CZ179597A3 - Způsob modulace LC 132 (opioidu podobné) receptorové funkce - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Řešení se týká screeningové metody terapeuticky vhodné sloučeniny testováním LC132 receptor agonisty ve screeningové zkoušce na psychiatrické a/nebo neurologické poruchy. Screeningové metoda je založena na kontaktování LC 132 receptorů s činidlem, o kterém se předpokládá, zeje agonistou LC132 receptorové funkce, s následující detekcí vazby a/nebo agonistické aktivity dané sloučeniny a na testování činidla LC132 ágonistickou aktivitou v antiepileptické, antikonvulzantní nebo anxiolytické screeningové zkoušce.

Způsob modulace LC132 (opiodům podobné) receptorové funkce

Oblast techniky

Předložený vynález se týká screeningové metody, zahrnující testování LC132 receptor agonisty ve screeningivýcb zkouškách pro neurologické a/nebo psychiatrické poruchy. Specifičtěji, screeningová metoda je založena na uvedení LC132 receptorů do styku s činidlem, považovaným za působící jako agonista LC132 receptorové funkce s následující detekcí vazby a/nebo agonistické aktivity sloučeniny a pak testování činidla s LC132 agonistickou aktivitou v antiepileptickém, antikonvulzním a/nebo anxi o 1ytickém screeningovém testu pro demonstrování terapeuticky relevantní aktivity v těchto poruchách.

Dosavadní stav techniky

V současnosti benzodiazepin receptor agonisté (např. alprazolam, diazepam, lorazepam) stále představují predominantní léčbu v klinické medicíně pro úzkostné poruchy, zejména akutní úzkost. Protože benzodiazepin receptor agonisté mají antikonvulzantní vlastnosti, používají se někteří také jako antiepi1eptická léčiva. V poslední době byly nalezeny jiné třídy léčiv pro klinické použití při léčbě úzkostných poruch, například selektivní inhibitory zpětného vychytávání serotoninu (např. fluoxetin) a buspiron. Léčba epilepsie je v s oučasnos t i prováděna 1éčivv j ako j e karbamazepin, f enyto i n, valproat, ethoxysuximid a fenobarbital. Jak je popsáno dále, nejsou dostupná léčiva používaná ve farmakologickém léčení úzkosti, epilepsií a konvulzí optimální.

l“ • · · • ··· «····· *· ·· ·· • · · • ·· • · · · · • · · ·· ··

Úzkost je fyziologický fenomen, který působí jako varovný signál pro reálné nebo potenciální nebezpečí. Úzkost se stává patologickou, jestliže se objevuje za nepřítomnosti jakéhokoliv reálného nebezpečí nebo když intenzita emoce je přehnaná. Jak fyziologická tak patologická úzkost mohou být život ohrožující, jestliže se vyskytují ve vztahu k již existujícím organickým poruchám a mohou vytvářet nebo zvěčnit různé fyziologické poruchy. Různé úzkostné poruchy představují relativně běžné psychiatrické poruchy s hodnocením kombinované prevalence v obecné populaci asi 4 až 8 procent. Bezprostřední zmírnění poskytnuté benzodiazepin receptor agonisty v léčbě úzkostných poruch je dobře zdokumentováno. I když účinnost těchto léčiv se jeví jako udržovaná po dlouhou dobu, nebezpečí incize se zvyšuje, jestliže léčba probíhá více než několik týdnů. I když nežádoucí účinky mohou být z velké části vyloučeny optimalizací dávek benzodiazepin receptor agonistů pro jednotlivého pacienta, dávky vyžadované pro obtížné případy úzkosti a epilepsií jakož i pro snížení patologického svalového tonu často potlačují bdělost na úroveň, která narušuje intelektuální funkci a snižuje pozornost a přesnost v různých oborech (práce na strojích, řízení vozidla). Individuální citlivost na tuto nadměrnou sedaci se velmi mění. Svalová relaxace může vést ke zmatené řeči a narušené chůzi, zejména u starších pacientů. Behaviorální disinhibice se může objevovat při vyšších dávkách a i při normálních dávkách u jednotlivců, majících minimální zkušenosti s centrálně aktivními léčivy. Problémy se také mohou vyskytovat díky d 1 ouhodobému výstave ní be n z o d i a z epinrece p t o r o výrn ag on i s ť ům. Jedním z nich je vývoj tolerance k terapeutickému účinku. Ztráta antiepi 1eptické účinnosti se objevuje u značné části pacientů (označeno jako únikový fenomen). Fyzická závislost manifestovaná jako symptomy vysazení léčiva po přerušení podávání, je funkcí trvání vystavení léčivu, dávky, trvání působení léčiva a osobnosti pacientů. Ve zřetelném kontrastu k anxiolytikům působícím přes agonismus benzodiazepinového receptorů (která vykazují antikonvulzantní, svalově relaxační a sedativní/hypnotické účinky), azaspirodekandion buspiron představuje pouze anxi olytickou aktivitu. Bylo uvažováno, že mechanismus působení buspironu zahrnuje parciální agonismus na serotoniniA receptorů. Výhody buspironu zahrnují menší sedaci, mens í psychomotorické zhoršení ve spojení s pož íváním ethanolu, sníženou fyzickou závislost a mnohem menší návykovou závislost než u benzodiazepin receptorových plných agonistů. Nicméně velké zpoždění v nástupu anxiolytické aktivity je výrazným rozdílem vzhledem ke klasickým benzodiazepinovým trankvi1 izérům, kteří působí rychle. Navíc zde jsou možné problémy při komplianci léčby buspironem a problémy s účinností u pacientů dříve léčených benzodiazepin receptorovými agonisty nebo vykazujícími těžkou úzkost. Buspiron není pouze cenným přínosem k medikální výzbroji, jehož místo se stává postupně jasněji definovaným, ale je velmi důležitý z teoretického hlediska, protože je prvním anxiolytikem k naplnění rigorózní klinické účinnosti a bezpečných moderních standardů. Z hlediska mechanismu působení selektivních inhibitorů zpětného vychytávání serotoninu (SSBI) se jeví, že výsledná zvýšená využitelnost neurotransmitéru serotoninu v synaptické štěrbině je odpovědná za farmako1ogické účinky této třídy léčiv. Avšak nástup t erapeut i ckého působení SSRI j e porna 1 ý, obvyk1e vyžadu j í cf“ ” alespoň několik týdnů. I když byly původně vyvinuty a převážně používány jako antiepresanty, byly SSBI zvýšeně používány při léčení panické choroby, např. fluoxetin nebo ····

99·· ·9 • · « ··· · « • · · · • · · • 999 ·9 • 9 ·· • · > · ·· ··· ·

9 ·· 9· obsesivně-kompulzivní choroby, např. fluvoxamin. SSRI jsou obecně dobře tolerovány, i kdž běžné nežádoucí účinky pro součeniny této třídy zahrnují nervozitu, třes, závratě, bolesti hlavy, nespavost, sexuální dysfunkci, zvracení a diarrheu. Navíc tricyklický antidepresant clopiramine, který je potentní neselektivní inhibitor zpětného vychytávání serotoninu, je schválen pro léčení obsesivní kompulzivní poruchy /viz např. Martin a Haefely, v Principles of Pharmaco1ogy, vyd. Munson a spol., Chapman & Halí. N.Y. 1995, str. 243-277/.

