CZ19150U1 - Holografický mikroskop - Google Patents

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká mikroskopu, který s využitím holograťického principu umožňuje konfokální zobrazení v procházejícím bílém světle a reálném čase. Podstatné je, že je využito nekohe5 rentního (bílého) světla.

Dosavadní stav techniky

Současné mikroskopy využívající interference světla (interferenční či holografické mikroskopy) s oddělenou předmětovou a referenční větví lze rozdělit do dvou základních skupin, na mikroskopy i nterfero metrické a mikroskopy holografické.

ío Interťerometrické mikroskopy. Svazky interferují pod nulovým nebo téměř nulovým úhlem, takže hustota interferenčních proužku v interferogramu nesplňuje holografiekou podmínku. Jelikož automatizované měření OPD (Optical Path Diťferenee) vyžaduje získání úplné informace o předmětové vlně, je nutno zaznamenat alespoň tři snímky s různým fázovým posuvem. Proto tylo interferometry obsahují fázový kompenzátor (v různých podobách) a jsou označovány jako inter15 ťerometry s řízenou fází (phase-shifting). Časový interval nutný k zaznamenání tří snímků vylučuje možnost zobrazovat rychlé děje. Také proudění v okolním prostředí a vibrace zařízení negativné ovlivňují výsledné zobrazení, protože každý ze tří snímkuje zaznamenán za jiných podmínek. Příkladem je komerčně známý Mirauův objektiv, publikovaný v Yamaguchi, I., Zhang, T. 1997. „Phase-shifting digital holography“, Opt. Tett. Vol. 22, No. 16.

2o Výhodou těchto systémů je možnost použít zcela nekoherentního osvětlení (žárovka, výbojka), které odstraňuje koherenční zrnitost a umožňuje docílit efektu hloubkové diskriminace zobrazení [9], tj. vytvoření optických řezů vzorkem. Nevýhodou je nutnost vícenásobného záznamu.

Ilolografické mikroskopy. Takto se označují obvykle systémy s prostorovou nosnou frekvencí, tedy systémy využívající interference svazků pod nenulovým úhlem (off-axis holografie). Vzni25 kající interferogramy splňují holografiekou podmínku a výsledné zobrazení lze numericky rekonstruovat z jediného digitálního záznamu (hologramu). Aby interference nastala v celém obrazovém poli, je nutno použít koherentní, nebo částečně (prostorově) nekoherentní osvětlení. Technická řešení holografických mikroskopů, které využívají koherentního nebo částečně (prostorové) nekoherentního osvětlení jsou známa například z; Cuche T., Bevilacqua F„ Depeursinge jo Ch. 1999, „Digital holographv for quantitative phase-eontrast imaging, Optics Letters, Vol. 24, No. 5; Marquet P., Rappaz B„ Magistretti P.J., 2005. „Digital holographic mícroscopv: a noninvasive eontrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracv, Optics Letters, Vol. 30, No. 5; Kemper B„ Langehanenberg P., Bally von G., 2007, „Digital holographic microscopy. A new method for surface analysis and marker-ťree dynamic lite cell imaging, Optik & photonik, No. 2; Leith L.N., Chien W.-Ch. Mills K.D., Athey B.D., Dilworth D.S.. 2003, „Optical sectioning by holographic coherence imaging: a generalized analysis, J, Opt. Soc. Ani. A, Vol. 20, No„ W02008092107; US2008137933; EPI852890 nebo jako komerčně nabízené digitální holografické mikroskopy firmy Lyncée-Tec (www.lynceetec.com).

w Výhodou těchto systémů je získání úplné informace o předmětové vlně z jediného snímku (offaxis holografie). Tudíž jsou vhodné pro pozorování dynamických procesu. Nevýhodou je nutnost použití téměř koherentního osvětlení, která vede k určitému stupni koherenčního zašumění obrazu, kompromisům v oblasti volby zdroje světla a nemožnosti pozorovat vzorky vnořené v rozptylujícím prostředí, případné vzorky objemového charakteru.

