CZ185398A3 - Potravinářský výrobek obsahující houbu a způsob jeho přípravy - Google Patents

Potravinářský výrobek obsahující houbu a způsob jeho přípravy Download PDF

Info

Publication number
CZ185398A3
CZ185398A3 CZ981853A CZ185398A CZ185398A3 CZ 185398 A3 CZ185398 A3 CZ 185398A3 CZ 981853 A CZ981853 A CZ 981853A CZ 185398 A CZ185398 A CZ 185398A CZ 185398 A3 CZ185398 A3 CZ 185398A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
strain
fungi
parent
higher ploidy
strains
Prior art date
Application number
CZ981853A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas William Naylor
Trevor Williamson
Anthony Peter Joseph Trinci
Geoffrey David Robson
Marilyn Gail Wiebe
Original Assignee
Zeneca Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeneca Limited filed Critical Zeneca Limited
Publication of CZ185398A3 publication Critical patent/CZ185398A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/008—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L31/00—Edible extracts or preparations of fungi; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Jellies, Jams, And Syrups (AREA)

Description

176042/JT 4 · · « 9 « ·994
t
Potravinářský výrobek obsahující houbu a způsob jeho přípravy Oblast techniky
Tento vynález se týká hub.
Dosavadní stav techniky Z houby rodu Fusarium, což je haploidní houba, jsou komerčně vyráběny lidské potraviny. Zvláště vhodný kmen Fusarium A3/5, IMI 145425, je popsán v patentu na rostlinu č. US 4 347.
Pro výrobu potravin s atraktivním chuťovým vjemem (vjemem v ústech) je žádoucí, aby se hyfy Fusaria málo větvily, a to je právě případ kmene Fusaria IMI 145425. Avšak při prodloužené kontinuální fermentaci se Fusarium více větvi, neboť ve fermentorové kultuře vznikají varianty. Vznik silně rozvětvených variant se zdá být obecným rysem prodloužené fermentace hub (Třinci, A.P.J. et al., 1990, Microbial Growth Dynamics, s. 17-38, IRL Press, Oxford, U.K.).
Je proto žádoucí, aby se produkovaly kmeny Fusaria s větší morfologickou stabilitou.
Ve šlechtitelských programech houbových kmenů byl parasexuální cyklus hub často hodnocen jako cenný prostředek pro zlepšení komerčně důležitých produkčních kmenů, neboť umožňuje kombinovat výhodné vlastnosti dvou jedinců cestou rekombinace, heterokaryose nebo diploidie. Např. bylo popsáno, že diploidi mají zvýšenou produkci kyseliny citrónové (Das a Roy, 1978), penicilinu (Elander et al., 1973) a cefalosporinu C (Takeda Chemical Co., 1977). Zprávy o kvalitativních změnách popisují obnovení sporulační 2 2 • · t • · ··· • « · · t « • · t · ·« 9·
« ·# *· 9 9 • t schopnosti u P. chrysogenum (Calam et al., 1976), zlepšené filtrační vlastnosti u ň. niger (Balí et al.,1978), obecně zlepšenou životaschopnost u C. acremonium (Hamlyn a Balí, 1979), sníženou potřebu kyslíku u M. inyoensis (Crueger, 1982) a eliminaci produkce p-hydroxypenicilinu V u P. chrysogenum (Chang et al., 1982). Naproti tomu se zdá, že u Fusaria nebyla jasně dokázána parasexualita (Booth, 1984), ačkoliv byli popsáni domnělí diploidi F. oxysporum (Buxton, 1956). Pokusy prokázat produkci diploidů F. graminearum NRRL 319 (Bu'Lock et al., 1986) byly neúspěšné, ale byli popsáni heterokaryonti.
Podle Rowlandse (1984) jsou diploidi nestabilní a kultury jsou náchylné během fermentace k selhání s progresivní ztrátou produktivity, pokud není uplatněn nějaký druh selekčního tlaku. Existují důkazy, že u S. cerevisiae se objevují adaptivní mutace s vyšší frekvencí (l,6x) u vyvíjející se diploidní populace ve srovnání s haploidní populací (.Paquin a Adams, 1983). To podporuje názor, že diploidní populace hub jsou nestabilní. Ale my jsme zjistili, že určité kmeny s vyšší ploidií ze skupiny Fungi imperfecti (houby nedokonalé) projevují vyšší (morfo.logickou) stabilitu v typických růstových podmínkách ve srovnání s rodičovskými haploidy.
Podstata vynálezu
Vytvořili jsme kmeny Fusaria s vyšší ploidií a vynalezli jsme způsoby, kterými mohou být produkovány kmeny s vysokou ploidií z hub skupiny Fungi imperfecti, zejména rodu Fusarium. Ty pak mají lepší morfologickou stabilitu než haploidní kmeny. Má se za to, že je to částečně umožněno sníženou citlivostí k mutacím díky faktu, že mutované geny, které způsobují zvýšené větvení, jsou recesivní, a tedy odpovídající mutace obou duplikovaných genů u kmenů s vyšší ploidií je nutná předtím, než se dědičný znak může přenést nepohlavním rozmnožováním. Skupina Fvngi imperfecti se liší od ostatních hub tím, že normálně houby této skupiny neprocházejí sexuálním stadiem. Tudíž se dá předpokládat,, že kmeny s vyšší ploidií budou obecně stabilnější v dědičných vlastnostech než haploidní kmeny za předpokladu, že jsou kultivovány v podmínkách, kde zvrat (reverze) nebo i jen částečný zvrat k haploidní formě je zanedbatelný. „Vyšší ploidií" je zde myšlena ploidie vyšší než haploidie včetně aneuploidie.
Vynález se týká lidské potraviny, která obsahuje kmen houby ze skupiny Fungi imperfecti s vyšší ploidií, kde každý z rodičů má genetickou zábranu růstu, která ale není společná s druhým rodičem. Vynález se také týká kmene Fusaria s vyšší ploidií. Výhodně je jeden z rodičů auxotrofní (tj. taková varianta organismu, která pro svůj růst vyžaduje dodání zvláštních živin) pro dvě sloučeniny vybrané z histidinu, argininu, leucinu a adeninu, a přitom druhý rodič je auxotrofní pro jiné dvě sloučeniny z výše uvedených. Vhodné kmeny byly dne 6. listopadu 1995 uloženy v Mezinárodním mykologickém ústavu (IMI), Bakeham Lané, Egham, Surrey TW20 9TY, jako položky č. IMI 369190, 369191 a 369192 společností Marlow Food Limited, Station Road, Stokesley, Middlesbrough TS9 7AB.
