CZ11393A3 - GASTRIN AND CCK-B RECEPTORS ENCODING cDNA - Google Patents

GASTRIN AND CCK-B RECEPTORS ENCODING cDNA Download PDF

Info

Publication number
CZ11393A3
CZ11393A3 CZ93113A CZ11393A CZ11393A3 CZ 11393 A3 CZ11393 A3 CZ 11393A3 CZ 93113 A CZ93113 A CZ 93113A CZ 11393 A CZ11393 A CZ 11393A CZ 11393 A3 CZ11393 A3 CZ 11393A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cells
cck
polypeptide
gastrin
receptor
Prior art date
Application number
CZ93113A
Other languages
English (en)
Inventor
Alan S Kopin
Original Assignee
New England Medical Center Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/978,892 external-priority patent/US5541071A/en
Application filed by New England Medical Center Inc filed Critical New England Medical Center Inc
Publication of CZ11393A3 publication Critical patent/CZ11393A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/26—Psychostimulants, e.g. nicotine, cocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Tento vynález byl uskutečněn s vládni podporou poskytnutou pod č. DK01934, č. P30DK39428 a č. DK32878 Národními ústavy zdraví. Vláda má zakotvena určitá práva v touto vynálezu.
Vynález se týká rodiny receptorů gastrinu/cholecystokininu (CCK-B) .
Dosavadní stav techniky
Gastrin je peptidový hormon o 17ti aminokyselinách produkovaný žaludečními antrálními G buňkami. Hlavním fyziologickým účinkem tohoto hormonu je stimulace parietálních buněk žaludku tak, aby vylučovaly kyselinu chlorovodíkovou. Gastrin je rovněž trofickým hormonem, který moduluje růst a diferenciaci žaludeční sliznice, právě tak jako sliznice tenkého a tlustého střeva, během normálního vývoje (Johnson, L. R., 1987, Physiology of the Gastrointestinal Tract. Raven
Press, NY) a za některých pathologických stavů (např. Zol1inger-El1isonův syndrom, karcinom žaludku, zhoubná anemie). Fyziologické účinky tohoto peptidu jsou spouštěny navázáním gastrinu na jeho plasmalemový receptor, který byl pokusně identifikován afinitnim značením jako bílkovina o zdánlivé molekulové hmotnosti 74 000 daltonů (Baldvin, G. S. a ost., 1986, J Biol Chem 261 12252-7. Matsumoto, M. a ost., 1987,
J Am Physiol 252=G143-G147). Agonistická stimulace receptorů gastrinu na parietálních buňkách má za následek hydrolýzu fosfatidylinositolu a vzestup koncentrace intracelulárního vápníku (Muallem, S. a Sachs, G., 1984, Biochim Biophys Acta
805:181-185, Chev, C. S. a Broun, M. R. , 1986, Biochim Biophys Acta 888:116-25) zprostředkovaný bílkovinami vážícími guaninnukleotid (G-proteiny) (Roche, S. a ost., 1990, Biochim
Biophys Acta 1055^287-94). Gastrin, cho1ecystokinin a peptidy příbuzné CCK tvoří rodinu hormonů, která je charakterizována stejnou strukturou C-koncového pentapeptidamidu, což je doména kritického významu pro vazbu na receptor.
Odpovídající cílové receptory pro tuto rodinu hormonů lze řadit do dvou hlavních tříd, a to receptory typu CCK-A a receptory typu CCK-B podle spektra jejich agonistické anebo antagonistické spécifi ty (Miller, L. J. , 1991, v CCK Antagonists in Gastroenterology. Springer-Verlag, Berlin, str. 27-34). Periferní anebo “zažívací receptor (CCK-A), který je v pankreatu, žlučníku a některých mozkových jádrech, má 1 OOOkrát vyšší afinitu pro sulfátovaný CCK-8 než pro gastrin. Receptory CCK-B/gastrinu jsou v mozku (CCK-B“), na buňkách hladkého svalstva a na parietálních buňkách (gastrinové receptory) . Vazebné studie s mozkovými membránami a s parietálnlmi buňkami v nichž byly srovnávány relativní afinity pro agonisty vykazuji 6-10násobně, resp. l-2násobně vySSi afinitu pro CCK než pro gastrin (Jensen, R. T., a ost., v Gastro 1 ntest i na 1_Endocr inol ogy_^Receptors_and
Post-Receptor Wechanisms, Hartcourt Brace Jovanovich, San Diego, str. 95). Centrální místa CCK (CCK-B) vykazuji vysokou aktivitů pro sulfátovaný oktapeptidový fragment (CCK-8s), děsu 1 fát ováný oktapeptid (CCK-8d), gastrin, CCK-4 (C-koncový tetrapeptid CCK) a pentagastrin (CCK-5) a podobají se receptorům gastrinu svoji agonistickou selektivitou. Receptory CCK-B mohou hrát roli v úzkostných stavech, v modulaci bolesti, paměti, pocitu sytosti a v panikových poruchách. CCK je nejčastěj$í neuropeptid a CCK-B je nejčastější podtyp receptoru vyskytující se v mozku (CCK-B >>>CCK-A) .
Podstata vynálezu
Postatou vynálezu obecně je přečištěná nukleová kyselina kódující jeden z rodiny savčích receptorů gastrinu/ cholecystokininu (CCK-B) nebo jeho fragment anebo analog. Pod
pojmem rodina savčích receptorů gastrinu/cholecystokininu -B“ jsou míněny polypeptidy savčího původu, které obecně vykazuji 60%ní, lépe 80%ní, ještě lépe 9O£ní a nejlépe 95%ní či dokonce 992íní sekvenční homologii s přírodním savčím receptorem gastrinu/CCK-B (jak znázorněno v obr. 1; sekvenční identifikační číslo (SEKV IDČ:2). S výhodou nukleová kyselina kóduje receptor gastrinu, nukleová kyselina kóduje receptor CCK-B, člen rodiny receptoru gastrinu/CCK-B je na povrchu parietálních buněk, mozkových buněk, imunologických buněk, enterochromovým buňkám podobných buněk (ECL), nádorových buněk, např. buněk rakoviny tlustého střeva, malých buněk karcinomu plic nebo leiomyomu, nebo buněk hladkého svalstva, nejlépe jsou-li tyto buňky z psích tkání anebo ještě lépe, jsou-li to 1 i dské buňky.
Vynález se týká i homogenní populace buněk v niž každá z buněk obsahuje nakloňovanou nukleovou kyselinu kódující jeden ze členů rodiny receptorů gastrinu/CCK-B. Bakteriální buňky transfektované přečištěnou nukleovou kyselinou kódující receptor gastrinu (klon GR-1) jsou uloženy v ATCC a označeny č. 75195. Dva klony bakteriálních buněk transfektováných přečištěnou nukleovou kyselinou kódující část (HBR-1) nebo celý (hCCKB: FBCR-4) receptor CCK-B jsou uloženy v ATCC a označeny č. 75196, resp. 75303. Buňky podle tohoto vynálezu obsahující nukleovou kyselinu mohou nejlépe exprimovat biologicky aktivní polypeptid z rodiny receptorů gastrinu/CCK-B. Buňky mohou být i eukaryotické buňky, např. COS-7 nebo buňky vaječníku čínského křečka (CHO).
Součástí vynálezu podle této přihlášky je navíc vpodstatě čistý polypeptid, receptor gastrinu, produkovaný nukleovou kyselinou kódující jeden ze členů rodiny receptorů gastrinu/CCK-B nebo jeho fragment či analog. V preferovaných příkladech je receptor gastrinu polypeptid obsahující sled aminokyselin vpodstatě identický s aminokyselinami 1 až 453 ve sledu SEKV ID Č:l=
MELLKLNRSAQGSGAGPGASLCRAGGALLNSSGAGNLSCEPPRLRGAGTRELELAIRVTL
120
YAVIFLMS VGGřTVL XIWLGLSRRLRTVTNAFLLSLAVSDLLLAVACMPFTLLPNLMGTF
121
180
IFGTWCKAVSYLMGVSVSVSTLSLVAIALERYSAICRPLQARVWQTRSHAARVIIATWM
181
240
LSGLLMVPYPVYTAVQPAGGARALQCVHRWPSARVROTWSVLLLLLLFFVPGWMAVAYG
241
300
LISRELYLGLRFDEDSDSESRVRSQGGLRGGAGPGPAPPNGSCRPEGGLAGEDGDGCYVQ
301
360
LPRSRQTLELSALTAPTPGPGGGPRPYQAKLLAKKRWRMLLVIWLFFLCWLPLYSANT
361
420
WRAFDS SGAHRALSGAPISFIHLLSYASACVNPLVYCFMHRRFRQACLETCARCCPRPPR
421 453
ARPRPLPDEDPPTPSIASLSRLSYTTISTLGPG.
V jiných preferovaných příkladech je zdánlivá molekulová hmotnost glykosylováného polypeptidu zhruba 76 000 daltonů, polypeptid je glykosylovaný nebo neglykosylováný a polypept Id je exprimován lidskými buňkami, např. lidskými parietálními buňkami, mozkovými buňkami, buňkami hladkého svalstva, imunologickými buňkami, ECL buňkami δi nádorovými buňkami .
Tento vynález rovněž zahrnuje obecně vpodstatě δistý polypeptidový receptor CCK-B produkovaný nukleovou kyselinou kódující jeden ze ólenů rodiny savólch receptorů gastrinu/CCK-B nebo jeho fragment δi analog. Polypeptidový receptor CCK-B může obsahovat sled aminokyselin vpodstatě identický s aminokyselinami 1 až 447 ve sledu uvedeném pod SEKV ID Č·· 4:
60 MELLKLNRSVQGTGPGPGASLCRPGAPLLNSSSVGNLSCEPPRIRGAGTRELELAIRITL
120
YAVIFLMSVGGNMLIIWLGLSRRLRTVTNAFLLSLAVSDLLLAVACMPFTLLPNLMGTF
121 180 IFGTVICKAVSYLMGVSVSVSTLSLVAIALERYSAICRPLQARVWQTRSHAARVIVATWL
181 240
LSGLLMVPYPVYTWQPVGPRVLQCVHRWPSARVRQTWSVLLLLLLFFIPGWMAVAYGL
241 300
XSRELYLGLRFDGDSDSDSQSRVRNQGGLPGAVHQNGRCRPETGAVGEDSDGCYVQLPRS
- 301 360 rpaleltaltapgpgsgsrptqakllakkrwrmllviwlfflcwlpvysantwrafdg
361 420
PGAHRALSGAPISFIHLLSYASACVNPLVYCFMHRRFRQACLETCARCCPRPPRARPRAL
421 447
PDEDPPTPSIASLSRLSYTTISTLGPG.
Polypeptid CCK-B nůže být glykosyl ováný nebo neglykosylováný a exprimovaný lidskými buňkami, např. lidskými parietálnimi buňkami, lidskými mozkovými buňkami nebo lidskými buňkami hladkého svalstva.
V jiném ohledu provedení podle tohoto vynálezu obsahuje expresivní knihovnu cDNA parietálnich buněk. Segmenty cDNA této knihovny jsou nejlépe odvozeny od psích parietálních buněk, lidských parietálních buněk nebo hlavních lidských buněk. Expresivní vektor používaný v této knihovně cDNA může obsahovat jednu anebo více z těchto látek: počátek replikace SV40 nebo cytomegalovirový (CMV) promotor. Ještě lépe je konstruovat knihovnu cDNA s expresivním vektorem obsahujícím pcDNA-1 nebo Agtll.
Provedením podle tohoto vynálezu je i metoda na izolaci nukleových kyselin kódujících polypeptidy přítomné v parietálnlch buňkách, vyznačující se vyhodnocováním expresivní knihovny cDNA s cílem nalézt izolovanou nukleovou kyselinu kódující receptor prostaglandinu E2 (PGE2).
DNA kódující jeden receptor z rodiny savčích receptorů gastrinu/CCK-B podle tohoto vynálezu je použitelná pro metodu na Identifikaci antagonisty tohoto člena rodiny. Metoda zahrnuje přidání agonisty specifického pro rodinu receptorů gastrinu/CCK-B ke kultivovaným buňkám, které byly transfektovány např. cDNA GR-1 anebo cDNA CCK-B podle tohoto vynálezu v přítomnosti potenciálního antagonisty a stanovení schopnosti tohoto potenciálního antagonisty buď a) bránit vazbě agonisty na gastrinový receptor anebo b) blokovat agonistou indukovaný vzrůst volného vápníku [Ca*2] v cytosolu anebo c) blokovat agonistou indukovanou aktivaci fosfolipasy C anebo
d) blokovat agonistou indukovanou aktivaci adenylát cyklasy a tak prokázat jeho být gastrin, např. nebo desulfátovaný) antagonistickou aktivitu. Agonistou může gastr i η- 17 nebo gastr i n-34 (sulfátováný nebo agonistou může být cholecystokinin (CCK), lépe CCK-8s, CCK-8d, CCK-4 anebo pentagastrin (CCK-5). Agonistu je zde nutno chápat jako chemickou sloučeninu schopnou spojit se s receptorem a iniciovat jeho aktivitu. Preferovaným příkladem podle tohoto vynálezu je antagonista receptoru z rodiny savčích receptorů gastrinu/CCK-B identifikovaný podle této metody. Pod pojmem antagonista jak je používán zde jest chápat chemickou sloučeninu, která inhibuje aktivitu receptoru, jako je jeho schopnost vázat agonistu.