Z CZ 8547 U je znám holograficky konfokální mikroskop pro bílé světlo, který umožňuje pozorováni vzorku ve vínové nekoherentním světle, bez toho. že by bylo nutné použít monochromatické světlo a uměle vytvářet jeho prostorovou nekoherenei, Rychlost snímání tak není. oproti konvenčnímu konťokálnímu mikroskopu, omezena žádnou pohyblivou součástí optické soustavy.

CZ 19150 Ul

Zařízení používá nekoherentní optický zdroj. Svazek paprsků je difraktován v 1. a-1. řádu fázovou difrakční mřížkou do optických větví. Prostřednictvím děliče svazků je optická osa objektivu ztotožněna s optickou osou osvětlovací optické cesty a zároveň s optickou osou zobrazovací optické cesty v každé z optických větví. Kompenzace stranového převrácení barev ve spektrálním rozkladu sekundárních zobrazení zdroje je dosaženo zrcadly a děliči svazku. Frekvenci snímaných konfokálních obrazů tak omezuje pouze rychlost záznamového zařízení a nikoliv optická soustava. Zařízení popsané v CZ 8547 U neumožňuje pozorování objektů přes disperzní prostředí v procházejícím světle.

Cílem předloženého technického řešení je rozšířit možnosti dosavadního stavu techniky.

ío Podstata technického řešení

Cíle předloženého technického řešení bylo dosaženo digitálním holografickým mikroskopem s prostorovou nosnou frekvencí zobrazujícím v procházejícím bílém světle, jehož podstata spočívá v tom, že je použito optické sestavy umožňující použít zcela nekoherentní osvětlení (bílé světlo plošného zdroje) bez nutnosti vícenásobného záznamu obrazu (stačí jediný snímek - hologram).

Zařízení tak umožňuje pozorovat v reálném čase vzorky vnořené v rozptylujícím prostředí (bez použití zabarvení vzorku umělými barvivý) a objekty trojrozměrného charakteru.

Optická sestava je dvousvazkovým interferometrem osazeným zobrazovacími systémy. K dělení svazku je využito difrakční mřížky, čímž dochází k uhlové disperzi světla v pupile osvětlovacích objektivů. Ze zobrazujících objektivů vychází světlo s touž úhlovou disperzí a při dodržení ekvi20 valence osvětlovací a zobrazovací části mikroskopuje možno docílit interference světla různých vlnových délek pod příslušnými úhly. Tím vznikají interferenční proužky téže frekvence pro všechny vlnové délky světla a formují nekoherentní obrazový hologram digitálně zaznamenaný a numericky dále zpracovaný.

Možnosti pozorování vzorku ve skutečně reálném čase bylo dosaženo především použitím off25 axis uspořádání interferometru - předmětová a referenční větev se sbíhají pod nenulovým úhlem a vzniklý interferenční obrazec (hologram) splňuje holografickou podmínku. Zlepšení možnosti pozorování vzorků v disperzním prostředí bylo dosaženo především použitím časové a prostorové nekoherentniho zdroje světla a použitím referenčního objektu, kterýje v referenční větvi optické sestavy uložen ve stejné rovině jako je uložen pozorovaný vzorek v předmětové větvi op50 tické sestavy.

Potlačení násobně rozptýleného světla ve zobrazení bylo dosaženo především použitím světla s nízkou koherencí.

Použití difrakční mřížky je oproti použití prizmatu výhodné, protože pro vznik interferenčního obrazce lokalizovaného ve výstupní rovině není potřeba použít spojovacího členu.

Použití soustavy zrcadel umožňuje snadnou obsluhu mikroskopu a zajišťuje kompenzaci stranové inverze barev.

Výhodná provedeni technického řešení jsou předmětem závislých nároků na ochranu a jsou blíže popsána v příkladném provedení technického řešení.

Přehled obrázků na výkrese to Technické řešení je schematicky znázorněno na výkrese jako schéma optické sestavy sestávající z osvětlovací soustavy, difrakční mřížky, předmětové a referenční větve optické sestavy mikroskopu a ze zobrazovací soustavy (vše obr. 1).

