 mmol) 0,7 N bromidu sodného (0,70 ml, 0,46 mmol), 2,2,6,6tetramethyl-l-piperidinyloxy, (volný radikál) TEMPO (3 mg, 0,02 mmol) v dichlormethanu (1 ml) míchané při teplotě 0 °C se přidal po kapkáchrozotok bělidla (2,1 ml, 4,9 mmol) a hydrogenuhličitan sodný (117 mg, 1,4 mmol). Směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 2 hodin. Směs se extrahovala ethylacetátem (3 x 20 ml) . Kombinované organické extrakty se promyly 10 % thiosulfátem sodným (3 x 10 ml, solným rozotokem (10 ml), sušily se (MgSO₄) , filtrovaly se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se promyl ethylacetátem (2 x 1 ml). Po vysušení se získalo 161 mg (81 %) 3-(1,3-dioxo-l,3dihydroxy-isoindol-2-yl)-propionaldehydu ve formě pevné látky. ^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 9,82 (s, 1H) , 7,85 (dd, 2H, J = 5, 6,

2,8 Hz), 7,73 (dd, 2H, J= 5,6, 2,8 Hz), 4,04 (t, 2H, J = 7,2

Hz) , 2,89 (t, 2H, J = 7,2 Hz) .

K roztoku shora popsaného aldehydu (150 mg, 0,74 mmol), triethylaminu (113 ml, 0,81 mmol) a síry (24 mg, %,81 mmol) v dichlormethanu (10 ml) při teplotě místnosti se přidal tert-butyl kyanoacetát (114 mg, 0,81 mmol). Směs se míchala a zahřívala na teplotu výtoku v atmosféře dusíku po dobu 2 hodin. Po ochlazení na teplotu místnosti se sráženina filtrovala a vzniklo 189 mg tert-butylesteru kyseliny 2-amino5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-thiofen-3karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

Filtrát se odpařil ve vakuu. Zbytek se pohltil do ethylacetátu (50 ml), promyl se 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou (2 x 10 • · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ml), solným Rozpouštědlo ethylacetátem

144 .· : · :

······· · · « ml), saturovaným uhličitanem odným (2 x 10 roztokem (10 ml), sušil se (MgSO₄) a filtroval se se odpařilo ve vakuu a zbytek se promyl studeným (2x1 ml) . Získalo se 52 mg tert-butylesteru kyseliny 2amino-5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylme- thyl)-thiofen3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky. Celkový výtěžek je 241 mg (91 %).

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 7,86 (dd, 2H, J = 7,2, 4 Hz), 7,72 (dd, 2H, J= 7,2, 4 Hz), 6,97 (s, 1H) , 5,83 (s, 2H, NH₂) , 4,78 (s, 2H), 1,56 (s, 9H).

K míchanému roztoku popsanému shora v textu thiofen (100 mg, 0,28 mmol) v tetrahydrofuranu (2 ml) se přidal roztok tertbutylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (60 mg, 0,31 mmol) v tetrahydrofuranu (1 ml). Reakce se míchala při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu a surová směs se extahovala do ethylacetátu (50 ml) . Organický extrakt se promyl 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou (2x 5 ml), saturovaným roztokem uhličitanu sodného (2x5 ml) , solným roztokem (5 ml), sušil se (MgSO₄) a filtroval se. Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku 130 mg (96 %) tert-butylester kyseliny 2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-5-(1,3-dioxo-l,3-dihydroisoindol-2 j-ylmethyl) -thiofen-3-karboxylové ve formě pevné látky.

XH NMR (400 MHz, CDC13) δ 12,23	(s, 1H), 7,87	(dd, 2H,	J = 7,2,
4 Hz), 7,73 (dd, 2H, J= 7,2,	4 Hz),	7,24	(s, 1H),	4,93 (s,
2H), 1,60 (s, 9H), 1,57 (s, 9H)	•
K roztoku kyseliny trifluoroctové (1	ml) v	dichlormethanu (1
ml) se přidal shora popsaný	tert-butylester (100	mg, 0,21

mmol). Roztok se míchal při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se promyl sichloromethanem (3x1 ml) a vzniklo 63 mg (82 %) 5-(1,3dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl-methyl)-2-(oxalyl-amino)thiofen-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

145

^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,05 (s, 1H) , 7,89 (m, 2H) , 7,87 (m, 2H), 7,10 (s, 1H), 4,83 (s, 2H).

MSm/z : 373 (M-l) .

Podobným způsobem, jak se popisuje v příkladu 43 se připravují následující sloučeniny.

Příklad 69:

5-(3,4-dimethoxy-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina

M. p. 230 0^231 °C vypočteno pro Ci₅H₁₃NiC>7Si 1 x H₂O

C 48,78% H, 4,09 % N, 3,79 % zjištěno:

C 49,01 %, Η 3,75 %, N 3,79 %.

Příklad 10:

5-(3-methoxy-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina

M. p. 217 - 218 °C

146 • · ·· vypočteno pro C^HnNiOgSi 0,75 x H₂O C 50,22 % H, 3,76 % N, 4,18 % zjištěno:

C 50,02 %, H 3,73 %, N 4,16 %.

Příklad 71:

5-(3,5-dimethoxy-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina

M. p. 223 o®/ 225 °C vypočteno pro C15H13N1O7S1 1,25 x H₂O

C 48,19% H, 4,18 % N, 3,75 % zjištěno:

C 48,25 %, H 4,10 %, N 3,39 %.

Příklad 72:

5-(3-nitro-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina

M. p. větší než 250 °C vypočteno pro C13H7N1O7S1 1,25 x H₂O

C 41,01 % H, 2,51 % N, 7,36 % zj ištěno:

C 41,03 %, H 2,38 %, N 7,17 %.

147

Příklad 73:

5-(3-amino-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina

M. p. více než 250 °C vypočteno pro C13H10N2O5S1 0,5 x H₂O

C 49, 52% H, 3,52 % N, 8,88 % zjištěno:

C 49,48 %, H 3,44 %, N 8,71 %.

Příklad 74:

5-(4-methoxy-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina

M. p. 220 ot 221 °C vypočteno pro Ci^HnNiOgSi 0,4 x H₂O

C 51,19% H, 3,62 % N, 4,62 % zj ištěno:

C 51,29 %, H 3,53 %, N 3,96 %.

Příklad 75:

148 • · · · · · • · · • · ·· • ·

·· ·· • * 4 • · • · • ·

5-(4-amino-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylová kyselina

M. p. 223 - 225 °C vypočteno pro C13H10N2O5S1 0,5 x H₂0

C 49,52 % H, 3,52 % N, 8,88 % zjištěno:

C 49,40 %, H 3,87 %, N 8,23 %.

Příklad 76:

dvoj sodná ethoxy)-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylové kyseliny K roztoku methylesteru 3-(ethoxyoxalylamino)-5-(4hydroxyfenyl)thiofen-2 karboxylová kyseliny (524 mg, 1,5 mmol) a uhličitanu draselného (275 mg, 2,0 mmol) v N,Ndimethylformamidu (35 ml) se přidal v atmosféře dusíku ω-brom2-methoxyacetofenon (460 mg, 2 mmol). Po míchání po dobu 3 hodin se srážel surový methylester 3-(ethoxyoxalylamino)-5-(4-(2- (2-methoxyfenyl) -2-oxy-ethoxy) fenyl) -thiofen-2-karboxylové kyseliny a separoval se filtrací.

K roztoku surového methylesteru 3-(ethoxyoxalylamino)-5-(4-(2•(2-methoxyfenyl) -2-oxy-ethoxy) fenyl) -thiofen-2-karboxylové kyseliny (0,5 g) v methanolu (15 ml) se přidal 1 N (hydroxid * · · φ · · • · · · · » * · · · · · · • · · · * · • ·· ·· ·· po dobu 3 hodin vody a ethanolu »· ···« • · φ • · ··

149 .· : · • ·« · Φ·· draselný (10 ml). Po míchání při teplotě 65 °C se produkt izoloval filtrací a promyl se směsí (1:1), přičemž se získalo 290 mg dvojsodné sole kyseliny 5—(4 — - (2-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-ethoxy)-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

M. p. 286 - 287 °C vypočteno pro C22Hi8NiO9SiNa₂ C 50,19 % H, 3,42 % N, 2,66 % zjištěno:

C 51,18 %, H 3,42 %, N 2,58 %.

Příklad 77:

o

trojsodná sůl kyseliny 5-(4-karboxymethoxy-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylové kyseliny

K roztoku methylester 3-(ethoxyoxalylamino)-5-(4-hydroxyfenyl)thiofen-2 karboxylové kyseliny (307 mg, 1,0 mmol) a uhličitanu draselného (166 mg, 1,2 mmol) v N,N-dimethylformamidu (5 ml) se přidal v atmosféře dusíku 2-bromoacetamid (165 mg, 1,2 mmol). Po míchání při teplotě 50 °C po dobu 16 hodin reakce rychle ochladila přidáním vody a srážel se surový methylester 5-(4-karbamoylmethoxyfenyl)-3-(ethoxyoxalylamino)-thiofen-2-karboxylové kyseliny (70 mg) a separoval se filtrací.

PH filtrátu se upravilo na hodnotu 1 až 2 1 N kyselinou chlorovodíkovou a semihydrolyzovaný produkt methylester 5—(4—

-karbamoylmethoxyfenyl)-3-(oxalylamino)-thiofen-2-karboxylové kyseliny (300 mg) se izoloval filtrací. K suspenzi

150 »4 *494 • 4 · • 449

49

4 4

4*9 9 4 4 9

4 9 • 49 «4 • 4 4 ·

4 4 4

4 4 ·

9 4 4

4 94 methylesteru 5-(4-karbamoylmethoxyfenyl)-3-(oxalylamino)thiofen-2-karboxylové kyseliny (295 mg, 0,78 mmol) v methanolu (5 ml) a vodě (5 ml) se přidal 1 N hydroxid sodný (2 ml) . Po míchání po dobu 5 dní se sraženina filtrovala a získalo se 105 mg (88 %) trojsodné sole kyseliny 5-(4-karboxymethoxy-fenyl)3-(oxalyl-amino)-thiofen-2-karboxylové ve formě pevné látky.

M. p. větší než 300 °C vypočteno pro Ci₅Hi₂N₁OioSiNa₃

C 38,56 % H, 2,59 % N, 3,00 % zjištěno:

C 38,73 %, H 2,74 %, N 3,06 %.

Stejným způsobem, jak se popisuje v příkladu 77 se připravila následující sloučenina.

Příklad 78:

5-(4-(4-fluoro-benzyloxy)-fenyl)-3-(oxalyl-amino)-thiofen-2•karboxylová kyselina ^XH NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 5,15 (s, 2H) , 7,1 (d, 2H) , 7,25 (t, 2H), 7,55 (q, 2H), 7,7 (dd, 2H), 8,2 (s, 1H).

SP/MS: 415 (M+, 12%), 372, 353, 299, 218, 190, 162, 109 (100

Příklad 79:

o • · · ·

151

5-((2-(1,3-dioxo-l, 3-dihydro-isoindol-2-yl)-acetylamino)methyl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylová kyselina K roztoku terC-butylester kyseliny 2-(terC-butoxyoxalylamino) -5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-yl-methyl)-thiofen3-karboxylové (0,4 g, 0,82 mmol, připravil se způsobem jak se popisuje v příkladu 30) v dichloromethanu (2 ml) se přidal bezvodý hydrazin (28 ml, 0,9 mmol) a směs se míchala při teplotě okolí po dobu 19 hodin v atmosféře dusíku. Pak se přidala další část hydrazinu (84 ml, 2,7 mmol) a dichlormethan (5,5 ml) a míchání pokračovalo dalších 88 hodin. Přidal se dichlormethan (50 ml) a reakční směs se umístila do sonikatoru po dobu 20 minut a filtrovala se přes celit. Filtrát se odpařil při vakuu a získalo se 0,24 g (82 %) terC-butylester kyseliny 5-aminomethyl-2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-thiofen-3karboxylové ve formě pevné látky, která se čistila v dalším kroku.

K roztoku kyseliny (1,3-dioxo-l, 3-dihydro-isoindol-2-yl)octové (0,17 g, 0,82 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (0,133 g, 0,98 mmol) a 2,6- lutidinu (0,4 ml) v suchém acetonitrilu (10 ml) v atmosféře dusíku chlazeném na ledu se přidal l-(3dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidhydrochlorid (0,21 g, 1,1 mmol) a rozotok se míchal po dobu 30 minut. Přidal se terC-butylester kyseliny 5-aminomethyl-2-(terC-butoxyoxalylamino) -thiofen-3-karboxylové (0,24 g, 0,68 mmol), odstranila se chladící lázeň a roztok se míchal při teplotě okolí po dobu 20 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil v dichlormethanu a promyl se saturovaným vodným roztokem uhličitanu sodného a IN kyselinou chlorovodíkovou, sušil se (Na₂SO₄) a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek (0,18 g) se rozpustil v suchém tetrahydrofuranu (6 ml) v atmosféře dusíku, a přidal se terC-butylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (0,25 g, 1,3 mmol) a roztok se míchal při teplotě okolí po dobu 17 hodin. Rozpouštědlo se odpařilo a zbytek se rozpustil ve směsi dichloromethan a v saturovaném • · · ·

152 vodném roztoku uhličitanu sodného. Organická vrstva se sušila (Na₂SO₄) a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se podrobil chromatografii na silikagelu a získalo se 0,1 g terC-butylester kyseliny 2-(terfi-butoxyoxalyl-amino)-5-((2-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-acetylamino)-methyl)-thiofen-3-karboxylové.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,3 (bs, 1H) , 7,9 (m, 2H) , 7,8 (m,

2H), 7,1 (s, 1H), 6,5 (m, 1H) , 4,6 (m, 2H) , 4,4 (s, 2H) , 1,8 (s, 9H), 1,6 (s, 9H).

K terč-butylester kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-((2-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-yl)-acetylamino)-methyl)-thiofen-3-karboxylové (0,1 g, 0,8 mmol) se přidala 20 % kyselina trifluorooctová v dichloromethanu (4 ml) a reakční směs se míchala při teplotě okolí v atmosféře dusíku po dobu 14 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se ciseloval s dichloromethanem až se vytvořila pevná látka. Sráženina se separovala filtrací a sušila ve vakuu po dobu 18 hodin a získalo se v podstatném množství výtěžek 5—((2-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-acetylamino)-methyl)-2-(oxalyl-amino)-thiofen-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

M. p. 243 ^244 °C ^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,1 (s, 1H) , 8,9 (s, 1H) , 7,8 7,9 (m, 4H), 7,1 (s, 1H), 4,4 (m, 2H) , 4,2 (s, 2H) .

153

Příklad 80:

Za použití chemie pevné fáze se syntetizovalo 64 členů rod/iny knihovny podle následujícího schématu:

OH

TEMPO

90%

Λ

HCI

THF i—CHO ^S» ⁰ TEA/OCM

Wang-prys kyřice

Cs.CO,, NMP _ Wang O ' •y^o

-OM

Wang

HjNNHj

CHjCIj

HjN

R1-NCO	TFA
		CHjCI,
	R2-O-C0-CI	TFA
	2,6-lutidin	CHjCIj
	R3-SO,-Cl	TFA
	TEA	CHjCI2
	R4-SO7-NCO	TFA

CHjCI,

Xi označuje bod připojení R-skupiny procento znamená oblast píku HPLC při vlnové délce 220nm.

• · · ·

154

R-skupina	vzorec	mol.hm.	LC/MS
0 “/Ν''“. X H	C13H15N3O8S	373.34	není zásah
1 0 H	C13H17N3O6S	343.36	není zásah
0 H	C11H13N3O6S	315.31	není zásah
Q-A. NOj H	C15H12N4O8S	408.35	407 (M-H,44%)
H	C16H15N3O7S	393.38	není zásah
γΟ-Α, o H	C17H15N3O7S	405.39	ηθηί zásah
0	C12H15N3O6S	329.33	není zásah
bXVx, H	C15H12BrN3O6S	442.25	442 (M-H, 50%)
ί^ίιθ L JI JI YYx, l H	C21H25N3O6S	447.51	446 (M-H,92%)

·· ·· > · · « ► · · '( » · >

155

Αλ Η	C15H12N4O8S	408.35	407 (M-H.48%)
f^il 0 Α Λ Jl rir N xt U1 H	C19H15N3O6S	413.41	412 (M-H.49%)
ř^ii ° Wx, 1 H i^íl	C21H17N3O6S	439.45	438 (M-H,81%)
Λ c^A H	C17H11F6N3O6S	499.35	498 (M-H,83%)
Qá CF, H	C16H12F3N3O6S	431.35	není zásah
H	C16H12F3N3O6S	431.35	430 (M-H.48%)
1 0 Aa,	C12H15N3O6S	329.33	328 (M-H.94%)
°A	C15H19N3O6S	369.40	368 (M-H,85%)
QA, /0 H	C16H15N3O7S	393.38	není zásah
crA	C16H15N3O6S	377.38	376 (M-H,86%)

» ···· φ · • · ··

156

\ν, /0 Η	C17H17N3O8S	423.40	422 (Μ-Η,39%)
JAA Η	C19H23N3O6S	421.48	420 (Μ-Η,29%)·
QA Η	C15H13N3O6S	363.35	362 (Μ-Η,26%)
„AU 2 Η	C15H12N4O8S	408.35	407 (Μ-Η,44%)
αΧα Η	C18H19N3O9S	453.43	452 (Μ-Η, 34%)
ΓΧ ° ? AAS Α '' Ν^Χ, 0 Η 1	C15H13N3O8S2	427.41	426 (Μ-Η,62%)
	C16H15N3O8S2	441.44	440 (Μ-Η,89%)
“Ό-,? i '' 'Ν' X, 0 Η 1	C15H12CIN3O8S2	461.86	460 (Μ-Η,41%)
ΒΓΠ °° 0 Η 1	C15H11BrN2O7S	443.23	442 (Μ-Η,71%)
ΡΥΎ ° ° AAS Α '< Ν^Χ, 0 η 1	C15H11FN2O7S	382.33	381 (Μ-Η.82%)

157

0 >^οΑχ,	C14H18N2O7S	358.37	357 (M-H,70%)
no2	C15H11N3O9S	409.33	408 (M-H,87%)
ΎΠ 0 ° O H 1	C16H15N3O8S2	441.44	No Hit
0	C17H24N2O7S	400.45	399 (M-H,68%)
q-Λ,	C16H14N2O7S	378.36	377 (M-H,63%)
0 —oAx,	C12H14N2O7S	330.32	329 (M-H,54%)
I 0 AAx,	C12H14N2O7S	330.32	329 (M-H,76%)
VOAX,	C15H11N3O9S	409.33	408 (M-H,82%)
O (P^cAx, 02nFA	C16H13N3O9S	423.36	422 (M-H,63%)
	C16H14N2O8S	394.36	393 (M-H,78%)
	C17H24N2O7S	400.45	399 (M-H,78%)
0 ^OAX,	C12H10N2O7S	326.29	325 (M-H,92%)

158

0 -οΛχ,	C11H12N2O7S	316.29	315 (Μ-Η,70%)
0 Ύ^οΛχ,	C13H16N2O7S	344.35	343 (Μ-Η.86%)
0 —οΛχ,	C12H12N2O7S	328.30	327 (Μ-Η.73%)
ο Α	C13H14N2O7S	342.33	341 (Μ-Η,74%)
.-X θ Λ \\ 11 ΒΓ \ Λ π_Χι	C14H11BrN2O7S2	463.28	362 (Μ-Η,45%)
Λ	C10H10N207S	302.26	301 (Μ-Η,72%)
Ο-Λ,	C15H12N2O7S	364.34	363 (Μ-Η,82%)
Ρ_9 ο2ν ^-S-X, 0	C15H13N3O9S2	443.41	442 (Μ-Η,94%)
θ^θΆιΐ ο γ ΜΜ 1 0	C15H11F3N2O8S2	468.39	467 (Μ-Η,62%)
0	C14H11CIN2O7S2	418.83	417 (Μ-Η,31%)
\ 0 \-s-x, Γ δ	C11H14N2O7S2	350.37	349 (Μ-Η,89%)
ρΑ^|·χ'	C14H11FN2O7S2	402.38	401 (Μ-Η,34%)
ο II —S-X, II 1 ο	C9H10N2O7S2	322.32	321 (Μ-Η,50%)

ΒΒ

Β Β

Β ·

Β ♦ ·

Β Β

ΒΒ BBBB « Β

Β ···

159

,—. ο (Ζ y—S-X. \ / II 1 ο0	C18H14N2O7S2	434.45	433 (M-H,42%)
V /— s-x, II 1 0 .	C10H12N2O7S2	336.34	335 (M-H.46%)
,—0 ΡΓ’	C15H11F3N2O7S2	452.39	451 (M-H.82%)
ΛύλΛχ, η \=y π	C16H15N3O8S2	441.44	440 (M-H,42%)
—\ θ \ Π '-s-x, Η 1 0	C11H14N2O7S2	350.37	349 (M-H,57%)
	C18H20N2O7S2	440.50	439(M-H,42%)
NOj	C15H10F3N3O9S2	497.38	496 (M-H,68%)
CF, ° '-S-X, II ’ 0	C10H9F3N2O7S2	390.32	389 (M-H,92%)
0-Vs-x, II 1 o	C16H14N2O7S2	410.43	409 (M-H,46%)
ah	C14H12N2O7S2	384.39	383 (M-H,42%)

» ··· · · · * » » · « · · «······« • · 9 9 9 9··· ······· *·· ·· ·'» ··

160

Příklad 81

sodná sůl kyseliny 6-benzoyl-2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro-thion[2,3-c]pyridin-3-karboxylové .