Lidské potraviny odvozené z Fungi imperfecti mají výhodně snížený obsah nukleových kyselin, výhodně méně než 2 % hmotnostní.
Vynález se týká kmene hub ze skupiny Fungi imperfecti, který je mrtvý, a jehož obsah nukleových kyselin je nižší než 2 % hmotnostní. Houba může být usmrcena a její obsah nukleových kyselin současně snížen na méně než 2 % hmotnostní 4 působením vody o teplotě přinejmenším 60 °C, přičemž to může být voda kultivačního média.
Genetickou zábranou může být to, že každý z rodičů je auxotrofem pro odlišný metabolit, anebo že každý produkuje genový produkt nezbytný pro růst, .který má teplotní nebo pH citlivost větší než odpovídající genový produkt druhého rodiče. Kultivací kmene s vyšší ploidií ve vhodném prostředí (buď postrádajícím živiny, pro které jsou rodiče auxotrofní, nebo v takovém, které má teplotu nebo pH, při kterých žádný z rodičů nemůže růst bez dodávky genového produktu druhého, viz výše) je možná selekce proti zvratu k haploidnímu stavu, * a tak lze udržovat zvýšenou morfologickou stabilitu houby.
Vynález se dále týká lidské potraviny, která obsahuje kmen houby skupiny Fungi imperfecti, přičemž houba byla ošetřena tak, aby se odstranily nukleové kyseliny a/nebo modifikovala její textura, chuť nebo vjem v ústech.
Kmeny s vyšší ploidií se mohou produkovat tak, jak se popisuje dále. Vhodný haploidní kmen se pěstuje a je podroben mutagenezi, např. působením ultrafialového záření, dokud nevzniknou auxotrofní kmeny, které ztratily schopnost tvořit určité metabolity. Kultura je pak vyseta na agarové plotny a je doplněna úplným médiem, které umožňuje růst jak auxotrofům, tak i nemutovaným organismům. Otisky (replikami) na plotny s minimálním médiem se identifikují nemutované kmeny, auxotrofní houby se vyberou z ploten s úplným médiem a určí se jejich požadavky na živiny. Mohou se tak vybrat dva auxotrofy, např. vyžadující odlišné aminokyseliny jako živinu, a použít k vytvoření kmene s vyšší ploidií, jak je dále popsáno, nebo se mohou nadále kultivovat odděleně a celý postup lze opakovat (kromě toho, že v takovém případě bude minimální médium obsahovat aminokyselinu(y) vyžadovanou každým z auxotrofů). Tímto způsobem lze vytvořit dva dvojité 5 ·· » · · 9 » ··· I · · · I · » · ·· ·· ♦ ♦ ·· 9 « · « auxotrofy, z nichž každý výhodně vyžaduje dvě aminokyseliny, přičemž obě jsou odlišné od obou aminokyselin vyžadovaných druhým auxotrofem. Pokud je třeba, odpovídájícím způsobem lze připravit trojnásobného auxotrofa či auxotrofa vyššího stupně, ti by pak výhodně měli být auxotrofní pro skupiny metabolitů, které nemají žádné společné členy.
Vynález dále zahrnuje způsob přípravy kmene s vyšší ploidií houby ze skupiny Fungi imperfecti, např. rodu Fusarium, který spočívá v kultivaci dvou auxotrofů s odlišnými požadavky na výživu společně v médiu obsahujícím živiny nezbytné pro růst obou (stadium společné kultury), dále pak. kultivace organismů odvozených z této kultury v minimálním médiu bez auxotrofních složek (stadium kultury v minimálním médiu) a získání kmene s vyšší ploidií ze stadia kultury v minimálním médiu.
Ve stadiu společné kultury je nutné indukovat sporulaci. Toho lze dosáhnout známými prostředky, např. vyprovokováním sporulace působením vhodného typu výživy na organismus, např. dodáváním složitých uhlíkatých sloučenin jako jediného hlavního zdroje živin.
Zjistili jsme, že po přenesení do minimálního živného média, tj. média bez auxotrofních složek, se kmeny s vyšší ploidií pocházející z obou auxotrofů množí lépe ve srovnání s haploidními kmeny nebo kmeny s vyšší ploidií odvozenými z téhož auxotrofa, přičemž tento vliv lze ještě zvětšit působením mutagenu na organismus, výhodně působením záření, např. ultrafialového světla, a to v intenzitě dostatečné k usmrcení značného podílu přítomných haploidních kmenů.
Kmeny s vyšší ploidií se výhodně selektují, např. kultivací na plotnách, s využitím selekčního kritéria jako je zvýšená rezistence k mutagenezi, např. ultrafialovým světlem. Když je to nutné, selektované organismy se mohou dále kultivovat v minimálním médiu, a je-li to třeba v podmínkách mutageneze, např. ultrafialovým světlem, a pak se znovu selektují přežívající kmeny s vyšší ploidií. Z kmenů s vyšší ploidií, získaných výše popsaným postupem, je možné provádět další .selekci na jiné vlastnosti jako je např. rychlost růstu. Příklady provedení vynálezu 1.1. Rodičovské haploidní kmeny
Kmen Fusaria A3/5 (CMI 145425, ATCC 20334) je haploidní kmen divokého typu. Kmeny UMDA4-C a UMDA6-N byly získány ze suspenze spór kmene A3/5 ozářené ultrafialovým světlem obvyklou technikou vhodnou pro mutace. Oba kmeny jsou dvojitě auxotrofní. UMDA4-C vyžaduje ve výživě histidin a arginin a je odolnější k chlorečnanu než C3/5. UMDA6-N vyžaduje leucin a adenin a je odolnější k dusíkatým hořčičným látkám než A3/5. 1.2. Udržování kultury a příprava zárodečných kultur Organismy byly udržovány jako hyfové segmenty v 50% (objem/objem) glycerolu a uloženy v lahvičkách (2 ml) při teplotě -196 °C. Zárodečné kultury byly připraveny přenesením alikvotu z jedné takové lahvičky do litrové Ehrlenmeyerovy baňky s 50 ml nebo 200 ml růstového média RHM (viz dále) . Kultury byly dále inkubovány při 28 °C po dobu až 72 hodin.
1.3. Růstová média 1.3.1. Médium RHM
Obsah látek na 1 litr: d-glukóza 10 g, K2SO4 0,3 g, NH4CI 4,4 g, MgS04.7H20 0,25 g, KH2PO4 20,0 g, roztok stopových prvkůA 5,0 ml, biotin 30 pg. A Jeden litr roztoku stopových prvků obsahoval: CaCl2.2H20 2,0 g, FeCl3.6H20 2,0 g, kyselina citrónová 1,5 g, ZnCl2 1,0 g, MnCl2.4H20 1,0 g, CuC12.2H20 0,2 g, CoC12.2H20 0,2 g,
NaMo04.2H20 0, 2g.