CZ 19150 Ul

Příkladné provedeni technického řešení

Příklad 1

Mikroskop je tvořen jed no mřížko vým dvou svazkovým aehromatickým interferometrem se čtyřmi shodnými mikroskopovými objektivy, z nichž dva slouží jako kondenzory K1 a K2 a dva jako objektivy Ol a 02 (viz obrázek I). Vzhledem k použití nekoherentního svétla jsou větve interferometru navrženy jako opticky ekvivalentní.

Osvětlovací soustava mikroskopu je tvořena plošným zdrojem světla NZ. který může býl současně prostorově i časově nekohcrentní (např. halogenovou lampou nebo výbojkou), apertumí clonou proměnné velikosti pro regulaci prostorové koherence osvětlení, výměnnými neutrálními ío filtry a výměnnými barevnými filtry pro regulaci časové koherence a kolektorovou čočkou Cl zobrazující plošný zdroj do ohniskových rovin kondenzorů K1 a K2. Osa osvětlovací soustavy je sjednocená s osou interferometru.

Osvětlovací soustava přivádí osvětlovací svazek kolmo na ditrakční mřížku DM, na níž svazek difraktuje a zrcátky se vybírá 1. a -1. difrakční řád tvořící svazky referenční a předmětové větve.

Prostorová frekvence difrakční mřížky je zvolena tak, aby difrakční a interferenční úhly a svazků byly malé. Není tak potřeba použít spojovacího členu a interferenční obrazec je lokalizovaný ve výstupní rovině mikroskopu.

Svazek paprsků předmětové větve je z difrakční mřížky DM zrcadly Z5 a Z6 směrován do osvětlovacího objektivu K2, který plní funkci kondenzoru. Poté svazek paprsků předmětové zn větve prochází přes pozorovaný předmět P, kterým může být komůrka s buňkami naplněná médiem. Na pozorovaný předmět je zaostřen objektiv 02. Objektiv 02 zobrazí předmět do výstupní roviny mikroskopu pomocí soustavy zrcadel Z7 a Z8.

Svazek paprsků referenční větve je z difrakční mřížky DM zrcadly Z1 a Z2 směrován do osvětlovacího objektivu Kl, který plní funkci kondenzoru. Poté svazek paprsků referenční větve pro25 ehází přes referenční objekt R, kterým může být komůrka naplněná pouze médiem. Na referenční objekt je zaostřen objektiv Ol. Objektiv OJ zobrazí předmět do výstupní roviny mikroskopu pomocí soustavy zrcadel Z3 a Z4.

Soustavy zrcadel Z3, Z4 a Z7, Z8, které přivádějí svazky paprsků z objektivů 01 a ()2 do zobrazovací roviny, jsou uspořádány tak, že zobrazovací svazek vycházející z objektivu 02 umístěnejo ho na pravé straně od osy interferometru přichází do výstupní roviny z levé strany a zobrazovací svazek vycházející z objektivu 01 umístěného na levé straně od osy interferometru přichází do výstupní roviny z pravé strany. Tímto překřížením předmětové větve s referenční větví dojde ke kompenzaci stranově invertovaného pořadí barev ve spektrálním rozkladu.

Zobrazovací soustava je tvořena objektivem C2 a digitální kamerou DK. Objektiv C2 zobrazuje hologram vzniklý ve výstupní rovině na čip digitální kamery DK. Osa zobrazovací soustavy je sjednocená s osou interferometru.

Zrcadla Z2, Z3, Z6, Z7 jsou naklápěna ve dvou osách a kondenzory Kl, K2 jsou posouvány ve směrech kolmých k optické ose, což umožňuje nastavit osvětlující svazek do osy příslušných objektivů a sjednotit zobrazení difrakční mřížky oběma větvemi ve výstupní rovině. Tím je dosa40 ženo splnění podmínky pro interferenci svazků.