Směs N-benzoyl-4-piperidon (20 g, 0,1 mol), ethylkyanoacetát (10,9 ml, 0,1 mol), acetát amonný (2 g) a kyselina octová (6 ml) v benzenu (100 ml) se zahřála na teplotu výtoku v reakční nádobě se třemi hrdly vybavenými jímačem vody podle DeanStarka po dobu 1 hodiny. Chlazená reakční směs se naředila ethylacetátem (100 ml) a promyla se vodou (3 x 100 ml), saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (80 ml), sušila se (MgSO₄) , filtrovala se a odpařila ve vakuu, přičemž vzniklo podstatné množství ethylesteru kyseliny (1-benzoyl-piperidin-4-yliden)-kyanooctové, ve formě pomalu krystalizujícího roztoku.

Směs shora v textu popsaného ethylesteru kyseliny benzoyl.piperidin-4-yliden (10 g, 0,034 mol), síry (1,13 g, 0,035 mol), morfolin (6,5 ml) v ethanolu (35 ml) se zahřála na teplotu 50 °C po dobu 2 hodin a míchala se při teplotě místnosti přes noc. Sraženina se separovala filtrací a promyla se 96 % ethanolem (3 x 50 ml) , diethyletherem a sušila se ve vakuu, přičemž vzniklo 9,27 g (84 %) ethylesteru kyseliny 2-amino-6-benzoyl-4,5,6, 7-tetrahydro-thion[2,3-c]pyridin-3karboxylové ve formě pevné látky.

K míchanému roztoku shora popsaného ethylesteru 4,5,6,7-tetrahydro-thion[2,3-c]pyridin-3-karboxylové (5 g, 0,015 mol), triethylaminu (4,21 ml, 0,03 mol) v suchém tetrahydrofuranu (30 ml) při teplotě 0 °C se přidával po kapkách roztok ethyloxalylchloridu (1,9 ml, 0,017 mol) v suchém tetrahydrofuranu (20 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při

161 • > 1» · » · 9 · 9

9 99 9 9

9

99 9 99 9

9

9' 9

9 9

9 9 9

9 9

9 teplotě místnosti po dobu 18 hodin, ponořila se do vody s ledem (300) ml) a extrahovala se ethylacetátem (3 x 100 ml) . Kombinované organické extrakty se promyly saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (100 ml) , sušily se (MgSO₄) , filtrovaly se a odpařily se ve vakuu. Vzniklo 4,2 g (84 %) ethylesteru 6-benzoyl-2-(ethoxyoxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro-thion[2,3-c]pyridin-3-karboxylové ve formě krystalizujícího oleje.

K roztoku shora popsaného ethylesteru kyseliny thieno[2,3c]pyridin-3-karboxylové (4,2 g, 9,76 mmol) v ethanolu (lOOml) se přidal roztok hydroxidu sodného (0,9 g, 21,46 mmol) ve vodě (100 ml). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě (100 ml) a promyl se ethylacetátem (2 x 100 ml) . K vodné fázi se přidala koncentrovaná kyselina chlorovodíková až do dosažení hodnoty pH = 1 a sraženina se separovala filtrací a promyla se vodou (2 x 50 ml) , diethyletherem (2 x 30 ml) a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 2,9 g (79 %) sodná sůl kyseliny 6-benzoyl-2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydrothion[2,3-c]pyridin-3-karboxylové ve formě pevné látky.

M. p. amorfní vypočteno pro Cr/Hia^OgSiNai 1 x H₂0

C 49,28 % H, 3,65 % N, 6,76 % zjištěno:

C 49,31 %, H 3,86 %, N 6,53 %.

Podobným způsobem, jak se popisuje v příkladu 81 se připravily následující sloučeniny.

Příklad 82:

162 »· ··♦· • · • · » · • · » ·

2- (oxalyl-amino) -4,5,6, 7-tetrahydro-benzo[b]thiofen-3karboxylová kyselina

M. p. 230 ^231 °C vypočteno pro C11H11NO5S

C 49,07 % H, 4,12 % N, 5,20 % zjištěno:

C 49,87 %, H 4,37 %, N 5,06 %.

Příklad 83:

6-benzyl-2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylové kyselina vypočteno pro C17H16N2O5S 1,75 H₂O

C 52,10 % H, 5,01 % N, 7,15 % zjištěno:

C 52,11 %, H 4,81 %, N 7,01 %.

Příklad 84:

6-methyl-2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylová kyselina

M.p. je větší než 250 °C vypočteno pro CiiHi₂N₂C>5S 0,6 H₂0 C 44,77 % H, 4,51 % N, 9,49 % zjištěno:

C 44,54 %, H 4,17 %, N 9,21 %.

163 • 44 4

4 • 4 44

4. '4. 4 4

4 4 4 4 4

4 · 4 4' 4 4

4 4 · · 4

4· 44 44

Příklad 85:

OH

-N O^- Na*

sodná sůl kyseliny 2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2, 3

c]pyran-3-karboxylová

M.p. větší než 250 °C vypočteno pro CioHgNiOgSNa 0,75 H₂O

C 39,16 % H, 3,12 % N, 4,57 % zj ištšno:

C 39,29 %, H 3,67 %, N 4,41 %.

Příklad 86:

2-(oxalyl-amino)-6-fenetyl-4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3c]pyridin-3-karboxylová kyselina vypočteno pro Ci8Hi8N₂O₅S 1 x H₂O C 55,09 % H, 5,14 % N, 7,14 % zj ištěno:

C 55,47 %, H 5,04 %, N 7,07 %.

Příklad 87

164

Φ · φ φ· φ φ φ φ φ ·- φ * φ φ · φ Φ'Φ ·

2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro-4,7-ethano-thieno[2,3b]pyridin-3-karboxylová kyselina vypočteno pro C12H12N2O5S 0,7 5 H2O C 46,52 % H, 4,39 % N, 9,04 % zj ištěno:

C 46,48 %, H 4,79 %, N 8,87 %.

Příklad 88:

Cl

Hydrochlorid kyseliny 2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro

-thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylové M.p. je větší než 250 °C vypočteno pro C₁₀HioN₂05S 0,5 x H₂O

C 38,35 % H, 4,34 % N, 8,64 % zjištěno:

C 38,04 %, H 3,83 %, N 8,87 %.

Příklad 89:

OH

O O

2-(oxalyl-amino)-6-pyridin-2-ylmethyl-4,5,6,7-tetrahydro~thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylová kyselina

K směsi sole kyseliny trifluoroctové ethylesteru kyseliny 2

-(ethoxyoxalyl-amino) -4,5, 6, 7-tetrahydro-thieno[2, 3-c]pyridin-3-karboxylové (1,5 g, 3,40 mmol), uhličitanu draselného (2,4 g

17,1 mmol), jodičnanu sodného (100 mg) v acetonu (40 ml) s přidal 2-pikolyl-chloridhydrochlorid (0,61 g, 3,7 mmol)

Φ φ φ φ ··

165

Výsledná směs se míchala při teplotě odtoku po dobu 18 hodin, filtrovala se a odpařila se ve vakuu. Zbytek se titroval diethyletherem a pevná látka se separovala filtrací a čistila se silikagelu (300 ml) za použití směsi ethylacetátu/ethanolu/triethylaminu (3:1:0:4) jako eluentu. Sebraly se čisté frakce a eluent se odpařil ve vakuu a získalo se 650 mg (39 %) triethylamonné soli kyseliny 2-(ethoxyoxalylamino) -6-pyridin-2-ylmethyl-4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylové ve formě pevné látky.

K roztoku shora popsané triethylamonné sole (650 mg, 1,40 mmol) v ethanolu (15 ml) se přidalo 1 N vodný roztok hydroxidu sodného (4,1 ml, 4,1 mmol), pak se přidala voda (15 ml). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě (20 ml) a promyl se diethyletherem(2 x 10 ml). K vodné fázi se přidala koncentrovaná kyselina chlorovodíková až do dosažení hodnoty pH = 1 a vodná fáze se odpařila ve vakuu. Zbytek se suspendoval ve směsi 2-propanolu (2 x 15 ml) a sušil se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 181 mg (38 %) surové 2-(oxalyl-amino)-6-pyridin-2•ylmethyl-4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylové kyseliny.

Surový produkt (181 mg) se rozpustil ve směsi vody (10 ml) a 5N roztoku hydroxidu sodného (10 ml) a promyl se diethyletherem (2 x 10 ml). Vodná fáze se okyselila na hodnotu pH = 3 1 N'kyselinou chlorovodíkovou a sraženina se odstranila filtrací a promyla se vodou (3 x 20 ml), sušila se vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin, přičemž vzniklo 51 mg (11 %) 2-(oxalyl-amino)-6-pyridin-2-ylmethyl-4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylové kyseliny v pevné formě.

K roztoku shora uvedené triethylamonné sole (650 mg, 1,40 mmol) v ethanolu (15 ml) se přidal la vodný hydroxid sodný (4,1 ml, 4,1 mmol) a pak voda (15 ml). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé

166 «φ φφφφ φ φ φ.

φ φφφ · φ φ φ φ φφ φφ· φφ φφ φ φ ·: ♦'· φ· · φ φ φ φ φ. φ· * φφ φφφ ·>· φ φ φ φ φ φφφ

Μ» ΦΦ ΦΦ *· látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě (20 ml) a promyl se diethyletherem (2 x 10 ml) . K vodné fázi se přidala la kyselin achlorovodíková, přičemž hodnota pH je 1 a vodná fáze se odpařila ve vakuu. Zbytek se suspendoval ve směsi 2-propanol/voda (1:1, 40 ml), míchal se po dobu 1 hodiny. sraženina se separovala filtrací a promyla se 2propanolem (2 x 15 ml) a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 181 mg (38 %) surové sloučeniny uvedené v názvu. Surový produkt (181 mg) se rozpustil ve směsi vody (10 ml) a 5 N hydroxidu sodného (10 ml) a promyl se diethyletherem (2 x 10 ml). Vodná fáze se okyselila na hodnotu pH 3 la kyselinou chlorovodíkovou a odstranila se filtraci a promyla se vodou (3 x 20 ml), sušila se vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin, přičemž se získalo 51 mg (11 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě pevné látky.

M.p. 238 <^244 °C vypočteno pro Ci6Hi₅N₃O₅S 2,5 x H₂0

C 47,29 % H, 4,96 % N, 10,34 % zj ištěno:

C 47,43 %, H 4,84 %, N 10,00 %.

Podobným postupem, jak se popisuje v příkladu 89, se připravují následující sloučeniny.

Příklad 90:

6-(3-methoxy-benzyl)-2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylová kyselina M.p. 233 237°C vypočteno pro Ci8Hi₈N₂O6S 1 x H₂O

167

C 52, 93 % Η, 4,94 % N, 6,86 % zjištěno:

C 52,79 %, H 4,99 %, N 6,42 %.

Příklad 91:

B · · · · ·

M · · ·- · ·· · · · . · · · · · · ·

I · · · ► · · · k · · · • · ··

Cl hydrochlorid kyseliny 2-(oxalyl-amino)-6-pyridin-3-ylmethyl 4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylové M.p. 234 «Ž238°C vypočteno pro C16H15N3O5S 1 x HCI, 0,5 x H₂O

C 47,24 % H, 4,21 % N, 10,33 % zj ištěno:

C 47,35 %, H 4,10 %, N 10,35 %.

Příklad 92:

2-(oxalyl-amino)-6-chinolin-2-ylmethyl-4,5,6, 7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylová kyselina M.p. větší než 250°C vypočteno pro C₂oHnN₃05S 1 x H₂O

C 55,95 % H, 4,22 % N, 9,61 % zjištěno:

C 55,94 %, H 4,46 %, N 9,78 %.

Příklad 93:

168

'4 · «

• 4 4

4

4 4 4 4 4 • 4

O

hydrochlorid kyseliny 2-(oxalyl-amino)-6-pyridin-4-ylmethyl'4,5, 6, 7-tetrahydro-thieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylové M.p. 230 ©3Ú235°C vypočteno pro C16H15N3O5S 1 x HC1, 1 x H₂O

C 46,21 % H, 4,36 % N, 10,10 % zjištěno:

C 45,82 %, H 4,42 %, N 10,02 %.

Příklad 94:

HO

O O Na sodná sůl kyseliny 6-(oxalyl-amino)-lH-indol-7-karboxylové K míchanému roztoku ethylesteru kyseliny 6-amino-lH-indol-7karboxylové (1,5 g, 7,3 mmol, připravilo se způsobem popsaným v publikaci J. Org. Chem. 61, 1155-1158 (1996)), triethylaminu (1,55 ml, 11 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (100 ml) při teplotě 0 °C se po kapkách přidal roztok ethyloxalylchloridu (980 μΐ, 88 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (10 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 2 hodin a ponořila se do vody s ledem (300 ml) a sraženina se odstranila filtrací a sušila se vakuu při teplotě 50 °C, přičemž vzniklo 2,25 g (100 %) ethylesteru kyseliny 6•(ethoxyoxalyl-amino)-lH-indol-7-karboxylové ve formě oleje.

K roztoku shora popsaného ethylesteru kyseliny lH-indol-7karboxylové (2 g, 6,60 mmol) v ethanolu (30 ml) se přidal 1 N vodný roztok hydroxidu sodného (16,4 ml, 16,4 mmol) ve vodě (30 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě »· ···· • 9 9 9 99

• ·

169 místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a k vodné fázi se přidala koncentrovaná kyselina chlorovodíková až do dosažení hodnoty pH = 1. Sraženina se separovala filtrací a promyla se vodou (2 x 50 ml) , diethyletherem (2 x 30 ml) a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 1,34 g (82 %) sodné sole kyseliny 6•(oxalyl-amino)-lH-indol-7-karboxylové.

M.p. je větší než 250°C vypočteno pro Culb^OsNa 1,5 x H₂O

C 44,46 % H, 3,39 % N, 9,43 % zjištěno:

C 44,31 %, H 3,34 %, N 9,00 %.

Podobným způsobem, jak se popisuje v příkladu 94, se připravuje následující sloučenina.

Příklad 95:

sodná sůl kyseliny 6-(oxalyl-amino)-lH-indol-5-karboxylové. Ethylester kyseliny 6-amino-lH-indol-5-karboxylové se připravoval způsobem, který se popisuje v publikaci J. Org. Chem. 61, 1155-1158 (1996)).

M.p. je větší než 250°C vypočteno pro Cn.H7N₂O5Na 1,5 x H₂O

C 44,46 % H, 3,39 % N, 9,43 % zjištěno:

C 44,41 %, H 3,68 %, N 9,00 %.

Příklad 96:

170 sodná sůl kyseliny 3-[4-(3-morfolin-4-yl-propionyl)-piperazinl-ylmethyl]-6- (oxalyl-amino) -lH-indol-5-karboxylové.

K roztoku 37 % vodného formaldehydu (2,7 g, 33 mmol) v kyselině octové (8 ml) chlazeném na ledu se po kapkách přidal roztok tert-butylesteru kyseliny piperazin-1karboxylové (2,7 g, 15 mmol). Po míchaní po dobu 15 minut se přidala směs kyseliny 6-(ethoxyoxalyl-amino)-lH-indol-5karboxylové (4 g, 13 mmol) s kyselinou octovou (80 ml) a tetrahydrofuranu (80 ml) a výsledná reakční směs se míchala po dobu 18 hodin při teplotě místnosti. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a ke zbytku se přidala voda (100 ml) . Vodná fáze se extrahovala ethylacetátem (2 x 100 ml) , kombinované organické extrakty se promyly saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (100 ml), vodou (2 x 100 ml), saturovaným vodným roztokem chloridu amonného (1 x 80 ml), sušily se (MgSO₄), filtrovaly se a odpařily se ve vakuu. Zbytek se titroval diethyletherem (50 ml) a sraženina se separovala filtrací a promyla se diethyletherem ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž vzniká 3,4 g (51 %) ethylesteru kyseliny 3-(4-terCbutoxykarbonyl-piperazin-l-ylmethyl]-6- (ethoxyoxalyl-amino) -1Hindol-5-karboxylové ve formě pevné látky.

K roztoku shora popsaného ethylesteru kyseliny 6(ethoxyoxalyl-amino)-lH-indol-5-karboxylové v dichloromethanu (20 ml) se přidala kyselina trifluorooctová (20 ml) při teplotě místnosti. Výsledná směs se míchala po dobu 1 hodiny, těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil ve vodě (50 ml) a výsledná směs se míchala po dobu 30 minut. Sraženina se separovala filtrací a promyla se vodou (50 ml), diethyletherem (50 ml) a ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž i7sC vzniklo 3,6 g (100 %) sodné soli kyseliny trifluorooctové ethylesteru kyseliny 6-(ethoxyoxalyl-amino)-3-piperazin-lylmethyl-lH-indol-5-karboxylové v pevné formě.

Ke směsi shora popsaného piperazinu (3 g, 5,81 mmol) v dichloromethanu (100 ml) a triethylaminu (2,5 ml) chlazené na ledu se po kapkách přidala směs chloropropionylchloridu (0,6 ml, 6,39 mmol) v dichloromethanu (10 ml). Výsledná směs se míchala po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, promyla se vodou (50 ml), sušila se (MgSO₄) , filtrovala se a odpařila se ve vakuu za vzniku 1,8 g, (68 %) ethylesteru kyseliny 3-(4akryloyl-piperazin-l-ylmethyl)-6(ethoxyoxalyl-amino)-lH-indol5-karboxylové.

K roztoku ke shora popsanému akryloyl-piperazinu (0,5 g, 1,1 mmol) v ethanolu (50 ml) se přidal morfolin (0,24 g, 2,74 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě výtoku po dobu 18 hodin a těkavé látky se odpařily ve vakuu. Zbytek se rozpustil ve vodě (50 ml), pH se upravilo na hodnotu 2 1 N kyselinou chlorovodíkovou a promyl se ethylacetátem (2 x 50 ml) . Vodná fáze se neutralizovala 1 N hydroxidem sodným, sráženina se separovala filtrací, promyla se vodou a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 3 hodin. Vzniklo 0,3 g (50 %) ethylesteru kyseliny 6-(ethoxyoxalyl-amino)-3-[4-(3-morfolin 4yl-propionyl)-piperazin-l-ylmethyl)-lH-indol-5-karboxylové ve formě pevné látky.

K roztoku shora uvedeného ethylesteru lH-indol-5-karboxylové (0,2 g, 0,37 mmol) v ethanolu (5 ml) se přidal roztok hydroxidu sodného (45 mg, 1,10 mmol) ve vodě (15 ml). Výsledná směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin, pH se upravilo na hodnotu 1 přidáním 1 N kyseliny chlorovodíkové. Vodná fáze se promyla ethylacetátem ( 2 x 25 ml) a pH se upravilo na hodnotu 5 přidáním 1 N hydroxidu sodného. Pak následovalo přidání dichlormethanu (25 ml) . Sraženina se odstranila filtrací a promyla se vodou (50 ml) a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 30 mg (17 %) sodné sole kyseliny 3—[4—(3-morfolin-4-yl-propionyl)-piperazin-1ylmethyl]-6-(oxalyl-amino)-lH-indol-5-karboxylové ve formě pevné látky.

M.p. je větší než 250 °C

LC-MS (E*) M/Z 488

Příklad 97:

1-(3-methoxy-benzyl)-6-(oxalyl-amino)-lH-indol-5-karboxylová kyselina.

K roztoku ethylesteru kyseliny 6-amino-lH-indol-5-karboxylové (1,0 g, 3,30 mmol, připraveném způsobem, který se popisuje v publikaci J. Org. Chem. 61, 1155-1158 (1996)) v suchém N,Ndimethylformamidu (40 ml) se přidal hydrid sodný (0,28 g, 7,3 mmol, 60 % v minerálním oleji) . Reakční směs se míchala po dobu 1,5 hodiny a po kapkách se přidával roztok 3methoxybenzylchlorid (0,5 ml, 3,6 mmol) v suchém N,Ndimethylformamidu. Výsledná reakční směs se míchal po dobu 1,5 hodiny a vylila se do vody (300 ml) a promyla se diethyletherem (3 x 100 ml) . Nerozpuštěná hmota se separovala filtrací a vodná fáze se okyselila na hodnotu pH = 4 přidáním IN kyseliny chlorovodíkové. Sraženina se separovala filtrací s promyla se vodou, sušila se při 50 °C a získalo se 400 mg (29 %) ethylesteru kyseliny 6-ethoxyoxalyl-amino)-1-(3methoxy-benzyl)-lH-indol-5-karboxylové kyselin ve formě pevné látky.

K roztoku shora popsaného ethylesteru kyseliny lH-indol-5•karboxylové (0,3 g, 0,7 mmol) v ethanolu (10 ml) se přidal IN hydroxidu sodného (2,1 ml, 2,1 mmol) a voda (10 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18

1·7δ· ···’ hodin. Těkavé látky se odstranily odpařením ve vakuu a pH se upravilo na hodnotu 2 přidáním IN kyseliny chlorovodíkové, Sraženina se separovala filtrací a promyla se vodou, sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 230 mg (89 %) 1-(3-methoxy-benzyl)-6-(oxalyl-amino)-lH-indol-5-karboxylová kyselina ve formě pevné látky.

M.p. : 222 02=226 °C vypočteno pro C₁₉Hi₆N2C>6 0,4 x H₂O

C 60,77 % H, 4,51 % N, 7,46% zjištěno:

C 60,96 %, H 4,44 %, N 7,28 %.

Podobným způsobem jako se popisuje v příkladu 81 se připravily následující sloučenina.

Příklad 98:

2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]thiopyran-3karboxylová kyselina vypočteno pro C!oH₉N05S2 C 41,80 % H, 3,16 % N, 4,88 % zj ištěno:

C 41,97 %, H 3,20 %, N 4,69 %.

Příklad 99:

Na’

O • · ·· sodná sůl kyseliny 2-(oxalyl-amino)-9H-thieno[2,3-c]chromen-3karboxylové

K roztoku 4-kromanonu (20 g, 0,14 mol), ethylkyanoacetátu (16,8 g, 0,15 mol) a acetátu amonného (11,4 g, 0,15 mol) v ebenzenu (500 ml) se přidala kyselina octová (5 ml) . Výsledná reakční směs se zahřívala na teplotu odtoku po dobu 18 hodin a vytvořená voda se sbírala v jímači vody podle DeanStarka. Přidala se další část acetátu amonného (10 g, 013 mol) a zahřívání na teplotu odtoku pokračovalo po dobu dalších 8 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu, ke zbytku se přidala voda (500 ml) a vodná fáze se extrahovala ethylacetátem (2 x 200 ml) . Kombinované organické extrakty se promyly vodou (2 x 100 ml), saturovaly se vodným chloridem sodným (100 ml), sušily se (MgSO₄) , filtrovaly se a odpařily se ve vakuu, přičemž vzniklo 28 g 1:1 směsi nezměněného počátečního materiálu a ethylesteru kyseliny chroman-4-yliden-kyanooctové ve formě oleje. K roztoku surového produktu v ethanolu (250 ml) se přidala síra (2,5 g, 0,08 mmol) a morfolin (15 ml). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě 50 °C po dobu 4 hodin při teplotě místnosti a filtrovala se. Těkavé látky se odpařily ve vakuu, přičemž se získalo 30 g surového extraktu. Produkt se rozdělil do dvou částí, které se částečně čistily na silikagelu (900 ml) za použití směsi ethylacetát/heptan (1:3). Sebrali se semi-čisté frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu, přičemž se získal surový olej, který se rozpustil v diethyletheru (80 ml) a krystalizoval se přidáním heptanu (125 ml) . Sraženina se odfiltrovala, promyla se heptanem a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin, přičemž se získalo 8,9 g (24 %) ethylester kyseliny 2-amino-9Hthieno[2,3-c]chromen-3-karboxylové ve formě pevné látky.

K míchanému roztoku shora popsaného ethylester kyseliny 2amino-9H-thieno[2, 3-c]chromen-3-karboxylové (2,9 g, 10,53 mmol), triethylamin 3 ml) v suchém tetrahydrofuranu (100 ml) při teplotě 0 °C se přidal po kapkách roztok • ··

1Λ5 • · ·· ethyloxalylchloridu (1,6 g, 11,6 mmol) v suchém tetrahydrofuranu.(20 ml). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodiny. Pak se nalila do vody s ledem (200 ml) a sraženina se separovala filtrací a sušila se při vakuu při teplotě 50 °C, přičemž vzniklo 2,6 g (66 %) ethylesteru kyseliny 2-(ethoxyoxalyl-amino)-9H-thieno[2,3-c]chromen-3-karboxylové ve formě pevné látky.

K roztoku shora popsaného ethylesteru (1,5 g, 4 mmol) v ethanolu (25 ml) se přidal hydroxid sodný (480 mg, 12 mmol) a voda (50 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 42 hodin. Přidala se voda (100 ml) a směs se promyla diethyletherem (100 ml) . pH vodné fáze se upravila na hodnotu 1 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové, sraženina se separovala filtrací, promyla se vodou a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 6 hodin, přičemž se získalo. 0,6 g (47 %) sodné sole kyseliny 2-(oxalyl-amino)-9H-thieno[2,3-c]chromen-3-karboxylové ve formě pevné látky.

M.p. : 227 229 °C vypočteno pro CííHgNOgSNa 0,5 H₂O C 48,1 % H, 2,59 % N, 4,00 % zjištěno:

C 48,39 %, H 2,93 %, N 3,93 %.

Příklad 100:

2-((2-H-tetrazol-5-karbonyl)amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

Ke směsi N,N-dimethylformamidu (1,6 ml) a acetonitrilu (5 ml) chlazeného na teplotu -20 °C se přidala po kapkách směs oxalylchloridu (0,8 g, 6,31 mmol) v acetonitrilu (1 ml).

* · '· · '· · • » * • ···

146.

Výsledná směs se míchala po dobu 15 minut a přidalala se dvojdraselná sůl kyseliny tetrazol-5-karboxylové (1 g, 5,25 mmol)(1 g, 5,25 mmol, připravená způsobem podle publikace J. Med. Chem. 29, 538-549 (1986) ) a výsledná směs se míchala po dobu dalších 20 minut. Ke směsi se přidal po kapkách roztok terC-butylesteru 2-amino-4,5-dihydro-7H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové kyseliny (1,3 g, 5,25 mmol), pyridinu (2,2 ml) a acetonitrilu (2,5 ml) během 10 minut. Reakční směs se nachala dosáhnout teploty místnosti a pak se zahřívala na teplotu výtoku po dobu 30 minut. Chlazená reakční směs se vylila do vody (100 ml) a pH se upravilo na hodnotu 1 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Sraženina se separovala filtrací, promyla se heptanem a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C a po dobu 18 hodin. Získalo se 1,3 g (70 %) terCbutylesteru kyseliny 2-((l-H-tetrazol-5-karbonyl)amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

Shora v textu popsaný tert-butylester (0,6 g, 1,71 mmol) se rozpustil v dichlormethanu (5 ml) a přidala se kyselina trifluoroctová (5 ml) . Výsledná směs se míchala po dobu 40 minut při teplotě místnosti. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a ke zbytku se přidal diethylether (50 ml) , voda (25 ml) a 1 N hydroxid sodný (2 ml) . Fáze se separovaly a vodná fáze se promyla diethyletherem (50 ml) a pH se upravilo na hodnotu 1 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Sraženina se separovala filtrací, promyla se vodou (25 ml) sušila se vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin, přičemž se získalo 190 mg (38 %) 2-((2-H-tetrazol-5-karbonyl)amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyseliny ve formě pevné látky.

M.p.: větší než 250 °C vypočteno pro C10H9N5O4S 0,25 H₂O

C 40,7 % H, 3,19 % N, 23,36 % zj ištěno:

C 40,39 %, H 3,18 %, N 22,92

Q.

Ό ·

1.7Π.

Příklad 101:

dvoj sodná sůl kyseliny N-3-(2H-tetrazol-5-yl)-4,7-dihydro-5H•thieno[2,3-c]pyran-2-yl) oxalamové

Ethylester kyseliny 2-amino-4,5-dihydro-7H-thieno[2,3-c]pyran•karboxylové (26 g, 0,114 mol) se rozpustil ve formamidu (200 ml) a výsledná směs se zahřívala na teplotu odtoku po dobu 1,5 hodin. Po ochlazení na teplotu místnosti se sraženina separovala filtrací a promyla se vodou (2 x 80 ml) a sušila ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin, přičemž vzniklo 10 g (42 %) sloučeniny 5, 6-dihydro-8H-pyrano[4 ', 3 ' : 4,5]thieno[2, 3c]pyrimidin-4-on ve formě pevné látky.

K oxidchloridu fosforitému (70 ml) se přidal shora popsaný pyrimidin-4-on (7 g, 0,04 mol) a N,N-dimethylanilin (0,2 ml). Výsledná směs se zahřívala na teplotu výtoku po dobu 2 hodin, ochladila se a vylila se do vody s ledem (700 ml) . Sraženina se separovala filtrací, suspendovala se ve směsi ethylacetátu (400 ml) a vody (250 ml) a míchala se po dobu 15 minut. Vodná fáze se separovala a organická fáze se promyla saturovaným vodným chloridem sodným (100 ml), sušila se (MgSO₄), filtrovala se a odpařila se ve vakuu, přičemž se získalo 5,2 g (68 %) 4chloro-5, 6-dihydro-8H-pyrano[4 ', 3 ' : 4,5]thieno[2,3-d]pyrimidinu ve formě pevné látky.

Aby se zahřál roztok shora uvedeného thieno-pyrimidinu (4,5 g, 0,02 mol) v ethanolu (40 ml), přidával se po kapkách roztok hydrazinhydrátu (10 ml) v ethanolu (20 ml). Výsledný roztok se zahříval na teplotu výtoku po dobu 2 hodin, ochladil se na i·ss«··«' • · teplotu místnosti, sraženina se separovala filtrací, promyla se ethanolem (20 ml) a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 1,5 hodiny a získalo se 3,2 g 5,6-dihydro-8Hpyrano[4 ', 3 ' : 4,5]thieno[2,3-d]pyrimidin-4-yl-hydrazinu ve formě pevné látky.

K roztoku shora v textu popsaného hydrazinu (3 g, 0,014 mol) v 50 % vodném roztoku kyseliny octové (100 ml) chlazeném na ledu se přidal po kapkách roztok nitritu sodného (1 g, 0,015 mol) ve vodě (10 ml) . Reakční směs se míchala po dobu 2 hodin a sraženina se odstranila filtrací, promyla se vodou (25 ml) a sušila se při teplotě 50 °C po dobu 1 hodiny, přičemž se získaly 3 g (95 %) 10, ll-dihydro-8H-pyrano[4 ', 3 ' : 4,5]thieno[2,3e]tetrazol[5, l-c]pyrimidinu ve formě pevné látky.

K roztoku shora v textu popsaného tetrazolu (2,5 g, 0,011 mol) v dioxanu (30 ml) se přidal po kapkách 1 N hydroxid sodný (25 ml) . Reakční směs se míchala po dobu 3 hodin, vylila se do ledem chlazené vody (100 ml) . pH se upravilo na hodnotu 4 přidáním kyseliny octové. Sraženina se odstranila filtrací, promyla se vodou (25 ml) a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 18 hodin, přičemž se získalo 2,2 g (82 %) N-(3-(2Htetrazol-5-yl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2, 3-c]pyran-2-yl)formamidu ve formě pevné látky.

Shora v textu popsaný formamid (0,6 g, 2,7 mmol) se rozpustil v suchém tetrahydrofuranu (50 ml) a přidal se triethylamin (1 ml) . K výsledné směsi chlazené na ledu se přidal po kapkách roztok ethyloxalylchloridu (0,4 g, 2,96 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (5 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a ke zbytku se přidal diethylether (50 ml), voda (50 ml) a 1 N kyselina chlorovodíková, přičemž hodnota pH je 2 a malá sraženina se separovala filtrací. Separovala se organická fáze, sušila se (Na₂SO₄) , filtrovala se a odpařila se ve vakuu. Zbytek se suspendoval vdichloromethanu (20 ml) a míchal se po dobu 1 hodiny. Sraženina se separovala filtrací a sušila se

1·£9· ···’ vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 0,16 g (18 %) ethylester kyseliny N-(3-(2H-tetrazol-5-yl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-2-yl) oxalamové.

K roztoku shora v textu uvedeném ethylesteru kyseliny oxalamové (0,16 g, 0,49 mmol) v ethanolu (15 ml) se přidal 1 N hydroxid sodný (1 ml, 1,01 mmol). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Sraženina se separovala filtrací a promyla se ethanolem (10 ml), sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 48 hodin, přičemž se získalo 140 mg (83 %) dvojsodné sole kyseliny N-3-(2H-tetrazol-5-yl) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-2-yl) oxalamové ve formě pevné látky.

M.p. je větší než 250 °C vypočteno pro CioHgN50₄SNa₂ 3 x H₂O C 30,54 % H, 3,33 % N, 17,81 % zj ištěno:

C 30,70%, H 3,35 %, N 17,49 %.

Podobným způsobem, jako se popisuje v příkladu 81, se připravily následující sloučeniny.

Příklad 102:

o

o

6-benzylester kyseliny 2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5Hirthieno[2,3-c]pyridin-3,6-dikarboxylové.

M.p. je větší než 250 °C vypočteno pro Ci₈Hi6N₂O₇S

C 53, 46 % H 3,99 % N 6,93 % zjištěno:

•		··	··	• ·
	• · ·	•	• ·
	• *	•	• ·	• ·
•	• ·	•	• ·	• ·
	• · ·	• ·	• ·	• ·

C 53,44%, Η 4,15 %, N 6,69 %

Příklad 103:

6-ethylester kyseliny 2-(oxalyl-amino)-4,7-díhydro-5H

-thieno[2,3-c]pyridin-3,6-dikarboxylové

M.p. : 245 0^247 °C vypočteno pro C13H14N2O7S C 45,61 % H 4,12 % N 8,18 % zjištěno:

C 45,71%, H 4,31 %, N 7,86 %.

Příklad 104:

6-acetyl-2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3•c]pyridin-3-karboxylová kyselina

M.p.: 242 244 °C vypočteno pro C12H12N2O6S 0,25 x H₂O

C 45,50 % H 3,98 % N 8,84 % zjištěno:

C 45,64%, H 3,97 %, N 8,51 %.

Příklad 105:

·· 4 4 44 • · 4 ” • «44

4·			4 4	44	«4
	4«ť.	4	4	« 4	4 4
	*1	4	4	4 ·	4 *
4		4	4	4 4	4 4
	444		4 ·	44	4 4

OH

s M°

O OH

2-(oxalyl-amino)-6-fenylkarbamoylmethyl-4,5, 6, 7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyridin-3-karboxylová kyselina M.p.: 244 246 °C vypočteno pro Ci₈Hi₇N₃O₆S 1 x H₂O

C 51,30 % H 4,54 % N 9,97 % zj ištěno:

C 51,08 %, H 4,52 %, N 9,63 %.

Příklad 6:

5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-2-(oxalylamino) -4,7-dihydro-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina Směs benzyloxyacetaldehydu (8,3 g, 0,06 mol) v benzenu (80 ml) se přidala do 1-methoxy -3-trimethyůsilyloxy-l,3-butadien (10,6 g, 0,06 mol). Reakční směs se míchala v atmosféře dusíku po dobu 15 minut, ochladila se na teplotu 0 °C a přidal se po kapkách roztok 0,5 M chloridu zinečnatého (55 ml, 0,03 mol). Reakční smě se nechala ohřát na teplotu místnosti po dobu 16 hodin a odpařila se ve vakuu. Výsledný olej se něředil ethylacetátem (100 ml), promyl se 1N kyselinou chlorovodíkovou (3 x 50 ml), saturovaným uhličitanem sodným (3 x 50 ml), solným rozotokem (3 x 50 ml), sušil se (MgSO₄) a odpařil se ve vakuu. Výsledný olej se podrobil chromatografické analýze za použití směsi ethylacetát/hexan (1:2) jako eluentu.

* * · » · « • · » • *»· .3ÍU.J

•	• • ·, ·	·· • •	·· • · • ·	·· * '· • ·
•	·?' ·	•	• ·	• ·
	• ··	··	• ·	• ·

Shromáždily se čisté frakce a po odpaření ve vakuu se získalo 7,1 g (60 %) benzyloxymethyl-2,3-dihydropyran-4-on ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 7,39 - 7,31 (m, 6H) , 5,42 ( dd, J = 6 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3 Hz, 1H) , 4,57 (m, 1H) , 3,70 (m, 2H) , 2,74 ( dd, J = 17 Hz, 1H) , 2,41 (ddd, J = 17 Hz, 2Hz, 1 Hz, 1H) .

Shora v textu popsaný 2,3-dihydropyran-4-on (7,1 g, 0,032 mol) a 10 % paladium na uhlíku (0,4 g) v ethylacetátu (50 ml) se umístilo do Parrova míchače a hydrogenoval se při tlaku 0,21 MPa. Reakční směs se míchala po dobu 2 hodin, přičemž analýza TLC (methanol/dichlormethan 1:9) ukázala, že reakce byla úplná. Reakční směs se filtrovala skrz lože celitu a tekavé látky se odpařily ve vakuu. Zbytek se analyzoval chromatografií za použití ethylacetátu jako eluentu. Shromáždily se čisté frakce a po odpaření se získaly 3 g (75 %) 2-hydroxymethyl-tetrahydropyran-4-on ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 4,36 - 4,29 (m, 1H) , 3,77 - 3, 66 (m, 3H), 3,61 - 3,54 (m, 1H), 2,65 - 2,43 (m, 2H), 2,34 - 2,27 (m, 2H), 2,04 (bs, 1H, CH₂OH).

Shora popsaný tetrahydro-pyran-4-on (1,90 g, 0,015 mol), terCbutyl kyanoacetát (2,7 g, 0,019 mol), síra (0,51 g, 0,016) a morfolin (2,55 ml, 0,03 mol) se rozpustily v absolutním ethanolu (20 ml) a zahřály se na teplotu 50 °C po dobu 16 hodin. Reakční směs se ochladila, filtorvala a filtrát se odpařil ve vakuu. Výsledný olej se rozpustil v ethylacetátu (50 ml), promyl se vodou (2 x 50 ml), solným rozotokem (2 x 50 ml) a sušil se (MgSO₄) . Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu a zbytek se podrobil analýza na kolonové chromatografii za použití ethylacetát/hexanu (1:1) jako eluentu. Sebraly se čisté frakce a získalo a po odpaření ve vakuu se získalo 3,7 g (90 %) terC-butylesteru kyseliny 2-amino-5-hydroxymethyl-4,7dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové

9999

9 9 • * 9 9

3, 67 (m, 3H) , • ·· ·* ·· · · * · · •X · · · · · · · · ·' · « • ·· 9 9 · · ^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 4,64 (s, 2H) , 3,80 2,77 - 2,72 (m, 1H), 2,57 - 2,53 (m, 1H), 1,54 (s, 9H).

Shora v textu popsaný terc-butylesteru kyseliny karboxylové (3 g, 0,015 mol), fthalimid (2,10 g, 0,014 mol) a trifenylfosfin (3,68 g, 0,014 mol) se rozpustily v suchém tatrahydrofuranu (60 ml) a ochladily se na teplotu 0 °C v atmosféře dusíku. Př(>* teplotě 0°C se po kapkách se přidal diisopropylazodokarboxylát (DIAD) (2,71 ml, 0,014 mol) a roztok se nechal míchat přes noc a pomalu se zahříval na teplotu místnosti. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a výsledná pevná látka se rozpustila v ethylacetátu (60 ml). Organická fáze se promyla solným roztokem (2 x 50 ml), sušila se (MgSO₄) a odpařil se ve vakuu. Zbytek se podrobil chromatografii , kde se jako eluční roztok použila směs ethylacetátu/hexanu (1:3). Když se produkt eluoval, použila se směs eluentu ethylacetát/hexan (1:2). Sebraly se čisté frakce a po odpaření ve vakuu se získalo 2,9 g (47 %) terC-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(1,3-dioxo-l,3-hydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylové ¹H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 7,87 - 7,85 (m, 2H) , 7,83 - 7,71 (m, 2H), 5,94 (bs, 2H) , 4,59 (d, J = 14 Hz, 1H) , 4,52 (d, J = 14 Hz, 1H), 4 - 3,98 (m, 2Hj , 3,83 - 3,79 (m, 1H) , 2,87 (d, J =

Hz, 1H), 2,58 (dd, J = 17 Hz, 9 Hz, 1H), 1,50 (s, 9H).

Ke shora popsanému terC-butylesteru kyseliny 4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (0,5 g, 1,2 mmol) rozpuštěném v dichloromethanu (5 ml) se přidal triethylamin (0,33 ml, 2,4 mmol) a terC-butylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (0,47 g, 2,4 mmol) v atmosféře dusíku. Reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a pevný zbytek se rozpustil v ethylacetátu (20 ml) . Organizká fáze se promyla 1 % kyselinou chlorovodíkovou (2 x 10 ml) , solným rozotokem (2 x 10 ml) , sušila se (MgSO₄) . Organická fáze se odpařola ve vakuu a získalo se 0,64 g (99 %) terC-butylesteru kyseliny 2-(terC-

• ···

1134

butoxyoxalyl-amino)-5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,48 (s, 1H. NHCO) , 7, 88 - 7,86 (m, 2H), 7,74 - 7,72 (m, 2H), 4,78 (d, J = 19 Hz, 1H), 4,07 - 3,90 (m, 2H), 3,88 - 3,80 (m, 1H) , 2,97 (d, J = 17 Hz, 1H) , 2,68 (dd, J = 17 Hz, 9 Hz, 1H), 1,58 (s, 9H), 1,54 (s, 9H).

Shora v textu popsaný ditert-butylester (2,8 g, 5,16 mmol) se rozpustil ve směsi kyseliny trifluoroctové a dichloromethanu (1:5) (36 ml). Reakce se míchala při teplotě místnosti po dobu hodin. Sraženina se odstranila filtrací, promyla se diethyletherem , sušila se vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 1,26 g (57 %) 5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2ylmethyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

M.p. : 245,2 <»245, 6 °C ^XH NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 12,32 (s, 1H. NHCO) , 7,95 - 7,80 (m, 4H), 7,95 - 7,80 (m, 4H) , 4,75 (d, J = 20 Hz, 1H) , 4,62 (d, J = 20 Hz, 1H) , 3, 96 - 3, 69 (m, 3H) , 3,01 (dd, J = 18 Hz, 1H), 2,60 (dd, J = 18 Hz, 9 Hz, 1H).

vypočteno pro CioHi4N₂0₈S

C 53,02 % H, 3,28 % N, 6,51 % zj ištěno:

C 53,01 %, H 3,31 %, N 6,41 %.

Příklad 107:

*« ··«· • · · • · ··

5.55..

5-benzoylamoni-methyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

Tert-butylesteru kyseliny 2-(tert-butoxyoxalyl-amino)-5-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno-[2,3-c]pyran-3-karboxylové (0,33 g, 0,60 mmol) se rozpustilo v rozotoku ethanolu (2 ml) a dichloromethanu (3 ml). Přidal se hydrazin a reakce se míchala v atmosféře dusíku při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Analýza TLC ukázala, že v reakce je stále přítomen počáteční materiál. Přidala se další část hydrazinu (28 μΐ, 0,9 mmol) a reakce se míchala při teplotě místnosti po dobu 16 hodin a pak při teplotě 45 °C po dobu 5 hodin. Směs se zakoncentrvala ve vakuu, znovu se rozpustila dichloromethanu a nerozpustný materiál se odstranifiltrací. Filtrát se sebral a zakoncentroval se při vakuu za vzniku surového tert-butylesteru kyseliny 5-aminomethyl-2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno-[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky. Tato látka prošla dalším stupněm bez čištění.

Shora v textu popsaný tert-butylesteru kyseliny 5H-thieno-[2,3-c]pyran-3-karboxylové (0,25 g, 0,60 mmol) se suspendoval ve směsi dichloromethanu a acetonitrilu (1:1, 5 ml). Přidal se triethylamin (0,25 ml, 1,8 mmol) a pak 1-hydroxybenzotriazolhydrát (0,10 g, 0,72 mmol) a 1—(3— -dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidhydrochlorid (0,14 g, 0,72 mmol) ve formě pevných látek. Heterogenní reakční směs se nechala míchat při teplotě místnosti po dobu 2 dní, pak se směs stala homogenní. Rozpouštědla se odpařila ve vakuu a zbytek se rozpustil dichloromethanu, promyl se dvakrát 1M kyselinou chlorovodíkovou, pak saturovaným uhličitanem sodným. Organická fáze se sušila (Na₂SO₄), filtrovala se a koncentrovala se ve vakuu za vzniku pevné látky, které se čistila chromatografií za použití směsi ethylacetát a hexan (1:1) jako eluentu. Sebraly se čisté frakce a odpařily se ve vakuu, přičemž vzniklo 50 mg (16 % během dvou kroků) tertbutylesteru kyseliny 5-(benzoylaminomethyl-2-(tertbutoxyoxalyl-amino) -5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2φφ φφφφ φ φ φ • φφφ φ φφ »♦ ·Φ φφφ · φ φ φ φ φφφ φφφφ φ φ φφφ φφ · φ φ φ φ φ φ φ «φφφφ ·· φφ ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno-[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

XH N	MR	(400 MHz, CDC1	3) δ	12,46 (s,	, 1H)	r	7,81 (d, J = 7	Hz,
2H),	7,	51 - 7,42 (m,	3H) ,	6,72 (bs,	1H)	t	4,83 (d, J = 17	Hz,
1H) ,	4,	74 (dd, J = 17	Hz,	1H), 4,05	- 3,	98	(m, 1H), 3,86	3, 78
(m,	1H)	, 3,45 - 3,38	(m,	1H), 2,97	(d,	J	= 19 Hz, 1H) ,	2,68
(dd,	J	= 19 Hz, 9 Hz,	1H) ,	1,61 (s,	9H) ,	1,	58 (s, 9H) .

Shora v textu popsaný benzoylaminomethyl-thieno-[2,3-c]pyran (40 mg, 0,078 mmol) se ošetřil 20 % kyselinou trifluorooctovou v dichloromethanu (2 ml) po dobu 4 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a cisolovaly se dvakřát dichlormethanem za vzniku sraženiny, která se separovala filtrací a sušila se s výtěžkem 30 mg (95 %) 5-benzoylamoni-methyl)-2-(oxalylamino) -4,7-dihydro-thieno[2, 3-c]pyran-3-karboxylové kyseliny.

^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,31 (s, 1H) , 8,63 (t, J = 4 Hz,

1H), 7,86 (d, J = 7 Hz, 2H) , 7,51 - 7,43 (m, 3H) , 4,80 (d, J = 17 Hz, 1H) , 4,64 (d, J % 17 Hz, 1H) , 3,82 (m, 1H) , 3,44 (m, 2H), 2,95 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 18 Hz, 9 Hz, 1H). LC/MS [M-H]: 403,39

HPLC(254,4 nm): 2,99 s, 84 %.

Příklad 108:

o

9 9 9

4 4 9

4 4 ·

9 9 *

• 9 4 <

»4 >4

5-benzoyloxymethyl-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-thieno[2, 3-c]pyran-3-karboxylová kyselina.

terC-butylesteru kyseliny 2-amino-5-hydroxymethyl-4,7-dihydro-5H-thieno-[2,3-c]pyran-3-karboxylové (0,23 g, 0,87 mmol), kyselina benzoová (0,10 g, 0,96 mmol) a triethylamin (0,23 ml,

1,7 mmol) se rozpustily v dichloromethanu (4 ml) a míchaly se v atmosféře dusíku. Přidaly se 1-hydroxy-benzotriazolhydrát (0,12 g, 0,96 mmol) a 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidhydrochlorid (0,17 g, 0,96 mmol) ve formě pevných látek. Heterogenní reakční směs se nechala míchat při teplotě místnosti po dobu 2 dní. Rozpouštědla se odpařila ve vakuu a zbytek se rozpustil ethylacetátu a promyi se IN kyselinou chlorovodíkovou, pak saturovaným uhličitanem sodným a sušil se (Na2SO₄) . Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku žluté pevné látky, které se čistila chromatografií za použití směsi ethylacetát a hexan (1:2) jako eluentu. Sebraly se čisté frakce a odpařily se ve vakuu, přičemž vzniklo 0,22 g (70 %) terf-butylesteru kyseliny 2-amino-5-benzoyloxymethyl-)-4,7-dihydro-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 8,06 (d, J = 7 Hz, 1H) , 7,42 (t, J =

Hz, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,44 (d, J = 5 Hz, 2H) , 4,03 - 3,97 (m, 1H), 2,88 (d, J = 18 Hz, 1H) , 2,64 (dd, J = 17 Hz, 10 Hz,

1H), 1,50 (s, 9H).

LC/MS [M+H]: 390,48

Ke shora v textu popsanému tert-butylesteru kyseliny karboxylové (0,18 g, 0,45 mmol) rozpuštěném v suchém tetrahydrofuranu (5 ml) se přidal triethylamin (0,18 ml, 1,4 mmol) a terC-butylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (0,26 g, 1,4 mmol) v atmosféře dusíku. Reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a pevný zbytek se rozpustil v ethylacetátu (10 ml). Organická fáze se promyla 1 % kyselinou

188 • ·

chlorovodíkovou (2 x 10 ml) , solným rozotokem (2 x 10 ml) , sušila se (Na₂SO₄), filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku oleje, který se čistil chromatografií za použití směsi ethylacetátu a hexanu (1:2) jako eluentu. Vzniklo 0,20 g (90 %) ter£-butylesteru kyseliny 5-benzoyloxymethyl-2- (terC-butoxyoxalyl-amino)-4,7-dihydro-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 8,07 (d, J = 7 Hz, 2H) , 7,56 (t, J = 7 Hz, IH), 7,44 (t, J = 7 Hz, 2H) , 4,85 (d, J = 15 Hz, IH) , 4,49 (dd, J = 5 Hz, 2H) , 4,03-3,99 (m, IH) , 2,99 (d, J = 17 Hz, IH), 2,72 (d, J = 17 Hz, 11 Hz, IH) , 1,58 (s, 9H) , 1,60 (s, 9H) .

Shora v textu popsaný ditert-butylester (0,15 g, 0,29 mmol) se rozpustil ve směsi 20 % kyseliny trifluoroctové v dichloromethanu (3 ml). Bezprostředně se vytvořila tmavě oranžová barva, který rychle změnila na červenou barvu. Reakce se míchala při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a hnědá pevná látka se dvakrát promyla se diethyletherem a vodou a separovala se filtrací. Výsledná pevná látka se sušila vakuu, přičemž se získalo 30 mg (25 %) 5-benzoyloxymethyl-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

XH NMR (400 MHz, DMSO-d6)	δ 12,40	(s, IH), 7,98	(d, J = 7	Hz,
2H) , 7,67 (t, J = 7 Hz,	IH), 7,54	(t, J = 7 Hz,	2H), 4,83	(d,
J = 15 Hz, IH) , 4,70 (d,	J = 15	Hz, IH), 4,44	(d, J = 5	Hz,
2H), 4,02 - 3,99 (m, IH),	2,99 (d,	J = 16 Hz, IH)	·, 2,70 (dd	, J

= 16 Hz, IH).

LC/MS [M-H]: 404,05

HPLC (254,4 nm): 7,16 s, 90 %.

189

2- (oxalyl-amino)-5-(1-oxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)4,7-dihydro-5H-thieno[2, 3-c]pyran-3-karboxylová kyselina.

K roztoku tert-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(1,3-dioxo-l,3dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran3- karboxylové (0,308 g, 0,74 mmol) v absolutním ethanolu (5 ml) se přidal hydrazin (47 μΐ, 1,48 mmol). Reakce se míchala při teplotě 80 °C po dobu 4 hodin a pak při teplotě místnosti po dobu 12 hodin. Vytvořená sraženina se separovala filtrací a filtrát se koncentroval ve vakuu. K olejovému zbytku se přidal dichlormethan (15 ml) a vytvořená sraženina se separovala filtrací. Filtrát se zakoncentroval ve vakuu za vzniku 0,19 g (90 %) tert-butylesteru kyseliny 2-amino-5-aminomethyl-4,7dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 5,91 (bs, 1H) , 4,62 (S, 1H) , 3,64 3,60 (m, 1H) , 2,92 - 2,84 (m, 2H)', 2,80 - 2,75 (m, 1H) , 2,52 2,45 (m, 1H), 1,53 (s, 9H).

LC/MS [M+H]⁺: 285

Ftalový dikarboxaldehyd (52 mg, 0,36 mmol) se rozpustil ve směsi nevodného acetonitrilu (2 ml) a kyseliny octové (44 μΐ, 0,72 mmol). Přidal se shora zmíněný tert-butylester kyseliny 2-amino-5-aminomethyl-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylové (0,11 g, 0,36 mmol) a reakce se míchala po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a pevný zbytek se rozpustil v ethylacetátu (25 ml) . Organická fáze se promyla saturovaným roztokem uhličitanu sodného, 1 % kyselinou chlorovodíkovou (5 ml), solným roztokem (5 ml), sušila se (Na₂SO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu . Zbytek se čistil chromatografií za použití gradientu od 15 % směsi ethylacetátu/dichloromethanu až 17 % • · · · ·» · ·

190 ethylacetátu/dichloromethanu jako eluentu, přičemž vzniklo 45 mg (30 %) terC-butylester kyseliny 2-amino-5-(1-oxo-l,3dihydro-isoindol-2-ylmethyl) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran3-karboxylové ve formě pevné látky.

XH NMR	(400 MHz,	CDCI3)	δ 7	,85 (d, J = 7	Hz,	1H) ,	7,	53 (t, J =
7 Hz, 1	H), 7,47	- 7,43	(m,	2H), 4,68 (d.	J --	= 17	Hz,	1H), 4,58
- 4,51	(m, 3H),	3,99	(dd,	J = 14 Hz, 3	Hz,	1H)	, 3	,93 - 3,89
(m, 1H)	, 3,66 -	3,61	(m,	1H), 2,88 (d,	J =	17	Hz,	1H), 2,55
(dd, J	= 17 Hz,	11 Hz,	1H) ,	1,52 (s, 9H).

K roztoku tert-butylester kyseliny 2-amino-5-(1-oxo-l,3dihydro-isoindol-2-ylmethyl) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran3-karboxylové (45 mg, 1,1 mmol) přidal bezvodý dichloromethan (4 ml) a tert-butylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (73 mg, 3,3 mmol) a triethylamin (17 μΐ, 1,1 mmol). Reakce se míchala v atmosféře dusíku při teplotě místnosti po dobu 5 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a surový materiál se rozpustil v ethylacetátu (20 ml) . Organická fáze se promyla 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou (3 ml), saturovaným uhličitanem sodným (3 ml), solným roztokem (5 ml), sušila se (Na₂SO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografií za použití dichloromethanu (100 %), po němž následuje směs 17 % ethylacetátu/dichloromethanu, které slouží jako eluent. Vzniklo 54 mg (91 %) tert-butylester kyseliny 2-(terCbutoxyoxalyl-amino-5-(1-oxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 12,50 (s, 1H) , 7,84 (d, J = 8 Hz,

1H), 7,53 (t, J = 7 Hz, 1H), 7,47 - 7,43 (m, 2H), 4,81 - 4,65 (m, 3H), 4,53 (d, J = 17 Hz, 1H) , 4,01 (dd, J = 14 Hz, 3 Hz, 1H), 3,96 - 3,89 (m, 1H), 3,69 - 3,62 (m, 1H) , 2,97 (d, J = 17 Hz, 1H2,63 (dd, J = 17 Hz, 11 Hz, 1H) , 1,59 (s, 9H) , 1,56 (s,

9H) .

191

APCI-MS [M+H]⁺: 529,5

Shora popsaný terC-butylester kyseliny 2-(terC-butoxyoxalylamino-5-(l-oxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (52 mg, 0, 098 mmol) se ošetřil roztokem 50 % směsi kyseliny trifluorooctové/dichlormetanu (3 ml) po dobu 4,5 hodiny při teplotě místnosti. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se třikrát promyl dichloromethanem (10 ml) . Vytvořená sraženina se separovala filtrací a promyla se dichloromethanem, přičemž se získalo 28 mg (70 %) 2-(oxalylamino) -5-(l-oxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,32 (s, 1H) , 7,69 (d, J = 8 Hz,

1H), 7,61 - 7,59 (m,	2H), 7,51 - 7,45	(m,	1H), 4,81	(d, J = 15
Hz, 1H) , 4,65 (d, J	= 15 Hz, 1H) , 4,	60	(s, 2H), 3	,95 - 3,92
(m, 1H) , 3,75 (d, J	= 5 Hz, 2H) 2,94	(dd,	J = 6 Hz,	1H) , 2,56
(dd, J = 6 Hz, 1H)
APCI-MS [M+H]+: 417,3

HPLC (254,4 nm) : 3, 079 (100 %).

Příklad 110:

2-(oxalyl-amino)-6-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thiofen-3karboxylová kyselina

2-(ethoxyoxal-amino)-6-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thiofen-3-karboxylová kyselina (3 g, 0,013 mol) se rozpustila ve směsi • · · ·

192 vody (40 ml, ethanolu (20 ml) a tetrahydrofuranu (20 ml) při teplotě místnosti. K výsledné směsi se přidal 1 N hydroxid sodný (20,24 ml, 20,24 mmol). Výsledná reakční směs se míchala pří teplotě místnosti po dobu 72 hodin, pH se upravilo na hodnotu 3 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Sraženina se separovala filtrací a promyla se vodou (2 x 15 ml) , diethyletherem (2 x 15 ml) a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 1,96 g (73 %) 2-(oxalyl-amino)-6-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thiofen-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

M.p. je větší než 230 °C vypočteno pro CnHgNOgS C 46, 64 % H, 3,30 % N, 4,94 % zjištěno:

C 46,97 %, H 3,30 %, N 5,80 %.

Podobným postupem, jak se popisuje v příkladu 81, se připravily následující sloučeniny.

Příklad 111:

4-karboxymethyl-2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]-thiofen-3-karboxylová kyselina

2-karbmethoxymethylcyklohexanon se připravil stejným způsobem, jak se popisuje v publikaci J. Am. Chem. Soc. 81, 3955-3959 (1959) v případě 2-karbethoxy-methylcyklohexanon.

M. p. větší než 250 °C vypočteno pro C13H13N1O7S1 0,75 H₂O i

• · · ·

193

C 45,81 % Η, 4,29 % Ν, 4,11 % zjištěno :

C 45,79 %, Η 4,02 %, Ν 4,08 %.

Příklad 112:

2- (oxalyl-amino) -6-οχο-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]-thiopyran3- karboxylová kyselina l-oxo-2,3,5,6-tetrahydro-4H-thiopyran-4-on se připravil stejným způsobem, jak se popisuje v publikaci J. Org. Chem. 27, 282-284 (1962).

M. p. větší než 250 °C vypočteno pro C₁₀H9NiO6S₂ 0,2 x NaCl

C 38,13 % H, 2,88 % N, 4,45 % zj ištěno:

C 37,98 %, H 2,82 %, N 4,29 %.

Příklad 113

sodná sůl kyseliny 2-(oxalyl-amino)-6, 6-dioxo-4,7-dihydro-5Hthieno[2,3-c]-thiopyran-3-karboxylové

1,l-dioxid-2,3,5,6-tetrahydro-4H-thiopyran-4-on se připravil stejným způsobem, jak se popisuje v publikaci J. Org. Chem. 60, 1665-1673 (1995).

M. p. větší než 250 °C vypočteno pro CioHgNiO^Nai 1 x H₂O

194

C 33,43 % Η, 2,81 % N, 3,90 % zj ištěno:

C 33,43 %, H 2,78 %, N 3,76 %.

Podobným způsobem, jak se popisuje v příkladu 107, se připravily následující sloučeniny.

Příklad 114:

2-(oxalyl-amino)-5-(((4-oxo-chromen-4H-3-karbonyl)amino)methyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,32 (s, 1H) , 9,47 (t, J = 4 Hz,

1H) ,	9, 08	(s,	1H), 8,19	(dd, J	= 8 Hz, 2 Hz,	1H)	, 7,90	(dt, J
= 8	Hz, 2	Hz,	1H), 7,78	(d, J	= 8 Hz, 1H) 7,	60	(t, J =	8 Hz,
1H) ,	4,88	(d,	J = 15 H	z, 1H),	4,70 (d, J =	15,	1H) ,	3,83 -
3,79	(m, 1	H) ,	3,72 - 3,	66 (m,	1H), 3,55 - 3,	48	(m, 1H)	, 2,95
(d,	J = 15	Hz,	1H), 2,60	(dd, J	% 15 Hz, 8 Hz,	1H)	-

LC/MS [M-H]: 471,4

HPLC (254,4 nm): 3,105 (94 %).

Příklad 115:

2-(oxalyl-amino)-5-(((4-oxo-chromen-4H-2-karbonyl)amino)methyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

195

• · »··· • · ·	• ·· ·	·· •	·· '·	Φ	·· • »
• · ··	• Φ	•	Φ	*	• ·
• ·	• ·	•	•	•	• ·
	• · ·	• ·	• ·		• ·

^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,32 (s, 1H) , 9,33 (t, J = 4 Hz,

1H), 8,05 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,89 (t, J = 8 Hz, 1H) , 7,76 (d,

J = 8 Hz, 1H) 7,53 (t, J = 8 Hz, 1H), 6,84 (s, 1H), 4,83 (d, J = 15 Hz, 1H), 4,66 (d, J = 15, 1H) , 3,89 - 3, 84 (m, 1H), 3,56

- 3,45 (m, 2H), 2,98 (d, J = 18 Hz, 1H) , 2,63 - 2, 52 (m, 1H, částečně zkresleno DMSO).

LC/MS [M-H]~: 471,4

HPLC (254,4 nm) : 2, 886 s, (95 %) .

Příklad 116:

5-((3-furan-3-yl-akryloylamino)-methyl)-2-(oxalyl-amino)-54,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,32 1H), 7,99 (s, 1H), 7,71 (s, 1H) , (s, 1H) , 6,42 (d, J = 15 Hz, 1H) , (d, J = 15 Hz, 1H) , 3,74- 3,67 2,91 (d, J = 17 Hz, 1H), 2,53

DMSO).

LC/MS [M-H]: 419,4

HPLC (254,4 nm): 2,822 s, (91 %) .

(s, 1H), 8,20 (t, J = 5 Hz,

7,33 (d, J = 15 Hz,	1H) ,	6, 68
4,81 (d, J = 15 Hz,	1H)	4,65
(m, 1H), 3,44 - 3,34	(m,	2H) ,
(dd, 1H, částečně	zkresleno

Příklad 117

O

S

O OH

196

9 9 » é · ·	•	99		99		99
• 9«9	·· 4	•	9	9	9	9
	• ·	9	4	9	9	4
						4
• ·	• · • · ·	4 99	4	9 4 9	9	9 9 9

5-((3-furan-3-yl-akryloylamino)-methyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,32 (s, 1H) , 8,37 (t, 1H) , 7,77 (s, 1H) , 7,23 (d, J = 15 Hz, 1H) , 6,76 (d, J = 3 Hz, 1H), 6,57 (dd, J = 3 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 15 Hz, 1H) 4,81 (d, J = 15 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 15 Hz, 1H) , 3, 74 - 3, 67 (m, 1H) , 3,48 3,32 (m, 2H), 2,91 (d, J = 17 Hz, 1H), 2,53 (dd, 1H, částečně zkresleno DMSO).

[M-H]’: 419,3

HPLC (254,4 nm) : 2,815 s, (86 %).

Příklad 118:

2-(oxalyl-amino)-5-(((3-oxo-indan-l-karbonyl)amino)methyl)4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

XH NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,32 (s, 1H) , 8,81	(bs,	1H), 7,74
- 7,62 (m, 3H), 7,47 (t, J = 7 Hz, 1H) , 4,83	(d, J	= 15 Hz,
1H) , 4,67 (d, J = 15 Hz, 1H) , 4,29 (t, J = 5	Hz, 1H) 3,41 -
3,25 (m, 3H), 2,91 (d, J = 15 Hz, 1H) , 2,77	(d, J	= 15 Hz,
2H), 2,58 - 2,51 (m, 1H, částečně zkresleno DMSO).

[M-H]^-: 457,5

HPLC (254,4 nm) : 2, 634 s, (97 %) .

Podobným způsobem, jak se popisuje v příkladu 106, se připravila následující sloučenina.

Příklad 119:

o

o rv o

t o OH

197

5-(2,4-dioxo-thiazolidin-3-ylmethyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

NMR (400 MHz, CD₃OD a DMSO-d₆) δ 4,88 (m, 2H) , 3,97 - 3,89 (m, 3H), 3,72 - 3,69 (m, 2H), 3,08 (m, 1H), 3,02 (m, 1H).

MS (ESI (-)): 399

HPLC (254,4 nm): 2,67 s, (100 %).

Podobným způsobem, jako se popisuje v příkladu 81, se připravily následující sloučeniny.

Příklad 120:

Cl %-OH

O

O OH

2-(oxalyl-amino)-5-(2'-spirol[l', 3 Jdioxolan)-6,7-dihydro-4Hbenzo[b]thiofen-3-karboxylová kyselina M. p.: 232 - 234 °C:

vypočteno pro C13H13NO7 1 x H₂O

C 45,22 % H, 4,38 % N, 4,06 % zj ištěno:

C 45,24 %, H 4,39 %, N 3,89 %.

Podobným způsobem, jako se popisuje v příkladu 107, se připravily následující sloučeniny.

Příklad 121:

o

o.

198

·*	• · · ·	i ··		··	• ·
• ·	•	·· ·	•	• 9	•	•
•	··»	• ·	•	• ·	•	•
•						*
•	•	• · • · · ··	Φ	• · • ·	• ··	•

5-((3,5-dimethoxy-benzoylamino)-methyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, DMSO~d₆) δ 12,31 (s, 1H) , 8,63 (t, J = 5 Hz,

1H) , 7,02 (s, 2H), 6,62 (s, 1H), 4,80 (d, J = 15 Hz, 1H), 4,64 (d, J = 15 Hz, 1H) , 3, 82 - 3,79 (m, 1H) , 3,77 (s, 6H) , 3,47 3,45 (m, 2H), 2,94 (d, J = 17 Hz, 1H) , 2,53 (dd, J = 17 Hz, 11 Hz, 1H).

LC/MS [M-H]: 463,4

HPLC (254,4 nm): 3,161 s, (93 %).

Příklad 122:

Cl

5-(5,6-dichloro-l,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-2(oxalyl-amino) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

K roztoku 2-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-4-on (625 mg, 4,81 mmol) ve směsi pyridinu (778 μΐ, 9,62 mmol) a chloroformu (6 ml) při teplotě 0 °C v atmosféře dusíku se pomalu přidával 4nitrobenzensulfonylchlorid (1,6 g, 7,22 mmol) . Směs se nechala zahřát na teplotu místnosti a míchala se po dobu 3 hodin. Přidal se chloroform (30 ml) a roztok se promyl 2 N kyselinou chlorovodíkovou (3 x 10 ml), 5 % NaHCCb (3 x 10 ml) a vodou (3 x 10 ml) . Organická fáze se sušila (Na₂SO₄) , filtrovala a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se podrobil chromatografii na silikagelu za použití gradientu dichloromethan:hexan:ethylacetát (1:1:0 až 8:0:2) jako eluentu. Shromáždily se čisté frakce a těkavé látky se odpařily ve vakuu. Získalo se 0,98 g (65 %) 4-oxo-tetrahydro199 pyran-2-ylmethylesteru 4-nitrobenzensulfonové kyseliny ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 2,37 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 2,57 (m, 1H), 3,89 (m, 1H) , 4,20 - 4,26 (m, 3H) , 8,14 (dd, 2H, J = 0,6 Hz, 9 Hz), 8,42 (dd, 2H, J = 0,6 Hz, J -9 Hz).

MS m/z : 315,3 (M+).

4-oxo-tetrahydro-pyran-2-ylmethylesteru 4-nitrobenzensulfonové kyseliny (0,5 g, 1,59 mmol), ethylenglykol (986 mg, 15,9 mmol) a p-toluensulfonová kyselina (61 mg, 0,32 mmol) se vypustily do benzenu (20 ml). Rozpouštědlo se odtranilo ve vakuu a získala se pevná látka. Pevná látka se rozpustila v dichloromethanu (30 ml) a promyla se v saturovaném vodném roztoku uhličitanu sodného (2x5 ml) a vodou (2x5 ml) . Organická fáze se sušila (Na₂SO₄), filtrovala a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Získalo se 0,582 g (100 %) 1,4,8-trioxaspiro[4,5]dec-7-ylmethylesteru 4-nitrobenzensulfonové kyseliny ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1, 53 - 1,73 (m, 4H) , 3,54 (m, 1H) ,

3,8 (m, 2H), 3,96 (m, 4H), 4,15 (m, 2H), 8,12 (dd, 2H, J = 1,5 Hz, J = 9 Hz), 8,40 (dd, 4H, J = 1,5 Hz, 9 Hz).

MS m/z : 359,3.

3,4-dichloroftalimid (90,2 mg, 0,42 mmol) se rozpustil v N,Ndimethylformamidu (2 ml) při teplotě místnosti. Přidal se hydrid sodný (17 mg, 0,42 mmol) v atmosféře dusíku. Přidal se 1, 4,8-trioxa-spiro[4,5]dec-7-ylmethylester 4-nitrobenzensulfonové kyseliny (100 mg, 0,28 mmol) a směs se zahřívala na teplotu 140 °C po dobu 3 hodin. Po ochlazení na teplotu místnosti se do reakční směsi přidala voda s ledem (5 ml) a směs se extrahovala ethylacetátem (3 x 15 ml) .

ethylacetátové extrakty se promyly IN chlorovodíkovou (2x5 ml), vodou (2x5 ml), saturovaným uhličitanem sodným (2x5 ml) a vodou (2x5 ml) . Po sušení (Na₂SO₄) následovala filtrace a rozpouštědlo se odstranilo odpařováním ve vakuu. Získalo se 97 mg (94 %) 5,6-dichloro-2Kombinované kyselinou

200 (1,4,8-trioxa-spiro[4,5]dec-7-ylmethylester)-isoindol-1,3-dion ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,60 (m, 2H) , 1,78 (m, 2H) , 3,54 (m,

IH), 3,64 (m, IH) , 3,88 (m, 2H) , 3,95 (m, 4H) , 7,95 (d, 2H, J = 3 Hz) .

MS m/z : 373,7 (M+) .

5, 6-dichloro-2- (1,4,8-trioxa-spiro[4,5]dec-7-ylmethylester) isoindol-1,3-dion (87 mg, 0,234 mmol) se rozpustil v tetrahydrofuranu (2,5 ml). K roztoku se přidala 1 N kyselina chlorovodíková (1 ml) a směs se zahřívala při teplotě 75 °C po dobu 20 hodin. Heterogenní směs se odpařila do sucha ve vakuu a výsledná pevná látka se rozpustila v dichloromethanu (10 ml) a promyla se vodou (3x2 ml). Organická vrstva se sušila (MgSO₄) , pak následovala filtrace a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu. Získalo se 62,1 mg (81 %) 5,6-dichloro-2-(4-oxotetrahydro-pyran-2-ylmethyl)-isoindol-1,3-dion ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 2,31 - 2,41 (m, 2H) , 2,48 (t, IH, J % 2 Hz), 2,62 (m, 2H), 3,60 (m, IH), 3,72 (m, IH), 3,99 (m, 2H), 4,29 (m, IH), 7,96 (d, 2H, J = 2,7 Hz).

MS m/z : 331,1 (M+).

5,6-dichloro-2-(4-oxo-tetrahydro-pyran-2-ylmethyl)-isoindol1,3-dion (60 mg, 0,18 mmol) se míchal s terCbutylkyanoacetátem (33,5 mg, 0,24 mmol), elementární sírou (6,44 mg, 0,20 mmol) a morfolinem (32,4 μΐ, 0,37 mmol) v ethanolu po dobu 20 hodin při teplotě 50 °C. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a výsledná pevná látka se rozpustila v dichloromethanu (30 ml) a promyla se vodou (2 x 10 ml) . Organická fáze se sušila (MgSO₄) , pak následovala filtrace a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu. Zbytek (111 mg) se čistil preparativní TLC Kieselgel 6OF254, 1 mm) za použití směsi hexanu a ethylacetátu (1:1) jako eluentu. Čistá látka se získala po odpaření rozpouštědla ve vakuu. Získalo se 28 mg (32 %) tert-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(5, 6-dichloro-l,3201

9999 » ·

9*999

-dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,54 (s, 9H) , 2,90 (m, 1H) , 3,35 (m, 2H), 2,60 (m, 2H) , 2,90 (m, 1H) , 4,62 (m, 1H) , 7,95 (d, 2H, J =1,8 Hz).

MS m/z : 483,3 (M+), 427 (M-57).

Směs terf-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(5,6-dichloro-l,3-dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (27,5 mg, 0,057 mmol), terCbutylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (55,8 mg, 0,29 mmol) a triethylamin (16 μΐ, 0,114 mmol) v tetrahydrofuranu (2 ml) se míchala při teplotě místnosti po dobu 20 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a výsledný syrup se rozpustil v dichloromethanu (15 ml) a promyl se vodou (3 x 3 ml) . Organická fáze se sušila (MgSO₄) , pak následovala filtrace a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu. Zbytek (35,7 mg) se čistil preparativní TLC (Kieselgel 60F₂5₄, 0,5 mm) za použití směsi hexanu a ethylacetátu (8:2) jako eluentu. Po izolaci se získalo 8,5 mg (24 %) tert-butylesteru kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-(5,6-dichloro-l, 3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,58 (s, 18H) , 2,68 (m, 1H) , 2,97 3,02 (m, 1H), 3,82 (m, 1H) , 4,63 - 4,68 (m, 1H) , 4,77 - 4,82 (m, 1H), 7,97 (d, 2H, J = 2,1 Hz).

MS m/z : 611,4 (M+) .

TerC-butylesteru kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-5-(5,6-dichloro-1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (3,5 mg, 5,7xl“³ mmol) se rozpustilo ve 20 % kyselině trifluorooctové v dichloromethanu (1 ml) a míchal se po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a získalo se 2,7 mg (95 %) 5-(5,6-dichloro-l, 3-dioxo-l,3-dihydro202

Φ φφφφ » ·£· ···· φφφ

φφ φφ • * · « • · · φ φ * φ φ • · φ φ φφ φφ isoindol-2-ylmethyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5Hthieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky. ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 2,66 (s, 1H) , 3,10 (m, 1H) , 3,80 (m,

1H), 3,98 (m, 2H), 4,66 (m, 1H), 4,74 (m, 1H).

MS m/z : 498,3 (M+).

Následující sloučeniny se připravily způsobem, který se popisuje v příkladu 122.

Příklad 123:

5-(1,3-dioxo-l,3,4,5,6,7-hexahydro-isoindol-2-ylmethyl)-2-(oxalyl-amino) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

2-(1,4,8-trioxa-spiro[4,5]dec-7-ylmethylester)-4,5, 6, 7tetrahydro-isoindol-1,3-dion 73,1 mg (62 %) ve formě oleje.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,42 - 1,58 (m, 2H) , 2,24 (m, 2H) , 2,62 (m, 2H) , 3,10 (m, 2H) , 3,50 (m, 2H) , 3,71 (m, 3H) , 3,94 (m, 6H), 5,9 (m, 2H).

2-(4-oxo-tetrahydropyran-2-ylmethyl)-4,5, 6, 7-tetrahydroisoindol-1,3-dion 50 mg (92 %) ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 0,86 (m, 2H) , 1,64 (m, 2H) , 2,22 (m,

1H), 2,34 (m, 2H) , 2,61 (m, 3H) , 3,13 (m, 2H), 3,79 (m, 1H) ,

3,95 (m, 1H), 4,28 (m, 1H), 5,92 (m, 2H).

TerC-butylester kyseliny 2-amino-5-(1,3-dioxo-l, 3,4,5,6,7hexahydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3c]pyran-3-karboxylové se získal jako pevná látka po čištění » ····· • ·

203 • 99

9 ·

9 9 • © 9

9 9

999 99 »· •ι · » » • · · · • · · · • · · ·

99 preparativní TLC (Kieselgel 6OF254, 1 mm) za použití směsi hexanu a ethylacetátu (1:1) jako eluentu (36 mg, 47 %).

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,53 (s, 9H) , 2,22 (m, 2H) , 2,62 (m, 2H), 2,83 (m, 1H) , 3,11 (m, 2H) , 3,56 (m, 1H) , 3,83 (m, 2H) ,

4,50 (m, 2H), 5,89 (m, 2H).

MS m/z 419,5 (M+), 363,4 (M-57).

TerC-butylester kyseliny 2-(terC-butoxyoxalylamino-5-(1,3-dioxo-1,3,4,5,6,7-hexahydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové se získal po čištění preparativní TLC (Kieselgel 60F₂₅₄, 0,5 mm) za použití směsi hexanu a ethylacetátu (8:2) jako eluentu.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,60 (s, 18H) , 2,24 (m, 2H) , 2,92 (m, 3H), 3,14 (m, 2H) , 3,90 (m, 2H) , 4,11 (m, 1H) , 4,63 (m, 1H) , 4,78 (m, 1H), 5,91 (m, 2H).

MS m/z 545,5 (M-), 489,4 (M-57).

5-(1,3-dioxo-l,3,4,5,6,7-hexahydro-isoindol-2-ylmethyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina se získala jako pevná látka (17,2 mg, kvantitativní výtěžek).

^XH NMR (400 MHz, CD3OD) δ 2,28 (s, 2H) , 2,55 (m, 2H) , 2,97 (m, 2H), 3,31 (m, 2H), 3,56 - 3,93 (m, 3H), 4,70 (m, 2H), 5,91 (m, 2H) .

MS m/z 433,3 (M-).

Příklad 124:

2Ό4

2-(oxalyl-amino)-5-(1,1,3-trioxo-l,3-dihydro-lH-benzo[d]isothiazol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

XH NMR (400 MHz,	CD3OD) δ 8,09 - 7,8	(m, 4H),	4,85	-4,67	(m,
3H), 4,21 - 4,13	(m, 1H), 4,02 - 3,94	(m, 1H),	3,11	- 3,06	(m,
1H) , 2,90- 2,80	(m, 1H) .
MS (ESI (-)) : 465.
HPLC (254,4 nm):	2,31, s, 99 %.
Příklad 125:	.0 -

5-[ (4-methoxy-benzensulfonylamino) -methyl]-2- (oxalyl-amino) 4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina K roztoku tert-butylester kyseliny 2-amino-5-aminomethyl-4,7dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (101 mg, 0,35 mmol) v dichloromethanu (1 ml)se přidal pyridin (32 μΐ, 0,39 mmol) a 4-methoxybenzensulfonylchlorid (82 mg, 0,39 mmol). Reakční směs se míchala při teplotě místnsoti po dobu 48 hodin. Reakční směs se ředila dichloromethanem (2 ml) a podrobila se preparativní TLC (1:1 hexan/ethylacetát) . Vzniklo 10 mg (10 %) terC-butylesteru kyseliny 2-amino-5-((4-methoxybenzensulfonylamino) -methyl) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran3-karboxylové ve formě pevné látky.

XH NMR (400 MHz,	CDCI3) δ	7,82	(d, J =	9 Hz,	2H), 6,	93 (d,	J =
9 Hz, 2H), 5,3 (bs, 2H),	4,57	(s, 2H)	, 3,84	(s, 3H)	, 3,72	(m,
1H), 3,10 - 3,06	(m, 1H),	2,95	- 2,87	(m, 1H)	, 2,69	- 2,64	(m,
1H) , 2,41 - 2,32	(m, 1H),	1,47	(s, 9H)	•
MS: APCI(-): 453	[M-H].

K roztoku terú-butylesteru kyseliny 2-amino-5-((4-methoxybenzensulfonylamino) -methyl) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran3-karboxylové (8 mg, 0,017 mmol) v dichloromethanu (1 ml) se ···· · · · · ·· ·

2Ό5 : · ···· ··· ··· ·· ·· ·· přidal triethylamin (7,4 μΐ, 0,051 mmol) a terď-butylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (10 mg, 0,051 mmol) a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 16 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil v dichloromethanu (2 ml) . Roztok se čistil preparativní TLC za použití směsi 10 % methanol/90 % dichloromethan. Získalo se 10 mg (100 %) tert-butylesteru kyseliny 2-(tert-butoxyoxalylamino-5-((4-methoxy-benzensulfonylamino)-methyl)-4,7-dihydro5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 7,83 (d, J = 9 Hz, 2H) , 6,93 (d, J =

Hz, 2H) , 4,68 (m, 2H) , 3,85 (s, 3H) , 3,7 (m, 3H) , 3,29 3,22 (m, 1H) , 2,80 - 2,75 (m, 1H) , 2,53 - 2,43 (m, 1H) , 1,56 (s, 18H).

MS: APCI(+): 582,8 [M+H], 527 (-1 terť-Bu) .

TerC-butylester kyseliny 2-(terC-butoxyoxalyl-amino-5-((4methoxy-benzensulfonylamino)-methyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2, 3c]pyran-3-karboxylové (10 mg, 0,017 mmol) se přidal k roztoku 25 % kyseliny trifluorooctové v dichloromethanu (2 ml) .

Reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 2 hodiny. Rozpouštědlo se odstranilo odpařováním ve vakuu.

Zbytek se srážel přidáním diethyletheru a promyl se dvakrát diethyletherem. Po sušení vznikly 2 mg (25 %) 5-[ (4-methoxybenzensulfonylamino) -methyl]-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H•thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky. ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,78 (d, J = 9 Hz, 2H) , 7,02 (d, J = 9 Hz, 2H), 4,76 - 4,63 (m, 2H) , 3,84 (s, 3H) , 3,75 (m, 1H) , 3,50 - 3,47 (m, 2H), 2,89 - 2,83 (m, 1H), 2,52 - 2,42 (m, 1H). MS: APCI( + ): 471 [M+H],

Příklad 126

HO

OH

N-(6-hydroxy-3-hydroxymethyl-4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thiofen-2-yl)-oxalamová kyseliny

TerC-butylester 2-(ethoxyoxalyl-amino)-6-(2'-spiro[l', 3'Jdioxolan-6,7-dihydro-4H-benzo[b]thiofen-2-yl)-oxalamové kyseliny (20 g, 0,05 mol) se rozpustil ve směsi (1:4) kyseliny trifluorooctové a dichloromethanu (200 ml) obsahující vodu (1 ml) při teplotě 0 °C. Reakční směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 hodiny a při teplotě místnosti po dobu 20 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a pevný zbytek se titroval diethyletherem (2 x 100 ml) a sušil se ve vakuu, přičemž vzniklo 15,08 g (100 %) 2-(ethoxyoxalyl-amino)-6-oxo-4,5,6,7tetrahydro-benzo[b]thiofen-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

Ke směsi ethanolu (50 ml) a dichlormethanu (50 ml) se přidala 2-(ethoxyoxalyl-amino)-6-oxo-4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiofen•3-karboxylová kyselina (2 g, 6,43 mmol) následovaná borhydridem sodným (124 mg, v peletu). Výsledná směs se míchala při teplotě místnosti po další 4 hodiny. Reakční směs se rychle ochladila přidáním směsi vody (100 ml) a kyseliny mravenčí (100 ml) při teplotě 0 °C. Vodní fáze se extrahovala ethylacetátem (2 x 100 ml) a kombinované organické fáze se promyly solným roztokem (100 ml), sušily se Na₂SO₄, filtrovaly se a odpařily se ve vakuu, přičemž vzniklo 860 mg (43 %) N-(6hydroxy-3-hydroxymethyl-4,5,6, 7-tetrahydro-benzo[b]thio-fen-2yl)-oxalamová kyseliny ve formě pevné látky. Po té, co se nechal roztok stát po dobu 18 hodin se vodná fáze filtrovala a filtrační koláč se promyl vodou (2 x 15 ml) a sušil se ve vakuu, přičemž se získala další část 710 mg (48 %) N-(6·· ···

2Q7,

hydroxy-3-hydroxymethyl-4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thio-fen-2yl)-oxalamová kyseliny ve formě pevné látky, vypočteno pro C11H13N1O5S1 0,5 x H₂O

C 47,14 % H, 5,03 % N, 5,00 % zjištěno:

C 47,19 %, H 5,00 %, N 4,94 %.

Následující sloučenina se připravila podobným způsobem jak se popisuje v příkladu 81.

Příklad 127:

2-(oxalyl-amino)-6-(2'-spiro[l', 3 ']dioxolan-6,7-dihydro-4Hbenzo[b]thiofen-2-yl)-3-karboxylová kyselina M.p.zvětší než 250 °C vypočteno pro C13H13NO7S

C 47,70 % H, 4,00 % N, 4,28 % zjištěno:

C 47,93 %, H 4,09 %, N 4,27 %.

Příklad 128:

6-hydroxy-2-(oxalyl-amino)-4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thiofen3-karboxylová kyselina

Ethylester kyseliny 2-(ethoxyoxalyl-amino)-6-(2 'spiro[l', 3 Jdioxolan-6,7-dihydro-4H-benzo[b]thiofen-2-yl)-3karboxylové (8,7 g, 22,7 mmol) se rozpustil ve směsi 25 % *· ···<

2t)8 « · · · · • ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · kyseliny trifluorooctové v dichloromethanu (100 ml) chlazené v ledové lázni a přidala se voda (0,5 ml) . Reakční směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 2 hodin při teplotě místnosti po dobu 48 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethanolu (100 ml) a odpařil se ve vakuu (dvakrát). Pevný zbytek se promyl diethyletherem (80 ml) a sušil se ve vakuu při teplotě 50 °C, přičemž se získalo 6,68 g (88 %) ethylesteru kyseliny 2-(ethoxyoxalyl-amino)-6-oxo4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thiofen-3-karboxylové ve formě pevné látky.

K roztoku ethylesteru kyseliny 2-(ethoxyoxalyl-amino)-6-oxo4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thiofen-3-karboxylové (2 g, 5,89 mmol) ve směsi dichlormethanu (40 ml) a ethanolu (40 ml) se přidal borohydrát sodný (64 mg, 1,77 mmol). Reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 64 hodin, přidal se další borohydrid sodný (22,3 mg, 0,59 mmol) a míchání pokračovalo po dalších 18 hodin. Během dalších 6 hodin míchání se přidaly dvě další části borohydridu sodného (23 mg a 15 mg) . Do reakční směsi se přidal ledem chlazený saturovaný chlorid amonný (50 ml) a výsledná směs se extrahovala ethylacetátem (3 x 50 ml) . Kombinované organické extrakty se sušily (Na₂SO₄) , filtrovaly a odpařovaly ve vakuu. Zbytek se rozpustil dvakrát v ethylacetátu (100 ml) a odpařil se ve vakuu, pevný zbytek se promyl diethyletherem (80 ml) a sušil se ve vakuu při teplotě 50 °C. Získalo se 1,46 g (75 %) ethylesteru kyseliny 2-(ethoxyoxalyl-amino)-6-hydroxy-4,5,6,7tetrahydro-benzo[b]thiofen-3-karboxylové ve formě pevné látky. 1,35 g uvedeného materiálu se podrobilo kolonové chromatografii (solikagel) za použití směsi ethylacetátu a heptanu (1:1) jako eluentu. Sebraly se čisté frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Získalo se 0,9 g čistého ethylesteru kyseliny 2-(ethoxyoxalyl-amino)-6-hydroxy-4,5,6,7•tetrahydro-benzo[b]thiofen-3-karboxylové ve formě pevné látky.

	9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 209 :· :	• · · 9 • · 9 · • 9 9 9 9 9 9 9	• 9 9 '9 * 9 9 9 9 9
*H NMR (300 MHz, CDC13) δ	1,42 (m, 6H),	1,86 (m,	2H), 2,02 (m,
1H), 2,71 (dd, 1H), 2,85	(m, 1H), 3,00	(m, 2H),	4,19 (bs, 1H),
4,40 (dq, 4H), 12,45 (bs,	1H, NHCO) .
K roztoku shora popsaného	diethylesteru	(0,3 g,	0,88 mmol) ve

vodě (10 ml) se přidal 1 N hydroxid sodný (3,1 ml, 3,08 mmol). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 16 hodin. Vodná fáze se okyselila přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové v množství, aby hodnota pH byla 1. Reakční směs se odpařila ve vakuu na polovinu původního objemu. Sraženina se separovala filtrací, promyla malým množstvím diethyletheru a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 16 hodin. Vzniklo 130 mg (52 %) 6-hydroxy-2- (oxalylamino) -4,5,6, 7-tetrahydro-benzo[b]thiofen-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

M.p.: amorfní ^XH NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 1,63 (m, 1H) , 1,86 (m, 1H) , 2,5 (m, 1H, částečně zkresleno DMSO), 2,71 (m, 1H) , 2,86 (m, 2H), 3,91 (m, 1H), 4,87 (bs, 1H), 12,35 (bs, 1H, NtfCO).

Následující sloučenina se připravila podobným způsobem, jak se popisuje v příkladu 107.

Příklad 129:

5-(2-methyl-4-oxo-4H-chinazolin-3-ylmethyl)-2-(oxalyl-amino)•4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina ^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,32 (s, 1H) , 8,10 (d, J = 8 Hz,

1H),	7,80	(t,	J	= 7	Hz, 1H), 7,50 (d, J = 8 Hz, 1H),	7,49	(t,
J =	7 Hz,	1H)	r	4,78	(d, J = 15 Hz, 1H) , 4,53 (d, J	= 15	Hz,
1H) ,	4,39	(d,	J	= 15	Hz, 1H), 4,21 (dd, J = 15 Hz, 9	Hz,	1H) ,

2,65 (m,

4,00 - 3,94 (m, 1H) , 3,05 (d, J = 17 Hz, 1H), 2,74 1H, částečně zkresleno okolními vazbami), 2,68 (s, 3H).

¹³C NMR (100,6 MHz, DMSO-d₆) δ 167,7, 162,8, 161,6, 157,6 156,1, 148,3, 146,9, 136,0, 130,5, 127,9, 127,8, 126,5, 121,4 115,0, 74,4, 65, 9, 49,8, 31,4, 25, 0.

[M-H]': 4 42,1

HPLC (254,4 nm): 2,631 s, 81%.

Příklad 130:

y-oH o

o.

o

OH

7-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-2-(oxalylamino) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina Diethylacetal ftalimidoacetaldehydu (100 g, 0,38 mol) a 1 N kyselina chlorovodíková (600 ml) se míchala při teplotě výtoku po dobu 5 minut nebo až se dosáhlo homogenního roztoku. Reakční směs se ochladila a sraženina se separovala filtrací a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 16 hodin. Získalo se 63,3 g (88 %) ftalimidoacetaldehydu ve formě pevné látky.

^XH NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 4,58 (s, 2H) , 7,76 - 7,78 (m, 2H) ,

7,90 - 7,92 (m, 2H), 9,67 (s, 1H).

Ke směsi ftalimidoacetaldehydu (64 g, 0,34 mol) a trans-1methoxy-3-(trimethylsilyloxy)-1,3-butadien (81,5 g, 0,38 mol) v benzenu (600 ml) míchané po dobu 15 minut se v atmosféře dusíku přidal po kapkách 45 % roztok komplexu diethyletheru chloridu zinečnatého c dichloromethanu (55,5 ml, 0,17 mol) při teplotě 0 °C. Reakce se nechala ohřát na teplotu místnosti přes noc. K reakční směsi se přidala voda (500 ml) a výsledná směs se extrahovala ethylacetátem (200 ml) . Organický extrakt se promyi 1 N kyselinou chlorovodíkovou (2 x 200 ml) a solným roztokem (200 ml). ). Organická fáze se sušila (Na₂SO₄), ·· ···· • « · • ·»· ΛΠ...⁵ * »· ·· ·· ·· « · · · · · • · · · · · · • φ · φ · φ φ * • · · φ φ φ φ »·φ φφ φφ ·· filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Získal se pomalu krystalyzující olej (98 g) . Pevná látka se přidala do směsi ethylacetátu a diethyletheru (400 ml, 1:1) a výsledná sraženina se separovala filtrací, promyla se malou částí diethyletheru a sušila se při teplotě 50 °C po dobu 1 hodiny. Vzniklo 59,8 g (69 %) 2-(4-oxo-3,4-dihydro-2H-pyran-2ylmethyl)-isoindol-1,3-dionu jako pevné látky. Filtrát se odpařil ve vakuu a zbytek se podrobil kolonové chromatografii na silikagelu (11) za použití směsi ethylacetátu a heptanu (1:2) jako eluentu. Sebraly se čisté frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu do dosažení suchosti. Pevná látka se separovala filtrací a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C po dobu 16 hodin. Vzniklo dalších 15 g (17 %) 2-(4-oxo-3,4dihydro-2H-pyran-2-ylmethyl)-isoindol-1,3-dionu jako pevné látky.

^XH NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 2,61 (d, 2H) , 3,85 (dd, 1H) , 4,18 (dd, 1H), 4,76 (m, 1H) , 5,43 (d, 1H) , 7,28 (d, 1H) , 7,69 7,77 (m, 2H), 7,84 - 7,88 (m, 2H).

2-(4-oxo-3,4-dihydro-2H-pyran-2-ylmethyl)-isoindol-1,3-dion (13 g, 0,051 mol) se rozpustil v ethylacetátu (250 ml) a umístil se do Parrovy nádoby. Opatrně se přidalo 10 % Pd/C (1,5 g) a směs se míchala za tlaku 0,21 MPa vodíku po dobu 6,5 hodiny (zařízení Parr). Po odpaření následuje filtrace ethylacetátu ve vakuu. Získalo se 11,5 g 2-(4-oxo-tetrahydropyran-2-ylmethyl)-isoindol-1,3-dion, který je dostatečně čistý, aby se použil v dalším kroku. Analytická čistá sloučenina se získala čištěním malého vzorku (250 mg) kolonovou chromatografií na silikagelu, přičemž se využívá jako eluentu směs hexan/ethylacetát s gradientem (od 100/0 do 50/50). Sebraly se čisté frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Získalo se 142 mg (55 %) 2-(4-oxo-tetrahydro-pyran-2.ylmethyl)-isoindol-1,3-dionu ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 2,30 - 2, 68 (m, 4H) , 3,62 (m, 1H) ,

3,74 (m, 1H), 4,00 (m, 2H), 7,75 (m, 2H), 7,88 (m, 2H).

ΦΦ φφφφ * ♦ Φ φ φφφ φ φφ ·· φ • · · · φ φφ φ φφφ φφφφ ΦΦ ΦΦΦ Φφ 9 ΦΦΦ Φ » · ·

ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ Φ>

Ke směsi tert-butylkyanoacetátu (11,2 g, 0,079 mol),

2- (4-oxo-tetrahydro-pyran-2-ylmethyl)-isoindol-1,3-dionu (18,7 g, 0,072 mol) a elementární síry (2,5 g, 0,079 mol) v ethanolu se přidal morfolin (20 ml) a výsledná směs se míchala při teplotě 50 °C po dobu 3 hodin. Chlazená reakční směs se filtrovala a těkavé látky se odpařily ve vakuu. Ke zbytku se přidala voda (200 ml) a diethylether 100 ml. Sraženina se separovala filtrací a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C.

Vzniklo 9,1 g (30 %) tert-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(1,3dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5Hthieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

Filtrát se extrahoval s ethylacetátem (2 x 150 ml) a promyl se solným roztokem (100 ml) , sušil se (Na₂SO₄) , filtroval se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek (20 g) se čistil kolonovou chromatografií na silikagelu (1 1) za použití směsi hexanu a ethylacetátu (1:2) jako ředidla. Sebraly se čisté frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se promyl diethyltherem a pevná látka se separovala filtrací a sušila se při teplotě 50 °C. Získaly se další 2,2 g (7 %) tertbutylesteru kyseliny 2-amino-5-(1,3-dioxo-l, 3-dihydroisoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylové jako pevné látky.

Filtrát se odpařil ve vakuu a získalo se 10,2 g (34 %) skoro suchého terč-butylesteru kyseliny 2-amino-7-(1,3-dioxo-l, 3dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran3- karboxylové ve formě oleje.

terC-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(1,3-dioxo-l,3-dihydroisoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylové ^XH NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 1,50 (s, 9H) , 2,54 - 2,63 (m, IH) , 2, 84 - 2,90 (m, IH) , 3,79 (q, IH) , 3,96 - 4,04 (m, 2H) , 5,91 (bs, 2H, NH₂), 7,70 (m, 2H) , 7,84 (m, 2H) .

• · · ·

terf-butylesteru kyseliny 2-amino-7-(1,3-dioxo-l, 3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ^XH NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 1,50 (s, 9H) , 2,71 - 2,90 (m, 1H) ,

3, 67 - 3,77 (m, 2H) , 4,02 - 4,15 (m, 2H) , 4,90 (m, 1H) , 6,04 (bs, 2H, NH₂) , 7,70 (m, 2H) , 7,84 (m, 2H) .

Směs terč-butylesteru kyseliny 2-amino-7-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (10,2 g 0,25 mol), tert-butylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (7,2 g, 0,037 mol) v suchém tetrahydrofuranu (150 ml) se míchala při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Pak se přidala další část tert-butylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (2,0 g, 0,01 mol) a výsledná směs se míchala po dobu 16 hodin při teplotě místnosti. Sraženina se separovala filtrací, promyla se malou částí diethyletheru a sušila se ve vakuu. Získalo se 3,5 g (26 %) terč-butylesteru kyseliny 2-(terC-butoxyoxalylamino)-7-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

Filtrát se odpařil ve vakuu a ke zbytku se přidala voda (100 ml) a ethylacetát (100 ml). Sraženina se separovala filtrací a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C a získalo se 0,8 g (6 %) terC-butylesteru kyseliny 2-(terť-butoxyoxalylamino)-7-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (300 MHz, CDCI3) δ 1,60 (s, 9H) , 1,62 (s, 9H) , 2,79 2,97 (m, 2H), 3,73 (m, 1H), 3,83 - 3,88 (dd, 1H), 4,07 - 4,16 (m, 2H), 5,09 (m, 1H) , 7,71 (m, 2H) , 7,85 (m, 2H) , 12,55 (bs,

1H, NHCO) .

Shora v textu popsaná sloučenina terf-butylesteru kyseliny 2-('terC-butoxyoxalylamino) -7- (1,3-dioxo-l, 3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (0,8 g, 1,47 mmol) se přidala k roztoku 25 % kyseliny • · · ·

214 trifluorooctové v dichloromethanu (30 ml) . Reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 6 hodin. Rospouštědlo se odstranilo ve vakuu. Zbytek se precipitoval přidáním diethyletheru, separoval se filtrací a sušil se ve vakuu při teplotě 50 °C a získalo se 0,5 g (79 %) 7-(1,3-dioxo-l,3dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5Hthieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky. M.p. je větší než 250 °C vypočteno pro Ci9Hi₄N₂O₈S 0,5 x H₂O

C 51,94 % H, 3,44 % N, 6,38 % zj ištěno:

C 52,02 %, H 3,37 %, N 6,48 %.

Příklad 131:

7-(acetylamino-methyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5Hthieno[2, 3-c]pyran-3-karboxylová kyselina

Ke směsi tert-butylesteru kyseliny 7-(1,3-dioxo-l,3-dihydroisoindol-2-ylmethyl) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylové (6 g, 0,014 mol) v ethanolu (100 ml) se přidal hydrazinhydrát (1,4 ml, 0,028 mol). Výsledná reakční směs se míchala při teplotě odtoku po dobu 1 hodiny. Pak se ochladila a nerozpustná hmota se odfiltrovala a sušila se ve vakuu. Ke zbytku se přidala voda (100 ml) a výsledná směs se extrahovala diethyletherem (2 x 100 ml). Kombinované organické extrakty se promyly solným roztokem (100 ml), sušily se (Na₂SO₄), filtrovaly se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Získalo se

215 • · ··

2,9 g (71 %) tert-butylesteru kyseliny 2-amino-7-aminomethyl*4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě oleje.

^XH NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 1,55 (s, 9H) , 2,70 - 2,97 (m, 4H) , 3,69 - 3,78 (m, 1H), 4,13 (m, 1H), 4,50 (m, 1H), 6,09 (bs, 2H, thiofen-NH₂) .

K roztoku chlazeném vodou s ledem shora v textu popsaném terfc«-butylesteru kyseliny 2-amino-7-aminomethyl-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (1,5 g, 5,27 mmol) a triethylamin (1,5 ml) v dichlormethanu (50 ml) se po kapkách přidal acetylchlorid (0,46 g, 5,80 mmol). Reakční směs se nechala zahřát na teplotu místnosti a míchala se dalších 30 minut. Reakční směs se promyla vodou (2 x 25 ml), sušila se (Na₂SO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek se čistil na chromatografické koloně na silikagelu (1 1) za použití ethylacetátu a pak se použila směs ethylacetátu a ethanolu (20:1) jako eluentů. Sebraly se čisté frakce a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu a získalo se 0,3 g (17 %) terC-butylesteru kyseliny 7-(acetylamino-methyl)-2-amino-4,7- dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové.

^XH NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 1,56 (s, 9H) , 1,99 (s, 3H) , 2,77 (m, 2H), 3,19 (m, 1H) , 3,67 - 3,79 (m, 2H) , 4,09 - 4,16 (m, 1H) ,

4,63 (m, 1H), 5,91 (bs, 1H), 6,10 (bs, 2H).

Ke směsi shora popsaného terC-butylesteru kyseliny 7- (acetylamino-methyl) -2-amino-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran—3-karboxylové (0,3 g, 0,92 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (40 ml) se po kapkách přidávala směs tert-butylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (22 mg, 1,10 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (5 ml) . Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (100 ml) a promyl se vodou (50 ml) a solným roztokem (50 ml). Organická fáze se promyla se sušila (Na₂SO₄) , filtrovala se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Zbytek (0,4 g) se smíchal se směsí diisopropyletheru (5 ml) a

216 • · diethyletheru (5 ml). Sraženina se separovala filtrací a filtrát se odpařoval ve vakuu. Získalo se 0,25 g (60 %) terC-butylesteru kyseliny 7-(acetylamino-methyl)-2-(ter€-butoxyoxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě oleje.

^XH NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 1,64 (s, 9H) , 1,65 (s, 9H) , 2,02 (s,

3H), 2,87 (m, 2H), 3,29 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 3,89 (ddd, 1H),

4,18 (m, 1H), 4,78 (m, 1H) , 5,93 (bs, 1H, NHCOMe) , 12,5 (s,

1H, NHCOCOOH).

Shora v textu uvedená sloučenina terč-butylesteru kyselipy 7-(acetylamino-methyl)-2-(terC-butoxyoxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové (0,2 g, 0,44 mmol) se přidala k roztoku 25 % kyseliny trifluorooctové v dichloromethanu (20 ml) . Reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. V této době se rozpouštědlo odpařilo ve vakuu. Zbytek se srážel přidáním diethyletheru, filtroval se a sušil se ve vakuu při teplotě 50 °C. Získalo se 0,11 g (73 %) 7-(acetylamino-methyl)-2-(oxalyl-amino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

M.p. : 220 cÁ-222 °C ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 1,87 (s, 3H) , 2,82 (bs, 2H) , 3,19 (m, 1H), 3,51 (m, 1H) , 3,67 (m, 1H) , 4,07 (m, 1H) , 4,69 (m,

1H), 8,14 (t, 1H, NHCOMe), 12,3 (s, 1H, NHCOCOOH).

Příklad 132:

THF ·

K terC-butylesteru kyseliny 2-amino-5-(1,3-dioxo-l,3-dihydroisoindol-2-ylmethyl) -4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3karboxylové (4,5 g, 0,011 mol) rozpuštěném v dichloromethanu (30 ml) se přidal uhličitan sodný (1 g, 0,011 mol) rozpuštěný ve vodě (16 ml) . Reakční směs se ochladila na teplotu 0 °C a přidal se 9-fluorenylmethylchlorofomát (3 g, 0,012 mol). Po míchání po dobu 15 minut se reakční směs zahřála na teplotu místnosti a míchala se po dobu 16 hodin. Organická fáze se separovala a promyla se solným roztokem (10 ml). Vodná fáze se extrahovala dichloromethanem (2 x 20 ml) a kombinované organické fáze se sušily (MgSO₄) , filtrovaly se a odpařily se ve vakuu za vzniku oranžové pevné látky, která se čistila chromatografii za použití dichloromethanu jako eluentu.

Sebraly se čisté frakce a odpařily se ve vakuu. Získalo se 5,6 g (81 %) terC-butylesteru kyseliny 5-(1,3-dioxo-l,3-dihydroisoindol-2-ylmethyl)-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxykarbonylamino)4,7-dihydro-5H-thieno[2, 3-c]pyran-3-karboxylové.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 10,60 (bs, 1H) , 7,87 - 7,84 (m, 2H) ,

7,75	(d,	J =	8 Hz, 2H), 7,73 - 7,70	(m,	2H) , 7,60	(d,	J = 8
Hz,	2H) ,	7,39	(t, J = 8 Hz, 2H) , 7,30	(t,	J = 8 Hz,	2H)	, 4,74
(d,	J =	14 Hz	, 1H), 4,62 (d, J = 14	Hz,	1H), 4,48	(d,	J = 7
Hz,	2H) ,	4,27	(t, J = 7 Hz, 1H) , 4,05	- 4,	,00 (m, 2H)	, 3,	86 -3,

218,

(m, 1H) , 2,92 (d, J = 17 Hz, 1H) , 2,64 (dd, J = 17,9 Hz,

1H), 1,59 (s, 9H).

LC/MS [M+H]⁺: 637, 4 9

Ke shora v textu popsané látce thieno[2,3-c]pyran chráněné F- moc (5,5 g, 8,6 mmol) se přidalo při teplotě 0 °C k roztoku 20 % kyseliny trifluorooctové v dichloromethanu (30 ml). Reakce se míchala po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. Těkavé látky se odpařovaly ve vakuu a zbytek se srážel s diethyletherem, separoval se filtrací a sušil se. Získalo se 4,2 g (85 %) kyseliny 5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxy-karbonylamino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10,22 (br s, 1H) , 7,88 (d, J = 5

Hz, 2H) 7,88 - 7,82 (m, 4H) , 7,66 (d, J = 5 Hz, 2H), 7,40 (t, J = 5 Hz, 2H) , 7,32 (t, J = 5 Hz, 2H) , 4,68 -4,48 (m, 4H) , 4,34 (t, J = 5 Hz, 1H), 3,90 - 3,81 (m, 2H) , 3,72 - 3, 67 (m,

1H), 2,51 (m, 1H).

K pryskyřici Wang (3,75 mg, 4,5 mmol) se přidalo dichloromethan (50 ml) a směs se ochladila na teplotu 0 °C v' atmosféře dusíku. Přidal se diisopropylethylamin (25 ml) a pak následoval methansulfonylchlorid (2,25 ml, 29 mmol). Reakce se míchala při teplotě 0 °C po dobu 30 minut, pak při teplotě místnosti dalších 30 minut. Pryskyřice se separovala filtrací a promyla se dichloromethanem (2 x 30 ml), N-methylpyrrolidinonem (20 ml) a opět s dichloromethanem (2 x 30 ml) . Methansulfonylester pryskyřice Wang se sušil ve vakuu po dobu 2 hodiny a použil se přímo v dalším kroku.

Ke shora popsanému methansulfonylester pryskyřice Wang a 5-(1,3-dioxo-l,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxy-karbonylamino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2, 3-c]pyran-3karboxylové kyselině (4,85 g, 8,4 mmol) se přidal N-methylpyrrolidinon (45 ml). Přidal se uhličitan česný (2,2 g, 6,7 mmol) a reakce se míchala v atmosféře dusíku po dobu 16

hodin a pak při teplotě 80 °C po dobu 36 hodin. Směs se ochladila na teplotu místnosti, pruskyřice se separovala filtrací, promyla se vodou, methanolem a opakovaně dichloromethanem a sušila se ve vakuu po dobu 2 hodin. Získal se ester Wang pryskyřice kyseliny 5-(1,3-dioxo-l,3-dihydroisoindol-2-ylmethyl)-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxy-karbonylamino)4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové.

Shora v textu popsaný ester Wang pryskyřice (4,85 g) se míchal v roztoku 20 % piperidinu v tetrahydrofuranu (20 ml) po dobu 45 minut. Pryskyřice se pak separovala filtrací, promyla se tetrahydrofuranem (2 x 20 ml) , methanolem (2 x 20 ml) a dichloromethanem (3 x 20 ml) a sušila se ve vakuu po dobu 3 hodiny. Vznikl ester Wang pryskyřice kyseliny 2-amino-5-(1,3dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl) -4,7-dihydro-5Hthieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové.

Shora v textu popsaný ester Wang pryskyřice (4,85 g) se suspendoval ve směsi dichloromethanu (50 ml) a triethylaminu (3 ml). V atmosféře dusíku se přidal tert-butylesteru kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (4,2 g, 0,021 mmol) a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 16 hodin. Pryskyřice se separovala filtrací a promyla se methanolem (30 ml), dichloromethanem (30 ml). Tento způsob se opakoval dvakrát. Pryskyřice se sušila ve vakuu po dobu několika hodin a získal se komplex kyseliny 2-(tertbutoxyoxalyl-amino)-5-(1,3-dioxo1,3-dihydro-isoindol-2-ylmethyl)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3c]pyran-3-karboxylové-Wang pryskyřice.

Malý vzorek shora popsaného esteru Wang pryskyřice se ošetřil 20 % kyselinou trifluorooctové v dichloromethanu (3 ml) po dobu 1 hodiny. Pryskyřice se separovala filtrací a filtrát se koncentroval ve vakuu. Zbytek se dvakrát odpařil z dichloromethanu. Vzniklo 30 mg pevné látky, která měla hodnotu ^XH NMR a MS stejnou jako látka syntetizovaná v příkladu 106. Nanesení Wang pryskyřice se stanovilo jako 0,6 mmol/g.

Φ ·

Φ ·

220

Shora v textu popsaný ester Wang pryskyřice (3 g, 1,8 mmol)) se suspendoval v dichloromethanu (25 ml) . Přidal se hydrazin (0,14 ml, 4,5 mmol) a reakce se míchala v atmosféře dusíku při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Pryskyřice se separovala filtrací a promyla se několokrát buď methanolem nebo dichloromethanem. Shromáždil se filtrát a koncentroval se. Získalo se 260 mg pevné látky. Stanovilo se, že reakce není úplná a pryskyřice se supsendovala opět v dichloromethanu (15 ml) a ošetřila se hydrazinem (50 μΐ) po dalších 16 hodin. Pryskyřice se separovala filtrací a promyla se několokrát buď methanolem nebo dichloromethanem. Z filtrátu se získalo dalších 30 mg meziproduktu. V tomto bodě se zjistilo, že reakce je úplná a pryskyřice se sušila ve vakuu po dobu 3 hodiny. Získalo se 2,67 g 5-aminomethyl-2-(terCbutoxyoxalylamino)-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylová kyselina-Wang pryskyřice. Pryskyřice je pozitivní v ninhydrinovém testu pro aminy.

Shora v textu popsaný ester Wang pryskyřice (2,67 g) se suspendoval ve směsi tetrahydrofuranu a dichloromethanu (1:1, 90 ml) a nanesl se na OntoBlock (80 prohlubní, 0,02 mmol v každé prohlubni). Bloky se vypouštěly. Zatím se 80 karboxylových kyselin navážilo do jednotlivých zkumavek (0,044 mmol na jednu zkumavku) . Připravil se roztok hydrochlorid 1(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (0,85 g, 4,4 mmol), 1-hydroxy-benzotriazolhydrátu (0,6 g, 4,4 mmol) a triethylaminu (1,1 ml, 8 mmol) v N,N,-dimethylformamidu (100 ml). tento roztok se přidal do každé zkumavky (1 ml na zkumavku) a pak se obsah každé zkumavky přenesl do prohlubně zařízení OntoBlock (aby se dosáhlo plné rozpustnosti, tak se zkumavky sonikovaly). Bloky se pak kolébaly po dobu dvou dní. Po tento čas se bloky nechaly vytékat a promývaly se methanolem a dichloromethanem. Bloky se pak umístily do vakuové sušárny po dobu 2 hodin, pak se přidal do každé prohlubně 1 ml roztoku tert-butylester kyseliny imidazol-l-yl221

BB ···· Β BB ·· • · · ΒΒΒΒ ΒΒΒΒ

Β ΒΒΒ ΒΒΒ Β Β Β Β • ·· ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒ # Β ΒΒΒΒΒΒΒ

ΒΒΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ oxo-octové (0,2 Μ v dichloromethanu). Bloky se pak houpaly po dobu 16 hodin. Pak se bloky znovu promyly za použití methody uvedené shora v textu. Po promytí se přidal do každé prohlubně 1 ml roztoku 20 % kyseliny trifluorooctové v dichloromethanu a nechal se sednout po dobu 45 minut. Bloky se nechaly vytékat a filtráty se shromáždily na mikrotitrační destičce. Prohlubně se ošetřily dalším 0,5 ml roztoku 20 % kyseliny trifluoroctové v dichloromethanu a opět se shromáždil filtrát. Těkavé látky se odpařily ve vakuu. Na mikrotitrační destičce vzniklo 80 sloučenin ve formě pevné látky. Destička se analyzovala hmotnostní spektrofotometrií. 66 z prohlubní obsahovala očekávaný produkt jako molekulární iont.

X_x je bod navázání procento znamená plochu pod pikem HPLC při vlnové délce 220 nm.

R-skupina	vzorec	' mol. hmioitv..	LC/MS
o ó		496,50	495 (M-H,21%)
X.	θ2θΗ2θΝ2θθδ	464,45	463 (M-H,30%)

·· ···· • · · • · ··

222

F A Fzv 1 F	C20H14F6N2O7S	540,40	539 (M-H, 16%)
σ'	C18H22N2O7S	410,45	409 (M-H,33%)
x,	C20H21N3O7S	447,47	446 (M-H,39%)
	C20H19N3O8S	461,45	460 (M-H,38%)
X,	C18H20N2O7S	408,43	407 (M-H,40%)
A X,	C19H18N2O8S	434,43	433 (M-H,49%)
►VS/*. Φ x,	C20H21N3O7S	447,47	446 (M-H,38%)
6	C24H20N2O8S	496,50	495 (M-H,47%)
0 0'^'CM, o X,	C20H18N2O9S	462,44	444 (M-H2O)
z	C15H16N2O7S	368,37	367 (M-H,33%)
o-Z	C21H20N2O8S	460,47	459 (M-H,31%)
s X.	C17H20N2O8S	412,42	411 (M-H,30%)

• · ··· · • · · · • ···

223 .: ’ .

····*·· ·

<A 1 X,	C17H16N2O7S2	424,45	423 (M-H,16%)
H ιαχα*·	C20H17N3O7S	443,44	557 (M+TFA, 36%)
X, CQ H	C20H17N3O7S	443,44	442 (M-H,37%)
Χ1Ί3Ο H	C20H17N3O7S	443,44	425 (M-H2O,23%)
A CT	C19H17N3O7S	431,43	430 (M-H,48%)
	C21H18N2O8S	458,45	414 (M-CO2,24%)
	C26H24N2O9S	540,55	539 (M-H,17%)
u°	C21H16N2O9S	472,43	471 (M-H,35%)
o£xA ď	C27H23N3O8S	549,56	663 (M+TFA,36%)
	C18H16N2O7S2	436,47	437 (M+H,45%)
O7“	C20H20N207S	432,46	431 (M-H,20%)
9	C16H14N2O8S	394,36	393 (M-H,43%)

«· ··?· • · ·· ··

224

	C22H18N2O7S	454,46	453 (Μ-Η,42%)
	C19H18N2O8S	434,43	433 (Μ-Η,22%)
ο, χ,	C19H18N2O7S	418,43	417 (Μ-Η,28%)
CA·	C21H22N2O9S	478,48	477 (Μ-Η.25%)
*1	C21H22N2O8S	462,48	461 (Μ-Η,33%)
ď	C20H18N2O7S	430,44	429 (Μ-Η,57%)
~Ά	C22H22N2O9S	490,49	446 (M-CO2,42%)
Η Ν-^/χι	C16H17N3O8S	411,39	410 (Μ-Η,14%)
r— Ο 9 κ	C16H14N2O8S	394,36	393 (Μ-Η, 39%)
9 X,	C16H14N2O7S2	410,43	409 (Μ-Η,51%)
Qf Μ ° *,	C21H17N3O9S	487,45	486 (Μ-Η, 17%)
^Ν-γΛ CJ Ν	C16H14N4O7S	406,38	405 (Μ-Η, 17%)
(ΆΑ τ<0' ' χ,λ.	C17H15N3O8S	421,39	420 (Μ-Η, 18%)

225 ·««

4 ·

4·4

• 4 4 4 • 4

44

	C17H15N3O7S	405,39	404 (M-H,43%)
Cf	C17H15N3O7S	405,39	404 (M-H,41%)
f F-U 1 <>	C21H16F6N2O7S	554,43	553 (M-H, 18%)
σ%	C20H20N209S2	496,52	495 (M-H,51%)
σ ρνίχσ F	C20H16F2N2O7S	466,42	465 (M-H,43%)
σ	C16H16N2O8S	396,38	510 (M+TFA,21%)
οί^ 0	C22H19N3O9S	501,48	500 (M-H,23%)
	C18H22N2O8S	426,45	425 (M-H,24%)
CH, X,	C21H23N3O7S	461,50	460 (M-H,23%)
ΡΆ 7' x.	C19H16N2O9S	448,41	447 (M-H,42%)
co)-	C22H23N3O8S	489,51	488 (M-H,33%)
Λ ď	C20H18N2O9S	462,44	418 (M-CO2,27%)

φ

226 ·· ···· • · • ··· • · ·

• 9 99

9 9 · * ♦ ♦ * • 9 9 ·

9 9 9

9 9 9

	C20H18N2O8S	446,44	445 (Μ-Η,16%)
ο/ 0	C20H19N3O8S	461,45	460 (Μ-Η,21%)
χ,	C16H18N2O8S	398,39	380 (Μ-Η2Ο.25%)
</	C18H16N2O8S	420,40	421 (Μ+Η,39%)
O^N^Xj Η 1	C15H17N3O8S	399,38	398 (Μ-Η,19%)
9 8ί χ.	C19H18N2O7S2	450,49	449 (Μ-Η,23%)
C\ S λ	C20H20N207S2	464,52	463 (Μ-Η.31%)
χ,ν° CO Η	C21H17N3O8S	471,45	470 (Μ-Η,32%)
0 σΓ' Η	C22H19N3O8S	485,48	není zásah
ο Π *Ν ° I X.	C20H17N3010S	491,44	není zásah
CUA Η	C22H21N3O8S	487,49	486 (M-H,17%)
θ' 0	C18H21N3O8S	439,45	438 (M-H.30%)

227

vp <ύύνι tc xi H	C25H21N5O9S	567,54	566 (M-H,32%)
x,	C23H22N2O10S	518,50	519 (M+H, 15%)
aR”	C21H20N4O7S	472,48	471 (M-H,41%)
H.C'''-X· 0;=z^-° \\	C23H21N3O9S	515,50	514 (M-H,45%)
<AA H	C16H19N3O8S	413,41	412 (M-H,26%)
V *«	C18H23N3O8S2	473,53	472 (M-H,31%)
^yVI os x, 0	C25H25N3O9S	543,56	542 (M-H,20%)
Λ-V	C18H23N3O8S	441,46	440 (M-H,28%)
<A? Ί ’ 0 X.	C28H23N3O9S	577,57	576 (M-H, 17%)
	C18H16N2O8S	420,40	419 (M-H,34%)
-¾ I X,	C22H22N2O7S	458,49	457 (M-H,22%)
A	C26H18N2O9S	534,51	není zásah

22^:.....· ► · · · « • · • · ··

Λ	C23H20N2O8S	484,49 /	není zásah
ο	C21H16N2O9S	472,43	471 (Μ-Η,30%)
go χ,	C21H18N2O8S	458,45	457 (Μ-Η,27%)
γΎ^ ° *.	C22H19N3O9S	501,48	500 (Μ-Η,30%)

229

Příklad 133:

sodná sůl kyseliny 2-amino-5-aminomethyl-4,7-dihydro-5H- thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové

K míchanému roztoku methylesteru kyseliny 3-amino-thieno[2,3c]pyridin-2-karboxylové (1 g, 4,8 mmol), triethyleminu (1 ml, 720 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (50 ml) při teplotě 0 °C se po kapkách přidal roztok ethyloaxalylchloridu (0,8 g, 5,76 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (5 ml).Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 3 hodin a nalila se do vody s ledem (200 ml) . Sraženina se separovala filtrací a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C. Získalo se 0,9 g (61 %) methylesteru 3- (ethoxyoxalyl-amino) -thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové jako pecné látky.

Roztok shora popsaného methylesteru kyseliny thieno[2,3-c]pyridin-2-karboxylové (0,5 g, 1,62 mmol) v ethanolu (20 ml) se přidal k roztoku hydroxidu sodného (0,2 g, 4,87 mmol) ve vodě (10 ml) . Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin, okyselila se na hodnotu pH 4 přidáním IN vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, přičemž se sraženina separovala filtrací a promyla se vodou (2 x 50 ml), diethyletherem (2 x 30 ml) a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C. Získalo se 130 mg (30 %) sodné sole kyseliny

2-amino-5-aminomethyl-4,7-dihydro-5H-thieno[2,3-c]pyran-3-karboxylové ve formě pevné látky.

M. p. je větší než 250 °C vypočteno pro CioHs^OsSiNai 1 x H₂O C 39,22% H, 2,30 % N, 9,15 %

230

zj ištěno:

C 39,32 %, H 2,35 %, N 8,89%.

Příklad 134:

7-(oxalyl-amino)-thieno[2,3-b]pyrazin-3-karboxylová kyselina K roztoku methylesteru kyseliny 6-amino-thieno[2,3-b]pyrazin-7•karboxylové (62,7 mg, 0,3 mmol) v tetrahydrofuranu (0,5 ml) se přidal tert-butylester kyseliny imidazol-l-yl-oxo-octové (117,6 mg, 0,6 mmol) a triethylamin (42 μΐ, 0,3 mmol). Výsledná směs se míchala po dobu 20 hodin při teplotě místnosti.

Těkavé látky se odstranily ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (5 ml) , promyl se 1 % kyselinou chlorovodíkovou (2x2 ml), vodou (2x2 ml), sušil se (MgSO₄) , filtroval se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Získalo se 96 mg (95 %) methylesteru kyseliny 6-(terč-butoxyoxalylamino)-thieno[2,3b]pyrazin-7-karboxylové ve formě pevné látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,60 (s, 9H) , 3,80 (s, 3H) , 8,60 (d,

J = 1,5 Hz, IH), 8,70 (d, J = 1,5 Hz, IH).

K roztoku shora popsaného methylesteru kyseliny 6-(terCbutoxyoxalylamino)-thieno[2,3-b]pyrazin-7-karboxylové (37,8 mg, 0,112 mmol) v dioxanu (1,2 ml) se přidal hydroxid litný (45 mg) a voda (0,6 ml) a směs se míchala po dobu 20 hodin při teplotě místnosti. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (30 ml), promyl se 1 N kyselinou chlorovodíkovou (3x3 ml), vodou (3x3 mlú, sušil se Na₂SO₄) , filtroval se a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu. Získalo se 20 mg (67 %) 7-(oxalyl-amino)-thieno[2,3-b]pyrazin-3karboxylové kyseliny ve formě pevné látky.

231.· ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,64 (d, J = 1,5 Hz, 1H) , 8,66 (d, J = 1,5 Hz, 1H) .

MS m/z 150,00 (M-117) ztráta COOH a COCOOH.

Příklad 135:

5-(oxalyl-amino)2,3-dihydro-thieno[2,3-b]furan-4-karboxylová kyselina

K roztoku dihydro-furan-3-on (11,5 g, 0,134 mol, připraveném způsobem, jak se popisuje v Org. Syn. Coll. Vol. 5, 866) v ethanolu (200 ml) se přidal ethylkyanoacetát (16,6 g, 0,147 mol), síra (4,7 g, 0,147 mol) a morfolin (15 ml). Slabě exothermní reakce se míchala při teplotě 45 °C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se ochladila, filtrovala a filtrát se odpařil ve vakuu. Výsledný olej se rozpustil v ethylacetátu (400 ml), promyl se vodou (2 x 100 ml, solným roztokem (100 ml) a sušil se (Na₂SO₄) . Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu a zbytek (28 g) se podrobil chromatografií (1 1 silikagel) za použití směsi ethylacetátu/hexanu (1:1) jako eluentu. Shromáždily se semičisté frakce a po odpařené ve vakuu se získalo 8,4 g surového ethylesteru kyseliny 5-amino-2,3dihydro-thieno[2,3-b]furan-4-karboxylové ve formě oleje.

Ke shora popsanému ethylesteru kyseliny 5-amino-2,3-dihydrothieno[2,3-b]furan-4-karboxylové (8,4 g, 0,039 mol) rozpuštěném v suchém tetrahydrofuranu (150 ml) se přidal triethylamin (10 ml) a po kapkách směs ethyloxalylchloridu (4,9 g, 0,043 mol) v tetrahydrofuranu (25 ml) v atmosféře dusíku. Výsledná reakční směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Těkavé látky se odpařily ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (400 ml). Organická fáze se promyla vodou (200 ·· « 4 • · ·· ²³^:λ ml), solným roztokem (100 ml) a sušil se (Na2SO₄) , filtrovala se a odpařila se ve vakuu. Zbytek se filtroval skrz silikagel za použití směsi ethylacetátu/hexanu (1:1) jako

Rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu a 1 silikagel) (1:2) jako eluentu chromatografii (1 ethylacetátu/hexanu semičisté frakce a zbytek se za eluentu. podrobil použití směsi Shromáždily se po odpaření ve vakuu a promytí zbytku diethyletherem se získalo 0,5 g (1,2 %) ethylesteru kyseliny

5-(ethoxyoxalyl-amino)-2,3-dihydro-thieno[2,3-b]furan-4karboxylové.

K roztoku ethylesteru kyseliny 5-(ethoxyoxalyl-amino)-2,3dihydro-thieno[2,3-b]furan-4-karboxylové (0,4 g, 1,2 mmol) ve směsi s ethanolem (10 ml) a vodou (25 ml) se přidal roztok 1 N hydroxidu sodného (3,8 ml, 3,8 mmol). Směs se míchala po dobu 20 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se ředila vodou (50 ml) a promyla se ethylacetátem (50 ml) . Vodná fáze se okyselila 1 N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 2. Sraženina se separovala filtrací a promyla se vodou, sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C. Získalo se podle NMR 0,2 g ethylesteru kyseliny 5-(oxalyl-amino)-2,3-dihydro-thieno[2,3b]furan-4-karboxylové. Monoester se rozpustil ve směsi vody (40 ml) a ethanolu (10. ml) a k této směsi se přidal 1 N hydroxid sodný (3 ml, 3 mmol) . Směs se míchala po dobu 20 hodin při teplotě místnosti. Směs se okyselila 1 N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 2 a sraženina se separovala filtrací, promyla se vodou a sušila se ve vakuu při teplotě 50 °C. Získalo 150 mg (46 %) 5-(oxalyl-amino)2,3-dihydrothieno[2,3-b]furan-4-karboxylové kyseliny ve formě pevné látky. M.p. je větší než 250 °C ^XH NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 3,12 (t, H) , 4,89 (t,2H), 12 (bs,

1H, NHCO) .

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina, která splňuje následující tři kritéria:

   1) vykazuje strukturu danou obecným vzorcem I:

   kde R, R₂ a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin,
2. 2) působí jako ligand jednotky rozeznávající fosfotyrosin, přičemž se upřednostňuje inhibitor nebo modulátor jedné nebo více PTPas nebo proteiny, které obsahují domény SH2 a
3. 3) mají molekulovou hmotnost nižší nebo rovnou 2 500 Da.

   2. Sloučenina podle nároku 1, která má strukturu danou obecným vzorcem II ·- kde R, Ri a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a Ri je přednostně vodík.

   3. Sloučenina, která splňuje všechny z následujících 3 kriterií:

   1) vykazuje strukturu danou obecným vzorcem III:

   234 .

   • *· · • · · φ * '· • · · · · · • · · · ě · · kde Ri, R₂, R₃ a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R₃ a R₅ se mohou vzájemně kovalentně vázat,

   2) musí působit jako ligand jednotky rozeznávající fosfotyrosin, přičemž se upřednostňuje inhibitor nebo modulátor jedné nebo více PTPas nebo proteiny, které obsahují oblasti SH2 a

   3) mají molekulovou hmotnost nižší nebo rovnou 2 500 Da.

   4. Sloučenina podle nároku 3, která má strukturu danou obecným vzorcem IV:

   kde R_x, R₃, R₄ a R₅ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R₃ a R5 se mohou vzájemně kovalentně vázat a R je přednostně vodík.

   5. Sloučenina podle nároku 4, která vykazuje strukutru danou obecným vzorcem V^:

   235

   • • · · ·> • • · • • • • • · · • · • • '· • • • · • • • • • * · · • · • · ··

   kde Ri, R₃, R₄ a R₅ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R₃ a R₅ se mohou vzájemně kovalentně vázat a R je přednostně vodík.

   6. Sloučenina podle nároku 5, která vykazuje strukturu danou obecným vzorcem VI '· kde R₃, R₄ a R₅ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R₃ a R5 se mohou vzájemně kovalentně vázat a R je přednostně vodík.

   7. Sloučenina podle nároku 3. která vykazuje strukturu danou obecným vzorcem VII· kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci VII reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a Ri, R₂, R₃, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin.

   8. Sloučenina podle nároku 7, která vykazuje strukturu danou obecným vzorcem VIII *3

   236.’ kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci VIII reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a Ri, R, R₃, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a symbol R je přednostně vodík.

   9. Sloučenina podle nároku 7, která vykazuje strukturu danou obecným vzorcem IX :

   (lť) kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci IX reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a R_x, R₂, R3, a R4 je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin.

   10. Sloučenina podle nároku 9, která vykazuje strukturu danou vzorcem X :

   kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci X reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a R₂, R_3ř a R4 je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin.

   11. Sloučenina podle nároku 10, která vykazuje strukturu danou obecným vzorcem XI ·.

   237

   BB BBB • *

   • • BB B • B B B B • ·· • B B B Β B • B B B • • • · • • • B B B · · B · Β B BB

   (X0 kde symbol A spolu s dvojnou vazbou ve vzorci XI reprezentuje libovolný aryl, jak se definuje shora v textu a R, R₃, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin a R je přednostně vodík.

   12. Sloučenina podle nároku 3, která vykazuje strukturu danou obecným vzorcem XII

   R1 R4 O _R3^^o-^r

   R2 O (yitj kde Ri je chemická skupina schopná být donorem protonů a/nebo akceptorem protonů, upřednostňuje se -COOH, 5-tetrazolyl, -NH₂, -CONH₂ a R, R₂, R₃, a R₄ je libovolná chemická skupina nebo kombinace chemických skupin.

   13. Sloučenina podle libovolného z předcházejících nároků, která v podstatě působí jako klasický, kompetitivní inhibitor jedné nebo více PTPas.

   14. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 12, která v podstatě působí jako inhibitor jedné nebo více PTPas smíšeného typu. 15. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, která v podstatě působí jako inhibitor jedné nebo více PTPas, které

   se podílejí na regulaci signalizační dráhy tyrosinkinasy.

   • · •· ·»·· » · · ό ό

   238 která

   16. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, v podstatě inhibuje nebo moduluje signalizační dráhu receptortyrosinkinasy prostřednictvím interakce s jednou nebo více regulačními PTPasami, přičemž se upřednostňuje signalizační dráha receptoru insulinu, IGF-I receptoru a/nebo jiných členů rodiny receptoru insulinu, rodiny receptoru EGF, rodiny receptoru růstového faktoru získaného z destiček, rodiny receptoru nervového růstového faktoru, rodiny receptoru růstového faktoru hepatocytů, rodiny receptoru růstového hormonu a/nebo členů jiných rodin tyrosinkinas receptorového typu.

   17. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, která v podstatě inhibuje nebo moduluje' signalizaci tyrosinkinasy, která není receptorového typu prostřednictvím úpravy jedné nebo více regulačních PTPas, přednostně moduluje členy rodiny kinás Src nebo jiných vnitrobuněčných kinas.

   18. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, která v podstatě inhibuje nebo upravuje aktivitu jedné nebo více PTPas, jenž negativně regulují signalizační dráhu transdukce.

   19. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, která inhibuje nebo upravuje aktivitu jedné nebo více PTPas, které pozitivně regulují signalizační dráhu transdukce, upřednostňuje se CD45.

   20. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, která inhibuje nebo upravuje aktivitu jedné nebo více PTPas, jenž pozitivně regulují signalizační dráhy transdukce v imunitních buňkách.

   21. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, která inhibuje nebo moduluje aktivitu jedné nebo více PTPas, jenž negativně regulují signalizační dráhu 22. Sloučenina podle libovolného z transdukce. nároků 1 až 14, která

   inhibuje jednu nebo více PTPas prostřednictvím navázání na aktivní místo uvedené PTPasy(s) nebo na jiná místa, která

   239 • ·· ·· ·· • « · · · 9 · • · · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ·· negativně ovlivňují navázání substrátu na uvedenou PTPasu(y), jde o alosterický modulátor.

   23. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, která upravuje aktivitu jedné nebo více PTPas prostřednictvím interakce se strukturami umístěnými vně aktivních míst enzymů, přičemž se upřednostňují oblasti SH2.

   24. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 14, která upravuje siganalizační dráhu transdukce prostřednictvím navázání sloučenin podle vynálezu na oblasti SH2 nebo oblasti PTB signalizačních molekul, které nejsou PTPasy.

   25. Sloučenina podle libovolného z předešlých nároků charakterizovaných tím, že je selektivní inhibitor PTPas nebo sloučenina, která je ligandem jednotky selektivně rozeznávající fosfotyrosin.

   26. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 24 charakterizovaná tím, že je neselektivním inhibitorem PTPas.

   27. Sloučenina podle nároku 26 charakterizovaná tím, že je inhibitorem nebo modulátorem alespoň čtyř PTPas nebo 4 rodin PTPas.

   28. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro PTPasu, která zde není popsaná. 29. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro PTPasu uvedenou v tabulce č. 1. 30. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro rodinu PTPa. 31. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro PTPa. 32. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro ΡΤΡε. 33. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro CD45. 34. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro rodinu ΡΤΡβ.

   35. Sloučenina podle nároku selektivní pro ΡΤΡβ. 36. Sloučenina podle nároku selektivní pro PTP-DEP1. 37. Sloučenina podle nároku selektivní pro rodinu PTP-LAR. 38. Sloučenina podle nároku selektivní pro PTP-LAR. 39. Sloučenina podle nároku selektivní pro ΡΤΡσ. 40. Sloučenina podle nároku selektivní pro ΡΤΡδ. 41. Sloučenina podle nároku selektivní pro rodinu ΡΤΡμ. 42. Sloučenina podle nároku selektivní pro ΡΤΡμ. 43. Sloučenina podle nároku selektivní pro PTPk. 44. Sloučenina podle nároku selektivní pro rodinu PTP1B. 45. Sloučenina podle nároku selektivní pro PTP1B. 46. Sloučenina podle nároku selektivní pro TC-PTP. 47. Sloučenina podle nároku selektivní pro rodinu SHP-PTP. 48. Sloučenina podle nároku selektivní pro SHP-1. 49. Sloučenina podle nároku selektivní pro SHP-2. 50. Sloučenina podle nároku selektivní pro rodinu ΡΤΡξ.

   • • * · • 99 9 • • 9 • • · • • • • > •9 • • • • Φ • <·« · 9 · ·· • •

   charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je charakterizovaná tím, že je

   51. Sloučenina selektivní pro podle ΡΤΡξ. nároku 25 charakterizovaná tím, že je 52. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro ΡΤΡγ. 53. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro rodinu PTP-PEST • 54. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro rodinu PTPH1. 55. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro PTPH1. 56. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro PTPD1. 57. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro PTPD2. 58. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro PTPMEG1 • 59. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro rodinu IA-2. 60. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro IA-2. 61. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro ΙΑ-2β. 62. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro rodinu ΡΤΡψ. 63. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro ΡΤΡψ. 64. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro PTPp. 65. Sloučenina podle nároku 25 charakterizovaná tím, že je selektivní pro ΡΤΡφ. 66. Sloučenina podle libovolného z předchozích nároků, která vykazuje molekulovou hmotnost nižší než 1 000 daltonů a

   upřednostňuje se více než 100 daltonů.

   242

   67. Sloučenina podle libovolného z nároků, která má hodnotu Ki menší než 200 μΜ proti jedné nebo více PTPas.

   68. Sloučenina podle libovolného z předchozích nároků, která vykazuje hodnotu Ki menší než 2 μΜ proti jedné nebo více PTPas.

   69. Sloučenina podle libovolného z předchozích nároků, která vykazuje hodnotu Ki menší než 100 nM proti jedné nebo více PTPas.

   70. Sloučenina podle libovolného z předchozích nároků, která vykazuje hodnotu IC₅₀ menší než 200 M proti jedné nebo více molekulám jednotky(ek) rozeznávající fosfotyrosin.

   71. Sloučenina podle libovolného z předchozích nároků, která vykazuje hodnotu IC₅o menší než 2 M proti jedné nebo více molekulám jednotky(ek) rozeznávající fosfotyrosin.

   72. Sloučenina podle libovolného z předchozích nároků, která vykazuje hodnotu IC50 menší než 100 nM proti jedné nebo více molekulám jednotky(ek) rozeznávající fosfotyrosin.

   73. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 66, která vykazuje hodnotu Ki menší než 2 μΜ proti jedné nebo dvěma PTPasám nebo rodinám PTPas a hodnotu Ki větší než 50 μΜ proti alespoň dvěma jiným PTPasám nebo rodinám PTPas.

   74. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 66, která vykazuje hodnotu Ki menší než 100 nM proti jedné nebo dvěma PTPasám nebo rodinám PTPas a hodnotu Ki větší než 10 μΜ proti alespoň dvěma jiným PTPasám nebo rodinám PTPas.

   75. Použití sloučeniny podle libovolného z předchozích nároků při přípravě léčivého přípravku při úpravě aktivity jedné nebo více PTPas nebo jiných molekul, které obsahují jednotku(y) rozeznávající fosfotyrosin.

   76. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu a prevenci cukrovky typu I, cukrovky tupu II, porušené tolerance glukosy, rezistence na inzulin, obezity, disfunkcí imunity zahrnující autoimunitu a AIDS, onemocnění s poruchami koagulačního systému, alergické onemocnění, osteoporéza, poruchy

   243 proliferace, které zahrnují zhoubné bujení a lupénku, onemocnění se zvýšenou nebo sníženou syntézou a účinky růstových hormonů nebo cytokinů, které regulují uvolnění nebo odezvu na růstový hormon, onemocnění mozku zahrnující Alzheimerovu nemoc a schizophrenii a infekční onemocnění.

   77. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 vhodné pro přípravu léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci cukrovky typu I, cukrovky tupu II, porušené tolerance glukosy, rezistence na inzulin a/nebo obezity.

   78. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 vhodného pro přípravu léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci stavů s disfunkcí imunity zahrnující autoimunitu, jako je revmatická artritida, systémový lupus erythematodes.

   79. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro použití jako imunosupresivního činidla.

   80. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu nebo léčbu stavů s poruchou imunity zahrnující AIDS.

   81. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci alergického onemocnění zahrnující astma a alergické kožní onemocnění.

   82. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci poruch proliferace, které zahrnují zhoubné bujení.

   83. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci osteoporézy.

   84. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci lupénky.

   244

   85. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci onemocnění se zvýšenou nebo sníženou syntézou nebo účinky růstového hormonu, onemocnění se sníženou nebo zvýšenou syntézou hormonů nebo cytokinů, které regulují uvolnění růstového hormonu nebo odezvu na růstový hormon.

   86. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci onemocnění s poruchami koagulačního systému.

   87. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci onemocnění mozku zahrnující Alzheimerovu nemoc a schizophrenii.

   88. Použití sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 při přípravě léčivého přípravku pro kontrolu, léčbu nebo prevenci infekčního onemocnění.

   89. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, ž e obsahuje účinné množství sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74 spolu s farmaceutický přijatelným nosičem nebo ředidlem.

   90. Farmaceutická kompozice podle nároku 89 vyznačující se tím, že obsahuje v jednotkové dávce mezi 0,5 mg a 1 000 mg sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 74.

   91. Způsob úpravy aktivity jedné nebo více PTPas nebo jiných molekul s jednotkou(ami) rozeznávajícími fosfotyrosin v objektu, který potřebuje takovou kontrolu, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci účinného množství sloučeniny nebo kompozice podle libovolného z nároků 1 až 74 uvedenému objektu.

   92. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 74 spojená s vhodnou matricí pevné fáze.

   • · • ·

   245

   93. Způsob izolace proteinu nebo glykoproteinu s afinitou ke sloučenině podle libovolného z nároků 1 až 74 z biologického vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje • kontakt imobilizované sloučeniny ppodle nároku 89 s uvedeným biologickým vzorkem, aby uvedená imobilizovaná sloučenina vytvořila komplex navázáním na uvedený protein nebo glykoprotein, • odstranění nenavázaného materiálu z uvedeného biologického vzorku a izolace uvedeného komplexu a • extrakce uvedeného proteinu nebo glykoproteinu z uvedeného komplexu.

   94. Způsob izolace proteinové tyrosinfosfatasy s afinitou ke sloučenině podle libovolného z nároků 1 až 71 z biologického vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje • kontakt imobilizované sloučeniny podle nároku 89 s uvedeným biologickým vzorkem, aby uvedená imobilizovaná sloučenina vytvořila komplex navázáním na uvedenou proteinovou tyrosinfosfatasu, • odstranění nenavázaného materiálu z uvedeného biologického vzorku a izolace uvedeného komplexu a • extrakce uvedené proteinové tyrosinfosfatasy.

   95. Způsob izolace proteinu, který obsahuje doménu Src homologie 2 nebo oblast vázající fosfotyrosin, s afinitou ke sloučenině podle libovolného z předchozích nároků, které se týkají sloučeniny z biologického vzorku, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje • kontakt imobilizované sloučeniny podle nároku 89 s uvedeným biologickým vzorkem, aby uvedená imobilizovaná sloučenina vytvořila komplex navázáním na protein, který obsahuje doménu Src homologie 2 nebo oblast vázající fosfotyrosin, • odstranění nenavázaného materiálu z uvedeného biologického vzorku a izolace uvedeného komplexu a

   246 • extrakci uvedeného proteinu, který obsahuje doménu Src homologie 2 nebo oblast vázající fosfotyrosin, z uvedeného komplexu.

   96. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 71 spojená s fluorescenční nebo radioaktivní molekulou.

   97. Způsob spojení fluorescenční nebo radioaktivní molekuly se sloučeninou podle libovolného z nároků 1 až 71, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   • kontakt uvedené sloučeniny s uvedenou fluorescenční nebo radioaktivní molekulou v reakční směsi za vzniku komplexu, • odstranění materiálu, který netvoří komplex, a izolace uvedeného komplexu z uvedené reakční směsi.

   98. Způsob detekce proteinové tyrosinfosfatasy nebo jiných molekul s jednotkami rozeznávajícími fosfotyrosin v buňce nebo v objektu za použití sloučeniny podle nároku 93, vyznačující se tím, že zahrnuje • kontakt uvedené buňky nebo jejího extraktu nebo biologického vzorku z uvedeného subjektu nebo injekcí zavedené uvedené sloučeniny do uvedeného subjektu, přičemž uvedená sloučenina produkuje komplex s uvedenou proteinovou tyrosinfosfatasou nebo s uvedenými molekulami s jednotkou(ami) rozeznávající fosfotyrosin, • detekci uvedeného komplexu, přičemž se detekuje přítomnost uvedené proteinové tyrosinfosfatasy nebo uvedených jiných molekul s jednotkou(ami) rozeznávající fosfotyrosin.

   99. Způsob stanovení množství proteinových tyrosinfosfatas nebo jiných molekul s jednotkou(ami) rozeznávajícími fosfotyrosin v buňce nebo v objektu za použití sloučeniny podle nároku 93, vyznačující se tím, že zahrnuje • kontakt uvedené buňky nebo jejího extraktu nebo biologického vzorku z uvedeného objektu nebo injekcí zavedené uvedené sloučeniny do uvedeného subjektu, přičemž uvedená sloučenina produkuje komplex s uvedenou proteinovou tyrosinfosfatasou

   247 nebo s uvedenými molekulami s jednotkou(ami) rozeznávající fosfotyrosin, • stanovení množství uvedeného komplexu, čímž se detekuje přítomnost uvedené proteinové tyrosinfosfatasy nebo uvedených molekul s jednotkou(ami) rozeznávajícími fosfotyrosin.

   100. Způsob stanovení funkce dané proteinové tyrosinfosfatasy nebo skupiny proteinových tyrosinfosfatas nebo uvedených molekul s jednotkou(ami) rozeznávající fosfotyrosin v buňce nebo v objektu za použití sloučeniny podle nároku 93, vyznačující se tím, že zahrnuje • kontakt uvedené buňky nebo jejího extraktu nebo biologického vzorku z uvedeného objektu nebo injekcí zavedené uvedené sloučeniny do uvedeného subjektu, přičemž uvedená sloučenina produkuje komplex s uvedenou proteinovou tyrosinfosfatasou nebo s uvedenými molekulami s jednotkou(ami) rozeznávající fosfotyrosin, • stanovení biologických účinků vyvolaných komplexem.

   101. Sloučenina, která po pohlcení buňkami nebo savci má strukturu a funkci definovanou v libovolném z nároků 1 až 71.