Minimální soli (kromě glukózy· a biotinu) byly smíchány a hodnota pH nastavena na 6,0 pomocí 20% (hmotnost/objem) NaOH. Výsledný roztok byl podle potřeby rozdělen do nádob. Glukóza byla připravena odděleně jako zásobní roztok obsahující 500 g l-1 d-glukózy. Oba roztoky pak byly sterilizovány v autoklávu při 121 °C po 20 minut. Po vychladnutí byla do každé nádoby doplněna glukóza podle * potřeby. Také biotin byl přidán ze zásobního roztoku, který byl sterilizován filtrací a obsahoval 30 mg l-1 biotinu.
1.3.2. Médium YPG
Obsah látek na 1 litr: kvasničný extrakt 3 g, mykologický pepton 5 g, D-glukóza 10 g. Kvasničný extrakt s peptonem byly smíchány a vytvořily základní roztok, který byl sterilizován v autoklávu při 121 °C po 20 minut. Pak byla přidána glukóza ze zásobního roztoku, který obsahoval 500 g l-1 D-glukózy a byl připraven, jak je popsáno v sekci 1.3.1.
1.3.3. Médium CMC
Obsah látek na 1 litr: karboxymetylcelulóza (CMC) 15 g, NH4NO3 1,0 g, KH2P04 1,0 g, MgS04.7H20 0, 5 g. Jednotlivé složky byly rozpuštěny a hodnota pH nastavena na 6,0 pomocí 20% (hmotnost/objem) NaOH předtím, než byl roztok sterilizován v autoklávu při 121 °C po 20 minut. 1.3.4. Fermentorové médium
Toto médium bylo vytvořeno ze 3 samostatných zásobních roztoků, z nichž každý byl připraven v objemu 10 1 a sterilizován autoklávováním při 121 °C po 20 minut. 8 • II ·· ·· ·· ·· • 1 1 1 • · • • · • • • · • • ··· • · ·· • · • · • • · • 111 • • • · • • • · • • · 111 1111 ·· ·· ·· ·· a) Koncentrát minimálních solí
Obsah látek na 10 litrů: K2SO4 40 g, MgS04.7H20 18 g, (CH3COOH)2Ca 4 g, H3PO4 (85 % objemových) 23 ml, roztok stopových prvků 10 ml.
Jeden litr roztoku stopových .prvků obsahoval: MnS04.4H20 40g, ZnS04.7H20 50 g, CuS04.5H20 5 g, Biotin 50 mg, cH2S04 5 ml. b) Glukóza Zásobní roztoky obsahující 66 g 1_1 glukózy byly připraveny rozpuštěním 730 g monohydrátu glukózy ve vodě o celkovém objemu 10 1. c) Železo
Množství na 10 litrů: FeS04.7H20 5 g, cH2S04 5 ml. Nádoby obsahující koncentrát minimálních solí a glukózový roztok byly spojeny po autoklávování a obsah smíchán, takže se vytvořil hlavní živný roztok. Roztok železa obsahující přibližně 100 mg I"1 Fe2+ byl přidáván nezávisle. 1.3.5. Doplněná média
Arginin, histidin, leucin a adenin byly přidány podle potřeby k minimálnímu médiu v koncentraci 500 mg l-1. 1.3.6. Tuhá média
Pokud byla zapotřebí tuhá média, před autoklávováním se přidal agar v množství 15 g 1_1. Roztátý agar se po sterilizaci ponechal zchladnout na 55 °C, a pak se důkladně promíchal před rozdělením do přibližně 20ml alikvotů do 9cm Petriho misek. 1.4. Vytváření a izolace heterokaryontů
Tekuté kultury dvojitých auxotrofů byly připraveny, jak je popsáno v sekci 1.2, v médiu RHM (50 ml) doplněném podle potřeby argininem a histidinem nebo adeninem a leucinem. Pak byla indukována sporulace inokulací obou kmenů do média CMC, ke kterému byl přidán arginin, histidin, adenin a leucin, 9 • c ·· ·· ·· ·· • · • • • • · • • t t • ··· • · ·· • • · • • · • ··· • • • • · • · • • • • ···· ·· ·· ·· ·· a nádoby byly inkubovány při 28 °C po dalších 24 hodin. Výsledné suspenze makrokonidií byly smíchány v poměru 1:1 a 40μ1 alikvoty byly přeneseny do jednotlivých jamek 10 sterilních 96jamkových mikrodestiček, kam bylo pak přidáno 160 μΐ sterilního média YPG. Po. zamíchání byly destičky inkubovány při 28 °C po 48 až 72 hodin. V některých případech tato doba zahrnuje také expozici kafru nebo ultrafialovému záření.
Kafr: destičky byly inkubovány 4 hodiny při 28 °C v atmosféře s kafrem tak, že byly umístěny v uzavřené nádobě s několika krystaly d-kafru rozptýlenými po dně. Po tomto . ošetření byly destičky vyjmuty a dále inkubovány na vzduchu dalších 44 hodin při 28 °C.
Ultrafialové záření: destičky byly inkubovány obvyklým způsobem po 48 hodin při 28 °C, a pak vystaveny ultrafialovému světlu 20 μΤϊ cm-2 na 210 sekund. Po expozici byly destičky dále inkubovány při 28 °C po 24 hodin.
Alikvoty (10 μΐ) byly odebrány z každé jamky na konci inkubačního období a smíchány se 190 μΐ média RHM ve druhé sadě mikrodestiček. Ty byly pak inkubovány při 28 °C po 7 dní, aby se zvýraznil prototrofní růst (prototrofní organismus je organismus divokého typu schopný růstu bez dodání zvláštních látek do média). 1.5. Vyhledávání a izolace domnělých polyploidů
Nové mikrodestičky s jamkami naplněnými 190 μΐ média RHM byly inokulovány 10μ1 alikvoty z kultur, které vykazovaly prototrofní růst. Destičky pak byly inkubovány při 28 °C po 5 dní a cyklus se 2x opakoval, aby se zvýraznily kmeny, které byly schopné důsledně růst v minimálním médiu. Objemy byly potom upraveny v příslušných poměrech tak, že se přeneslo 100 μΐ vybraných kultur do univerzálních lahví obsahujících 10 • ·
• · · · • · • é «· • ··· • · · · • · • · • · · 5 ml média RHM. Lahve pak byly inkubovány při 28 °C a stálém promíchávání po 4 dny.