Pod pojmem glykosylovaný jak je používán zde jest rozumět bílkovinu s koválentně navázanou jednou cukernou složkou anebo více cukernými složkami. Pod pojmem neglykosylovaný je nutno rozumět neobsahující kovalentně navázané cukerné složky. Pod pojmem “zdánlivá molekulová hmotnost“ je míněna molekulová hmotnost stanovená v denaturačním polyakry1amidovém gelu srovnáním se standardy, např. s bílkovinnými standardy o známé molekulové hmotnosti. Pod pojmem “receptor je zde míněna molekula na povrchu cílové buňky, která váže hormon, např. gastrin anebo CCK.
Vpodstatě čistý zde znamená preparát, např. bílkovinný, který je vpodst/tě zbaven bílkovin, lipidů a dalších
Λ příměsí s nimiž se vyskytuje v přírodě. Typicky je látka vpodstatě čistá jestliže nejméně 10 %, lépe nejméně 20 *, ještě lépe nejméně 50 % , ještě lépe nejméně 60 %, ještě lépe nejméně 75 %, ještě lépe nejméně 90 % a vůbec nejlépe nejméně 99 % celkového materiálu (počítáno na hmotnost, na suchou anebo vlhkou hmotnost anebo na molární procenta anebo molární zlomek) je bílkovina o kterou jde. Čistotu lze stanovovat vhodnou metodou, např. sloupcovou chromatografi i, elektroforézou v polyakrylamidovém gelu anebo pomoci HPLC. Bílkovina je také vpodstatě přečištěna jestliže je zbavena svých přiro7 zených příměsí anebo jestliže je oddělena od nativních znečíštěnin, které ji doprovázejí v přírodě.
Pod pojmem “vpodstatě identický sled aminokyselin je zde míněn sled aminokyselin, který se liší pouze konzervativními záměnami aminokyselin, např. záměnou jedné aminokyseliny aminokyselinou téže třidy (např. aminokyselinou, která má stejný hydrofobni charakter, náboj, pKa anebo další stejné konformační anebo chemické vlastnosti, např. jako je záměna val inu za leucin, argininu za lysin atd.) anebo sled, který se liší jednou anebo více nekonzervativntmi záměnami aminokyselin, delečemi anebo inzercemi v polohách sledu aminokyselin tak, že nezruší biologickou aktivitu polypeptidu jak popsáno výše. Sled aminokyselin je zařazen do tohoto vynálezu jestliže se liší modifikací, která sníží anebo pozmění jednu receptorovou aktivitu, ale ne další. Tak např. změna, která vede ke změně aktivity ve vazbě ligandu ale ne ke změně v signální aktivitě receptorů anebo naopak je zahrnuta do tohoto vynálezu.
Pod pojmem “přečištěná nukleová kyselina jak je používán zde jest chápat sled nukleové kyseliny anebo jejího fragmentu přečištěné od sledů, které je obklopuji v přirozeném stavu, např. fragment DNA, který byl izolován od sekvencí, které k němu přiléhají, např. od sekvencí, které jej obklopují na jeho normálním místě v genomu. Termín se vztahuje i na nukleové kyseliny, které byly vpodstatě přečištěny od ostatních složek, jako jsou bílkoviny, které je v přírodě provázejí v buňce.
Pod pojmem homologický“ jak je používán zde jest rozumět sekvenční podobnost dvou polypeptidových molekul anebo dvou molekul nukleových kyselin. Jestliže je poloha v obou srovnávaných sledech obsazena touž monomemi jednotkou base anebo aminokyseliny, např. jestliže jedna poloha v obou dvou molekulách DNA je obsazena adeninem, pak jsou molekuly homologické v této poloze. Homologie dvou sledů je funkcí počtů srovnatelných anebo homologických poloh společných oběma sleδ dům. Tak např. jestliže 6 z 10 poloh ve dvou sledech je odpovídajících anebo homologických, pak jsou sledy homologické z 60 %. Např. homologie dvou sledů DNA, a to 3'ATTGCC'5 a 3'TATGGC'5 je 50 %.
Popis preferovaných příkladů podle vynálezu
Nejprve je podán stručný popis obrázků.
Obrázky
Obr. 1 znázorňuje sled aminokyselin receptoru gastrinu z psích parietálních buněk (SEKV ID Č:l). Předpokládané transmembránové domény receptoru gastrinu jsou podtrženy a označeny římskými číslicemi. Souhlasná místa N-glykosylace jsou označena #. Potenciální místa protein kinasy C anebo kasein kinasy II, jak byla předpovězena podle schémat nalezených v Prosíte Database (Bairock. A., 1991, Nucleic Acid Res 19:
2241) jsou označena Λ.
Obr. 2 znázorňuje primární strukturu receptoru gastrinu z psích parietálních buněk a přiřazení známých receptorů navázaných na G-protein. Aminokyse1 iny označené stínováním jsou identické ve 2 ze 3 receptorů. Vodorovné čáry nad sledy znázorňují transmembránové segmenty předpovězené podle KKD algoritmu. Zkratky: FC5, receptor neuropeptidu Y-Yl; hB2AR, i dský 02 adrenerg i cký receptor.
Obr. 3 je graf znázorňující účinek koncentrace konkurenta na vazbu 12®I-CCK-8. Každý bod znázorňuje průměr ze tří pokusů. Maximální vazba v nepřítomnosti konkurenta (100 byla 5,2±2,0 pM. Buňky, které nebyly transfektovány nevykazovaly vysytltelnou vazbu.
Obr. 4 je autoradiograf ukazující afinitnl značení receptoru gastrinu z psích parietálních buněk na transfektovaných buňkách COS-7 s použitím bifunkční chemické křížové vazby. Výsledky jsou typické pro 4 podobné pokusy.
Obr. 5 je autoradiograf znázorňující analýzu northernovým přenosem transkriptů receptoru gastrinu v mRNA izolova9 né z psích tkání. Poly(A)+RNA byla nanesena takto: játra, 1, 1 parietální buňky, 0,3 pg, pankreas, 0,5 ug, a kůra mozková, 1,0 pg. Transkript odpovídající GR-1 je označen Šipkou.
Obr. 6 je graf ukazující signál druhého messengera v transfektovaných buňkách COS-7 po stimulaci gastrinem (1 pM). A. Šipka znázorňuje přídavek gastrinu I. Údaje představují 3 pokusy. B. Ins-1, 4, 5-P3 měření (průměr + standardní chyba měření pro n=l) v buňkách divokého typu a v buňkách transfektovaných.
Obr. 7 ukazuje sled nukleotidů cDNA receptorů gastrinu GR-1 (SEKV ID Č:1).
Obr. 8 je znázornění: 66 nukleotidů cDNA CCK-B (SEKV ID C:2); B. 22 aminokyselin předpovězených z nukleotidového sledu na obr. 8A ve srovnání s odpovídajícím sledem aminokyselin odvozeným z cDNA GR-1 (aminokyse1 iny 281-302 v obr. 1, SEKV ID Č:2, SEKV ID Č:3).
Obr. 9 je znázornění sledu nukleotidů cDNA hCCKB lidského receptorů CCK-B (SEKV ID Č:4).
Obr. 10 ukazuje sled aminokyselin lidského receptorů CCK-B (SEKV ID Č:4).
Obr. 11 ukazuje sled aminokyselin receptorů CCK-B z lidského mozku a přiřazení receptorů psího gastrinu a krysího CCK-A. Aminokyseliny označené stínováním jsou identické v nejméně 2 ze 3 receptorů. Vodorovné dárky nad sledy představují transmembránové segmenty předpovězené s pomocí KKD algoritmu (Klein a ost. 1985. Biochim Biophys Acta 815: 468-76). Číslování odpovídá aminokyselinám v receptorů CCK-B. Zkratky: hCCK-B, lidský receptor CCK-B, dGASTRIN, psí receptor gastrinu, rCCK-A, krysí receptor CCK-A.
Obr. 12 je autoradiograf znázorňující northernový přenos transkriptu CCK-B v mRNA isolované z lidských tkání. Poly(A)*RNA byla nanesena do každé dráhy jak naznačeno. Transkript odpovídající receptorů CCK-B je označen šipkou.
Obr. 13 je graf ukazující signál druhého messengeru v buňkách COS-7 exprimujicích rekombinantní receptor lidského mozkového CCK-B. A. V buňkách COS-7 s přídavkem Fůra-2 byla stanovena koncentrace volného vápníku v cytosolu z poměrů emisí fluorescence při 340 a 380 nm (340/380 nm). Šipkou je znázorněn přídavek CCK-8 (0,1 pM) nebo EGTA (2,5 mM) . Údaje znázorňují výsledky 3 pokusů. B. CCK-8 (0,1 μΜ) zvýšil hladiny Ins-1, 4, 5-P3(průměr ± standardní chyba měření pro n=3) v buňkách COS-7 transfektovaných cDNA receptorů CCK-B od 1 834 ± 119 do 8 3031275 DPM/106 buněk (p<0,001).
Obr. 14 je graf ukazující účinek koncentrace konkurenta na vazbu 125I-CCK-8 na receptor CCK-B. Vazba 125I CCK-8 na buňky COS-7 přechodně transfektované hCCK-B-pcDNAI je ukázána v přítomnosti vzrůstajících koncentrací: (A) CCK-8, gastrinu, CCK-4, a (B) L364,718 a L365.260. Každá křivka představuje průměr z 3-5 pokusů. Netransfektované buňky nevykazovaly žádnou vytěsnitelnou vazbu.
Odvození uložených materiálů
Klony plasaidů GR-1, HBR-1 a hCCK-B byly uloženy v American Type Cul ture Collection (A. T. C. C.) v Rockvillu, MD, a jsou přístupné pod těmito čísly ATCC No. 75195, No. 75196 a No. 75303. Tyto uložené klony dávají těm, kteří jsou ěkolení v oboru získat materiály podle tohoto vynálezu. Odvození uložených materiálů je popsáno níže. Receptor gastrinu a receptor CCK-B produkované těmito uloženými materiály jsou příkladem, nikoli však omezením, tohoto vynálezu. Ti, kteří mají běžnou zručnost v oboru mohou snadno izolovat odpovídající receptory a nukleové kyseliny tyto receptory kódující s použitím níže popsaných metod. Osoby určené přihlašovatelem, tj. president a pracovníci Nev England Medica1 Center Hospital zodpovídají za to, že nahradí tyto kultury pokud by zhynuly před uplynutím termínu vydání patentu a dále za to, že zpraví ATCC o udělení takovéhoto patentu s tím, že k tomuto datu budou uložené kultury zpřístupněny veřejnosti. Do té doby budou uložené kultury přístupné Komisaři pro patenty za podmínek uvedených v 37 CFR S 1.14 a 35 USC S 112.
Podrobný popis
Níže uvedeného postupu bylo použito ke konstrukci expres i vní knihovny cDNA psích parietálních buněk, k izolaci genu gastrinového receptorů ze psích parietálních buněk a k ověření identity a biologické aktivity výsledného rekombinantního klonu. Rekombinantni receptor byl izolován z knihovny vyprodukované z vysoce nabohaceného preparátu parietálních buněk. Analýza mRNA z izolovaných parietálních buněk pomocí northernového přenosu ukazuje, že transkript gastrinového receptorů (GR-1) je vysoce exprimován v těchto buňkách. Bylo použito vazebných studií s agonisty a antagonisty, afini tniho značeni a testování transdukce signálu, aby bylo možno zjistit, zda biologická aktivita rekombinantniho receptorů souhlasi s aktivitou nalezenou v nativních psích parietálních buňkách.
Nakloňovaná cDNA gastrinového receptorů byla naopak použita k izolaci cDNA lidského CCK-B a genu.
Konstrukce expresivni knihovny cDNA psích parietálních buněk
Pro izolaci psích parietálních buněk byly buňky enzymaticky dispergovány jak popsáno (Soli a ost., 1984, J Clin Invest. 73:1434-47). Izolované buňky byly nabohaceny ve vytřepávacím systému Beckman XJ-1O a izolovány při 900 ot/min v rozmezí rychlosti toku 50 až 80 ml/min. Další nabohacení na 95Xní čistotu stanovenou barvením podle Papanicolaoua bylo dosaženo isopyknickou centrifugací v diskontinuálním gradientu hustoty PercolluR.