Epilepsie je neurologická porucha, která poskytuje asi 1 procento populace. Tento chronický stav je charakterizován opakujícími se spontánními záchvaty nepůsobenými aktivní mozkovou chorobou. Záchvaty jsou náhlé, silné, č<sově omezené změny v chování spojené s nadměrným uvolňováním mozkových neuronů. V současnosti jsou epilepsie obvykle klasifikovány podle hlavního záchvatového typu přítomného u pacienta (u daného pacienta může být jeden nebo více než jeden typ záchvatů, alě jeden je obvykle častější než ostatní a používá se jako základ pro klasifikaci). Praktickou výhodou klasifikace záchvatového typu je, že umožňuje, v určitém stupni, předpovídat responzivitu k teraputickým alternativám. Obecně pouze asi polovina pacientů bude mít své záchvaty bezpečně kontrolované antiepi1eptickými léčivy; zbývající polovina bude rozdělena na pacienty, mající příležitostné záchvaty a pacienty, kteří mají nekontrolovatelné záchvaty a/nebo jyepřijjtfcΛ.1 né^nežádouc í ái-ě-i-nky- z -ant-řepH epťřcké⁼------medikace. Dále léčiva v současnosti používaná často vykazují vedlejší účinky. Existuje mnoho etiologií záchvatů a původ často zůstává nejasný, proto jsou antiepileptika jakož i jiná ···· ·· • · « • · · · 4 • · · 4 • · 4 • · · · · * • · · · 4 • · 1 ·· ·· léčiva, vykazující antikonvulzantní účinky, terapeuticky důležitá, (např. viz Lloyd a Gillenwater, v Principles of Pharmacology, vyd. Munson a spol., Chapman & Halí, N.Y., 1995, str. 363-398).

Sedmnáct aminokyselin dlouhý peptid (F-G-G-F-T-G-A-R-K-SA-R-K-L-A-N-Q) nazvaný orphanin FQ nebo nociceptin byl dříve již izolován z krysího mozku (Meunier a spol., Nátuře 377:532-535, 1995) a z prasečího hypothalamu (Reinscheid a spol., Science 270: 792-794, 1995). Aminokyselinová sekvence orphaninu FQ je shodná se sekvencí nociceptinu a bude zde dále označována jako OFQ. Julius (Nátuře 377:476, 1995) diskutuje objev OFQ s uvedením, že tento peptid vykazuje největší sekvenční podobnost s dynorphinem A, jedním z pěti uznávaných endogenních ligandů pro opiodní receptory. OFQ inhibuje adenylat cyklasu v CHO(LC132⁺) buňkách v kultuře a indukuje hyperalgesi i , je-li podáván intracerebroventrikulárně myši (Meunier a spol, loc,cit.). Schéma výsledků naznačuje, že tento heptadekapeptid je endogenní agonista LC132 receptorů a že se jeví jako mající pro-nociceptivní vlastnosti. Reinscheid a spol., (loc.cit.) uvádějí, že je-li injektován intracerebroventrikulárně myši, snižuje OFQ lokomotorickou aktivitu a vyvolává hyperalgesii v testu mrskání ocasem (ale ne v testu na horké desce). Byl učiněn závěr, že OFQ může působit jako mozkový neurotransmitér k modulování nocicepčního a lokomotorického chování.

_ ^«.. Vaushan^a^.-Chri-sb i e -(Br«.•J-. Pharmacol“. 1’77 :Ν 6Ό9-Τ6 117⁼ Γ996) hodnotili působení OFQ na membránové vlastnosti krysích dorsál ní ch švů jaderných neuronů za použití celočlánkové náplasťové svorky zaznamenané v mozkovém řezu. V souladu s uvedenou přítomností LC132 receptorové mRNA v dorsálních švových neuronech (Lachowicz a spol., J.Neurochem. 64:34-40, 1995) a G-proteinein-zprostředkované kopulace klonovaných LC132 receptorů k aktivaci K kanálků (Zhang a Yu, J.Biol.Chem. 270:22772-22776, 1995) bylo zjištěno, že LC132 receptorový ligand nociceptin potentně a účinně zvyšuje vnitřní usměrnění K vodivost v dorsálních švových neuronech.

Překvapivě vynálezci demonstrovali, že agonisté LC132 receptorů podobní OFQ ovlivňují ve zvířecích modelech psychiatrické a neurologické poruchy (předpoklad terapeutické účinnosti u pacientů), zejména, ale bez omezení, léčbu úzkostných poruch, epilepsií a konvulzí. Toto stanovení umožnilo přihlašovateli vyvinout metody a protokoly, kterými mohou být identifikovány vhodné substance, které poskytují jak terapeuticky vhodné sloučeniny a/nebo sloučeniny, které mohou být použity při objevování terapeuticky vhodných sloučenin. V souladu s tím se předložený vynález týká metod screeningu terapeuticky vhodné sloučeniny, které zahrnují testování LC132 receptor agonisty ve screeningové zkoušce pro psychiatrické a/.nebo neurologické poruchy, zejména v ant i ep i 1 ept i ckém , antikonvulsantním nebo anxiolytickém screeningovém testu.

V preferovaném provedení zahrnuje metoda screeningu terapeuticky vhodné sloučeniny testování LC132 receptor agonisty ve screeningové zkoušce psychiatrické a/nebo neurologické poruchy. Výhodně metoda zahrnuje kontaktování LC132 receptoru s činidLem, u kterého se očekává; že budemít¹ ’ LC132 receptorovou aktivitu a detekci vazby LC132 recepto-činidla a/nebo stanovení LC132 receptor agonistické aktivity s následujícím testováním činidla, majícího ···· • · · • · ·· • · · • · · • · · · · • · · ·· ·· agonistickou aktivitu ve screeningové zkoušce psychiatrické a/nebo neurologické poruchy, totiž v antiepi1eptické, antikonvulzantní nebo anxiolytické screeningové zkoušce.

Výraz LC132 receptor nebo LC132 receptorový protein označuje nativní receptorový protein a jeho deriváty, tento receptor nebo jeho deriváty z různých živočišných druhů mají v literatuře několik jmen, nejběžněji je užíván ORLi . LC132 receptor, orphan receptor, jehož lidské a myší DNA byly v poslední době charakterizoványm se strukturně řadí k opiodním receptorům (Mollereau a spol., FEBS Lett. 341: 33-38, 1994; Fukuda a spol., FEBS Lett. 343: 42-46, 1994; Chen a spol.,

FEBS Lett. 347: 279-283, 1994; Bunzow a spol., FEBS Lett. 347: 284-288, 1994; Wang a spol., FEBS Lett.348: 75-79, 1994; Lachowicz a spol., loc.cit.; Nishi a spol.,

Biochem.Biophys.Res.Commun. 205: 1355-1357, 1994 a Wick a spol., Molec.Brain Res. 27: 37-44, 1995). LC132 receptorová bioaktivita je charakterizována svojí vysokou vazebností OFQ a je negativně kopulována s adenylát cyklasou (Meunier a spol., loc.cit.; Reinscheid a spol., 1995, loc.cit.).

Obyčejně preferované LC132 receptorové deriváty mají aminokyselinovou sekvenci, mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu s odpovídající lidskou LC132 receptorovouaminokyselinovou sekvencí, výhodně alespoň 90% a nejvýhodněji alespoň 95% a jsou charakterizovány tím, že jsou schopny vazby k OFQ s vysokou afin i tou. Zviáště výhodné provedení zkouškové metody zahrnuje použití nativního lidského LC132 receptorového proteinu.

···· ·· • · • ·· · • 9 ·· ♦ · · · • · ·· • · · * · • 9 9

99

Výraz LC132 receptorový protein také zahrnuje deriváty přirozeně nebo nepřirozeně se vyskytujících receptorových proteinů a příbuzných proteinů, obsahující alespoň částečnou proteinovou sekvenci schopnou vazby k OFQ peptidu, tj. proteiny, ve kterých jedna nebo více aminokyselin přírodního LC132 receptoru nebo jeho fragmentů, byla nahrazena nebo vypuštěna bez ztráty vazebné aktivity. Takové deriváty mohou být produkovány známými meodami peptidové chemie nebo rekombinantní DNA technologií. Výraz LC132 receptorový protein také zahrnuje deriváty, které mohou být připraveny z funkčních skupin, vykytujících se jako postranní řetězce na zbytcích nebo N- nebo C-terminálních skupinách, prostředky známými v oboru. Tyto deriváty mohou zahrnovat alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin při reakci s amoniakem nebo s primárními nebo sekundárními aminy, N-acylderiváty volných aminoskupin aminokyselinových zbytků vytvořené s acylskupinami (např. alkanoylovými nebo karbocyk1 ickými aroylskupinami) nebo O-acylderiváty volných hydroxy1ových skupin (např. deriváty seryl- nebo threonyl zbytků) vytvořené s acylskupinami.

LC132 (opiodu podobný) orphan receptor byl v poslední době identifikován na bázi těsné homologie s předpovězenou aminokyselinovou sekvencí opiodních receptorů (Mollereau a spol., loc.cit.; Bunzow a spol. Loc.cit.; Lachowicz a spol., loc.cit.). Jestliže byly LC132 receptory exprimovány v hetero1ogních systémech, např. CHO buněčných liniích, etorphin a dyn q χ p h i n _ A s 1 a b ě =i nh i -bu j í c y k li c k o u A MP t v o r bu, “áTe j iné opiody jsou neaktivní. Heptadekapeptid OFQ byl identifikován jako potentní a účinný endogenní agonista LC132 receptoru (Meunier a spol., loc.cit., Reinscheid a spol. (1995), ···· ·· • · • · · · • · · • · • · · · · ·· ·· • · • ·· ··· · • · ·· ·· loc.cit). LC132 transkripty jsou exprimovány v několika oblastech centrálního nervového systému, o kterých je známo, že jsou zahrnuty do regulace bolesti, zahrnujících hypotha1amus, mozkový kmen a míšní dorsální roh (Julius, loc.cit.).

Exprese LC132 receptorového proteinu a jeho derivátů může být dosaženo běžnou rekombinantní DNA technologií. Takové techniky jsou vysvětleny v literatuře (viz např. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Moleculare Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989 a Ausubel a spol., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Association & Wiley Interscience, 1987). Dále mohou být DNA molekuly nebo jejich fragmenty, kódující úplně nebo částečně LC132 proteiny, získány technikou polymerasové řetězové rakce (PCE). Sekvence nukleové kyseliny, kódující LC132 receptor, mohou být exprimovány za použití mnoha různých kombinací hostite1/vektor . Vhodné expresní vektory mohou obsahovat segmenty chromosomálních, hechromosomálních a syntetických nukleokyselinových sekvencí. Příklady takových vektorů jsou virální vektory jako jsou různé známé deriváty SV40, bakteriální vektory jako jsou plasmidy z E.coli, fágové DNA, jako jsou lambda fágové deriváty, M13 a jiné filamentozní jednořetězcové DNA fágy jakož i vektory vhodné ve kvasinkách, jako jsou deriváty 2μ plasmidu, vektory použitelné v eukaryotických buňkách, výhodněji vektory použitelné v živočišných buňkách, jako jsou ty, které zahrnují SV40, od adenoviru a/nebo reírovi ru odvo z ené DNA s ekver.ce . - ’ ·

Hostitelská buňka použitá pro expresi LC132 receptor kódujících nukleokyse 1inových sekvencí může být vybrána ze • ·

• · ♦ · • · ·· • · · · · · • · · mnoha znáých hostitelů. Velké množství hostitelů je například dostupné z The American Type Culture Collection (ATCC). Preferovaní hostitelné pro LC132 expresi jsou savčí buňky jako jsou CHO buňky. Příprava LC132 receptor exprimujících buněčných linií je v oboru známá a je popsána například Reinscheidem a spol. (1995, loc.cit.).

Výraz LC132 receptoroví agonisté označuje sloučeniny schopné vazby k LC132 receptoru a tím modulace LC132 receptorové funkce, tj. inhibice forskolinem stimulované adenylyl cyklasové aktivity v buňce transformované vektorem schopným exprese LC132 receptoru. Příklady agonistů jsou vysoce afinitní ligandy, výhodně s IC50 hodnotami menšími než 1 μΜ, např. OFQ nebo jeho deriváty.

Výraz kontaktování LC132 receptoru s činidlem, u které se očekává, že bude mít LC132 receptor agonistickou aktivitu může zahrnovat následující rysy: LC132 receptorový protein, výhodně lidský LC132 receptorový protein, se naváže za vhodných pufrovacích podmínek k pevné fázi. Pevná fáze je obvykle poly(viny1chlorid), ale mohou to být jiné polymery jsko je celulóza, polyakrylamid, nylon, polystyren nebo polypropylen. Pevné nosiče mohou být ve formě trubiček, kuliček, disků nebo mikroploten nebo jakýchkoliv jiných povrchů vhodných pro provedení zkoušky a který při pasivní vazbě LC132 receptoru, vykazuje vysoce afinitní receptor vazebné místo. Po promytí může být činidlo, u kterého se o čekává , ž es e vá ž e k LC1 32 r ec eptoru a/nebo že má LC1 3 2 ~ receptor agonistickou aktivitu, přidáno ve vhodném pufrovacím roztoku.

i 1 • ···· ·· · ·· ·* ··· »··· · · · · • ··· · · · · · ·· • ··· · ♦ · · · · · · • ···· · · · ··« ··· *· βι· ·· ··

Preferovaný způsob přípravy LC132 receptorů je charakterizován transfekci savčí buněčné linie, např. CHO buněčné linie, s vektorem, obsahujícím nuk 1eokyse1 i novou sekvenci, kódující LC132 receptor s následující expresí receptorového proteinu. Čištěná membrána, obsahující receptorový protein může pak být navázána k pevnému povrchu jak je popsáno výše a inkubována s činidly, u kterých se . očekává, že budou LC132 receptor agonisty. Tyto metody jsou v oboru známé a jsou popsány např. Reinscheidem a spol., loc.cit. V takovém případě metoda podle vynálezu zahrnuje (a) poskytnutí buněčných membrán, obsahujících LC132 receptory, (b) kontaktování membrán se sloučeninou, u které se očekává, že je LC132 receptor agonistou a (c) stanovení, zda se sloučenina váže k LC132 receptorů a projevuje agonistickou specifickou aktivitu s následující screeningovou zkouškou psychiatrické a/nebo neurologické poruchy.

Detekce navázání činidla, u kterého se očekává, že je LC132 receptor agonistou, může být provedeno přímým značením činidla nebo značením kompetitivního činidla podobného OFQ. Činidlo nebo kompetitivní činidlo může být značeno například radioaktivním značením. Výhodné provedení je popsáno Reinscheidem a spol. (1995, loclcit.) a také v příkladu 1.

řř ; Farmakologická charakterizace LC132 receptor agonistické t aktivity m§že být stanovena rozsahem inhibice forskolinem • , ,s t i mul ováné cAMP akumulace v hos t i te1ských buňkách (např. CHO buňkách) transfektovaných vektorem schopným exprese LC132 receptorů. Koncentrace cAMP mohou být stanoveny jak popisuje Reinscheid a spol. (1995, loc.cit.) nebo jinými metodami • · · · • · · · • · · · • · · · · • · · • · · · známými v oboru. Zvláště preferované provedení předloženého vynález zahrnující stanovení LC132 receptor agonistické aktivity je popsáno v příkladu 1.

LC132 receptor agonisté mohou být dále charakterizováni screeningovou zkouškou psychiatrické a/nebo neurologické poruchy. Výraz screeningová zkouška psychiatrická a/nebo neurologická zahrnuje, ale není tak omezen, anxiolytické, antiepi1eptické a/nebo antikonvulzantní screeningové zkoušky. Tyto zkoušky jsou známy v oboru jak popsáno dále:

Testy úzkosti (Martin & Haefely, cit.loc.) Byl vyvinut velký počet zvířecích modelů za účelem předpovídání anxiolytické aktivity nových sloučenin u lidí. Mnoho z těchto vzorů hodnotí zvířecí chování v tak zvané konfliktní situaci, tj. behaviorální odezva je současně pod vlivem dvou opačných motivačních stavů jako jsou tendence přiblížení a vyhnutí se. Pravděpodobně nejlepší model je kondiciovaný trestající konfliktní model, ve kterém jsou zvířata trénována na dobrovolné vyvolání určité odpovědi (např. stlačení páky) za účelem dosažení odměny (např. potravy pro hladová zvířata). Jakmile zvířata vykazují konstantní úroveň odpovídajícího pákového tlaku, pak se zavedou krátké periody (obvykle signalizované viditelnými nebo akustickými signály) během nichž je stlačování páky současně odměněno potravou a trestáno marným elektrickým šokem do tlapky. Zvířata vykazují výrazně snížený poměr odpovědi během těchto konfliktních period, které . . j sou „ také charakt er i zovány různými z j evnými znaky - - emocionality. Charakteristický efekt benzodiazepin receptor agonistů, například anxiolytický diazepam, je disinhibice trestaného chování (vedoucí ke zvýšení v poměru odpovědí při potrestání) v dávkách, které spadají do přerušení netrestané odpovědi. Dále taková stejně aktivní léčiva produkují úzkosti podobný účinek za nepřítomnosti aktuálního trestání, tj. když je poměr stlačování páky redukován podmíněným strachem z potrestání. Konfliktní zatížení nevyžaduje kondicionované behaviorální odezvy: naivní žíznivá zvířata mohou být donucena k odporu k pití s tím, že pití je potrestáno kontaktem s elektrifikovaným hubicí. Takové trestem potlačované pití je d i s i nhibováno na dávce závisle benzodiazepin receptor agonisty (např. diazepam). Aktivita zkoumání může být podobně snížena případným trestem a uvolněna ošetřením se známými anxiolytiky. Konfliktní modely bez trestání jsou založeny na přítomnosti přirozeně opačných motivačních stavů, na jedné straně sklonem ke zkoumání a na druhé straně strachem z nového prostředí (např. pokud v komoře světlo-tma, zvýšené plus bludiště, spotřena neběžné potravy nebo normální potravy v neběžném prostředí, sociální interakce mezi zvířaty vzájemně neznámými). I když je běžné přičítat behaviorální disinhibiční účinek benzodiazepin receptorového agonismu v těchto experimentálních situacích anxiolyticky-podobnému působení, jejich účinek může být také interpretován jako obecné snížení vlivu škodlivých faktorů nebo i zhoršené schopnosti odmítat vrozené nebo kondicionované odpovědi. Ant ifrustrační efekt vznikající z benzodiazepin receptor agonismu je naznačen zvýšením odpovědi, která je udržována odpověcf-nahodi 1 ou odměnou v situaci, ve které je odměna redukována nebo vypuštěna. Elektrická stimulace periaqueduktální šedé plochy ve s t ředn í m mozku chron i c k y i mp1an t o váným i=e’l⁼ek ťr odam i do zvířat vyvolává nechuť a mnoho emocionálních reakcí; benzodiazepin receptor agonisté zvyšují práh nechuti. Stavy akutní úzkosti charakterizované behaviorálními a • · · · • · • · • · · • · · ♦ · · ·

• · • · • · · · fyziologickými symptomy (kardiovaskulární, endokrinní) mohou být vyvolány chemikáliemi známými jako anxiogenní u lidí, např. konvulzanty jako je pentyltetrazol, inverzními agonisty při benzodiazepin receptor agonistech, podávanými v subkonvulz ivních dávkách nebo i přerušením návyku na lék po chronickém léčení vysokými dávkami sedativ. Ultrazvukem vyvolané úzkostné projevy u krysích mláďat oddělených od jejich matek jsou sníženy benzodiazepin receptor agonisty. Farmako1ogická specifičnost benzodiazepin receptor agonistů ve výše uvedených modelech je impresivní, zatímco antidepresanty, analgetika a anti psychotiky jsou všechna relativně neúčinná.

Testy antiepi1epsie/antikonvulzant (Martin & Haefely, oc.c i t.).

Benzodiazepin receptor agonisté patří k nejpotentnějším léčivům známým pro použití při prevenci nebo odstranění záchvatů u zvířat vyvolaných aktuálně systémově podávanými chemikáliemi (např. pentylentetrazolem, bicucul1inem, picrotoxinem, inhibitory GABA biosyntézy, penicilinem, lokálními anestetiky, inhibitory acety1cho1inesterasy), aplikovanými na kortikální povrch nebo do ventrikulárního systému (srdeční glykosidy, glukamát receptor stimulant NDA) , nebo aplikovanými chronicky do kortexu (fokální aluminium nebo kobalt epilepsie). Tyto jsou také účinné při ochraně proti hyperbarickým záchatům a záchvatům vzniklým po chronické střídavé elektrické stimulaci v limbickém systému začínajících při podprahové intenzitě (netypické záchvaty).

Elektrokonvulz i vním záchvatům je také bráněno větš inou (ale ne všemi) benzodiazepin receptor agonisty, i když v dávkách výrazně vyšších než jsou ty, které byly nalezeny pro blokování chemicky vyvolaných záchvatů. Různé genetické modely epilepsie • · · · • · · · • · · · • · · · · · • · · * · · · · (fenotypu malých epileptických záchvatů u krys, záchvatů vyvolaných akustickou stimulací v geneticky náchylných myších kmenech nebo myoklonických záchvatů vyvolaných fotickou stimulací u geneticky náchylných paviánů) odpovídají na benzodiazepin receptor agonisty. Tak jsou benzodiazepin receptor agonisté účinní u všech současných zvířecích epileptických modelů, které předpovídají účinnost ve většině forem lidské epilepsie nebo konvulz ivních stavů. V souladu s jejich širokou antikonvu1zantní aktivitou benzodiazepin receptor agonisté chrání nebo potlačují epilepsii podobnou elektrickou aktivitu indukovanou různými postupy (konvulzanty, iontové kopozice) v mozkových řezech udržovaných in vitro, zejména v hippokampálních řezech. Tyto také mohou redukovat neuronální následné výboje indukované v různých mozkových oblastech při elektrické stimulaci. Benzodiazepin receptoroví agonisté bylí zjištěni jako redukující epilepsii podobné aktivity v ohnisku jakož i inhibující obecně.

OFQ a LC132 receptor agonista uvedený výše, byl injektován intracerebroventrikulárně do myši a zvířata byla hodnocena v testu použitém pro detegování anxiolytických efektů (konfliktní test, test tina-světlo; příklad 2 a 3). Bylo demonstrováno v obou testových modelech, že OFQ vykazuje anxiolytické účinky. Dále byl intracerebroventrikulárně injektovaný OFQ demonstrován jako aktivní v myším modelu epilepsie (audiogenní záchvatový model; příklad 4), což předpovídá obecně antikonvulzní účinky, jakož

.... i ant i ep i 1 ep t i ck č půs oben í u pac i en tu . Žádný z t ě ch to ^-potenciálních účinků OFQ není popsán v literatuře.

Preferované testy jsou popsány v příkladech 1, 2, 3 a 4 ♦>

• · ·· • · · • · · 9 9 9 «

dále.

Stanovení LC132 receptor agonistické aktivity a inhibice forskolinem stimulované cAMP akumulace v CHO buňkách transfektováných s LC132 ve srovnání s netransfektovanými CHO buňkami. OFQ inhibuje forskolinem stimulovanou cAMP akumulaci v CHO buňkách transfektováných s LC132 receptorem s mediánem účinné koncentrace (ECso) 1,05 + 0,21 nM a maximálním účinkem přibližně 80% inhibice při 100 nM. Nebyl zde žádný účinek na netransfektované buňky. Pro stanovení vazebných kinetik OFQ. k jehi receptorů byl vyvinut radioligand [^{1 25}I]Tyr¹⁴-orphanin a byl charakterizován (Reinscheid a spol., J.Biol.Chem. 271: 14163-14168, 1996). [¹²⁵I]Tyr¹⁴-orphanin se váže k membránám připraveným z CHO buněk exprimujících LC132 receptor nasytitelným a vytěsnitelným způsobem s Kd 56,2 + 7,3 pM a Bmax asi 200 fmol/mg proteinu. OFQ inhibuje vazbu [¹²⁵I]Tyr¹⁴-orphaninu k LC132 receptorů s inhibiční konstantou (Ki) 0,19 + 0,02 nM (Reinscheid a spol. (1996) loc.cit.).

Konfliktní test anxio 1ytického účinku (příklad 2) ukazuje, že OFQ (průměr + sem = 24,6 + 3,6) produkuje nevýznamné snížení netrestané odezvy ve srovnání s injekcí vehikula (průměr + se = 36.3 + 7,4), což indikuje minimální motorické zhoršení. Naopak OFQ (průměr + sem = 16,2 + 6,0) významně (P < 0,05 zvyšuje trestanou odezvu ve srovnání s injekcí vehikula (průměr + sem = 4,3 + 1,6) což indikuje anxiolytický účinek. Tento průběh výsledků je podobný tomu, který byl produk o ván značenou an-x i o 1 y t i ckouslouč en inou d i a zepameni ' podávaným orálně těmto stejným dvěma skupinám myší, což indikuje potenciál OFQ jako anxiolytického léčiva u pacientů.

• · • · · ··· · · ·· ··

Zkouška v světlo-tma v komoře na anxiolytický účinek (příklad 3) ukazuje, že OFQ významně (P < 0,05) zvyšuje dobu trávenou v osvětleném boxu v dávkách 0,3 nmol/myš (průměr + sem = 54 + 14 s) a 1 nmol/myš (průměr + sem =58+19 s) ve srovnání s injekcí vehikula (průměr + sem = 11 + 5 s).

Významně také snižuje (P < 0,05) počet pokusů o přechod v dávkách 0,3 nmol/myš (průměr + sem = 1,2 ± 0,6), 1 nmol/myš (průměr + sem = 0,7 + 0,2) a 3 nmol/myš (průměr + sem = 0,4 + 0,3) ve srovnání s injekcí vehikula (průměr + sem = 3,0 +

0,5). Tento průběh výsledků je indikativní pro anxiolytickou aktivitu OFQ.

Audiogenní záchvatový model (příklad 4) ukazuje, že OFQ vykazuje ochranný účinek proti akusticky vyvolaným tonickým záchvatům u geneticky ke zvuku citlivým myší v EDso dávce 0,7 nmol/myš. Tento výsledek předpokládá terapeutickou hodnotu OFQ v epilepsiii a ve snížení konvulzí.

V souladu s tím se předložený vynález také týká sloučenin připravitelných výše popsaným způsobem, např. OFQ a jeho derivátů a farmaceutických kompozic, obsahujících jednu nebo více z těchto sloučenin a terapeuticky inertní nosičový materiál. Dále se vynález týká použití těchto sloučenin při výrobě kompozice pro léčení psychiatrických a/nebo neurologických poruch a způsobů léčení psychiatrických a/nebo neurologických poruch, zahrnujících podání terapeuticky účinného množství OFQ nebo jeho derivátu. Příklady psychiatrických ,a/ne-bo- neur-oiog řckých“ poruch“Tsbu^řpTTepšTeT“ úzkost nebo konvulze.

Výraz OFQ a jeho deriváty se týká peptidu

F-G-G-F-T-G-A-R-K-S-A-R-K-L-A-N-Q, jeho fragmentů a/nebo nepřirozeně se vyskytujících peptidů nebo mutantů. Tento typ derivátů jsou peptidy, ve kterých jedna nebo více aminokyselin přírodního OFQ peptidu nebo jeho fragmentu byla nahrazena nebo vypuštěna bez ztráty agonistické aktivity. Takové deriváty mohou být produkovány známými metodami peptidové chemie.

Výraz OFQ a jeho deriváty také zahrnuje deriváty, které mohou být připraveny z funkčních skupin, vyskytujících se jako postranní řetězce na zbytku nebo N- nebo C-terminálních skupin, prostředky známými v oboru a jsou zahrnuty do vynálezu pokud zůstávají farmaceuticky přijatelné, tj. nenarušují agonistickou aktivitu peptidů a neudělují kompozicím, které je obsahují, toxické vlastnosti. Tyto deriváty mohou zahrnovat, například, polyethylenglykolové postranní řetězce, které mohou maskovat antigenní místa a/nebo rozšiřovat přítomnost OFQ peptidových derivátů v tělních kapalinách. Jiné deriváty zahrnují alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxy1ových skupin při reakci s amoniakem nebo s primárními nebo sekundárními aminy, N-acylderiváty volných ainoskupin aminokyselinových zbytků vytvořené s acylskupinami (např. alkanoyl nebo karbocyk1 ické aroylskupiny) nebo O-acyl deriváty volných hydroxylových skupin (např. skupin seryl- nebo threonylzbytků) vytvořené s acylskupinami.

Výraz OFQ a jeho deriváty také zahrnuje rozpustné formy výše uvedených derivátů. Rozpustné formy mohou být připraveny met ódami známými v oboru , např. chemi ckou synt ézou. ”

Dávkové rozmezí pro podání OFQ a jeho derivátů může být stanoveno odborníkem v oboru bez experimentování. Obecně jsou • · · · • · · • · · • · · · · • · · • · · · vhodné dávky ty, které jsou dostačující pro dosažení požadovaného účinku. Dávka by neměla být tak velká, aby vyvolávala nežádoucí vedlejší účinky jako jsou neočekávané křížové reakce, anafylaktické reakce a podobně. Obecně se dávka bude měnit s věkem, stavem, pohlavím a rozsahem choroby pacienta, protiindikacím, pokud se vyskytují, imunní tolerancí a jinými takovými proměnnými, podle úpravy jednotlivým lékařem. Předpokládané dávkové rozmezí je asi 0,1 ng/kg/den až asi 0,1 mg/kg/den. OFQ peptid a jeho deriváty mohou být podávány parenterálně injekcí nebo s časem se zvyšující perfuzí. Mohou být podávány intravenozně, intraperitoneálně, intramuskulárně nebo subkutánně.

Přípravky pro parenterální podání zahrnují sterilní nebo vodné nebo nevodné roztoky, suspenze a emulze. Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje jako olivový olej a injektovatelné organické estery jako je ethyloleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, alkoho1 ické/vodné roztoky, emulze nebo suspenze, obsahující salinická a pufrovaná media. Parenterální vehikula zahrnují roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrozu, dextrozu a chlorid sodný, laktátovaný Ringerův roztok nebo pevné oleje. Intravenozní vehikula obsahují kapalné a živné doplňky, elektrolytové doplňky jako jsou ty, které jsou na bázi Ringerovy dextrozy a podobně. Chránící látky a jiná aditiva mohou být také přítomna, jako, například, antimikrobiální látky, antioxidanty, chelatační činidla, inertní plyny a podobně ^obecriš^^Eeming-ton ' s₌. Pharnia ceu t i c.a.l_r=Scd_en ce18. , vyd. Mack Eds., 1990.

Předložený vynález se také týká sloučenin připravite1ných ·· ·· výše popsaným způsobem a farmaceutických kompozic, obsahujících jednu nebo více těchto sloučenin a terapeuticky inertní nosičový materiál.

Dále vynález zahrnuje použití L132 receptoru pro screening sloučenin vhodných pro léčení psychiatrických a/nebo neurologických poruch, zejména pro léčení úzkosti, epilepsie a křečí jak je popsáno výše.

Následující příklady jsou míněny jako ilustrující podrobnosti vynálezu, aniž by jej jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Stanovení L132 agonistické aktivity a inhibice foskolinem stimulované cAMP akumulace

Pro stanovení koncentrací cAMP, byly L132 receptorem transformované CHO buňky nebo CHO dhfr^- (přirozený typ) buňky umístěna na 24-jamkové plotny a rostly do konfluence. Po odstranění kultivačního media byly přidány testované sloučeniny nebo peptidy rozpuštěné v celkovém objemu 0,2 ml Dulbeccova modifikovaného Eagle media, obsahujícího 10 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM forskolinu a 1 mM Ro 20-1724 (získatelný od RBI) a buňky byly inkubovány 10 minut při 37 °C. Reakce byly ukončeny přídavkem 0,5 ml ledově studeného ethanolu a plotny byly zmrazený na -80 °C na 12 hodin. Po odstředění ploten bvlv části super na taxi tu odstraněny a sušeny pro stanovení cAMP. cAMP zkoušky (Biotrak SPA, Amersham) byly provedeny podle instrukcí výrobce. Ligandové vazebné zkoušky byly provedeny v 96-jamkových mikrojamkových plotnách se ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · · ·· ·· hlubokým dnem. CHO buňky stabilně exprimující L132 receptor byly sklizeny a resuspendovány v 10 objemech vazebného pufru, obsahujícího 50 mM Tris-HCI (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1 % BSA a 0,1 mg/ml každého z aprotininu, leupeptinu a pepstatinu. Membrány byly připraveny použitím tkáňového homogenizéru (nastavení 4 po 30 s; PT20, Kinematica, Lucern, Švýcarsko). Celkový membránový partikulát byl získán po odstředění při 45000 x g po 10 min při 4 °C. Výsledná peleta byla resuspendována a odstředěna dvakrát jak popsáno výše. Membrány byly nakonec zředěna ve vhodném objemu vazebného pufru a uchovávány při -70 °C. Proteinová koncentrace byla stanovena za použití BCA Protein Assay Kit-u (Pierce).

Inkubace membrán (10 až 18 pg proteinu) s [i 25 i]Tyr¹⁴-orphaninem byla provedena při teplotě místnosti po 1 hodinu v celkovém objemu 200 μΐ vazebného pufru. Pro kompetitivní vazebné pokusy bylo 50000 cpm [¹²⁵I]Tyr¹⁴-orphaninu (62,5 pM) přidáno společně s uvedenými koncentracemi neznačených peptidů. Nespecifická vazba byla stanovena za přítomnosti 50 nM OFQ. Vázané a volné ligandy byly odděleny rychlou vakuovou filtrací přes Whatman GF/C filtry za použití Brandel multikanálkového zařízení pro sklizeň. GF/C filtry byly předem ošetřeny s 0,3 % polyethy1eniminu, obsahujícího 0,1 % BSA po 1 hodinu při teplotě místnosti. Filtry byly promyty šestkrát 1 ml ledově studené Tris-HCI, pH 7,5 a pak spočteny v gamma čítači.

Příklad 2: Konfliktní test na anxiolytický účinek

Byly použity samice albínských myší (Ibm: MOKO (SPF); Biological Research Labs, Fullinsdorf, Švýcarsko). Na počátku tohoto pokusu byly tyto myši alespoň 2 až 3 měsíců staré a ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · « ·· ·· ···· byly předem dobře trénovány v konfliktním úkolu. Myši byly jednotlivě umístěny v plastových klecích typu Macrolon^R (asi 13 x 23 x 13 srn) s pilinami pokrytou podlahou. Teplota místnosti a vlhkost byly regulovány v ubikacích zvířat za přirozeného cyklu tma-světlo. Vodovodní voda byla dostupná dle libosti, zatímco přístup ke standardní laboratorní potravě byl <5(ezen. Myši byly udržovány na přibližně 80 až 85 % jejich tělesné hmotnosti za volného krmení. Tréningové a testovací postupy byly provedeny podle Martina a spol.

(Pharmaco1.Biochem.Behav. 46:905-910, 1993): Myši se sníženou potravou byly dobře trénovány v úloze, kdy během počátečních každých 5 minut byla stlačována páka (netrestaná odpověd) a potrava byla automaticky doručena jako odměna a pak během následujících 15 minut každé stlačení páky produkovalo (trestaná odpověd) odměnu potravou, ale současně byl poskytnut mírný šok do tlapek. V souladu s publikovanou literaturou orální podání 10 mg/kg diazepamu 30 minut před testem vede k určitému snížení netrestané odezvy, odpovídajícímu ale zvýšenému trestanému stlačování páky u těchto myší. Byly vytvořena dvě skupiny (N = 9). Objem intracerebroventrikulární injekce byl 2 μΐ. Vehikulum bylo umělá mozkomíšní kapalina.

OFQ (Research Gentics, Inc., Huntsville, Alabama) byl poskytnut v dávce 3 nmol/myš. Jak netrestaná (tj. počáteční 5-min.per ioda konfliktního testu) a trestaná (tj. následná 15-min.perioda konfliktního testu, ve které stlačení páky vede k potravě a současně šoku) část konfliktního testu byly hodnoceny, technik, provádějící behaviorální hodnocení nebyl informován o podmínkách testu pro jednotlivá, zvířata. .

Statistická analýza byla provedena porovnáním dvou skupin za použití Mann-Whitney U testu s p-hodnotou menší než 0,05 přijímanou jako statisticky významná.

···· ·· • · ·· · • · · ·

4» ··· ··· ·· • · ··· · • · • ·

Příklad 3: Hodnocení anxi o 1ytického účinku v boxu světlo-tma

Byly použity samci albínských myší /Ibm: MORO (SPF); Biological Research Labs, 4414, Fu11 ingsdorf, Švýcarsko). Myši byly umístěny do skupinových klecí s pilinami na podlaze v laboratorních ubikacích po několik dnů před testováním, teplota místnosti a vlhkost byly regulovány a zvířecí ubikace byly udržovány ve vratném cyklu světlo-tma. Vodovodní voda a standardní laboratorní potrava byly dostupné dle libosti. U naivní myši byla stanovena aktivita zkoumání. Zařízení je složeno z jednoho neprůhledného a jednoho průhledného PlexiglasR boxu stejné velikosti (20 x 20 x 14 cm) spojených neprůhledným plastovým tunelem (5 x 7 x 10 cm). Průhledný box byl osvětlen (4400 luxů ve středu tohoto boxu). Pět minut po intracerebroventrikulární injekci byly myši umístěny do tunelu tváří ke tmavému boxu. Časové zdržení v osvětleném boxu, počet pokusů o přechod (pouze hlava a přední tlapky vstupují do osvětleného boxu) a počet úplných přechodů z neprůhledného boxu do průhledného boxu byly zaznamenány pro 5minutové období. Myš byla hodnocena jako měnící prostor když všechny čtyři tlapky byly umístěny v dalším prostoru. Dno bylo po každém testu pečlivě vyčištěno. Každá ošetřená skupina byla složena z 10 až 20 myší. Objem intracerebrovaskulární injekce byl 2 μΐ. OFQ (Research Genetics, lne., Huntsville, Alabama) byl poskytnut v dávkách 3, 1, 0,3 a 0,1 nmol/myš. Umělá mozkomíšní kapalina byla použita jako vehikulum. Technik provádějící behaviorální hodnocení nebyl informován o podmínkách ošetření pro jednotlivá zvířata. Rozdíly mezi ošetřenými skupinami byly hodnoceny pomocí Studentova t-testu a p-hodnotou <0,05 uznávanou jako statisticky významnou.

• ···· ·· ·· · · · · • · · · · · • · · · · • · · · ··· ··· ·· · ·< ·· • · · · • · ·· ·· · · · • · · ·· ··

Příklad 4: Audiogenní záchvatový model antiepileptických/antikonvulzních účinků

Byly použity mladé myši [DBA/2J(SPF); Biological Research Labs, 4414 Fúl1ingsdorf, Švýcarsko]. Před testem byly myši umístěny do skupinových klecí s pilinami na podlaze v laboratorních ubikacích. Teplota místnosti a vlhkost byly regulovány a zvířecí ubikace byly udržována na přirozeném cyklu světlo-tma. Vodovodní voda a standardní laboratorní potrava byly dostupné dle libosti. Ochrana před audiogenními šoky byla hodnocena u naivní 3 týdny staré DBA/2J myši (o nich je známo, že jsou geneticky šokově náchylné). Další podrobnosti pokusu byly již popsány (Martin a spol., Psychopharmacology 111: 415-422, 1993). Krátce, bezprostředně po intracerebroventrikulární injekci, byla každá myš umístěna do separátního otevřeného průhledného Plexiglas^R boxu (21 x 44 x 21 cm), obsahujícího piliny na podlaze. Testování bylo provedeno ve zvukově izolované komoře a zahrnuje vystavení 14 kHz sinusoi dál nímu tonu při 110 dB (nula dB byla definována jako tlaková hladina 20 pPa) na 1 minutu během níž byla prováděna pozorování. Sluchová stimulace byla provedena 5 minut po ošetření. Byly použity skupiny 8 myší pro hodnocení každé dávky a podmínek vehikula. Objem intracerebroventrikulární injekce byl 2 pl. OFQ (Research Genetics, lne., Huntsville, Alabama) byl podán v dávkách 10,

3, 1, 0,1 a 0,01 nmol/myš. Jako vehikulum byla použita umělá mozkomíšní kapalina. Technik, provádějící behaviorální hodnocení, nebyl informován o podmínkách ošetření pro jednotlivá zvířata. Byl zaznamenán podíl skupiny, vykazující tonické křeče. ED50 hodnota byla vypočtena probit analýzou.

Claims (12)

1. (PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob screeningu terapeuticky vhodné sloučeniny, vyznačující se tím, že zahrnuje testování LC132 receptor agonisty ve screeningové zkoušce na psychiatrické a/nebo neurologické poruchy.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že stanovení LC132 receptor agonistické aktivity dané sloučeniny zahrnuje kontaktování LC132 receptoru s Činidlem, o kterém se předpokládá, že je agonistou LC132 receptorové funkce, s následující detekcí vazby k receptoru a/nebo agonistické aktivity dané sloučeniny.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) poskytnutí buněčných membrán, obsahujících LC132 receptory;

   (b) kontaktování membrán se sloučeninou, o které se předpokládá, že je agonistou LC132 receptoru a (c) stanovení, zda se sloučenina váže k LC132 receptoru a vykazuje agonistickou specifickou aktivitu.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se agonistická specifická aktivita stanoví detekcí inhibice forskolinem stimulované cAMP akumulace.

   ς ·«·· ·* • · · · • · · · · ·· · • · ♦ · · • » · · • · « · ·
5. 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že agonista je ligand s vysokou vazebnou afinitou k LC132 receptorů.

   6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj íc í se tím IC50 hodnotou že LC132 receptor agonista je charakterizován menší než 1 μΜ. 7. Způsob podle nároku 1-6, v y z n a č u j í c í se

   t í m, že screeningová zkouška pro psychiatrickou a/nebo neurologickou screeningovou zkoušku je antiepi1eptická, antikonvulzantní nebo anxiolytická screeningová zkouška.
6. 8. Způsob podle nároku 6,vyznačující se tím, že uvedená screeningová zkouška psychiatrické a/nebo neurologické screeningové poruchy je konfliktní test, zkouška v boxu světlo-tma nebo audiogenní záchvatový model.
7. 9. Použití metody podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro screening sloučenin vhodných pro léčení psychiatrických a/nebo neurologických poruch.
8. 10. Použití orphaninu FQ a jeho derivátů pro výrobu léčiva pro léčení psychiatrických a/nebo neurologických poruch.
9. 11. Použití podle nároku 10, kde chorobami jsóu epilepsie, úzkost a křeče.
10. 12. Orphanin FQ a jeho deriváty pro léčení psychiatrických a/nebo neurologických poruch.

    ···· • · · v · · * • · ·· • · · · · · • · · ·· ··
11. 13. Použití LC132 receptorového proteinu pro screening sloučeniny vhodné pro léčení psychiatrických a/nebo neurologických poruch.
12. 14. Farmaceutická kompozice, vyznačující se t í m, že obsahuje sloučeninu jak je definována v nároku 10 v kombinaci s terapeuticky přijatelným nosičem.