Kmeny získané výše podaným vyhledávacím postupem byly znovu inokulovány do tekutého média přenesením 2 ml kultury do univerzálních lahví obsahujících 50 ml média RHM a CMC. Obě kultury pak byly inkubovány při 28 °C a stálém promíchávání po 4 dny. Obsah lahví byl pak sklizen a použit k přípravě zásobních kultur pro dlouhodobé uskladnění. 1.6. Analýza kmenů pomocí odpovědi na dávku ultrafialového záření
Kultury požadovaných kmenů byly kultivovány v lahvích s 50 ml média RHM doplněného o přísady nutné pro dvojité auxotrofy. Každá láhev byla inkubována při 28 °C a stálém promíchávání po 48 hodin, a pak byla přenesením 10 ml inokulována subkultura ve druhé lahvi obsahující 50 ml média CMC. Ta byla inkubována za stejných podmínek po 16 až 20 hodin, aby se podpořila sporulace. Vegetativní mycelium bylo odstraněno přefiltrováním přes 2 vrstvy sterilní tkaniny do sterilní nádoby, a pak bylo 20 ml suspenze spor přeneseno do 9 cm Petriho misky. Suspenze byla neustále míchána pomocí magnetického míchadla.
Každá miska byla ozařována ultrafialovým světlem po dobu až 10 minut, pro ozařování byla použita přenosná lampa poskytující ozářenost 20 μίί cm-2. Životaschopnost (přežívání) se v průběhu ozařování měřila tak, že se 0,5 ml vzorku sériově naředilo Ringerovým roztokem, a pak se 0,2 ml každého ředění přenesly na misku s médiem RHM zpevněným agarem (a doplněným podle potřeby) . Misky byly inkubovány při 28 °C a počet kolonií po 48 hodinách byl vyhodnocen a použit k sestrojení časových závislostí průměrné životaschopnosti. Z nich pak bylo ···. ♦ · 4· ·· ··
···♦ • · · • ♦ ♦·· • * ♦ · • · · · ·· ·· 11 možné kvantitativně stanovit expoziční čas odpovídající dané míře usmrcení pro každý kmen. 1.7. Kontinuální průtokové kultury
Kultury byly kultivovány ve fermentoru Biostat ER3 firmy Braun (B. Braun Biotech, Aylesbury, Bucks) s pracovním objemem 2,8 1. Nastavené hodnoty byly: teplota 28 °C, pH 6,0 (udržováno autotitrací pomocí 7M NaOH), míchání 1000 rpm, průtok vzduchu 2,21 1 min-1. Pěnění bylo potlačeno časovaným přidáváním polypropylenglykolového oleje proti pěnění v množství 0,1 až 0,2 ml hod-1·. Nádoba fermentoru byla naplněna roztokem základních solí a glukózy, pak byl přidán síran železnatý tak, aby výsledná koncentrace Fe2+ v růstovém médiu byla 1 mg l-1. Byly nastaveny kontrolní hodnoty a kultura byla inokulována. Růst byl sledován spřaženou analýzou složení vytékajícího vzduchu pomocí hmotnostní spektrometrie, která byla užita ke stanovení rychlosti výdeje oxidu uhličitého (CER). Kontinuální průtoková kultivace byla zahájena spuštěním pump dodávajících roztok minimálních solí a glukózy, železa a protipěnivého prostředku, když hodnota CER dosáhla 35 mmol l-1 hod-1. Železo bylo přidáváno stálou rychlostí v množství odpovídajícím koncentraci Fe2+ ve vstupujícím médiu 0,8 až 1,0 mg Γ1.
Zpětnovazebná smyčka zahrnující hodnotu CER jako základní řídící proměnnou byla využita k regulaci rychlosti průtoku roztoku minimálních solí a glukózy v průběhu kontinuální kultivace. Signály získané hmotnostním spektrometrem byly zpracovány pomocí softwaru, který byl programován tak, aby vytvářel jednu ze dvou hodnot výstupního napětí jako odpověď na to, zda jsou změny hodnoty CER pod nebo nad nastaveným bodem. Výstupní napětí řídilo rotační rychlost peristaltické pumpy, která dodávala roztok základních solí a glukózy, a tím 12 12 ·· ♦ ♦· ·· · » • · • ♦ • ♦ ·«♦ ·♦·· « · ··· · · • · · řídilo rychlost ředění, nebot tento tok sám představoval více než 95 % celkového přítoku do fermentoru. Dvěma hodnotám výstupního napětí v praxi odpovídaly rychlosti ředění mezi 0,15 a 0,25 h'1. Ty byly navrženy tak, aby docházelo buď k dalšímu koncentrování nebo naopak ředění biomasy. Přepínání mezi dvěma limitními hodnotami bylo řízeno softwarem a byla udržována rovnováha, která odpovídala maximální růstové rychlosti organismu. Tento způsob umožňoval, aby se v kultivačním médiu udržovala nadměrná koncentrace glukózy a přitom systém pracoval s maximální povolenou rychlostí ředění.
Sledování morfologie kolonií
Denně byly odebírány čerstvé vzorky kultury z fermentoru a sériově naředěny sterilním Ringerovým roztokem. Alikvoty (0,1 ml) příslušného ředění byly přeneseny na 10 agarových ploten s pevným médiem RHM. Plotny byly inkubovány při 28 °C po 72 hodin, a pak byl stanoven podíl variant postupem, který popsal Wiebe (Wiebe et al., 1991). 2. Výsledky 2.1. Výběr a získání prototrofů
Celkem bylo provedeno 34 560 jednotlivých „páření", 11 520 bez zvláštního ošetření, 11 520 při expozici v kafru a 11 520 při ozařování ultrafialovým světlem. Tab. 1 uvádí počty prototrofů získaných každým z těchto postupů ze 3. (předposlední) a 4. (poslední) selektivní subkultury v minimálním médiu RHM. 13 13 Μ ·· • · · • · · · · • · · • · · • ·♦ Μ · · • · • · · • · • ···· ·· ·· • · I · • · · · • Μ · · • I ·
Tab. 1. Selektivní získání prototrofů užitím 3 způsobů mikrotestů Ošetřeni při pářeni Sledovaný počet Třetí subkultura Čtvrtá subkultura Frekvence vzniku prototrofa žádné 11 520 0 0 0 ultrafialové 11 520 113 1 8,7xl0~5 záření D-kafr 11 520 46 12 1, OxlO-3 Z konvenčních křížení, tj. bez expozice kafru nebo ultrafialovému záření, nebyli získáni žádní prototrofové, což ukazuje, že frekvence vzniku organismů schopných prototrofního růstu přirozeným způsobem je menší než 8,7 x 10“5. Ošetření kafrem bylo jasně nejúčinnějším způsobem, při kterém vzniklo 12 kmenů a frekvence vzniku se zvýšila alespoň o dva řády na 1 x 1CT3. Takto vzniklé kmeny byly označeny D2 a Dli až D21.