RNA byla připravena ze zhruba 1,5 x 10s parietálních buněk kyselou fenolovou extrakcí (Chromczynski a ost., 1987, Anal___Biochem 162=156-9) po níž následovala chromatografie na oligo(dT)-celulóze. Šest pg poly(A*)RNA bylo převedeno na dvojvláknovou cDNA (Aruffo, A. a ost., 1987, PNAS 84: 8573-7). Po přidání adaptorů BstXl (InVitrogen, San Diego) byla cDNA frakciována podle velikosti v gradientu 5 - 20 % octanu draselného a frakce větší než 1,5 kb byly zaligovány do expresnivního vektoru pcDNA-1 (InVitrogen, San Diego).
Izolace cDNA psího receptorů gastrinu
Pro izolaci klonu receptorů gastrinu z expresivnl knihovny cDNA psích parietálních buněk bylo vyprodukováno 2 x 106 primárních rekombinantů v hotovostech po 3 000 až 10 000 buněk transformací buněk Escher i ch i a co1 i MC1061/p3 elekroporací (Lín, Η. Y. a ost., 1991, PNAS 88:3185-9). Minipreparáty DNA představující jednotlivé hotovosti byly připraveny alkalickou lyží a pak transfektovány do buněk COS-7 přichycených na skleněných baňkách (Nunc) s použitím DEAE-dextranu (Pacholczyk, T. a ost., 1991, Nátuře 350:350-354). Zásobní suspenze bakterií představující jednotlivé hotovosti byly skladovány v glycerolu. Čtyřicetosm hodin po transfekci byly buň ky inkubovány 60 min při 37° C v Hankově pufru doplněném 25 mM HEPESem (pH 7,4), 0,1 % hovězího sérového albuminu (roztok A), 50 pM 125l-CCK-8 (New England Nuclear. 2 200 Ci/mmol) a 50 pM 125I-D-Tyr-Gly-[(Nle28<31)-CCK-26-331, což je analog CCK s volnou aminovou skupinou dostupnou pro fixaci (Pearson, R. K. a ost., 1987, Biochem Biophys Res Commun 147= 346-53). Po čtyřech promytích v ledovém roztoku A byly buňky fixovány ve směsi fosfátová solanka (pH 7,4)/ 2,53ní glutaraldehyd, ponořeny do 0,5 želatiny a vysušeny při 37° C. Sklíčka byla exponována 3 dny na fotoemulzi Kodak NTB2 (Gearing, D. P. a ost., 1989, EMBO J 8:3667-76) a pak zkoumána mikroskopicky v ztemnělém poli. Pozitivní hotovost byla postupně dělena až byl získán pozitivní klon (GR-1).
Sled nukleotidů klonu psího receptorů gastrinu GR-1 cDNA receptoru gastrinu byla subklonována do M13mpl8/19 a jednovláknové templáty 2 obou vláken byly sekvenovány metodou terminace řetězce (Tábor, S. & Richardson, C. C., 1987, PNAS 84=4767-71) s použitím modifikované polymerasy T7 (United States Biochemical Corp.) (Obr. 7 a SEKV ID Č=l). Sled byl analyzován s pomocí UWGCG programu GAP (Devereux, J. a ost., 1984, Nucleic Acids Res. 12=387-395) a KKD analýzou hydropathie (Klein, P. a ost., 1985, Biochim Biopbys Acta 815=468-76). cDNA má otevřený čtecí rámec kódující bílkovinu o 453 aminokyselinách s předpovězenou molekulovou hmotností 48 518 (obr. 1, SEKV ID Č=l). Amalýza hydropathie ukazuje na sedm hydrofóbních segmentů odpovídajících transmembránovým doménám, které jsou charakteristické pro rodinu receptorů navázaných na G-protein. Prozkoumání ostatních oblastí odvozeného sledu aminokyselin ukazuje velký počet aminokyselinových podpisů“ přítomných ve velké většině receptorů navázaných na G-protein. Aminový konec nakloňovaného receptoru nemá signální sekvenci i když obsahuje tři potenciálně možná místa vazby cukerné složky na asparagin (N-X-S/T) v polohách 7, 30 a 36.
Gastrinový receptor je signifikantně identický co do aminokyselin s rodinou /3-adrenerglckých receptorů navázaných na G-protein (obr. 2). Tak např. třetí cytoplasmatická smyčka a C-konec jsou bohaté na zbytky threoninu a šeřinu jako potenciální regulační místa analogická těm, která byla nalezena v rhodopsinu a v /32-adrenergickém receptoru (Dohlman, H. G. a ost., 1991, Ann Rev Blochem 60=653-88). Dva cysteinové zbytky (Cl27 a C206) se mohou podílet na disulfidové vazbě uvnitř řetězce podobné té, jež byla nalezena v rhodopsinu (Karnik, S. S. a ost., 1989. PNAS 85=8459-63). Translát GR-1 vykazuje vysoký stupeň (35 Sá) aminokyselinové shody s receptorem neuropeptidu Y-Yl, FC-5. Další receptory, které vykazují vysoký stupeň shody v aminokyselinách s receptorem gastrinu, jsou receptor lidského dopaminu D4 (28 %) , receptor 5HT z Drosophila melanogaster (27 %) a lidský /32 adrenergický re14 ceptor (26 %). Fylogenetická analýza ukazuje, Se GR-1 definuje novou větev třídy neuropeptidových ligandů receptorů vázaných na <3-protein.
Hybridizačni zkoušky GR-1 pomocí northernového přenosu
Výskyt GR-1 v tkáni (obr. 5) byl odhadován vysoko— stringentním northernovým přenosem. Poly(A+í RNA z dospělých psích tkáni byla oddělena na l,2%nlm agarosovém gelu v 0,66 M formaldehydu. RNA byla přenesena na membrány Nytran™ kapilární přesávkou. Filtry byly hybridizovány s vysokou stringencí v pufru obsahujícím 50?žní formamid (obj/obj) s Pstl-Xbal fragmentem cDNA gastrinového receptorů o velikosti 1 400 basí, označený! navázáním náhodných hexamerů (Feinberg, A. P. & Vogelstein, Β., 1983, Anal Blochem 132:6-13).
Autoradiogram byl exponován 45 hodin s dvěma kontrastními filtry při -80° C.
Receptorová mRNA byla nalezena v žaludečních parietálnich buňkách a v buňkách kůry mozkové (obr. 5). Vysoká stringence s níž byla prováděna hybrldizace northernovým přenosem poskytuje dobrý důkaz, Se receptor gastrinu a receptor CCK-B jsou vysoce homologlcké. Bylo popsáno, Se všechny tyto tkáně mají receptory typu receptorů gastrinu/CCK-B (Jensen, R. T. a ost., 1990, v Gastrointestinal Endocrinology= Receptors and Post-Receptor Mechanisms, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego, str. 95-113: Fourmy, D. a ost., 1987, 165=
683-92). 0 psím pankreatu je známo, Se ve srovnání s ostatními druhy se vyznačuje značným obsahem receptorů
CCK-B/gastr1nu.
Afinitnf zesitěni GR-1
Rekombinantnl receptor v membránách buněk COS-7 transfektovaných GR-1 byl afinitně označen, aby bylo zjištěno, zda je identický co do velikosti s receptorem popsaným dříve na psích nativních parietálnich buňkách.
Pro afini tni značení rekombinantní receptory na membránách buněk COS-7, které byly transfektovány GR-1, byly ponechány vázat 135I-D-Tyr-G1y-[(Nle)-CCK-26-331 60 min při 22° C. Následně byl navázaný radioligand oddělen od volného centrifugací (Pearson, R. K. a ost., 1987, Biochem Biophys Res Commun 147:346-53).
Odcentrované membrány byly zesíťovány s použitím 100 μΜ disukcinimidylsuberátu při 4° C po dobu 5 min a přebytek sítí ovací ho činidla byl zrušen Tris pufrem. Označené membrány byly odděleny elektroforézou v lO^ním polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS a pak byly vizualizovány autoradiografií. Výsledky ukázaly přítomnost bílkoviny v pásu o Mr» odpovídající přibližně 76 000 (obr. 4). Široký tvar pásu odpovídá tomu, že představuje glykoprotein. Skutečně také cukerná složka zodpovídá za značný rozdíl v molekulové hmotnosti mezi předpokládanou bílkovinou a afinitně označeným pásem. Tato velikost souhlasí s dřívějšími údaji získanými pomocí afinitního značeni, které byly získány s psími parietálními buňkami. (Matsumoto, M. a ost., 1987, Am J Physiol 252=G143-G147).
Vazba na receptor GR-1
Byly charakterizovány vazebné vlastnosti rekombinantního receptoru GR-1, aby bylo stanoveno, zda jsou typické pro receptory CCK-B/gastrinu. Buňky COS-7 (1,5 χ 106) byly naočkovány do kultivačních misek o průměru 10 cm (Nunc) a kultivovány v DNEM/10%nlm fetálnlm telecím séru v 5%ním CO2 při 37 °C. Po inkubaci přes noc byly buňky transfektovány 5 ug GR-1 fPacholczyk, T. a ost., 1991, Nátuře 350:350-354). Dvacetčtyři hodiny po transfekci byly buňky rozděleny do misek s 24 jamkami tak, aby v jedné jamce bylo 5 000 buněk. Po dalších 24 h byly s kompetitivní vazbou v roztoku A, který provedeny pokusy byl doplněn o 0, 15 mM PMSF a 40 pM 13SI-CCK-8 jakožto radioligand. Rovnovážná vazba se ustálila po 80 min inkubace při 37° C. Monovrstvy buněk byly pak třikrát promyty a radioaktivita byla kvantitativně stanovena po hydrolýze buněk v 1 N NaOH. Pokusy s vysycením radioligandem byly provedeny analogickým způsobem v rozsahu 2,5 až 1 000 pM 125I-CCK-8 (NEN) přičemž nevytěsnitelná vazba byla stanovována v přítomnosti neoznačeného konkurenta v paralelních jamkách.
Vazebné parametry byly rovněž měřeny v izolovaných plasmatických membránách buněk COS-7, které byly transfektovány GR-1. Vazba byla prováděna 60 min při 22 °C. Oddělení vázaného a volného radioligandu bylo dosaženo pomocí filtrace přes receptor vázající vrstvu (filtermat) jak popsáno dříve (Klueppelberg, U. G. a ost. 1989, Biochemistry 28:3463-8).
Analýzy kompetitivní a saturační vazby byly vyhodnocovány počítačovovou nelineární aproximací křivek (McPherson, G. A., 1985, J Pharmacol Methods 14=213-28).
Farmakologická charakterizace receptorů exprimovaných na buňkách COS-7 transfektovaných GR-1 ukázala vazebnou specifi tu, která je charakteristická pro receptory CCK-B/gastrinu (Matsumoto, M. a ost. 1987 , Am J Physiol 252: G143-G147). Vazba 125I-CCK prokázala jednu homogenní třídu receptorů, jak potvrzeno hodnotou Hillovy směrnice blízké jedné (0,93±0,07) pro homologickou kompetici s použitím neoznačeného CCK. Jiné strukturně příbuzné členy této rodiny hormonů soutěžily o vazbu 125I-CCK způsobem, který byl koncentračně závislý. Vypočtené hodnoty ICso pro CCK-8, gastrin a desulfátovaný CCK-8 byly 0,09 nM, 0,26 nM, resp. 1, 4 nM. To je v souhlase s afinitou radioligandu tak, jak byla odvozena ze saturačních vazebných pokusů v parietálních buňkách COS-7 (Kd=0,08 nM) transfektovaných GR-1 a v nativních parietálních buňkách (Ka=0,27 nM). Srovnatelných výsledků bylo dosaženo s použitím izolovaných membrán připravených z přechodně transfektovaných buněk COS-7 (ICso pro CCK-8, gastrin a desulfátovaný CCK-8 byly 0, nřf, 0,4 nlí resp. 1,5 nM) . Afinita téhož řádu pro všechny testované agonisty byla ověřena s použitím 125I-gastrinu (Amersham) jakožto radioligandu.
Antagonisté receptorů gastrinu/CCK, které jsou nepeptidové povahy, tj. L364.718 (IC5O=19 nM) a L365,260 (ICso=130 nM) vázaly rekombinantní receptor (obr. 3) s afinitami podobnými těm, které byly popsány pro nativní parietální buňky. Opět byly získány srovnatelné výsledky při použití 125I-CCK nebo 125I-gastrinu jako radioligandů v intaktních buňkách COS-7 transfektovaných GR-1 anebo v pokusech s izolovanými membránami těchto buněk. V mozku morčat, membránách žaludeční žlázy a v králičích parietálních buňkách, což všechno jsou tkáně bohaté na receptory CCK-B/gastrinu, je pořadí mohutnosti účinku těchto antagonistů obráceno (Chang, R. S. & Lotti, V. J., 1986, PNAS
83=4923-6; Roche, S. aost., 1991, Am J Physiol 260=G182-8).