Difrakční mřížka DM, soustavy zrcadel Zl_, Z2 a Z5, Z6 a kondenzory Kl, K2 jsou posuvné ve směru osy interferometru. Tím je možné po ukončení justáže rozostřit zobrazení mřížky v předmětových rovinách kondenzoru Kl a K2.

Zrcadlo Z6 a objektiv 02 jsou nezávisle posuvné ve směru osy interferometru pomocí mikromet45 riekých šroubů. Tímto opatřením lze nastavit shodnou optickou délku předmětové a referenční větve mikroskopu.

.) CZ 19150 Ul

Průmyslová využitelnost

Základní aplikační oblastí pro holografický mikroskop zobrazující v procházejícím bílém světle je biologie a medicína. Zařízení muže být s výhodou použito pri pozorování fixovaných i živých buněk a mikroorganizmů a jejich reakcí na vnější podněty. Holograiícký mikroskop zobrazuj ící v procházejícím bílém světle umožňuje s výhodou pozorovat živé buňky v suspenzi v reálném čase. Buňky jsou zviditelněny fázovým zobrazením a není tedy třeba využívat barvení buněk umělými barvivý, která jsou toxická a potlačují přirozené buněčné reakce.

Claims (9)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Holograiícký konťokální mikroskop tvořený osvětlovací soustavou, zobrazovací soustavou io a dvousvazkovým interferometrem se čtyřmi shodnými mikroskopovými objektivy, z nichž dva slouží jako kondenzory (K1 a K2) a dva jako objektivy (Ol a 02) a se čtyřmi soustavami zrcadel, z nichž dvě soustavy zrcadel (Zl, Z2 a Z5, Z6) slouží pro usměrnění svazku paprsků v osvětlovací části interferometru a dvě soustavy zrcadel (Z3, Z4 a Z7, Z8) slouží pro usměrnění svazku paprsků ve zobrazovací části interferometru, vyznačující se tím, že předme15 tová a referenční větev interferometru jsou navrženyjako opticky ekvivalentní,
2. 2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že zdroj světla (NZ) v osvětlovací soustavě je časově a prostorově nekoherentní.
3. 3. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že referenční objekt (R) se ukládá mezi objektivy (Kt a Ol) referenční větve interferometru do stejné roviny jako se ukládá zobra20 zovaný objekt (P) mezi objektivy (K2 a 02) předmětové větve interferometru.
4. 4. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že soustavy zrcadel (Z3, Z4 a Z7, Z8) jsou uspořádány tak, že dochází k překřížení svazku paprsků předmětové větve interferometru se svazkem paprsků referenční větve interferometru.
5. 5. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se t í m , že zrcadla (Z2, Z3, Zó, Z7) se dají 2_s naklápět ve dvou osách, kondenzory (ΚΙ, K2) a objektivy (Ol, 02) jsou posuvné ve směrech kolmých k optické ose, a že difrakční mřížka (DM), soustavy zrcadel osvětlovací části mikroskopu (Zl, Z2 a Z5, Z6) a oba kondenzory (ΚΙ, K.2) jsou posuvné ve směru osy interferometru.
6. 6. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jedno ze zrcadel (Zl, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8) je nezávisle posuvné tak, aby tímto posuvem bylo možné nastavit ui shodnou délku obou větví interferometru.
7. 7. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jeden z objektivů (Ol, 02, ΚΙ, K2) je nezávisle posuvný ve směru optické osy tak, aby bylo možné zobrazit difrakční mřížku (DM) do výstupní roviny nezávisle v obou větvích interferometru.
8. 8. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že děličem svazku paprsků, který 25 vstupuje z osvětlovací soustavy do interferometru, je lineární fázová difrakční mřížka (DM).
9. 9. Zařízení podle nároku l, vyznačující se tím, že prostorová frekvence difrakční mřížky (DM), která je umístěna jako dělič svazku paprsků vstupujících z osvětlovací soustavy do interferometru, je zvolena tak, aby difrakční úhel (a) byl nabýval hodnot v rozmezí 1,5 až 3,5 stupňů.