Způsob používající ultrafialové záření vedl ke vzniku pouze jednoho klonu (označen kódem 11-1/M1), který původně obsahoval dvě varianty s odlišnou morfologií kolonií. Ty byly pak nazvány „malá" a „velká" vzhledem ke vzájemným rozdílům v průměrech kolonií. Větší z těchto variant byla také životaschopnější a vytvářela zjevně hyfy s vyšší hustotou než menší varianta. Test odpovědi na dávku (viz 1.6) ukázal, že velká varianta byla odolnější k ultrafialovému záření, pravděpodobně díky nižší frekvenci vnitřních mutací. Na základě toho bylo rozhodnuto zaměřit se na tuto variantu a malá varianta byla opuštěna. Celkem bylo získáno 9 14 ♦ · • ·4 • · • · • 4 *♦ ··· ···· jednotlivých velkých kolonií, které rostly na ředicích plotnách v průběhu testu odpovědi na dávku jako subklony, a byly označeny jako kmeny Dl a D3 až D10. Původ (rodokmen) těchto kultur a 12 dalších kultur, které byly ošetřeny kafrem, je shrnut na obr. 1. 2.2. Analýza kmenů testem odpovědi na dávku ultrafialového záření
Expoziční časy (časy k usmrcení) odpovídající 90, 99 a 99,9% redukci počtu přežívajících kolonií byly užity ke kvantitativnímu hodnocení odpovědi na dávku pro každý kmen , (tab. 2).
Tab. 2. Srovnání časů expozice ultrafialovému záření vedoucích k 90, 99 a 99,9% usmrcení spor v suspenzi rodičovských haploidů a domnělých polyploidů F. graminearum označeni kmene s vyšší ploidií počáteční počet života schopných expoziční čas pro 90% usmrcení expoziční čas pro 99% usmrcení expoziční čas pro 99,9% usmrcení Dl 2.5x10« ml'1 5.5 13* >10 D2 4 x 10« ml’1 5.9 >10 >10 D3 1.8x10« ml*1 4.4 8.3 >10 D4 9.5xl05 ml’1 4.8 9.1 >10 D5 1 - 7xlOs ml'1 3.2 4.4 5.9 D6 1.5x10« ml*1 5.4 8.5 >10 D7 1-3x10« ml'1 4.2 7.7 >10 D8 4 x 10« ml'1 4.5 6.6 · >10 (Tab. 2 - pokračováni) D9 6.5xl05 ml'1 4.9 00 >10 D10 3 x 106 ml'1 4.1 8.5 >10 Dli 3.5xl05 ml"1 5.2 >10 >10 D12 1.4xl06 ml'1 5.7 8.7 >10 D13 5.5xl05 ml'1 5.2 9.5 >10 D14 3.5xlOs ml'1 3.5 7.2 >10 D15 2.6xl06 ml'1 5.3 >10 >10 Dl 6 9 x 105 ml'1 5.9 >10 >10 D17 2 x 10s ml'1 6.8 >10 >10 Dl 8 5 x 105 ml"1 4.9 8.4 >10 D19 l.lxlO6 ml'1 1.9 3.6 >10 D20 l.SxlO5 ml'1 10.5* >10 >10 D21 1.8xlQs ml*1 2.8 4.9 9.9 Parent Haploids A3/5 2.3xl05ml-1 4.4 5.7 7.4 UMDA4-C 1.5xl05 ml"1 7.4 >10 >10 UMDA6-N 3.9xlOs ml'1 5.7 9.2 >10 Všechny uvedené časy jsou v minutách Hodnoty označené * byly získány extrapolací 16 ·· Μ t · · • ·· ·· · · • ·
• · · · ·· ·· • · ··· • · · · · t Μ « · • * · · • · ·· ··· · · • ·
Organismy Dl, D2 a D21 byly 19. října 1995 uloženy v souladu s Budapešťskou smlouvou v Mezinárodním mykologickém ústavu (IMI), Bakeham Lané, Egham, Surrey TW20 9TY, Spojené království, jako položky č. IMI 369192, IMI 369191 a IMI 369190.
Pro kmen A3/5 byly příslušné časy k usmrcení 4,4, 5,7 a 7,4 minut. V případě dvojitých auxotrofů bylo zřejmé, že je třeba delší expozice k získání plně srovnatelných hodnot, neboť časy odpovídající 99,9% usmrcení (a 99% pro UMDA4-C) se nevešly do 10 minutové expozice.
Obecně hodnoty představující 90 a 99% usmrcení * u předpokládaných organismů s vyšší ploidií z páření ovlivněného ultrafialovým zářením byly stejného řádu jako hodnoty pro rodičovské haploidy. Většina skupin měla čas 90% usmrcení s odchylkou 0,5 minuty od času pro kmen A3/5, tj. 3,9 až 4,9 minuty, ačkoliv bylo zřejmé, že dva kmeny (Dl a D5) se odlišovaly od ostatních. Hodnoty pro Dl byly vyšší než odpovídající hodnoty pro ostatní izoláty ve skupině, zatímco všechny hodnoty pro D5 byly nižší. Tyto závislosti ukazují, že Dl je podobný dvojitým auxotrofům, t j. odolnější než A3/5, a že D5 je poněkud méně rezistentní než A3/5.
Naproti tomu polovina izolátů získaných z páření při ošetření kafrem vyžadovala expoziční časy k 99% usmrcení delší než 10 minut. Velká část kmenů měla tento čas v rozmezí 4,9 až 6,8 minut, ale byly zde čtyři významné výjimky. Kmeny Dl4, Dl9 a D21 se zdály být citlivější, zatímco D20 byl naopak odolnější, a to nejen ze skupiny ovlivněné kafrem, ale ze všech prototrofů izolovaných v průběhu celého programu. 17 • Μ «· · · * ♦ • · • « «·» *··· '·· «» ♦ · · t # · ·« * · · • I · «« ·* • · • * t • * t · * · ♦ 2.4. Výskyt variant v kontinuálních průtokových kulturách Dl a D2
Varianty s omezeným fenotypem kolonie se obvykle zjišťují v kontinuálních průtokových kulturách kmene A3/5 po období 107 ± 14 generaci, tj. 448 ± 60 hodin. Avšak varianty s omezeným fenotypem kolonií nebyly detekovány v průběhu fermentace Dl až do 540. generace a D2 až do 594. generace, tj. 1957 a 2028 hodin fermentace (tab. 3). Zvýšená stabilita se tak přibližuje nejméně čtyřnásobnému zvýšení délky produkčního běhu komerčních fermentací QUORN®.