Aktivace rekombinantního receptoru GR-1
Vazba gastrinu na rekombinantní receptor vyvolává typický vzestup koncentrace intracelulárního vápníku a hydrolýzy fosfátidylinositolu. Tato biologická odpověď v buňkách COS-7 transfektovaných GR-1 byla použita pro další ověření toho, že GR-1 kóduje funkční receptorovou bílkovinu.
Měřeni [Ca2+3 spuštěné receptorem GR-1
Osmačtyřicet hodin po transfekci byl k buňkám COS-7 přidán Ca2+ s fluoroforem fura-2 v modifikovaném pufru KRB. Změny fluorescence po stimulaci buněk pomocí 10“6 M gastrinu byly měřeny z poměru A340/A3S0 nm jak popsáno dříve CRajan, A. S. a ost., 1989 Diabetes 38:874-80).
Gastrin (10~6 M) spustil výrazný vzestup volného cytosolového vápníku [Ca2+3 od 46,5±6,9 nM do 142,4±16,2 nM yi (n=3, P<0,05), kdežto buňky netrasfektované nevykazovaly žádnou odpověď (obr. 6A). Po chelataci extracelulárnlho vápníku pomocí EGTA 92,5 nM) gastrin postupně vzrůstal ECa2*] od 17,6+1,0 do 88,5+11,6 nM (n = 3, P<0,05) což naznačuje, že gastrinem indukovaný vzestup [Ca2*] pocházel původně z intracelulárních hotovostí [Ca2*].
Měřěni fosf atidy1 inositolů spuštěných receptorem GR-1
Charakter odpovědi [Ca2*] naznačuje, že rekombinantní receptor spouští int racelulární signalizaci cestou aktivace fosfolipasy C: to bylo ověřeno měřením metabolitů fosfatidylinosi tolů.
Buňky COS-7 transfektované GR-1 byly kultivovány 24 h v mediu DMEM (GIBCO) bez inositolu, doplněném o 10 jjCi/ml [3H](myo)-inositolu (ARC) před analýzou. Po 1-h ekvilibraci v modifikovaném pufru KRB (viz výše) byly buňky stimulovány 10-6 M gastrinem po dobu 10 s a pak izolovány do mathanolu:HCl. Vodná fáze byla extrahována chloroformem, lyofi 1izována do sucha a analyzována pomocí HPLC na silném anexu (Auger, K. R. a ost,, 1989, Cell 57:167-75).
Měření metabolitů fosfatidylinositolů v buňkách COS-7 transfektovaných GR-1 bylo provedeno 10 s po stimulaci gastrinem (obr. 6b). Byl zvolen čas, který předcházel vrcholu indukovanému [Ca2*]. Gastrin (10*° M) zvýšil hladinu Ins-1,4, 5-P3 o 741+115 % oproti kontrole (buňky COS-7 transfektované GR-1 bez stimulace). Ins-1,3,4,5-P4, které mohou spolu s Ins-1,4,5-P3 modulovat intracelulární hladiny vápníku, vzrostly rovněž o 272115 % (n-3, P<0,01). Tyto výsledky jsou v souladu s předchozími sděleními o tom, že dráhy druhého messengera jsou propojeny s gastrínovým receptorem nativních parietálních buněk (Muallem, S. a ost., 1984, Biochim Biophys flcta 805=181-5: Chew, C. S. a ost., 1986, Biochim Biophys Acta 888:116-25: Roche, S. a ost., 1991, FEBS Lett 282= 147-51). Předběžné důkazy nasvědčují tomu, že receptor gastrinu exprimovaný v buňkách COS-7 je navíc propojen se stimulací adenylát cyklasy.
Vazbu agonistu a antagonistů, afini tni značení a transdukci signálu nelze odlišit od předchozích výsledků získaných s nativními psími parietál ními buňkami, o nichž bylo prokázáno, še obsahují jednu homogenní třídu receptorů. Hojný výskyt transkriptu GR-1 jak v buňkách psí kůry mozkové tak i v parietálních buňkách (obr. 5) podporuje názor, še receptory “CCK-B a gastrinu“ jsou vysoce homologické.
Konstrukce expresivni knihovny cDNA lidských parietálních buněk a__izolace cDNA lidského receptoru gastrinu
Lidské parietální buňky nebo hlavní buňky, o nichš je známo, še jsou obohaceny receptory CCK-B, lze poušít pro konstrukci expresivní knihovny lidské cDNA. Týchš metod jaké jsou ty poušívané pro konstrukci expresivní knihovny cDNA psích parietálních buněk se poůšije pro přípravu expresivní knihovny cDNA lidských parietálních buněk anebo hlavních buněk s tou výjimkou, še segmenty cDNA jsou zaligovány do vektorů XgtlO nebo Xgtll, jak popsáno jinde (Sambrook, a ost. 1989. Molecular Cl on ing: A Laboratory lianual, 2. vyd. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2:8.36-38). Přečištěná nukleová kyselina z klonu GR-1 podle tohoto vynálezu se poušije jako sonda na izolaci cDNA lidského receptoru gastrinu.
Izolace a sekvenční analýza cDNA lidského receptoru CCK-B (hCCDB)
Restrikční fragment Pstl-Xbal, kódující 3'-konec receptoru gastrinu buněk, označený radioaktivně [a-33P] náhodných hexamerů (Feinberg, A. P.
o 1 400 párů bas ί, z psích parietálních dCTP pomocí navázání a ost., 1983, Anal
Biochem. 132:6-13), byl poušít jako hybridizačni sonda pro vyhodnocení lidské knihovny
Λ DR2 cDNA lidských mozkových buněk (Clontech) (Benton, W. D. a ost, 1977, Science 196: 180-182). Filtry byly hybridizovány přes noc při 55° C v 5X SSC (IX SSC je 0,15 M NaCl/0,015 M citrát sodný, pH 7,0) a promyty 2X SSC/0,l%ním SDS při téže teplotě. Jeden pozitivní klon byl nalezen mezi 4 x 106 primárními rekombinanty, které byly vyhodnocovány. Po přečištění plaku odpovídající inzert cDNA (~1 kb) byl subklonován do expresivního vektoru pcDNA I (Invitrogen, San Diego, CA) a sekvenován metodou terminace řetězce (Tábor, S. a ost.,
1987, PNAS. 84:4767-4771) s použitím modifikované T7 DNA polymerasy (United States Biochemical Corporation). Porovnání sledu se sledem cDNA psího receptorů gastrinu s použitím UWGCG softwarových programů (Devereux, J. a ost., 1984, Nucleic Acids Res. 12-'387-395) naznačilo, Se původní klon byl fragment odpovídající 3’-konci předpokládané cDNA receptorů CCK-B. DNA z plaku byla přečištěna a sekvenována jak popsáno pro klon GR-1. Sled 66 párů bází uvnitř otevřeného čtecího rámce je ukázán ma obr. 8A (SEKV ID Č·1 2). SEKV ID Č: 2 rovněž ukazuje sled aminokyselin CCK-B předpovězený z cDNA. Tyto 22 aminokyseliny jsou vysoce homologické s 22 aminokyselinami předpovězeného sledu aminokyselin GR-1 («281-302 v SEKV ID Č:l; SEKV ID Č:3), jak ukázáno v obr. 8B.
Inzert cDNA o 1 kb byl pak použit jako hybridi začni sonda pro izolaci odpovídající celé cDNA lidského receptorů CCK-B z fetální (23. týden) lidské knihovny mozkových buněk v Λ LAS, coš je modifikovaný lambda vektor (Swaroop, a ost.,
1988, Nucleic Acids Res. 16:8739). Bylo provedeno vyhodnocení 8 x 10s primárních rekombinant za po.dminek popsaných výše. Sedm pozitivních klonů bylo přečištěno jako plaky: nejdelší inzert (hCCKB) byl subklonován do pcDNA I a sekvenován jak popsáno výše. Nukleotidový sled byl analyzován pomocí softwarových UWGCG propgramů popsaných výše (Devereux. J. a ost., 1984, Nucleic Acids Res, 12:387-395).
cDNA receptorů CCK-B z lidského mozku kóduje bílkovinu o 447 aminokyselinách (obr. 10, SEKV ID Č- 4) o předpovězené molekulové hmotnosti a porovnání s jinými receptor CCK-B je
419 daltonů. Analýza hydropathie známými receptory svědčí o tom, že členem rodiny receptorů se sedmi transmembránovými doménami,navázaných na G-protein . Aminový konec receptorů obsahuje tři možná asparaginová glykosylační místa (N-X-S/T), a to v polohách 7, 30 a 36, Odvozený sled aminokyselin ukazuje řadu strukturních charakteristik, které nalézáme ve většině známých receptorů navázaných na G-protein. Cysteinové zbytky, jeden v první extracelulární smyčce (C-127) a jeden v druhé extracelulární smyčce (C-205), mohou vytvořit disulfidovou vazbu uvnitř řetězce, podobnou té, která byla nalezena v rhodopsinu (Karnik, S. S. a ost., Zbytky šeřinu a threoninu jsou cytoplasmatické smyčce tak i na mohou být fosforylační místa, β-adrenerg i ckém ost., 1991, Eur
1988, PNAS. 85:8459-8463) nahromaděny jak v třetí karboxylovém konci; to analogická těm, která byla nalezena v receptorů a v rhodopsinu (Dohlman, H. G. a
J Biochem. 60:653-688).
Porovnání sledů ostatních známých receptorů navázáných na G-protein ukazuje, že odvozený sled aminokyselin receptorů CCK-B vykazuje nejvyšší stupeň identity aminokyselin s psím receptorem gastrinu (91 %); pak následuje krysí receptor CCKa (49 %') . Přiřazení sledů aminokyselin tří předpokládaných podtypů receptorů CCK/gastrinu (obr. 11) ukazuje vysoký stupeň sekvenční identity těchto tří receptorů, a to nikoliv pouze v transmembránových doménách, ale i pokud jde extracelulární a intracelulární smyčky. Dalšími receptory, které vykazují vysoký stupeň identity aminokyselin s receptorem CCK-B, jsou peptidové receptory hormonů, krysího neuropeptidu Y (30 %), lidského vasopressinu V2 (30 %), lidského oxytocinu (28 %), a receptory biogenních aminů, lidského β- adrenerg i cké ho (26 %) a krysího serotoninu (23 %).
Hybridizaon i__zkouška CCK-B pomoci northernového přenosu [cf_32p) dCTP a ost., 1983,
Dva mikrogramy poly(A) + RNA, izolované z devíti různých lidských tkání, byly odděleny v denaturačním agarosovém gelu ve formaldehydu a přeneseny na nylonovou mrmbránu (Human MTN blot, Clontech). Pstl-Xhol fragment hCCKB o 1 400 párů basí, označený radioaktivně navázáním náhodných hexamerů (Feingerb, A. A.
Anal Biochem, 132:6-13), byl hybridizován na membránu přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím 50%ní formámid (obj/obj), 5X SSC/20 mM fosfát sodný, pH 6,6, IX Denhardtův roztok, O, 5?íní SDS, 10%ní dextransul fát (hmot/obj) a roztrženou (sheared) DNA z lososího spermatu (100 jig/ml). Membrána byla promývána 40 min v 0,2X SSC s 0,l%ním SDS při 69 °C. Přenos byl znovu sondován cDNA lidského β-aktinu za stejných podmínek a přesávka promyta 0,2X SSC v 0,15ním SDS při 55 °C. Silný autoradiografický signál p-aktinu byl pozorován ve všech drahách po tříhodinové expozici (výsledky neuvedeny).
Výskyt transkriptu hCCKB v tkáních byl posuzován pomocí northernového přenosu za stringentních podmínek, obr. 12). Transkrlpt RNA o zhruba 2,2 kb byl nalezen v lidském mozku, žaludku a pankreatu což jsou všechno tkáně o nichž je známo, že podle funkčních údajů a/nebo údajů o vazbě receptorů obsahují podtypy receptorů CCK/gastrinu. Hybridizačni signál v mRNA izolované z žaludku ukazuje na identitu nebo křížovou reaktivitu s transkriptem receptorů gastrinu lidských parietálních buněk. Je však rovněž možné, že sonda hybridizuje s jiným příbuzným podtypem receptorů CCK/gastrinu. Dva pankreatické signály naznačuji expresi receptorů CCK/gastrinu rovněž v pankreatu.I když dosud to nebylo popsáno pro lidský materiál, bylo ukázáno fotoafinitnim značením, že psí pankreas obsahuje významné množství receptorů gastrinu navíc k receptorů» CCK-A (Fourmy, D. a ost., 1987, Eur J Biochem. 165:683-692). Tak o 2,2 kb nejspíše představuje receptorů gastrinu nebo CCK-B.
tedy hybridizační signál transkript pankreatického
Větší, méně intenzivní signál může být odrazem mRNA receptorů
CCKn, alternativně procesované varianty transkriptů o 2,2 kb anebo mRNA kódující dosud neznámý subtyp pank reatického receptoru CCK/gastrinu.
Měření [Ca*J_spouštěného receptorem CCK-B
Čtyřicetosm hodin po transfekci hCCKB-pcDNAI byl k buňkám COS-7 přidán Ca2*fluorofor fůra-2 v modifikovaném Krebs-Ringerově hydrouhličitanovém pufru. Změny v poměru emise fluorescence (340/380 nm) po stimulaci buněk 10-7 M CCK-8 byly měřeny jak popsáno dříve (Rajan, A. A. a ost.,
1989, Diabetes 38= 874-880).
Měřeni metabolitů fosfátidylinositolů spouštěných receptorem CCK-B
Buňky COS-7 transfektované hCCKB-pcDNA byly kultivovány v mediu DNEM (GIBCO) prostém inositolů doplněném o 10 jjCi/ml [3H1 (myo) - inositolů (ARC) 24 h před analýzou. Po 1 h ekvilibrace v modifikovaném Krebs-Ringerově hydrouhliči tanu (viz výše) byly buňky stimulovány 10-7 M CCK-8 10 s a izolovány do methanolu:HC1. Vodná fáze byla extrahována chloroformem, lyofi 1izována a analyzována na inositol-1, 4, 5- trifosfát (Ins-1, 4, 5-P3) a inositol-1, 3,
4, 5- tetrakisfosfát (Ins-1, 3, 4, 5-P4) pomocí HPLC na silném anexu (Auger, K. R. a ost., 1989, CeII. 57:167-175).
Aby se ověřilo, že hCCKB kóduje funkční receptor byla měřena signálizace druhého messengeru jako odpověď na stimulaci buněk COS-7, exprimujících rekombinantní receptor, pomocí CCK-8. CCK-8 ( 10-7 M) spouštěl výrazný vzestup volného cytosolového vápníku, [Ca2*]i, (obr. 13A, levý panel), kdežto netransfektované buňky nevykazovaly žádnou odpověď. Po chelataci extracelulárního vápníku pomocí 2,5 M EGTA (1,5 mM Ca2+ v pufru) přídavek CCK-8 (10-7 M) dočasně zvyšoval [Ca2+]i (obr. 13A, pravý panel), což svědčilo o tom, že původní vrchol vzestupu [Ca2+li indukovaný CCK-8 pocházel primárně 2 intracelulárních hotovostí Caa+. Charakter odpovědi CCa2+]i naznačuje, Se vazba CCK-8 k rekombinantnímu receptorů spouští řkracelulární signalizaci cestou aktivace lipasy C. To bylo ověřeno měřením metabolitu fosfatidylinositolů v buňkách COS-? transfektovaných hCCKB-pcDNA 10 s po stimulaci pomocí CCK-8 (obr. 13B) . Tento čas byl zvolen tak, aby právě předcházel vrcholu [Ca2*]i indukovanému CCK-8. CCK-8 ( ΙΟ'? M) zvyšoval hladinu Ins-1, 4, 5-P3 o 453 % oproti kontrole (n=3, P<0,01). Ins-1, 3, 4, 5-P4, bezprostřední metabolit Ins-1, 4, 5-P3, rovněž vzrostl o 186 % oproti kontrole (n=3, P<0,01). Tyto výsledky rovněž potvrzují, že izolovaný klon kóduje funkční receptor.
Vazba na receptor CCK-B
Buňky COS-7 (1,5 x 106) byly rozprostřeny na kultivační misky o průměru 10 cm (Nunc) a byly kultivovány v DNEM/lO^ním fetálním telecím séru v atmosféře 5 % COz/95 % vzduchu v inkubátoru při 37 °C. Po inkubaci přes noc byly buňky transfektovány (Pacholczyk, T. a ost., 1991, Nátuře. 35:350-354) pomocí 5-7 «g pcDNA I expresivního vektoru, který obsahoval hCCKB (hCCKB-pcDNA I). Dvacetčtyři hodiny po transfekci byly buňky rozděleny do misek se 24 jamkami (Costar, 2 x 104 buněk/jaraka). Po dalších 24 h byly provedeny pokusy s kompetitivní vazbou v Hankově pufru doplněném o 25 mM HEPES (pH 7,4), 0, lSíni hovězí sérový albumin a 0,15 mM PMSF. Dvacet pM 12SI CCK-8 (New England Nuclear) bylo použito jako radioligand. Rovnovážná vazba se ustálila po inkubaci 80 min při 37 °C. Monovrstvy buněk byly pak třikrát promyty, hydro1yzovány 1 N NaOH a navázaná radioaktivita stanovena kvantitativně. Neoznačení agonisté, CCK-8, gastrin I, CCK-4 (Peninsula) a antagonisté , L364.718 a L365,260 (Glaxo) byly testovány v koncentračním rozmezí 0, 1 pM - 10 χιΜ. Veškeré vazebné pokusy byly opakovány 3 až 5-krát. Údaje o kompetici byly analyzovány počítačovou nelineární aproximací křivek nM (obr. receptorů (Hughes, J A. a ost.
(Inplot 4.0, GraphPad, San Diego, CA).
Farmakologická charakterizace lidského mozkového receptorů CCK-8 exprimovaného v buňkách COS-7 ukázala agonistické aktivity, které odpovídaly receptorů typu CCK-B jak byl dříve definován z izolovaných mozkových membrán (Innis, R. B. a ost., 1980, PNAS. 77:6917-6921; Saito, A. a ost., 1980, Science. 208:1155-1156); Lotti, V. J. a ost. 1989, Eur J Pharmacol. 162:273-280; Hays, S. a ost., 1980, Neuropept i des. 1=53-62). Strukturně příbuzní agonisté CCK-8, gastrin I a CCK-4 všechny soutěžily o vazbu 125I CCK-8 na buňky COS-7 expri mující rekombinantní receptor způsobem, který jevil koncentrační závislost. Vypočtené hodnoty IC50 pro CCK-8, gastrin I a CCK-4 byly 0,14 nM, 0,94 nM, resp. 32 14A). Jak bylo možno očekávat u “prototypu CCK-B, rekombinantní receptor má vysokou afinitu jak pro CCK-8 tak i pro gastrin I, přičemž afinita pro CCK-8 je 7násobná. Tento rozdíl v relativních afinitách (CCK-8 versus gastrin I) je v dobrém souhlasu s lOnásobným rozdílem, který byl popsán ve čtyřech pracech, které studovaly isolované mozkové membrány morčete a krysy (Innis, R. B. a ost., viz výše; Saj to., A._ a ost. ,_ vis výše; Lotti, V. J. , viz výše; Hays, S. a ost., viz výše). Drobné odchylky v poměrech afinity, které se jeví ve srovnání s dřívějšími pracemi, lze přisoudit variabilitě v experimentálních podmínkách včetně podmínek přípravy tkání, zdroje peptidů a použitých radíoligandů.
Afinita k CCK-4 poskytuje další důkaz, že rekombinantní lidský mozkový receptor je spíše receptorem CCK-B než receptorem CCKa. V pracech s izolovanými mozkovými membránami morčat (Innis, R. B. a ost., viz výše). myší a ost., 1990, PNAS 87=6728-6732) a krys (Saito, viz výše) byl poměr hodnot IC50 receptorů CCK-3 pro CCK-4 (versus CCK-8) v rozmezí 10 až 110. V této studii lidského rekombinantni ho receptorů byl nalezen poměr hodnot IC50 (CCK-4 versus CCK-8) rovný 230, což souhlasí s výše citovanými hodnotami. Naproti tomu receptor CCK-A, charakterizovaný na krysích pankreatických, membránách váže
CCK-4 (oproti CCK-8) s hodnotou poměru ICso rovnou 30 000 až
000 (Jensen, R. T. a ost., 1989, Trends Pharmacol Sci, 10=
418-423; Hughes, J. a ost., viz výše).
Vazba nepeptidových antagonistů L364,718 a L365.260 na rekombínantní receptor dále potvrzuje správnost jeho klasifikace jakožto receptorů CCK-B (Hughes, J. a ost., viz výšei Lotti, V. J. a ost., viz výše; Chang, R. S. a ost.,
1986, PNAS. 83-4923-4926). Hodnoty IC50 pro L364.718 a L365,
260 jsou 145 nM resp. 3,8 nM (obr. 14B). L365,260 se vázal se zhruba 40násobnou afinitou oproti L364,718, což je hodnota dobře zapadající do rozmezí 6 až 125násobné afinity, která byla popsaná v literatuře (Hughes J. a ost., viz výše; Lotti,
V. J. a ost., viz výše). Hodnota ICso, kterou rekombínantní receptor vykazuje pro L365.260, je rovněž v dobrém souhlasu s referenční hodnotou stanovenou s izolovanými mozkovými membránami (2,4 nM) (Lotti, V. J. a ost., viz výše).
„ 3
Čištěni polypeptidových receptorů gastrinu a CCK-B
Polypeptidový receptor gastrinu a polypeptidový receptor CCK-B mohou být přečištěny s pomocí konvenčních metod používaných pro izolaci bílkovin, které jsou známy těm, kdo jsou v oboru zaškoleni, jako jsou např., ale nikoliv I výhradně, metody srážecí, chromatografické, imunoadsorpční nebo afinitní techniky. Polypeptid může být přečištěn z výchozího materiálu přičemž se použije cDNA GR-1 v buňkách
COS-7 jak popsáno, cDNA CCK-B v buňkách COS-7 anebo rekombínantní forma těchto cDNA zabudovaná do buněk superprodukčn í 1 i n i e. 1
Výběr kandidátů na antagonisty
Aktivace receptorů gastrinu indukovaná gastrinem nebo CCK poskytuje test na vyhodnocení kandidátů na antagonisty
CCK-4 nebo CCK-5 fosfatidylinositoly blokující vzestup cytosolového [Ca2+], vzestup hydrolýzy fosfátidylinositolů anebo vzestup aktivity adenylát cyklasy. Tak např. kandidáti na antagonisty se přidají ke kultivovaným buňkám, např. k buňkám COS-7, které exprimují cDNA receptorů GR-1 anebo CCK-B. Pak se ke kultuře přidá agonista receptoru gastrinu anebo receptoru CCK-B. Agonisté jsou. přičemž výčet se neomezuje pouze na tyto, gastrin, CCK, CCK-8s, CCK-8d, (Peninsula Co.). Vápník [Ca2+] nebo se změří jak popsáno výše (obr. 6A a 6B). Na stanovení hladin cAMP se použije komerční soupravy (Amersham). Za kandidáta na antagonistů se považují látky, které blokují aktivaci receptoru, jak ukázáno v obr. 6A a 6B nebo v obr. 13A a 13B. Kandidáti na antagonisty zahrnují jak peptidové tak nepeptidové látky.
Jinak lze pokusy s kompetitivní vazbou provést na buňkách COS-7 transfektovaných cDNA receptoru GR-1 nebo CCK-B jak je popsáno v obr. 3a 14. Změří se vazba agonisty na receptor. Tato měření se porovnají s kontrolním vzorkem buněk inkubovaných za stejných podmínek avšak bez přítomnosti potenciálního antagonisty. Jako použitelné antagonisty lze definovat ty molekuly, které inhibují vazbu agonisty na receptor, jak ukázáno Hillovým výnosem podobným tomu, který je na obr. 3.
Terapie
Tyto antagonisté, jakmile byly identifikovány, mohou být použity k inhibici aktivity receptoru gastrinu nebo receptoru CCK-B i n v i vo. Antagonisté receptoru gastrinu mohou být užitečné např. pro léčení Zolli ngerova-El 1isonova syndromu, rakoviny žaludku, zhoubné anemie, refluxní esophagitidy, vředové žaludeční choroby anebo rakovinných nádorů tím, še snižují aktivaci receptoru gastrinu a hladinu kyseliny v žaludku. Tak např. OmeprazoleR (Merck), o němž je známo, že snižuje hladinu kyseliny v žaludku, zvyšuje při dlouhodobé aplikaci hladinu gastrinu což u krys způsobuje vznik rakovinných nádorů. Proti tomuto účinku by bylo možno aplikovat antagonistu receptoru gastrinu, čímž by se docílilo toho, že Omeprasole1* by mohl být používán k léčení po delší dobu. Jelikož gastrin se může rovněž uplatňovat v růstu a diferenciaci, bylo by možno použít antagonistů receptorů gastrinu k léčení některých druhů rakoviny včetně, ale nikoliv pouze, rakoviny malých buněk plic anebo rakoviny hladkého svalstva.
Antagonistů receptoru CCK-B lze použít k inhibici aktivity receptoru CCK-B in vivo. Antagonisté receptoru CCK-B mohou přinést užitek při léčení bolesti, depresí a úzkostí, poruch paměti, poruch pocitu sytosti a poruch v jídle a panikových stavů. Tak např. analogy CCK, např. CCK-4, způsobují záchvaty paniky u lidí. Je-li receptor CCK-B blokován např. antagonistou receptoru CCK-B, pak se nával paniky zastaví.
Účinné množství antagonisty v obou případech by bylo možno podat pacientu intravenózně s použitím zařízení pro pomalé dávkování anebo per os konvenčním způsobem.
Jiné příklady
Jiné příklady jsou zahrnuty do následujících návrhů.
Tak např. lze izolovat jiné ekvivalentní klony pomocí hybridizačních vyhodnocovacích technik dobře známých těm, kteří běžně ovládají obor, a to s použitím cDNA podle tohoto vynálezu na vyhodnocení expresivních knihoven cDNA psích nebo lidských parietálních buněk. Podobně lze získat přečištěnou nukleovou kyselinu kódující receptor prostaglandinu Ea s použitím těchto knihoven cDNA.
Expresivní knihovna cDNA může být připravena lígací cDNA parietálních buněk do jiných vektorů, tj. do vektorů jiných než je pcDNA-1, AgtlO nebo Agtll, které jsou schopny biologicky akt i vn í bí1 koviny exprimovat produkty v eukaryotických buňkách.
Vynález zahrnuje vpodstatě homologická s jakoukoliv bílkovinu, která je psím reeceptorem gastrinu (obr. 1: lidským receptorem gastrinu a s lidským ID Č;4), právě tak jako jiné členy rodiny receptorů zahrnuty alelové
SEKV ID C:l), receptorem CCK-B (obr. 10: SEKV v přírodě se vyskytující g astrinu/CCK-B.
varianty, bílkoviny kódované vysoké nebo n í zké
2X SSC při 40 °C s délkou sondy
Rovněž jsou přirozené mutanty, indukované mutanty, DNA, která hybridizuje za podmínek stringence (tj. promývání biologicky aktivní rodiny receptorů přinejmenším 40 nukleotidů) na přirozenou nukleovou kyselinu. Patří sem i chimérické polypeptidy, které obsahují jeden člen rodiny receptorů gastrinu/CCK-B.
Vynález zahrnuje i jakýkoliv fragment nebo analog receptorů z gastrinu/CCK-B. Pod pojmem “biologicky aktivní je míněno, že má jakoukoliv aktivitu in vivo nebo in vitro. která je charakteristická pro rodinu receptorů gastrinu/CCK-B. Vzhledem k tomu, že rodina savčích receptorů gastrinu/CCK-B má velkou řadu fyziologických vlastností a vzhledem k tomu, že tyto vlastnosti lze vztáhnout k různým částem molekuly receptorů gastrinu/CCK-B, je užitečný fragment receptorů gastri nu/CCK-B ten, který vykazuje biologickou aktivitu v jakémkoliv testu na receptory gastri nu/CCK-B anebo který má jednu z následujících aktivit: a) schopnost receptorů vázat agonistů anebo b) schopnost zvýšit cytosolový vápník [Ca2+] po indukci agonistou anebo c) schopnost aktivovat fosfolipasu indukci agonistou anebo d) schopnost aktivovat po cyklasu, aby vzrostla hladina : rodiny savčích
%. lépe 40 %
C po indukci agonistou adenylát cAMP. Fragment anebo analog receptorů receptorů gastri nu/CCK-Β, který vykazuje anebo nejméně 90 % aktivity polypeptidového savčího receptorů gastri nu/CCK-B (např. toho, který je ukázán v obr. 1: SEKV ID Č;2) v kterémkoliv testu in vivo anebo .in.jvi.tro na savčí receptory gastri nu/CCK-B (např. v těch, které jsou popsány výše), je považován za biologicky aktivní a užitečný podle tohoto vynálezu.
Předpokládané biologicky aktivní fragmenty receptorů gastrinu/CCK-B lze vytvořit metodami, které jsou známy těm, kdož jsou zběhlí v oboru. Schopnost fragmentu vyhovět testům, které jsou popsány výše, lze odhadnout pomocí metod, které jsou známé těm, kdo jsou zběhlí v oboru, např. metodami popsanými níže.
Preferované analogy zahrnují členy rodiny receptorů gastrinu/CCK-B (anebo jejich biologicky aktivní fragmenty) aminokyselin se liší od sledů aminokyselin konzervat i vn í m i záměnám i am i nokyse1 i η, aminokyseliny aminokyselinou o podobných záměna val inu za glycin, argininu za více nekonzervativnimi záměnami inzercemi, které neodstraňují Jiné užitečné modifikace peptidu: takovéto analogy jej ichš sledy divokých typů pouze např. záměnou jedné v1astnostech (např. lysin atd.) am i nokyse1 i η, biologickou anebo jednou či delečemi anebo aktivitu polypeptidů.
jsou ty, které zvyšují stabilitu mohou obsahovat např. jednu či (které nahrazují peptidové vazby) anebo D-aminokyseliny ve sledu aminokyselin peptidu.
Analogy se mohou lišit od přirozených receptorů gastrinu/CCK-B ve sledu aminokyselin anebo v modifikacích, které neovlivňují sled aminokyselin anebo v obojím. Analogy podle tohoto vynálezu budou obecně vykazovat nejméně 70?Sní, lépe 80%ní, ještě lépe 90%ní a vůbec nejlépe 95%ní či dokonce 99 %ní homologii se segmentem o 20 zbytcích aminokyselin, ale raději o 40 zbytcích aminokyselin anebo ještě lépe s celým sledem aminokyselin přirozeného receptorů gastrinu či CCK-B.
Změny v primární sekvenci zahrnují genetické varianty, jak přirozené tak i indukované. Jsou zahrnuty i analogy, které mají i jiné zbytky než přírodní L-aminokyse1iny, např. D-aminokyseliny anebo aminokyseliny v přírodě se nevyskytující či syntetické, např. (3 nebo aminokyseliny.
více nepeptidových vazeb glykosylace polypept idu (proces i ngu),
Jinak lze zvýšit stabilitu cykližací peptidové molekuly. Vystavením polypeptidu účinkům enzymu, které mění fosforyláci, např. kinasám, nebo fosfatasám; modifikace zahrnují chemickou der ivat izaci i n v i vo nebo in vitro. jako např. acetylaci, methylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci: glykosylaci lze pozměmit např. změnou místa buď během syntézy a opracování (processingu) anebo aš v dalších stupňích opracování např. vystavením polypeptidu účinkům enzymů, které ovlivňují glykosylaci, coá jsou enzymy získané z buněk, které normálně takovýto procesing provádějí, jako jsou např. savčí glykosylační enzymy. Fosforylaci lze modifikovat vytstavením polypeptidu účinkům enzymů ovlivňujících fosforylaci, jako jsou např. kinasy či fosfatasy.
Navíc kromě polypeptidů, které mají vpodstatě celou délku řetězce vynález zahrnuje i biologicky aktivní fragmenty polypeptidů. Termín “fragment“ jak je zde používán je vztažen na polypeptid, o nejméně .. zbytcích aminokyselin, ale spíše zbytcích, nejlépe ale o nejméně 60 Fragmenty typicky o nejméně 40 zbytc í ch am i nokyselín.
CCK-B lze připravit metodami, které zběhlí v oboru. Schopnost kandidáta na fragment biologickou aktivitu receptoru gastrinu nebo odhadnout zde školení v oboru, gastr i nu/CCK-B receptorů gastrinu anebo jsou známe těm kdož jsou vykazovat CCK-B lze popsanými metodami známými těm, kdož jsou Rovněž jsou zahrnuty polypeptidové receptory obsahující aminokyseliny, jež jsou normálně odstraňovány během opracování (procesingu) , včetně dalších aminokyselin, které nejsou vyžadovány pro biologickou aktivitu polypeptidů anebo včetně dalších aminokyselin, které jsou důsledkem sestřihu mRNA či jiných jevů k nimž dochází při opracování (procesingu) bílkovin.
Seznam sekvencí (1) Obecná informace (i) Žadatel ’ Alan S. Kopin (ii) Název vynálezu: cDNA kódující receptory gastrinu a CCK-B (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Adresa pro korespondenci:
(A) Adresát: Fish & Richardson
(B) U1 i ce: 225 Franklin Street
(C) Město: Boston
(D) Stát: Massachusetts
(E) Země : U.S.A.
(F) PSČ: 02110-2804
(v) Forma č (A) (B) (C) (D) (iv) Údaje o (A) (B) (C) telná počítačem: Typ prostředí:
Počítač:
Operačn í systém: Software· žádost i
Číslo žádost i: Podána dne:
Klasí f ikace:
3,5“ disketa,
1,44 Mb
IBM PS/2 Model 50Z nebo 55SX MS-DOS (verze 5,0) WordPerfect (verze 5,1) (vii)
Údaje o předchozích žádostech:
(A) Číslo žádosti (B) Podána dne:
07/832.841 7. února 1992 (A) Číslo žádosti (B) Podána dne:
07/941,373
3. září 1992 a
i (viii) Informace o právním zástupci a agentuře:
(A) Jméno: Paul T. Clark (B) Číslo registrace: 30,162 (C) Reference/číslo záznamu: 00398/065003 (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: (617) 542-5070
( B) Te1efax (617) 542-8906
( C) Telex: 200154
(2) Informace ( i) o sekvenci s identifikačním Charakter i st i ka sekvence:
číslem
(A) Délka: 1440
( B) Typ: nukleová kyselina
(C) V1ákno: dvoj i té
(D) Topo1og i e: 1ineární
( xi)
Popis sekvence pod
GCCGGGGCC 9
ATG Met 1 GAG Glu CTG Leu CTA AAG CTG Leu AAC Asn CGG Arg AGC Ser GCG Ala 10 CAG Gin GGG Gly TCC Ser GGA Gly GCC Ala 15 GGG Gly 7
Leu Lys 5
CCG GGG GCT TCC CTG TGC CGC GCG GGG GGC GCC CTC CTC AAC AGC AGC 105
Pro Gly Ala Ser Leu Cys Arg Ala Gly Gly Ala Leu Leu Asn Ser Ser
20 25 30
GGT GCG GGC AAT CTC AGC TGC GAG CCG CCT CGC CTC CGC GGA GCC GGG 153
Gly Ala Gly Asn Leu Ser Cys Glu Pro Pro Arg Leu Arg Gly Ala Gly
35 40 45
ACA CGA GAA TTG GAG CTG GCC ATT AGG GTC ACC CTT TAT GCA GTG ATC 201
Thr Arg Glu Leu Glu Leu Ala Xle Arg Val Thr Leu Tyr Ala Val Ile
50 55 60
TTT CTG ATG AGT GTT GGA GGA AAT GTG CTC ATC ATC GTG GTC CTG GGA 249
Phe Leu Met Ser Val Gly Gly Asn Val Leu Ile Ile Val Val Leu Gly
65 70 75 80
CTG AGT CGC CGG CTG AGG ACT GTC ACC AAC GCC TTC CTG CTC TCA CTG 297
Leu Ser Arg Arg Leu Arg Thr Val Thr Asn Ala Phe Leu Leu Ser Leu
85 90 95
GCA GTC AGC GAC CTC CTG CTG GCT GTG GCT TGC ATG ccc TTC ACC CTC 345
Ala Val Ser Asp Leu Leu Leu Ala Val Ala Cys Met Pro Phe Thr Leu
100 105 110
CTG Leu ccc Pro AAT CTC ATG Asn Leu Met 115 GGC Gly ACG Thr TTC Phe 120 ATC TTT GGC ACA GTC Val 125 GTC Val TGT Cys AAG Lys 393
Ile Phe Gly Thr
GCA GTT TCC TAC CTC ATG GGG GTG TCT GTG AGT GTG TCC ACA CTA AGC 441
Ala Val Ser Tyr Leu Met Gly Val Ser Val Ser Val Ser Thr Leu Ser
130 135 140
CTT GTG GCC ATC GCC CTG GAG CGA TAC AGC GCC ATC TGC CGG CCG CTA 489
Leu Val Ala Ile Ala Leu Glu Arg Tyr Ser Ala Ile Cys Arg Pro Leu
145 150 155 160
CAA GCA CQC GTG TGG CAG ACG CGT TCC CAT GCG GCT CGT GTG ATC ATC 537
Gin Ala Arg Val Trp Gin Thr Arg Ser His Ala Ala Arg Val Ile Ile
165 170 175
GCC Ala ACT Thr TGG ATG CTC TCT GGA CTG CTC Leu 185 ATG GTG CCC Pro TAC Tyr CCG Pro 190 GTG Val TAC Tyr 585
Trp Met 180 Leu Ser Gly Leu Met Val
ACC GCC GTA CAG CCC GCA GGA GGG GCC CGG GCG CTG CAG TGC GTG CAT 633
Thr Ala Val 195 Gin Pro Ala Gly Gly 200 Ala Arg Ala Leu Gin 205 Cys Val His
CGT TGG CCC AGT GCG CGT GTC CGC CAA ACC TGG TCG GTA CTG CTG CTC 681
Arg Trp 210 Pro Ser Ala Arg Val 215 Arg Gin Thr Trp Ser 220 Val Leu Leu Leu
CTG CTT TTG TTC TTC GTC CCA GGC GTG GTT ATG GCT GTG GCC TAC GGG 729
Leu 225 Leu Leu Phe Phe Val 230 Pro Gly Val Val Met 235 Ala Val Ala Tyr Gly 240
CTC ATC TCC CGC GAG CTC TAC TTA GGG CTT CGC TTC GAC GAG AAC AGC 777
Leu Ile Ser Arg Glu 245 Leu Tyr Leu Gly Leu 250 Arg Phe Asp Glu Asp 255 Ser
GAC AGC GAA AGC CGA GTC CGA AGC CAA GGA GGG CTG CGG GGT GGG GCG 825
Asp Ser Glu Ser 260 Arg Val Arg Ser Gin 265 Gly Gly Leu Arg Gly 270 Gly Ala
GGA CCA GGT CCT GCC CCC CCC AAT GGG AGT TGC CGG CCG GAG GGC GGG 873
Gly Pro Gly 275 Pro Ala Pro Pro Asn 280 Gly Ser Cys Arg Pro 285 Glu Gly Gly
CTG GCT GGC GAG GAC GGC GAC GGC TGC TAC GTG CAG CTT CCG CGC TCG 921
Leu Ala 290 Gly Glu Asp Gly Asp 295 Gly Cys Tyr Val Gin 300 Leu Pro Arg Ser
CGT CAG ACC CTG GAG CTG TCC GCG CTG ACC GCG CCC ACT CCT GGG CCC 969
Arg 305 Gin Thr Leu Glu Leu 310 Ser Ala Leu Thr Ala 315 Pro Thr Pro Gly Pro 320
GGA GGT GGC CCC CGG CCC TAC CAG GCC AAG CTG TTG GCC AAG AAG CGC 1017
Gly Gly Gly Pro Arg 325 Pro Tyr Gin Ala Lys 330 Leu Leu Ala Lys Lys 335 Arg
GTG GTG CGG ATG CTG CTG GTG ATC GTC GTG CTT TTT TTC CTG TGT TGG 1065
Val Val Arg Met 340 Leu Leu Val Ile Val 345 Val Leu Phe Phe Leu 350 Cys Trp
TTG CCA CTG TAT AGT GCC AAC ACG TGG CGT GCC TTC GAC AGC TCT GGT 1113
Leu Pro Leu 355 Tyr Ser Ala Asn Thr 360 Trp Arg Ala Phe Asp 365 Ser Ser Gly
GCA CAC CGC GCA CTT TCA GGA GCG CCA ATC TCT TTC ATC CAC TTG CTG 1161
Ala His 370 Arg Ala Leu Ser Gly 375 Ala Pro Ile Ser Phe 380 Ile His Leu Leu
AGC Ser 385 TAC Tyr GCC Ala TCA GCC TGC GTC AAC Asn CCC Pro CTG Leu GTC Val 395 TAC Tyr TGC Cys TTC Phe ATG Met CAC His 400 1209
Ser Ala Cys 390 Val
CGT CGC TTC CGC CAG GCC TGC CTT GAG ACG TGT GCC CGC TGC TGC CCC 1257
Arg Arg Phe Arg Gin Ala Cys Leu Glu Thr Cys Ala Arg Cys Cys Pro
405 410 415
AGG CCT CCA CGA GCT CGC CCC CGG CCC CTT CCA GAC GAG GAC CCT CCC 1305
Arg Pro Pro Arg Ala Arg Pro Arg Pro Leu Pro Asp Glu Asp Pro Pro
420 425 430
ACC CCT TCC ATT GCT TCA CTG TCC AGA CTG AGC TAC ACC ACC ATC AGC 1353
Thr Pro Ser Ile Ala Ser Leu Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr Ile Ser
435 440 445
ACG CTA GGG CCT GGC TGAGGGGTA GGGGGAGAGT GGAGGCTGA GACGGGACA 1405
Thr Leu Gly Pro Gly
450
CACCCATTC CTACAGGCA GGGACCCAC CCAGACAC 1440 (2) Informace o sekvenci s identifikačním číslem: 2' (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 66
(B) Typ: nukleová kyselina
(C) V1 ákno ’ dvoj i té
(D) Topologie: 1 i neárni
(xi) Popis sekvence s identifikačním číslem:
GGG Gly 1 CGT Arg TGC CGG CCT GAG ACT GGC GCG GTT GGC GAA GAC AGC GAT GGC 48
Cys Arg Pro 5 Glu Thr Gly Ala Val 10 Gly Glu Asp Ser Asp Gly 15
TGC TAC GTG CAA CTT CCA 66
Cys Tyr Val Gin Leu Pro
20
Informace o sekvenci s identifikačním číslem 3= (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22
(B) Typ: am i nokyse1 i nová
( C) (D) Vlákno = Topologhie = 1ineární
(xi) Popis sekvence v : SEKV ID Č= 3:
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
Gly Ser Cys Arg Pro Glu Gly Gly Leu Ala Gly Glu Asp Gly Asp Gly 15 10 15
Cys Tyr Val Gin Leu Pro 20 (3) Informace o sekvenci identifikačního čísla: 4’ ( i) Charakteristika sekvence'· (A) Délka: 1356 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: dvojité (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence v: SEKV ID Č = 4:
ATG Met 1 GAG Glu CTG Leu CTA Leu AAG Lys 5 CTG Leu AAC Asn CGG Arg AGC GTG CAG Gin GGA Gly ACC Thr GGA Gly CCC Pro 15 GGG Gly 48
Ser Val 10
CCG GGG GCT TCC CTG TGC CGC CCG GGG GCG CCT CTC CTC AAC AGC AGC 96
Pro Gly Ala Ser 20 Leu Cys Arg Pro Gly 25 Ala Pro Leu Leu Asn 30 Ser Ser
AGT GTG GGC AAC CTC AGC TGC GAG CCC CCT CGC ATT CGC GGA GCC GGG 144
Ser Val Gly 35 Asn Leu Ser Cys Glu 40 Pro Pro Arg Ile Arg 45 Gly Ala Gly
ACA CGA GAA TTG GAG CTG GCC ATT AGA ATC ACT CTT TAC GCA GTG ATC 192
Thr Arg 50 Glu Leu Glu Leu Ala 55 Ile Arg Ile Thr Leu 60 Tyr Ala Val Ile
TTC CTG ATG AGC GTT GGA GGA AAT ATG CTC ATC ATC GTG GTC CTG GGA 240
Phe 65 Leu Met Ser Val Gly 70 Gly Asn Met Leu Ile 75 Ile Val Val Leu Gly 80
CTG AGC CGC CGC CTG AGG ACT GTC ACC AAT GCC TTC CTC CTC TCA CTG 288
Leu Ser Arg Arg Leu 85 Arg Thr Val Thr Asn 90 Ala Phe Leu Leu Ser 95 Leu
GCA GTC AGC GAC CTC CTG CTG GCT GTG GCT TGC ATG CCC TTC ACC CTC 336
Ala Val Ser Asp 100 Leu Leu Leu Ala Val 105 Ala Cys Met Pro Phe 110 Thr Leu
CTG CCC AAT CTC ATG GGC ACA TTC ATC TTT GGC ACC GTC ATC TGC AAG 384
Leu Pro Asn 115 Leu Met Gly Thr Phe 120 Ile Phe Gly Thr Val 125 Ile Cys Lys
GCG GTT TCC TAC CTC ATG GGG GTG TCT GTG AGT GTG TCC ACG CTA AGC 432
Ala Val 130 Ser Tyr Leu Met Gly 135 Val Ser Val Ser Val 140 Ser Thr Leu Ser
CTC Leu 145 GTG Val GCC Ala ATC Ile GCA Ala CTG Leu 150 GAG Glu CGG Arg TAC Tyr AGC Ser GCC Ala 155 ATC Ile TGC Cys CGA Arg CCA Pro CTG Leu 160 480
CAG GCA CGA GTG TGG CAG ACG CGC TCC CAC GCG GCT CGC GTG ATT GTA 528
Gin Ala Arg Val Trp 165 Gin Thr Arg Ser His 170 Ala Ala Arg Val Ile 175 Val
GCC ACG TGG CTG CTG TCC GGA CTA CTC ATG GTG CCC TAC CCC GTG TAC 576
Ala Thr Trp Leu 180 Leu Ser Gly Leu Leu 185 Met Val Pro Tyr Pro 190 Val Tyr
ACT GTC GTG CAA CCA GTG GGG CCT CGT GTG CTG CAG TGC GTG CAT His CGC Arg
Thr Val Val 195 Gin Pro Val Gly Pro Arg 200 Val Leu Gin Cys 205 Val
TGG CCC AGT GCG CGG GTC CGC CAG ACC TGG TCC GTA CTG CTG CTT CTG
Trp Pro Ser Ala Arg Val Arg Gin Thr Trp Ser Val Leu Leu Leu Leu
210 215 220
CTC TTG TTC TTC ATC CCG GGT GTG GTT ATG GCC GTG GCC TAC GGG CTT
Leu Leu Phe Phe Ile Pro Gly Val Val Met Ala Val Ala Tyr Gly Leu
225 230 235 240
ATC TCT CGC GAG CTC TAC TTA GGG CTT CGC TTT GAC GGC GAC AGT GAC
Ile Ser Arg Glu Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Asp Gly Asp Ser Asp
245 250 255
AGC GAC AGC CAA AGC AGG GTC CGA AAC CAA GGC GGG CTG CCA GGG GCT
Ser Asp Ser Gin Ser Arg Val Arg Asn Gin Gly Gly Leu Pro Gly Ala
260 265 270
GTT CAC CAG AAC GGG CGT TGC CGG CCT GAG ACT GGC GCG GTT GGC GAA
Val His Gin Asn Gly Arg Cys Arg Pro Glu Thr Gly Ala Val Gly Glu
275 280 285
GAC AGC GAT GGC TGC TAC GTG CAA CTT CCA CGT TCC CGG CCT GCC CTG
Asp Ser Asp Gly Cys Tyr Val Gin Leu Pro Arg Ser Arg Pro Ala Leu
290 295 300
GAG CTG ACG GCG CTG ACG GCT CCT GGG CCG GGA TCC GGC TCC CGG CCC
Glu Leu Thr Ala Leu Thr Ala Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ser Arg Pro
305 310 315 320
ACC CAG GCC AAG CTG CTG GCT AAG AAG CGC GTG GTG CGA ATG TTG CTG
Thr Gin Ala Lys Leu Leu Ala Lys Lys Arg Val Val Arg Met Leu Leu
325 330 335
GTG ATC GTT val GTG CTT TTT Phe TTT Phe CTG Leu TGT TGG TTG CCA GTT TAT AGT GCC Ala
Val Ile Val 340 Leu Cys 345 Trp Leu Pro Val Tyr 350 Ser
AAC ACG TGG CGC GCC TTT GAT GGC CCG GGT GCA CAC CGA GCA CTC TCG
Asn Thr Trp Arg Ala Phe Asp Gly Pro Gly Ala His Arg Ala Leu Ser
355 360 365
GGT GCT CCT ATC TCC TTC ATT CAC TTG CTG AGC TAC GCC TCG GCC TGT
Gly Ala Pro Ile Ser Phe Ile His Leu Leu Ser Tyr Ala Ser Ala Cys
370 375 380
GTC AAC CCC CTG GTC TAC TGC TTC ATG CAC CGT CGC TTT CGC CAG GCC
Val Asn Pro Leu Val Tyr Cys Phe Met His Arg Arg Phe Arg Gin Ala
385 390 395 400
TGC CTG GAA ACT TGC GCT CGC TGC TGC CCC CGG CCT CCA CGA GCT CGC
Cys Leu Glu Thr Cys Ala Arg Cys Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Arg
405 410 415
CCC AGG GCT CTT CCC GAT GAG GAC CCT CCC ACT CCC TCC ATT GCT TCG
Pro Arg Ala Leu Pro Asp Glu Asp Pro Pro Thr Pro Ser Ile Ala Ser
420 425 430
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296
CTG Leu TCC Ser AGG Arg 435 CTT Leu AGC Ser TAC Tyr ACC Thr ACC Thr 440 ATC Ile AGC Ser
GGA GTA 450 GAG GGG
ACA CTG GGC CCT GGC TGA 1344
Thr Leu Gly Pro Gly
445
1356
L <
r— 73 £> Cí </) ο
Σ >
ο (— &
< £
-λ <ζ>
NJ
Γ**’ <Χ3
CO ο
ο

Claims (32)

  1. oPinTEBTOVE NÁROKY
    1. Přečištěná nukleová kyselina kódující člena rodiny savčích receptorů gastrinu/cho1ecystokininu B (CCK-B) nebo jeho fragment či analog.
  2. 2. Nukleová kyselina podle nároku 1, vyznačující se tím, še zmíněný člen je receptor gastrinu.
  3. 3. Nukleová kyselina podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněný člen je receptor CCK-B.
  4. 4 . Přečištěná nukleová kyselina podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněný člen leží na povrchu parietálních buněk, mozkových buněk nebo buněk hladkého svalstva.
  5. 5. Přečištěná nukleová kyselina podle nároku 4, vyznačující se tím, že zmíněné buňky jsou psí buňky.
  6. 6. Přečištěná nukleová kyselina podle nároku 4, vyznačující se tím, še zrn i něné buňky j sou 1 i dské buňky.
  7. 7. Homogenní populace buněk, vyznačující se tím, še každá ze zmíněných buněk obsahuje klonovanou nukleovou kysel inu kódující člena rodiny savčích receptorů gastrinu/CCK-B.
  8. 8. Homogenní populace buněk podle nároku 7, vyznačující se tím, še zmíněné buňky exprimují biologicky aktivní polypeptid z rodiny receptorů gastrinu/CCK-B.
  9. 9. Homogenní populace buněk podle nároku 7, vyznačující se tím, še zmíněné buňky jsou eukaryotické buňky.
  10. 10. Homogenní populace buněk podle nároku 9, vyznačující se tím, še zmíněné buňky jsou buňky COS-7.
    ίί· Vpodstatě čistý polypeptidový receptor gastrinu připravený s pomocí nukleové kyseliny podle nároku 1.
  11. 12. Polypeptid podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněný polypeptidový receptor gastrinu má sled aminokyselin vpodstatě shodný se sledem aainokyselin 1 až 453 sekvence uvedené v SEKV ID Č:1:
    ! 60
    MELLKLNRSAQGSGAGPGASLCRAGGALLNSSGAGNLSCEPPRLRGAGTRELELAIRVTL
    61 120
    YAVIFLMSVGGNVLIIWLGLSRRLRTVTNAFLLSLAVSDLLLAVACMPFTLLPNLMGTF
    121
    180
    IFGTWCKAVSYLMGVSVSVSTLSLVAIALERYSAICRPLQARVWQTRSHAARVIIATWM
    181 240
    LSGLLMVPYPVYTAVQPAGGARALQCVHRWPSARVROTWSVLLLLLLFFVPGWMAVAYG
    241
    300
    LISRELYLGLRFDEDSDSESRVRSQGGLRGGAGPGPAPPNGSCRPEGGLAGEDGDGCYVQ
    301
    360
    LPRSRQTLELSALTAPTPGPGGGPRPYQAKLLAKKRWRMLLVIWLFFLCWLPLYSANT
    361
    420
    WRAFDSSGAHRALSGAPISFIHLLSYASACVNPLVYCFMHRRFRQACLETCARCCPRPPR
    421 453
    ARPRPLPDEDPPTPSIASLSRLSYTTISTLGPG
    Polypeptid podle nároku 11, vyznačující se zdánlivá molekulová hmotnost zmíněného (je-li glykosylován) je asi 76 000 dal tonu.
    tím, že polypept idu
    Polypept id polypept id podle nároku 11, není glykosylováný.
    vyznačuj ící se tím, že
    Polypeptid podle nároku 11, polypeptid je gIykosylováný.
    vyznačující se tím, že
  12. 16. Polypeptid podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněný polypeptid je exprimován lidskými buňkami.
  13. 17. Polypeptid podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněný polypeptid je exprimován lidskými parietálními buňkami, mozkovými buňkami nebo buňkami hladkého svalstva.
  14. 18. Vpodstatě čistý po1ypeptidový receptor CCK-B připravený s pomocí nukleové kyseliny podle nároku 1.
  15. 19. Polypeptid podle nároku 18, vyznačující se tím, že zmíněný po1ypeptidový receptor CCK-B má sled aminokyselin vpodstatě shodný se sledem aminokyselin 1 až 447 sekvence uvedené v SEKV ID Č: 4! 60 MELLKLNRSVQGTGPGPGASLCRPGAPLLNSSSVGNLSCEPPRIRGAGTRELELAXRTL
    61 120
    YAVIFLMSVGGNMLIIWLGLSRRLRTVTNAFLLSLAVSDLLLAVACMPFTLLPNLMGTF
    121 1θ0
    IFGTVICKAVSYLMGVSVSVSTLSLVAIALERYSAICRPLQARVWQTRSHAARVIVATWL
    131 240
    LSGLLMVPYPVYTWQPVGPRVLQCVHRWPSARVRQTWSVLLLLLLFFIPGWMAVAYGL
    241 300
    ISRELYLGLRFDGDSDSDSQSRVRNQGGLPGAVHQNGRCRPETGAVGEDSDGCYVQLPRS
    301 360
    RPALELTALTAPGPGSGSRPTQAKLLAKXRWRMLLVXWLFFLCWLPVYSANTWRAFDG
    361 420
    PGAHRALSGAPISFIHLLSYASACVNPLVYCFMHRRFRQACLETCARCCPRPPRARPRAL
    421 447
    PDEDPPTPSIASLSRLSYTTISTLGPG
  16. 20. Polypeptid podle nároku 18, vyznačující se tím, že zmíněný polypeptid je glykosylováný.
  17. 21 .
  18. 22.
  19. 23.
  20. 24.
  21. 25.
  22. 26.
  23. 27.
  24. 28.
  25. 29.
  26. 30.
    Polypeptid podle nároku 18. vyznačující se tím, še zmíněný polypeptid není glykosylovaný,
    Polypeptid podle nároku 18, vyznačující se tím, že zmíněný polypeptid je exprimován lidskými buňkami.
    Polypeptid podle nároku 18, vyznačující se tím, še zmíněný polypeptid je exprimován lidskými parietálními buňkami, mozkovými buňkami anebo buňkami hladkého svalstva.
    Expresivní knihovna cDNA parietálních buněk.
    Knihovna podle nároku 24, vyznačující se tím, še segmenty cDNA zmíněné knihovny jsou odvozeny s psích parietálních buněk.
    Knihovna podle nároku 24, vyznačující se tím, še segmenty cDNA zmíněné knihovny jsou odvozeny z buněk obsahujících lidské parietální buňky anebo lidské hlavní buňky.
    Knihovna podle nároku 24, vyznačující se tím, še expresivní vektor používaný ve zmíněné knihovně cDNA má začátek replikace SV40.
    Knihovna podle nároku 24, vyznačující se tím, že expresivní vektor používaný ve zmíněné knihovně má cytomegalovirový (CMV) promotor.
    Kn i hovna pod1e knihovna cDNA který zahrnuje nároku 24, vyznačující se tím, že zmíněná je konstruována s expresivním vektorem, pcDNA-1, AgtlO nebo \gtll.
    Metoda na i zo1ac i nukleových kyše 1 i n kóduj í cí ch polypeptidy, které jsou v parientálních buňkách včetně hodnocení expresivní knihovny cDNA podle nároku 24.
  27. 31. Metoda podle nároku 30, vyznačující se tím, Se zmíněné nukleové kyseliny kódují receptor prostaglandinu E2 (PGEs>.
  28. 32. Metoda na identifikaci antagonisty člena rodiny savčích receptorů gastrinu/CCK-B, vyznačující se tím, še zahrnuje dodání agonisty člena rodiny receptorů gastrinu/CCK-B do kultivovaných buněk, transfektovaných přečištěnou nukleovou kyselinou podle nároku 1, v přítomnosti kandidáta na antagonistu a stanovení schopnosti zmíněného kandidáta na antagonistu buď a) bránit vazbě zmíněného agonisty na zmíněný člen nebo b) blokovat vzrůst volného cytosolového vápníku indukovaný agonistou nebo c) blokovat aktivaci fosfolipasy C indukovanou agonistou nebo d) blokovat aktivaci adenylát cyklasy Indukovanou agonistou což je indikací antagonistické aktivity
    33. Metoda podle nároku 32, vyznačuj ící se tím, že zmíněný agonista je gastrin. 34. Metoda podle nároku 32, vyznačuj ící se tím, že zmíněný agonista je cholecystokinin (CCK). 35. Metoda podle nároku 34, vyznačuj ící se tím, že zra í něný
    agonista obsahuje CCK-8s, CCK-8d, CCK-4 nebo pentagastrin (CCK-5).
  29. 36. Bakteriální buňka transfektovaná přečištěnou nukleovou kyselinou podle nároku 2, uložená v ATTC a označená č.
    75195.
  30. 37. Bakteriální buňka transfektované přečištěnou nukleovou kyselinou podle nároku 3, uložená v ATTC a označená č. 75196.
  31. 38. Bakteriální buňka transfektované přečištěnou nukleovou kyselinou podle nároku 3, uložená v ATCC a označená č. 75303.
  32. 39. Antagonista člena rodiny savčích receptorů gastrinu/CCK-B identifikovaný metodou podle nároku 32.
CZ93113A 1992-02-07 1993-01-29 GASTRIN AND CCK-B RECEPTORS ENCODING cDNA CZ11393A3 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83284192A 1992-02-07 1992-02-07
US94137392A 1992-09-03 1992-09-03
US07/978,892 US5541071A (en) 1992-02-07 1992-11-12 Assay for identifying antagonists of gastrin and CCK-B receptors
CA002088878A CA2088878A1 (en) 1992-02-07 1993-02-05 Cdnas encoding the gastrin and cck-b receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ11393A3 true CZ11393A3 (en) 1994-01-19

Family

ID=27427008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ93113A CZ11393A3 (en) 1992-02-07 1993-01-29 GASTRIN AND CCK-B RECEPTORS ENCODING cDNA

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0561496A2 (cs)
JP (1) JPH06339380A (cs)
AU (1) AU665601B2 (cs)
CA (1) CA2088878A1 (cs)
CZ (1) CZ11393A3 (cs)
HU (1) HUT69777A (cs)
NZ (1) NZ245771A (cs)
SK (1) SK5393A3 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3459497A (en) * 1996-07-12 1998-02-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer cell proliferation inhibitors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUT65846A (en) * 1990-07-10 1994-07-28 Boehringer Ingelheim Int Method for preparation of o-glycosylated alpha-interferons and medicinal drugs containing it
AU1707892A (en) * 1991-05-22 1993-03-11 Ludwig Institute For Cancer Research Gastrin-binding protein
WO1992020814A1 (en) * 1991-05-22 1992-11-26 Ludwig Institute For Cancer Research Gastrin-binding protein
US5424413A (en) * 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes

Also Published As

Publication number Publication date
HUT69777A (en) 1995-09-28
JPH06339380A (ja) 1994-12-13
EP0561496A3 (cs) 1994-01-05
NZ245771A (en) 1994-08-26
SK5393A3 (en) 1994-01-12
HU9300302D0 (en) 1993-04-28
AU3212393A (en) 1993-08-12
EP0561496A2 (en) 1993-09-22
CA2088878A1 (en) 1994-08-06
AU665601B2 (en) 1996-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kopin et al. Expression cloning and characterization of the canine parietal cell gastrin receptor.
Feng et al. Functional characterization of a neuropeptide F‐like receptor from Drosophila melanogaster
O'Dowd et al. The cloning and chromosomal mapping of two novel human opioid-somatostatin-like receptor genes, GPR7 and GPR8, expressed in discrete areas of the brain
US5885794A (en) Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
Hudson et al. Identification of a nonneuronal isoform of synaptotagmin.
US20050186593A1 (en) Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
JP2002514055A (ja) ガラニンｇａｌｒ３受容体をコードするｄｎａおよびその使用
JPH10262687A (ja) 新規ヒト１１ｃｂスプライス変種
JP2001526064A (ja) 新規なｇ蛋白質カップリング受容体
US5892004A (en) Method for preparing PACAP receptor protein
JPH04506752A (ja) チロトロピンレセプター活性を有するポリペプチド、このレセプターとポリペプチドとをコードする核酸、そしてこのようなペプチドの利用
CA2224096A1 (en) The g-protein coupled receptor hfia041
US20040152875A1 (en) Novel purinergic receptor
US5541071A (en) Assay for identifying antagonists of gastrin and CCK-B receptors
EP0757716B1 (en) Dna encoding bradykinin b1 receptor
EP1017811A1 (en) G-protein coupled glycoprotein hormone receptor hg38
CA2482810C (en) Teneurin c-terminal associated peptides (tcap) and methods and uses thereof
US7074594B2 (en) Guanosine triphosphate (GTP) binding protein-coupled receptor proteins
AU782848B2 (en) DNA encoding SNORF62 and SNORF72 receptors
Schmitz et al. Identification of cholecystokinin-B/gastrin receptor domains that confer high gastrin affinity: utilization of a novel Xenopus laevis cholecystokinin receptor.
US5288621A (en) Pituitary TRH receptor
US6432652B1 (en) Methods of screening modulators of opioid receptor activity
CZ11393A3 (en) GASTRIN AND CCK-B RECEPTORS ENCODING cDNA
US6576742B1 (en) DNA sequence encoding a human imidazoline receptor and method for cloning the same
AU782897B2 (en) Compounds related to or derived from GFRalpha4 and their use