Tab. 3. První výskyt mutant s omezenou kolonií v kontinuální průtokové kultuře Fusaria kmene A3/5, Dl a D2.
Označeni kmene Průměrná rychlost ředění při kontinuálním toku (h-1) Čas po spuštění kontinuálního toku (h) Počet generací od počátku kontinuálního toku A3/5 0,17 448 ± 60 107 ± 14 Dl 0,19 1957 540 D2 0,2 2028 594 18 • »· *· * · * · • · «Μ ttt* ·· ·· • · • • · « · • · • ♦ ♦ ♦ • · • · ♦ ··· « * « · ♦ · • ♦ · ·· ♦ ♦ ·♦
Tab. 4. Existence parasexuálniho cyklu u hub Třída Druh Poznámka Odkaz Asco- Eurotium (Aspergillus) modelová houba Roper (1952) mycotina nidnlans Basidio- Coprinus cinereus koprofilní houba Casselton (1965) mycotina Ustilago myadis patogen kukuřice Holliday (1961) působí obilní sněť Deutero- Acremonium chrysogenxm užíván k produkci Nuesch et al. mycotina cefalosporinu C (1973) AspergiHus niger užíván k produkci Pontecorvo et al. kyseliny citrónové (1953) Aspergillus sojae užíván ve fermentaci Ishitani et al. kóji (1956) Penicillivm chrysogenum užíván k produkci Pontecorvo penicilinu a Sermontii (1954) Penicillium expansím patogen jablek Barron (1962) Verticillium albo-atrum patogen chmele Hastie (1962) Verticillium dahliae patogen s širokým Hastie (1962) spektrem plodin Verticillium lecanii hmyzí patogen Jackson a Heal (1983) Fusarium oxysporum patogen hrachu Buxton (1956) 19 • · • · «·* «··♦ ·· *· t · · t * ··· • t f · • » < ♦ • f »· « ·· • « ··· * • ♦ ·· ·♦ *« #♦
Seznam literatury BALL, C., LAWRENCE, A.J., BUTLER, J.M. & MORRISON, K.B. (1978) . European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 5, 95-102. BARRON, G.L. (1962). The parasexual cycle and linkage relationships in the storage rot fungus Penicillium expansum. Canadian Journal of Botany 40, 1603-1613. BOOTH, C. (1984). The Fusarium problém: historical, economic and taxonomie aspeets. In: The Applied Mycology ofFusarium (ed. M. O. Moss & J. E.Smith), pp. 1-14. London: British Mycological Society. BU'LOCK, J.D., MOONEY, J.P. & WRIGHT, C.E. (1986). Regulation of mycotoxin production by Fusarium graminearum: complementation effects beťween two mutant types. Biotechnology Letters 8 (5), 323-326. BUXTON, E.W. (1956). Heterokaryosis and parasexual recombination in pathogenic strains of Fusarium oxvsporum. Journal of General Microbiology 15, 133-139. CALAM, C.T., DAGLISH, L.B. & McCANN, E.P. (1976). In: Proceedings of the Second International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms. (ed. K.D. MacDonald) pp. 273 - 287. London: Academie Press. CASSELTON, L.A. (1965). The production and behaviour of diploids of Corprinus lagopus. Genetical Research 6, 190-208 CATEN, C.E. (1981). Parasexual processes in fungi. In: The Fungal Nucleus (eds. K. Gull and S. T. Oliver) pp. 191-214. Cambridge: Cambridge University Press. CHANG, L.T., TERESAKA, D.T. & ELANDER, R.P. (1982). Developments in Industrial Microhiology 23, 21-29. CRUEGER, A. (1982) . In: Fourth International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms. Abstract 0-V1-1. DAS, A. & ROY, P. (1978). Improved production of citric acid by a diploid strain of Aspergillus niger. Canadian Journal of Microhiology 24, 622-625. ELANDER, R.P., ESPENSHADE, M.A., PATHAK, S.G. & PAN, C.H. (1973). In: Proceedings of the First International Symposium on the Genetics of Industrial Microrganisms (eds. Z. Vaněk, Z. Holstalek & J. Cudlin) pp. 239-253. Amsterdam: Elsevier Publishing Co. HAMLYN, P.F. & BALL, C. In: Proceedings of the Third International Symposium on the Genetics of Industrial Microrganisms (eds. O. K. Šebek & A. I. Laskin) pp. 185-191. Washington DC: American Society for Microbiology. 21 21 ·· • · • · ··· *··♦ » · ···· » · ·· ♦ · • ·: :: : * *·:: · ·· ·· ·< HASTIE, A.C. (1962). Genetic recombination in the hop-wilt fungus Verticillium albo-atrum. Journal of General Microbiology 2Ί, 373-382. HASTIE, A.C. (1970). The genetics of asexual phytopathogenic fungi with speciál reference to Verticillium. In: Root Disesases and Soil-bome Pathogens (eds. T. A. Tousson, R. V. Bega & P. E. Nelson) pp. 55-62. Berkeley: University of Califomia Press HOLLIDAY, R. (1961) . Induced mitotic crossing-over in Ustilago maydis. Genetical Research 2, 231-248. ISHITANI, C., IKEDA, Y. &. SAKAGUCHI, K. (1956).
Hereditary variation and genetic recombination in Koji-molds (Aspergillus oryzae and Aspergillus sojae). VI. Genetic recombination in heterozygous diploids. Journal of General and Applied Microbiology (Tokyo) 2, 401-430. JACKSON, C.W. & HEALE, J.B. (1983). Protoplast fusion to overcome vegetative incompatibility in Verticillium lecanii parasexual genetics. In: Protoplasts 1983.
Poster Proceedings, 6th intemational Protoplast symposium, Basel, August 12-16, 1983, pp 318-319. Basel: Birkhauser Verlag. JOHNSON, J.R. (1975). Strain improvement and strain stability in filamentous fungi. In: The Filamentous Fungi Vol. 1. (eds. J.E. Smith & D.R. Berry) pp. 59-78. London: Edward Arnold. 22
··♦ · « • « * M tt I · « • ·· NÚESCH, J., TREICHLER, H.J. & LIERSCH, M. (1973). The biosynthesis of cephalosporin C. In: Genetice of Industrial Microorganisms, Actinomycetes and Fungi (eds. Z. Vaněk, Z. Hostalek & J. Cudlin) pp. 309-334. Prague: Academia. PAQUIN, C. & ADAMS, J. (1983). Frequency of fixation of adaptive mutations is higher in evolving diploid than haploid yeast poulations. Nátuře 302, 495-500. PEBERDY, J.F. (1988) . Genetic manipulation. In: Physiology of Industrial Fungi (ed. J.F. Peberdy) , pp. 187 - 218. Oxford: Blackwell Scientific Publications. PONTECORVO, G., ROPER, J.A. & FORBES, E. (1953). Genetic recombination without sexual reproduction in Aspergillus niger. Journal of General Microbiology 8, 198-210. PONTECORVO, G. & SERMONTI, G. (1954). Recombination without sexual reproduction in Penicillium chrysogenur. Nátuře 172, 126-127. REHM, H.J. & REED, G. (1981). Genetic Systems in industrial micro-organisms. In: Biotechnology, Vol. I Microbial Fundamentals (eds. H.F. Ebel and C. Schultz) pp. 246 - 251. Basel: Verlag Chemie. ROPER, J.A. (1952). Production of heterozygous diploids in filamentous fungi. Experientia 8 (1), 14-15. 23 ♦ · ·· • · ·· ·· • · · • · ··♦ • · · ♦ · ·· *♦ # · · ♦ • · Μ ♦ ·♦ · · ROPER, J.A. (1966). The parasexual cycle. In: The Fungi, Volume II, The Fungal Organism (eds. G. C. Ainsworth & A.S. Sussman) pp. 589-617. New York:
Academie Press. ROWLANDS, R.T. (1984). Industrial strain improvement: rational sereens and genetic recombination techniques. Enzyme & Microbial Technology 6, 290-300. STERN, C. (1936) . Somatic crossing-over and segregation in Drosophila melanogaster. Genetics 21, 625-630. TAKEDA CHEMICAL COMPANY (1977). [Production of cephalosporin C] . British Patent Number 1 488 822. WIEBE, M.G-, TŘINCI, A.P.J., CUNLIFFE, B, ROBSON, G.D & OLIVER, S.G., (1991) : Appearance of morpnological (colonial) mutants in glucose-limited continuous-flow cultures of Fusarium graminearum A3/5. Mycological Research 95, 1284-1288. WILLIAMS, M.A.J. & KIRK, P.M. (1988). Characteristics of industrial fungi. In: Physiology of Industrial Fungi (ed. J. F. Peberdy), pp. 1-17. Oxford: Blackwell Scientific Publications.

Claims (20)

  1. 24 • ♦· ·· · · • ♦ • · ♦ • · ···♦ ·· ♦ · ·· • · • ··· 9 · * • t · 99 * ·· • 9 999 9 • · ♦ ♦ ·· ·♦ ♦ ·« PATENTOVÉ NÁROKY 1. Lidský potravinářský výrobek vyznačující se tím, že obsahuje kmen s vyšši ploidií ze skupiny Fungi imperfecti, kde každý z rodičů má .genetickou zábranu růstové schopnosti, která není sdílena s druhým rodičem.
  2. 2. Jedlý kmen s vyšší ploidií rodu Fusarium, u něhož každý z rodičovských kmenů je auxotrofní pro jiný metabolit.
  3. 3. Kmen podle nároku 2, jehož jeden rodič je auxotrofní pro dvě aminokyseliny vybrané z histidinu, argininu, leucinu a adeninu, a druhý rodič je auxotrofní pro ostatní dvě z uvedených sloučenin.
  4. 4. Kmeny Fusaria IMI 369190, IMI 369191 a IMI 369192 a mutované varianty a z nich pocházející kmeny s vyšší ploidií.
  5. 5. Kmen s vyšší ploidií ze skupiny Fungi imperfecti, který je mrtvý a jehož obsah nukleových kyselin je menší než 2 % hmotnostní.
  6. 6. Kmen podle nároku 5, kde každý z rodičů má genetickou zábranu růstové schopnosti, která není sdílena s druhým rodičem.
  7. 7. Kmen podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, nebo potravinářský výrobek podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že kmen je mrtvý a jeho obsah nukleových kyselin je menší než 2 % hmotnostní. 25 • ♦· ·· · · • · • · • · ······· ·· ·· ► · · t · ··· I · · · » · · · ·· ·· ·· • * ♦ I · ?·· · • · ·· »t • · t ♦
  8. 8. Způsob přípravy kmene Fungi imperfecti podle nároků 5, 6 nebo 7, vyznačující se tím, že se použitím vody o teplotě nejméně 60 °C usmrtí kmen s vyšší ploidií ze skupiny Fungi imperfecti a současně se sníží obsah nukleových kyselin pod 2 % hmotnostní.
  9. 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že se použije houba Fusarium A3/5.
  10. 10. Způsob přípravy kmene s vyšší ploidií jedlého Fusaria · vyznačující se tím, že se kultivují dva auxotrofní kmeny, které vyžadují odlišné auxotrofní živiny, společně v médiu obsahujícím živiny, které umožňují růst obou kmenů (stadium společné kultury), a dále se kultivují organismy odvozené z této kultury v médiu, ve kterém chybí auxotrofní složky, tj. v minimálním médiu (stadium kultury v minimálním médiu), a ze stadia kultury v minimálním médiu se získá kmen s vyšší ploidií.
  11. 11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že auxotrofové se získají mutací a selekcí.
  12. 12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že oba auxotrofové pocházejí ze stejného kmene.
  13. 13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12 vyznačující se tím, že auxotrofové vyžadují jako živiny odlišné aminosloučeniny.
  14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že každý z auxotrofů vyžaduje jako živiny dvě 26 • ·· Μ · · • t • · · • · Mt Μ·· t f • ·· ·· *· • ··· • I I • · * • · ·· M I · · · I · ·· ·«« · · • · · M ·· aminosloučeniny, z nichž žádná není shodná s těmi, které vyžaduje druhý auxotrof.
  15. 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 14 vyznačující se tím, že houby ze stadia společné kultury se podrobí mutagenezi dostatečně silné k tomu, aby se usmrtil podstatný podíl jakýchkoliv přítomných haploidních hub, a přitom některé houby s vyšší ploidií přežily, čímž mutagenezi přežije větší podíl hub s vyšší ploidií než haploidních.
  16. 16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 15 vyznačující se tím, že houby se podrobí mutagenezi ve stadiu kultury v minimální médiu a nebo po zotavení z této kultury, přičemž mutageneze je dostatečně silná k tomu, aby se usmrtil podstatný podíl jakýchkoliv přítomných haploidních hub, a přitom některé houby s vyšší ploidií přežily, čímž mutagenezi přežije větší podíl hub s vyšší ploidií než haploidních.
  17. 17. Způsob podle nároku 15 nebo 16 vyznačující se t í m, že mutageneze se provede pomocí záření.
  18. 18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že záření, které se použije, je ultrafialové záření.
  19. 19. Způsob přípravy lidské potraviny vyznačuj ící se tím, že se kultivuje kmen s vyšší ploidií Fungi imperfecti takový, že každý z rodičů má genetickou zábranu růstové schopnosti, která není sdílena s druhým rodičem, a způsob se provádí v takových podmínkách, že se minimalizuje zvrat nebo částečný zvrat k haploidní formě(formám). ·· ··* • « 27
  20. 20. Lidská potravina vyznačující se tím, že obsahuje kmen s vyšší ploidií Fungi imperfecti, kde houba byla ošetřena tak, aby se odstranily nukleové kyseliny a/nebo změnila textura, chuť a vjem v ústech.
CZ981853A 1995-12-16 1996-12-09 Potravinářský výrobek obsahující houbu a způsob jeho přípravy CZ185398A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9525902.4A GB9525902D0 (en) 1995-12-16 1995-12-16 Fungus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ185398A3 true CZ185398A3 (cs) 1998-09-16

Family

ID=10785656

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ981853A CZ185398A3 (cs) 1995-12-16 1996-12-09 Potravinářský výrobek obsahující houbu a způsob jeho přípravy

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5980958A (cs)
EP (1) EP0870010B1 (cs)
JP (1) JP3672571B2 (cs)
CN (1) CN1209166A (cs)
AT (1) ATE267244T1 (cs)
AU (1) AU719054B2 (cs)
BR (1) BR9612037A (cs)
CZ (1) CZ185398A3 (cs)
DE (1) DE69632545D1 (cs)
GB (1) GB9525902D0 (cs)
HU (1) HUP9903788A3 (cs)
IL (1) IL124853A (cs)
IN (1) IN186160B (cs)
MX (1) MX9804812A (cs)
NO (1) NO982757L (cs)
NZ (1) NZ323986A (cs)
PL (1) PL327170A1 (cs)
RU (1) RU2218029C2 (cs)
WO (1) WO1997022686A1 (cs)
ZA (1) ZA9610477B (cs)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
EP1322655B1 (en) * 2000-01-14 2007-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
EP1133926A1 (en) * 2000-03-17 2001-09-19 Dsm N.V. Foodstuffs containing mucorales fungi
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
WO2003020884A2 (en) 2001-08-14 2003-03-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
US7615227B2 (en) 2001-12-20 2009-11-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce angiogenesis
US8466116B2 (en) 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
US8263091B2 (en) 2002-09-18 2012-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides
KR100762848B1 (ko) * 2006-05-25 2007-10-04 씨제이 주식회사 균류 단백질의 제조방법, 이에 의해 제조된 균류 단백질,이 균류 단백질을 포함하는 저칼로리의 인조육 및 천연육고기향 향미제
RU2560426C2 (ru) 2008-04-30 2015-08-20 Ксилеко, Инк. Переработка биомассы

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1440642A (en) * 1973-09-24 1976-06-23 Ranks Hovis Mcdougall Ltd Production of edible protein containing substances
US4163692A (en) * 1977-04-25 1979-08-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Low phosphate growth of fungal mycelia

Also Published As

Publication number Publication date
JP2001519645A (ja) 2001-10-23
IL124853A (en) 2002-08-14
MX9804812A (es) 1998-10-31
WO1997022686A1 (en) 1997-06-26
JP3672571B2 (ja) 2005-07-20
ATE267244T1 (de) 2004-06-15
NO982757D0 (no) 1998-06-15
IN186160B (cs) 2001-06-30
HUP9903788A2 (hu) 2000-03-28
AU719054B2 (en) 2000-05-04
HUP9903788A3 (en) 2000-04-28
NZ323986A (en) 2000-01-28
NO982757L (no) 1998-08-14
BR9612037A (pt) 1999-02-09
EP0870010B1 (en) 2004-05-19
PL327170A1 (en) 1998-11-23
IL124853A0 (en) 1999-01-26
US5980958A (en) 1999-11-09
RU2218029C2 (ru) 2003-12-10
CN1209166A (zh) 1999-02-24
EP0870010A1 (en) 1998-10-14
DE69632545D1 (de) 2004-06-24
AU1103997A (en) 1997-07-14
GB9525902D0 (en) 1996-02-21
US6270816B1 (en) 2001-08-07
ZA9610477B (en) 1997-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Scherr et al. The dimorphism phenomenon in yeasts
Trinci Myco-protein: A twenty-year overnight success story
Jackson et al. The composition and attributes of Colletotrichum truncatum spores are altered by the nutritional environment
CA2270116C (en) Beauvericin detoxification compositions and methods
CZ185398A3 (cs) Potravinářský výrobek obsahující houbu a způsob jeho přípravy
RU2549696C2 (ru) ШТАММЫ Cryptococcus flavescens, УСТОЙЧИВЫЕ К ПРОТИОКОНАЗОЛУ, ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ФУЗАРИОЗА
NZ335211A (en) Micro-organism Ochrobactrum anthropi and method for degradation of moniliformin in grain
KR20210118391A (ko) 에르고티오네인을 생산하는 균주 및 이의 선별 방법
Kiguchi et al. Intraspecific heterokaryon and fruit body formation in Coprinus macrorhizus by protoplast fusion of auxotrophic mutants
Schisler et al. Co-culture of yeast antagonists of Fusarium head blight and their effect on disease development in wheat
Conner et al. Efficacy of media for promoting ascospore formation by Neosartorya fischeri, and the influence of age and culture temperature on heat resistance of ascospores
Loera et al. Pectinase production by a diploid construct from two Aspergillus niger overproducing mutants
Hébraud et al. Protoplast production and regeneration from mycorrhizal fungi and their use for isolation of mutants
Chamberlain et al. The balance and interplay between asexual and sexual reproduction in fungi
Sasaki et al. Breeding of a brewer's yeast possessing anticontaminant properties
CN111713334A (zh) 一种生态食用菌种培育方法
US7067299B2 (en) Materials and methods for in vitro production of bacteria
Yanagi et al. An efficient method for the isolation of mycelial protoplasts from Coprinus macrorhizus and other basidiomycetes
CA2240593A1 (en) Fungal food
HK1017017A (zh) 真菌食品
Arras et al. Inhibitory activity of yeasts isolated from fig fruits against Penicillium digitatum
KR102865122B1 (ko) 푸사리움 브라키깁보숨 (Fusarium brachygibbosum)의 균사체 단백질 생산에서의 응용
Cho et al. Control of aflatoxin production of Aspergillus flavus by inghbitory action of antagonistic bacteria
JPH05268942A (ja) 新菌株の培養及び栽培方法
KR101233667B1 (ko) 고 농도의 ｒｎａ를 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic