SK5393A3 - Cdnas encoding the gastrin and cck-b receptors - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa uskutočnil s vládnou podporou poskytnutou pod č. DK01934, č. p30DK39428 a č. DK32878 Národnými ústavmi zdravia. Vláda má zakotvené isté práva v tomto vynáleze.

Vynález ša týka rodiny receptorov gastrínu/cholecystokinínu (CCK-B).

Doterajší stav techniky

Gastrín je peptidový hormón so 17timi aminokyselinami produkovaný žalúdočnými antrálnymi G bunkami. Hlavným fyziologickým účinkom tohoto hormónu je stimulácia parientálnych buniek žalúdka tak, .aby vylučovali kyselinu chlorovodíkovú. Gastrín je tiež trofický hormón, ktorý moduluj e rast a diferenciáciu žalúdočnej sliznice ako aj sliznice tenkého a tlstého čreva počas normálneho vývinu (Johnson, L. R., 1987,

Physiology of the Gastrointestinal Tract, Raven Press, N.Y.) a pri istých patologických stavoch (napr. Zollinger-Ellisonovom syndróme, karcinóme žalúdka, zhubnej anémii). Fyziologické účinky tohoto peptidu sa spúšťajú naviazaním na jeho plazmalémový receptor, ktorý bol pokusne identifikovaný afinitným značením ako bielkovina so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 74 000 daltonov (Baldwin, G. S., 1986, J. Biol. Chem. 261: 12252-7, Matsumoto, M. et al. 1987, J. Am. Physiol. 252: G143-G147). Agonistická gastrínu má za následok hydrolýzu zvýšenie koncentrácie intracelulárneho stimulácia receptorov fosfatidylinozitolu a vápnika (Muallem, S. a Sachs, G 805: 181-185, Chew, C. S., a

Biophys. Acta 888: 116-125) viažúcimi guanínnukleotid (G-proteínmi) (Roche, S. et al., 1990, Biochem. Biophys. Acta 1055: 287-294). Gastrín, cholecystokinín . 1984, Biochem. Biophys. Acta

Brown, M. R., 1986, Biochem. sprostredkované bielkovinám!

Receptory na bunkách a peptidy príbuzné CCK tvoria rodinu hormónov, ktorá je charakterizovaná rovnakou štruktúrou C-koncového pentapeptidamidu, čo je doména s kritickým významom pre väzbu na receptor.

Cielové receptory príslušné k tejto rodine hormónov sa dajú zaradiť: do dvoch hlavných tried, a to receptory typu CCK-A a receptory typu CCK-B, podlá ich agonistickej alebo antagonistickej špecifity (Miller, L. J., 1991, v CCK Antagonists in Gastroenterology, Springer-Verlag, Berlín, str. 27-34 ). Periférny alebo zažívací receptor (CCK-A), ktorý je pankrease, žlčníku a niektorých modzgových jadrách, má tisíc raž vyššiu afinitu k sulfátovanému CCK-8 ako ku gastrínu.

CCK-B/gastrínu sa nachádzajú v modzgu (CCK-B), hladkého svalstva a na parientálnych bunkách (gastrínové receptory. Väzobné štúdie s modzgovými membránami a s parientálnymi bunkami v ktorých sa porovnávali relatívne afinity k agonistom ukazujú na 6-10krát resp. l-2krát vyššiu afinitu pre CCK ako pre gastrín (Jensen, R. T. et al. v Gastrointestinal Endocrinology: Receptors and Post-Receptor Mechanisíns, Harcourt Brače Jovanovich, San Diego, str. 95). Centrálne miesta receptorov CCK (CCK-B) vykazujú vysokú aktivitu pre sulfátovaný oktapeptidový fragment (CCK-3s), desulfátovaný oktapeptidový fragment (CCK-3d), gastrín, CCK-4 (C-koncový tetrapeptid CCK) a pentagastrín (CCK-5) a podobajú sa receptorom gastrínu svojou agonistickou selektivitou. Receptory CCK-B môžu mat svoju úlohu pri stavoch stiesnenosti, pri modulácii bolesti, pamäti, pocitu sýtosti a v panikových poruchách. CCK je najčastejší neuropeptid a CCK-B je najčastejší podtyp receptora vyskytujúceho sa v modzgu (CCK-B >>> CCK-A).

Podstata vynálezu

Podstaou vynálezu obecne je prečistená nukleová kyselina kódujúca jeden z rodiny cicavčích receptorov gastrínu/ cholecystokininínu (CCK-B) lebo jeho fragment lebo analóg. Pod pojmom rodina cicavčích receptorov gastrínu/ cholecystokininínu B sa rozumejú polypeptidy cicavčieho pôvodu, ktoré obecne vykazujú 60%nú, lebo lepšie 80%nú, ešte lepšie 90%nú lebo najlepšie 95%nú či dokonca 99%nú sekvenčnú homolóogiu s prírodným cicavčím receptorom gastrínu/CCK-B (ako je znázornené v obr.l: sekvenčné identifikačné číslo SEKV ID Č:2). S výhodou nukleová kyselina kóduje receptor gastrínu, nukleová kyselina kóduje receptor CCK-8, člen rodiny receptorov gastrínu/CCK-8 je na povrchu parietálnych buniek, modzgových buniek, imunologických buniek, enterochromovým bunkám podobných buniek (ECL), nádorových buniek, napr. buniek rakoviny tlstého čreva, malých buniek karcinómu plúc lebo leiomyomu, lebo buniek hladkého svalstva, najlepšie keď sú tieto bunky z psích tkání alebo ešte lepšie kečf sú to ludské bunky.

Vynález sa tyká aj homogénnej populácie buniek v ktorej každá z buniek obsahuje naklónovanú nukleoví! kyselinu kódujúcu jeden z členov rodiny receptorov gastrinu/CCK-B. Bakteriálne bunky transfekované prečistenou nukleovou kyselinou kódujúcou receptor gastrínu sú uložené v ATCC a označené čís. 75195. Dva klóny bakteriálnych buniek transfekovaných prečistenou nukleovou kyselinou kódujúcou časť (HBR-1) lebo cely (hCCKB, FBCR-4) receptor CCK-B sú uložené v ATCC a označené čís. 75196, resp. 75303. Bunky podlá tohoto vynálezu obsahujúce nukleovú kyselinu môžu najlepšie exprimovat biologicky aktívny polypeptid z rodiny receptorov gastrínu/CCK-8. Bunky môžu byť aj eukaryotické bunky, napr. COS-7 lebo bunky vaječníku čínskeho škrečka (CHO).

Súčastou vynálezu podlá tejto prihôášky je naviac v podstate čistý polypeptid, receptor gastrínu, produkovaný nukleovou kyselinou kódujúcou jeden z členov rodiny receptorov gastrínu/ CCK-B lebo jeho fragment či analog. V preferovaných príkladoch je receptor gastrínu polypeptid obsahujúci sled aminokyselín v podstate identický s aminokyselinami vo slede SEKV ID Č:l:

130

GTWCXAVSYL«GVSVSVSTLSI,7A:A£.íRYSAÍCaPlQARW<2?RSHAARVirATWH

131

LjGLLMVRYPVYTÄVQRAGGARALQCVriRWPSARVRCTWSVLl

240 'VRGWKAVAYG

300 llSRELYlGlREOEaSOSESRVRSQGGLRGGAGPGPAPRNGSCRRSGGlAG&OGOGCYVQ

301

LPRSRQtLELSAiXÄPTPGPGCGPRRYQÄXLLÄXXRVVRMLLVITVL

260 ’LCWLPLYSANT

361

WRAEOSSGAHRALSGAP1S

420

S'íA5AC’/N?lVÍC“HHRRERQACLEtG.ARCC?R??R

A?.?R?£?C£D??T?sr.ASGSRLSY:S~lG?G.

V iných preferovaných príkladoch je zdánlivá molekulová hmotnosť glykozylovaného polypeptidu zhruba 76 000 daltonov, polypeptid je glykozylovaný lebo neglykozylovaný a polypeptid je exprimovaný ludskými bunkami, napr. ludskými parietálnymi bunkami, modzgovými bunkami, bunkami hladkého svalstva, imunologickými bunkami, ECL bunkami či nádorovými bunkami.

Tento vynález takisto zahrnuje v podstate čistý pclypeptidový receptor CCK-3 produkovaný nukleovou kyselinou kódujúcou jeden z členov rodiny cicavčích receptorov gastrínu/ CCK-B lebo jeho fragment či analóg. Polypetidový receptor CCK-B môže obsahovať sled aminokyselín v podstate identický s aminokyselinami 1 až 447 v slede uvedenom pod SEKV ID Č: 4

YAVI

120

M.SVGGNMLriWI.GCSRRraarrrjrÄELLSZAVSDLLLA.VXCMPmiSiniiSGTF rao

- 5 L31 240

L5GL-.HV?Y?\_l'Y7'.VQPVG?RV7QCVH?.W?SA?'.'?.Q7rtS'.^rLLLLLL773?GWXAVAYGL

ZSRíLYZ.GLRíGGCSCSDSQSRVRNQGGZ.RGÄVHQNGnCR?

R ? A L ϊ í. 7 AT. 7 A ? G ? G S G S R ? 7 Q A37. L A XXR V.’RHT - '·' 3 '.V7.

PGAHRATSGA? 33 HTT3YASÄG'.’N?T7YG7“K?.?.?RQAG:

300 ‘GAVGSCSOGCYVQLPRS

360 'L GWLRVY S ANTWRAF 7G

420

G .A?. C G ? R ? ? ?_AR ? R.AT ?7ľT??7?S3AS7SRT5Y773577G?G.

Polypeptid CCK-8 môže byť glykozylovaný lebo neglykozylovaný a exprimovaný iudskými bunkami, napr. ludskými parietálnymi bunkami, iudskými modzgovými bunkami lebo iudskými bunkami hladkého svalstva.

V inom ohiade postup podlá tohoto vynálezu obsahuje knižnicu cDNA expresie parietálnych buniek. Segmenty cDNA tejto knižnice sú najlepšie odvodené od psích parietálnych buniek, ludských parietálnych buniek lebo hlavných ludských buniek. Vektor expresie používaný v tejto knižnici cDNA môže obsahovať-jednu lebo viacero z týchto zložiek: počiatok replikácie SV40 lebo cytomegalovírusový (CMV) promótor. Ešte lepšie je konštruovať knižnicu cDNA s vektorom expresie obsahujúcim pcDNA-1 lebo lambda gtll.

Postupom pódia tohoto vynálezu je aj metóda na izoláciu nukleových kyselín kódujúcich polypeptidy prítomné v parietálnych bunkách vyznačujúca sa vyhodnocovaním knižnice cDNA expresie s cielom nájsť izolovanú nukleovú kyselinu kódujúcu receptor prostaglandínu E₂ (PGE₂).

DNA kódujúca jeden receptor z rodiny cicavčích receptorov gastrínu/CCK-B pódia tohoto vynálezu je použitelná pre metódu na identifikáciu antagonisty tohoto člena rodiny. Metóda zahrnuje pridanie agonisty špecifického pre rodinu receptorov gastrínu/CCK-B ku kultivovaným bunkám, ktoré boli transfekované napr. cDNA GR-1 alebo cDNA CCK-B podlá tohoto vynálezu a stanovenie schopnosti tohoto potenciálneho antagonistu bud

a) brániť väzbe agonistu na gastrínový receptor alebo b) blokovať agonistom indukovaný vzrast volného vápnika [Ca^2_r] v cytozóle

- 6 alebo c) blokovať agonistom idukovanú aktiváciu fosfolipázy C alebo ď) blokovať agonistom idukovanú aktiváciu adenylát cyklázy a tak preukázať jeho antagonistickú aktivitu. Agonistom môže byť gastrín, napr. gastrín-17 lebo gastrín-34 (sulfátovaný lebo desulfátovaný) alebo agonistom môže byť cholecystokinín (CCK), lepšie CCK-8s, CCK-8d, CCK-4 alebo pentagastrín (CCK-5). Agonistu je tu treba chápať ako chemickú zlúčeninu schopnú spojiť sa s receptorom a iniciovať jeho aktivitu. Preferovaným príkladom podlá tohoto vynálezu je antagonist receptoru z rodiny cicavčích receptorov gastrínu/CCK-B identifikovaný podlá tejto metódy. Pod pojmom antagonista ako je tu používaný treba chápať chemickú zlúčeninu, ktorá inhibuje aktivitu receptoru, akou je jeho schopnosť viazať agonistu.

Pod pojmom glykozylovaný ako je tu používaný treba rozumieť bielkovinu s kovalentne naviazanou jednou cukornou zložkou lebo viacerými cukornými zložkami. Pod pojmom neglykozylovaný treba rozumieť neobsahujúci kovalentne naviazané cukorné zložky. Pod pojmom zdanlivá molekulová hmotnosť sa myslí molekulová molekulová hmotnosť stanovená v denaturačnom géle porovnaním so štandartami, napr.

s bielkovinovými štantartami so známou molekulovou hmotnosťou. Pod pojmom receptor sa tu myslí molekula na povrchu delovej bunky, ktorá viaže hormón, napr. gastrín alebo CCK.

V podstate čistý tu znamená preparát, napr. bielkovinový, ktorý je v podstate zbavený bielkovín, lipidov a ďalších prímesí s ktorými sa vyskytuje v prírode. Typicky je látka v podstate čistá ak najmenej 10%, lepšie najmenej 20%, ešte lepšie najmenej 50%, ešte lepšie najmenej 60%, ešte lepšie najmenej 75%, ešte lepšie najmenej 90%, a vôbec najlepšie najmenej 99% (počítané na hmotnosť, na suchú lebo vlhkú hmotnosť alebo na molárne percentá lebo molárny zlomok) je bielkovina o ktorú sa jedná. Čistota sa dá stanovovať vhodnou metódou, napr. stĺpcovou chromatografiou, elektroforézou v polyakrylamidovom géle alebo pomocou HPLC. Bielkovina je v podstate prečistená ak je zbavená svojich prirodzených prímesí, alebo ak je oddelená od natívnych hmotnosť sa myslí polyakrylamidovom znečistenín, ktoré ju doprevádzajú v prírode.

Pod pojmom v podstate identický sled aminokyselín sa tu myslí sled aminokyselín, ktorý sa odlišuje len konzervatívnymi zámenami aminokyselín, napr. zámenou jednej aminokyseliny aminokyselinou tej istej triedy (napr. aminokyselinou, ktorá má rovnaký hydrofóbny charakter, náboj, pK_a alebo dalšie rovnaké konformačné lebo chemické vlastnosti, ako je napr. zámena valínu za leucín, arginínu za lyzín atd.) alebo sled, ktorý sa odlišuje jednou lebo viac nekonzervatívnymi zámenami aminokyselín, deléciami alebo inzerciami v polohách sledu aminokyselín tak, že nezrušia biologickú aktivitu polypeptidu ako je popísané vyššie. Sled aminokyselín je zaradený do tohoto vynálezu ak sa odlišuje modifikáciou, ktorá zníži lebo pozmení jednu receptorovú aktivitu, ale nie daíšie. Tak napr. zmena, ktorá vedie k zmene aktivity vo väzbe ligandu ale nie k zmene v signálnej aktivite recptoru alebo naopak je zahrnutá do tohoto vynálezu.

Pod pojmom prečistená nukleová kyselina ako sa tu používa sa má chápať sled nuklovej kyseliny alebo jej fragmentov prečistený od sledov, ktoré ju obklopujú v prirodzenom stave, napr. fragment DNA, ktorý bol izolovaný od sekvencíi, ktoré k nemu priliehajú, napr. od sekvencií, ktoré ho obklopujú na jeho normálnom mieste v genóme. Termín sa vzťahuje aj na nukleové kyseliny, ktoré boli v podstate prečistené od iných zložiek, ktoré ich doprevádzajú v bunke.

Pod pojmom homologický ako sa používa tu sa má rozumieť podobnosť dvoch polypeptidových molekúl alebo dvoch molekúl nukleových kyselín. Ak je poloha v obidvoch porovnávaných sledoch obsadená tou istou monomérnou jednotkou, napr. ak je jedna poloha v obidvoch molekulách DNA obsadená adenínom, potom sú molekuly homologické v tejto polohe. Homológia dvoch sledov je funkciou počtov porovnatelných alebo homologických polôh spoločných obidvom sledom. Tak napr. ak 6 z 10 polôh v dvoch sledoch je zodpovedajúcich lebo homologických, potom sú sledy homologické zo 60 %. Napr. homológia dvoch sledov DNA, a to 3'ATTGCC 5'a 3' TATGGC 5' je 50 %.

- 8 Popis preferovaných príkladov podía vynálezu

Najprv sa podáva stručný popis obrázkov Obrázky

Obr. 1 znázorňuje sled aminokyselín receptoru gastrínu z psích parietálnych buniek (SEKV ID Č:l). Predpokládané transmembránové domény receptoru gastrínu sú podčiarknuté a označené rímskymi číslicami. Súhlasné miesta N-glykozylácie sú označené #. Potencálne miesta proteín kinázy C lebo kazeín kinázy II, ako boli predpovedané podía schém nájdených v Prosíte Database (Bairock, A., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 2241) sú označené *.

Obr. 2 znázorňuje primárnu štruktúru receptoru gastrínu z psích parietálnych buniek a priradenie známych receptorov naviazaných na G-proteín. Aminokyseliny označené tieňovaním sú identické v 2 z 3 receptorov. Vodorovné čiary nad sledmi znázorňujú transmembránové segmenty predpovedané podlá KKD algoritmu. Skratky: FC5, receptor neuropeptidu Y-Yl; hB2AR, íudský beta2 adrenergický receptor.

Obr. 3 je graf znázorňujúci účinok koncentrácie konkurenta na väzbu ¹²⁵I-CCK-3. Každý bod znázorňuje priemer z troch pokusov. Maximálna väzba v neprítomnosti konkurenta (100%) bola

5,2 ± 2,0 pM. Bunky, ktoré neboli transfekované nevykazovali vysýtitelnú väzbu.

Obr. 4 je autorádiograf ukazujúci afinitné značenie receptoru gastrínu z psích parietálnych buniek na transfekovaných bunkách COS-7 s použitím bifunkčnej chemickej krížovej väzby. Výsledky sú typické pre 4 podobné pokusy.

Obr. 5 je autorádiograf znázorňujúci analýzu Northern prenosu transkriptov receptoru gastrínu v mRNA izolovanej z psích tkáni. Poly(A)⁺ RNA bola nanesená takto:: pečeň 1,1 μg, parietálne bunky 0,3 μg, pankreas 0,5 μg, a kôra modzgová 1,0 μg. Transkript zodpovedajúci GR-1 je označený šípkou.

Obr. 6 je graf ukazujúci signál druhého messengeru v transfekovaných bunkách COS-7 po stimulácii gastrínom (1 μΜ).

A. Šípka znázorňuje pridanie gastrínu I. Údaje predstavujú 3 pokusy. B. Ins-1, 4, 5-P₃ merania (priemer ± štandartná chyba merania pre n = 1) v bunkách divokého typu a v bunkách transfekovaných.

Obr. 7 ukazuje sled nukleotidov cDNA receptoru gastrínu GR-1 (SEKV ID Č: 1).

Obr. 8 je znázornenie: A. 66 nukleotidov cDNA CCK-B (SEKV ID Č: 2); B. 22 aminokyselín predpovedaných z nukleotidového sledu na obr. 8A v porovnaniu so zodpopvedajúcim sledom aminokyselín odvodeným z cDNA GR-1 (aminokyseliny 281-302 v obr I., SEKV ID Č: 2, SEKV ID Č: 3).

Obr. 9 je znázornenie sledu nukleotidov cDNA hCCKB ludského receptoru CCK-B (SEKV ID Č: 4).

Obr. 10 ukazuje sled aminokyselín ludského receptoru CCK-B (SEKV ID Č: 4).

Obr. 11 ukazuje sled aminokyselín receptoru CCK-B z ludského modzgu a priradenie receptorov psieho gastrínu a potkanieho CCK-A. Aminokyseliny označené tieňovaním sú identické v najmenej 2 z 3 receptorov. Vodorovné čiarky nad sledmi znázorňujú transmembránové segmenty predpovedané podlá KKD algoritmu (Klein et al., 1985, Biochim. Biophys. Acta 815: 468-76). Číslovanie zodpovedá aminokyselinám v receptore CCK-B. Skratky: hCCK-B, ludský receptor CCK-B, dGASTRIN, psí receptor gastrínu, rCCK-A, potkaní receptor CCK-A.

Obr. 12 je autorádiograf znázorňujúci Northern prenos transkriptov receptoru CCK-B v mRNA izolovanej z ludských tkáni. Poly(A)⁺ RNA bola nanesená do každej dráhy ako je vyznačené. Transkript zodpovedajúci receptoru CCK-B je označený šípkou.

Obr. 6 je graf ukazujúci signál druhého messengeru v transfekovaných bunkách COS-7 exprimujúcich receptor ludského modzgového CCK-B. A. V bunkách COS-7 s prídavkom Fura-2 bola stanovená koncentrácia volného vápnika v cytozóle z pomerov emisií fluorescencie pri 340 a 380 nm (340/380 nm). Šipka znázorňuje pridanie CCK-8 (0,1 μΜ) lebo EGTA (2,5 mM) . Údaje predstavujú výsledky 3 pokusov. B. CCK-8 (0,1 μΜ) zvýšil hladiny

- 10 Ins-1, 4, 5-P₃ (priemer ± štandartná chyba merania pre n = 3) v bunkách COS-7 transfekovaných cDNA receptoru CCK-B od 1 8334 ± 119 do 8 302 ± 275 DPM / 10⁶ buniek (p < 0,001).

Obr. 14 je graf znázorňujúci účinok koncentrácie konkurenta na väzbu l^i-ccK-S na receptor CCK-B. Väzba ^²⁵I-CCK-8 na bunky COS-7 prechodne transfekované hCCK-B-pcDNAI je ukázaná v prítomnosti rastúcich koncentrácií: (A) CCK-8, gastrínu, CCK-4 a (B) L364,718 a L365,260. Každá z 3 - 5 pokusov. Netransfekované vysýtitelnú väzbu.

krivka znázorňuje priemer bunky nevykazovali žiadnu

Odvodenie uložených materiálov

Klóny plasmidov GR-1, HBR-1 a hCCK-B boli uložené v American Type Culture Collection (A. T. C. C.) v Rockville, MD, a sú prístupné pod týmito číslami: ATCC No. 75195, No. 75196 a No. 75303. Tieto uložené klóny dávajú tým, ktorí sú školení v obore [možnost] získať: materiály podlá tohoto vynálezu. Odvodenie uložených materiálov je popísané nižšie. Receptor gastrínu a receptor CCK-B produkované týmito uloženými materiálmi predstavujú príklady nie však obmedzenie tohoto vynálezu. Tí, ktorí majú bežnú zručnost v. obore môžu si lahko izolovat príslušné receptory a nukleové kyseliny, ktoré ich kódujú s použitím nižšie popísaných metód. Osoby určené prihlasovatelom, t. j. prezident a pracovníci New England Medical Center Hospital zodpovedajú za to, že nahradia tieto kultúry pokial by zhynuly pred uplynutím termínu vydania patentu a ďalej za to, že dajú ATCC zprávu o udelení takéhoto patentu s tým, že k tomuto dátumu budú uložené kultúry sprístupnené verejnosti. Do toho času budú uložené kultúry prístupné Komisárovi pre patenty za podmienok uvedených v 37 CFR ^s 1.14 a 35 USC ^s

112.

Podrobný popis

Nižšie uvedený postup sa použil na konštrukci knižnice expresie cDNA psích parietálnych buniek, na izoláciu génu gastrínového receptoru z psích parietálnych buniek a na overenie identity a biologickej aktivity výsledného rekombinantného klónu. Rekombinantný receptor bol izolovaný z knižnice vyprodukovanej z vysoko nabohateného preparátu parietálnych buniek. Analýza mRNA z izolovaných parietálnych buniek pomocou Northern prenosu ukazuje, že transkrip gastrínového receptoru (GR-1) je vysoko exprimovaný v týchto bunkách. Použili sa väzobné štúdie s agonistami a antagonistami, afinitné značenie a testovanie transdukcie signálu, aby sa dalo zistif, či biologická aktivita rekombinantného receptoru súhlasí s aktivitou nájdenou v natívnych parietálnych bunkách.

Naklónovaná cDNA gastrínového receptoru sa naopak použila na izoláciu cDNA íudského CCK-B a génu.

Konštrukcia knižnice expresie cDNA psích parietálnych buniek

Na izoláciu psích parietálnych buniek sa bunky enzymaticky dispergovali ako je popísané (Soli et al. , 1984, J. Clin. Invest. 73: 1434-47). Izolované bunky boli nabohatené vo vytrepávacom systéme Beckman XJ-10 a izolované pri 900 ot./min v rozmedzí rýchlosti toku 50 až 80 ml/min. Ďalšie nabohatenie na 95%nú čistotu stanovenú farbením podlá Papanicolaoua sa dosiahlo izopyknickou centrifugáciou v diskontinuálnom gradiente hustoty Percollu^.

RNA bola pripravená zo zhruba 1,5 x 10⁸ parietálnych buniek kyselou fenolovou extrakciou (Chromczynski, et al., 1987, Anál Biochem. 162: 156-9) po ktorej následovala chromátografia na oligo(dT) celulóze. Šest μg poly(A)⁺ RNA bolo prevedených na dvojvláknovú cDNA (Arufo, A. et al. , 1987, PNAS 84: 8573-7). Po pridaní adaptorov BstXI (InVitrogen, San Diego) sa cDNA frakcionaval podlá velkosti v gradiente 5 - 20 % octanu draselného a frakcie väčšie ako 1,5 kb sa zaligovali do vektoru expresie pcDNA-1 (InVitrogen, San Diego).

Izolácia cDNA psieho receptoru qastrinu

Na izolácu klónu receptoru gastrínu z kižnice expresie cDNA psích parietálnych buniek bolo vyprodukovaných 2 x 10⁶ primárnych transformantov v zliatych porciách po 3 000 až 10 000 buniek transformáciou buniek Escherichia coli MC1061.-p3 elektroporáciou (Lin, H. Y. et al. , 1991, PNAB 88:3185-9). Minipreparáty DNA pedstavujúce jednotlivé porcie sa pripravili alkalickou lýzou a potom sa transfekovali do buniek COS-7 prichytených na sklenených bankách (Nunc) s použitím DEAE-dextránu (Pacholczyk, T. et al. , 1991, Náture 350: 350-354). Zásobné suspenzie baktérií predstavujúce jednotlivé porcie sa skladovali v glyceróle. Štyridsaťosem hodín po transfekcii boli bunky inkubované 60 min pri 37°C v Hankovom pufre doplnenom 25 mM HEPESom (pH 7,4), 0,1 % hovädzieho sérového albumínu (roztok A), 50 pM ¹²⁵I-CCK-8 (New England Nuclear, 2 200 Ci/mmol) a 50 pM ¹²⁵I-D-Tyr-Gly[(Nie²⁸' ³¹)-CCK-26-33], čo je analóg CCK s voínou amínovou skupinou dostupnou pre fixáciu (Pearson, R. K. et al., 1987, Biochem. Biopys. Bes. Comm. 147: 346-53 ). Po štyroch prmývaniach v ladovom roztoku A boli bunky fixované vo zmesi fosfátová solanka (pH 7,4) / 2,5 % glutáraldehyd, ponorené do

0,5 %nej želatíny a vysušené pri 37°C. Sklíčká boli exponované 3 dni na fotoemulzii Kodak NTB2 (Gearing, D. P. et al. , 1989, EMBO J. 8: 3667-76) a potom skúmané mikroskoicky v zatemnelom poli. Pozitívna porcia bola postupne delená kým sa získal pozitívny klón (GR-1).

Sled nukleotidov klónu psieho receptoru gastrínu GR-1 cDNA receptoru gastrínu bola subklónovaná do M13mpl8/19 a jednovláknové templáty z obidvoch vlákien boli sekvenované metódou termihácie reťazca (Tábor, S. a Richardson, C., 1987,

- 13 PRAS 84: 4767-71) s použitím modifikovanej polymerázy T7 (United States Biochemical Corp.) (Obr. 7 a SEKV ID Č: 1). Sled bol analyzovaný pomocou UWGCG programu GAP (Devereux, J. et al. , 1984, Rucleic Acids Res. 12; 387-395) a KKD analýzou hydropátie (Klein, P. et al. 1985, Biochim. Biophys. Acta 815: 468-76). cDNA má otvorený čítací rámec kódujúci bielkovinu s 453 aminokyselinami s predpovedanou molekulovou hmotnosťou 48 518 (obr. l, SEKV ID Č: 1). Analýza hydropátie ukazuje na sedem hydrofóbnych segmentov zodpovedajúcich transmembránovým doménam, ktoré sú charakteristické pre rodinu receptorov naviazaných na G-proteín. Preskúmanie ostatných oblastí odvodeného sledu aminokyselín ukazuje veíký počet aminokyselinových podpisov prítomných vo velkej väčšine receptorov naviazaných na G-proteín, Amínový koniec naklónovaného receptoru nemá signálnu sekvenciu aj ked obshuje tri potenciálne možné miesta väzby cukornej zložky na asparagín (N-X-S/T) v polohách 7, 30 a 36.

Gastrinový receptor je signifikantne identický čo do aminokyselín s rodinou β-adrenergických receptorov naviazaných na G-proteín (obr.2). Tak napr. tretia cytoplazmatická slučka a C-koniec sú bohaté na zvyšky treonínu a serínu ako potenciálne regulačné miesta analogické s tými, čo sa našli v rodopsíne a v β2-adrenergickom receptore (Dohlman, H. G. et al. , 1991, Ann. Rev. Biochem. 60: 653-88). Dva cysteínové zvyšky (C127 a C206) sa môžu podielať na disulfidovej väzbe vnútri reťazca podobnej tej, čo sa našla v rodopsíne (Karnik, S. S. et al. , 1989, JWAS’85: 8459-63). Translát GR-1 vykazuje vysoký stupeň (35 %) aminokyselinovej zhody s receptorom neuropeptidu Y-Yl, FC-5. Ďalšie receptory, ktoré vykazujú vysoký stupeň zhody v aminokyselinách s receptorom gastrínu sú receptor ludského dopamínu D4 (28 %), receptor (27 %) a ludský β2 adrenergický analýza ukazuje, že GR-1

5HT z Drosophila melanogaster receptor (26 %). Fylogenetická definuje novú vetvu triedy neuropeptidových ligandov receptorov viazaných na G-proteín.

Hybridizačné skúšky GR-1 pomocou Northern prenosu

Výskyt GR v tkáni (obr. 5) bol odhadovaný vysokostringentným Northern prenosom. Poly(A)⁺ RNA z dospelých psích tkáni sa separovala na 1,2 %nom agarózovom gele v 0,66 M , TM formaldehyde. RNA bola prenesená na membrány Nytran kapilárnym presávaním. Filtry boli hybridizovné s vysokou stringenciou v pufre obsahujúcom 50 %ný formamid (obj./obj.) s Pstl-Xbal fragmentom cDNA gastrínového receptoru s veíkosťou 1 400 báz, označeným naviazaním náhodných hexamérov (Feinberg, A. P. a Vogelstein, B., 1983, Anál. Biochem. 132: 6-13). Autorádiogram bol exponovaný 45 hodín s dvomi kontrastnými filtrami.

Receptorová mRNA bola nájdená v žalúdočných parietálnych bunkách a v bunkách modzgovej kôry (obr. 5). Vysoká stringencia s ktorou sa vykonávala hybridizácia Northern prenosom poskytuje dobrý dôkaz, že receptor gastrínu a receptor CCK-B sú vysoko homologické. Bolo popísané, že všetky tieto tkáne majú receptory typu receptoru gastrínu/CCK-B (Jensen, R. T. e t al. v Gastrointestinal Endocrinology: Receptors and Post-Receptor Mechanisms, Harcourt Brače Jovanovich, San Diego, str. 95-113; Fourmy, D, et al. , 1987, Eur. J. Biochem. 165: 683-92). 0 psom pankrease sa vie, že v porovnaní s ostatnými druhmi sa vyznačuje značným obsahom receptorov CCK-B/gastrínu.

Afinitné zosieťovanie GR-1

Rekombinantný receptor v membránach buniek COS-7 transfekovaných GR-1 bol afinitne označený, aby sa zistilo, či je identický čo do velkosti s receptorom popísaným skôr na psích natívnych parietálnych bunkách.

Na afinitné značenie sa rekombinantné receptory na membránach buniek COS-7 transfekovaných GR-1 ponechali viazat ¹²⁵I-D-Tyr-Gly[(Nie²⁸' ³¹)-CCK-26-33] po 60 min pri 22°C. Následne bol naviazaný rádioligand oddelený od volného centrifugáciou (Pearson, R. K. et al. , 1987, Biochem. Biopys. Res. Comm. 147: 346-53).

Odcentrifugované membrány boli zosieťované s použitím 100 μΜ disukcínimidylsuberátu pri 4°C po dobu 5 min a prebytok sietovacieho činidla bol zrušený Tris pufrora. Označené mebrány boli oddilené elektroforézou v 10 %nom polyakrylamidovom géle v prítomnosti SDS a potom boli vizualizované autorádiografiou. Výsledky ukázali prítomnosť, bielkoviny v páse s M_r zodpovedajúcou približne 76 000 (obr. 4). Široký tvar pásu zodpovedá tomu, že predstavuje glykoproteín. Skutočne tiež cukorná zložka zodpovedá za významný rozdiel v molekulovej hmotnosti medzi predpokládanou bielkovinou a afinitne označeným pásom. Táto veľkosť súhlasí so skoršími údajmi získanými pomocou afinitného značenia, ktoré sa získali s psími parientálnymi bunkami (Matsumoto, M. et al. 1987, J. Am. Physiol. 252: G143-G147).

Väzba na receptor GR-1

Boli charakterizované väzobné vlastnosti rekombinantného receptoru GR-1 aby sa určilo, či sú typické pre receptory CCK-B/ gastrínu. Bunky COS-7 (1,5 x 10⁶) boli naočkované do. kultivačných misiek s priemerom 10 cm (Nunc) a kultivované v DNEM/10 %nom fetálnom teľacom sére v 5 %nom C0₂ pri 37°C. Po inkubácii cez noc boli bunky transfekované 5 μg GR-1 (Pacholczy'k, T. et al. , 1991, Náture 350: 350-354). Dvadsaťštyri hodín po transfekcii boli bunky rozdelené do misiek s 24 jamkami tak, aby v jednej jamke bolo 5 000 buniek. Po daľších 24 h sa vykonali pokusy s kompetitívnou väzbou v roztoku A, ktorý bol doplnený o 0,15 mM PMSF a o 40 pM _aR_{o o} rádioligand. Rovnovážna väzba sa ustálila po 80 min inkubácie pri 37°C. Monovrstvy buniek sa potom tri razy premývali a rádioaktivita sa kvantitatívne stanovila po hydrolýze buniek v IN NaOH. Pokusy s vysýtením rádioligandom

- 16 boli vykonané analogickým spôsobom v rozsahu 2,5 až 1 000 pM 125i_cck pričom nevytesniteiná väzba bola stanovovaná v prítomnosti neznačeného konkurenta v paralelných jamkách.

Väzobné parametre boli taktiež merané v izolovaných plazmatických membránach buniek COS-7, ktoré boli transfekované GR-1. Väzba sa prevádzala 60 min pri 22°C. Oddelenia viazaného a volného rádioligandu sa dosiahlo pomocou filtrácie cez vrstvu viažucu receptor ako bolo popísané skôr (Klueppelberg, U. G. et al. , 1989, Biochemistry 28: 3463-8).

Analýzy kompetetívnej a saturačnej väzby boli vyhodnocované pomocou počítačovej nelineárnej aproximácie kriviek (McPearson,

G. A., 1985, J. Pharmacol. Methods 14: 213-28).

Farmakologická charakterizácia receptorov exprimovaných na bunkách COS-7 transfekovaných GR-1 ukázala väzobnú špecifitu, ktorá je charakteristická pre receptory CCK-B/gastrínu (Matsumoto, M. et al. 1987, J. Am. Physiol. 252: G143-G147). Väzba ¹²⁵I-CCK preukázala jednu homogénnu triedu receptorov, ako sa potvrdilo hodnotou Hillovej smernice blízkou jednej (0,93 ± 0,07) pre homologickú kompetíciu s použitím CCK. Iní štruktúrne príbuzní členovia tejto rodiny súťažili o väzbu ¹²⁵I-CCK spôsobom, ktorý bol koncentračné závislý. Vypočítané hodnoty IC₅₀ pre CCK-8, gastrín a desulfátovaný CCK-8 boli 0,09 nM, 0,26 nM resp. 1,4 nM. To je v súlade s afinitou rádioligandu tak, ako bola odvodená zo saturačných väzobných pokusov v parientálnych bunkách COS-7 (K_d = 0,08 nM) transfekovaných GR-1 a v natívnych parietálnych bunkách (K_d = 0,027 nM). Porovnateiné výsledky sa dosiahli s použitím izolovaných membrán pripravených z prechodne transfekovaných buniek COS-7 (IC_5Q pre CCK-8, gastrín a desulfátovaný CCK-8 boli 0,0,8 nM, 0,4 nM resp. 1,5 nM). Afinita toho istého rádu pre všetkých testovaných agonistov bola overená s použitím ¹²⁵I-gastrínu (Amersham) ako rádioligandu.

Antagonisti receptorov gastrínu/CCK nepeptidovej povahy t.j. L364,718 (IC50 = 19 nM) a L365,260 (IC₅₀ = 130 nM) viazali rekombinantný receptor (obr. 3) s afinitámi podobnými tým, ktoré boli popísané pre natívne parietálne bunky. Opäť boli získané porovnateľné výsledky pri použití ¹²⁵I-CCK lebo ¹²⁵I-gastrínu ako rádioligandov v intaktných bunkách COS-7 transfekovaných GR-1 alebo v pokusoch s izolovanými membránami týchto buniek. V modzgu morčiat, membránach žalúdočnej žlazy a v králičích parietálnych bunkách, čo všetko sú tkáne bohaté na receptory CCK-B/gastrínu je poradie účinku týchto antagonistov obrátené (Chang, R. S. a Lotti, V. J., 1986, PNAS 83: 4923-6; Roche, S. et al. , 1991, Am. J. Physiol. 260: G182-8).

Aktivácia rekombinantného receptoru GR-1

Väzba gastrínu na rekombinantný receptor vyvoláva typický vzostup koncentrácie intracelulárneho vápnika a hydrolýzy fosfatidylinozitolu. Táto biologická odpoveď v bunkách COS-7 transfekovaných GR-1 sa použila na ďalšie overenie toho, že GR-1 kóduje funkčnú bielkovinu.

Meranie fCa²⁺1 spustenej receptorom GR-1

Štyridsaťosem hodín po transfekcii bol k bunkám COS-7 pridaný Ca²⁺ s flurofórom fura-2 v modifikovanom pufre KRB. Zmeny fluorescencie po stimulácii buniek pomocou 10^-6 M gastrínu boli merané z pomeru ^A34o/^A38O nm ^ako i^e P°pí^sané prvšie (Rajan, A. S. et al., 1989, Diabetes 38: 874-80).

Gastrín (10^-δ M) spustil výrazný vzostup volného cytozólového vápnika [Ca²⁺] zo 46,59 ± 6,9 nM na 142,4 ±16,2 nM (n = 3, P < 0,05), zatial čo bunky netransfekované nevykazovali žiadnu odpoveď (obr. 6A). Po chelatácii extracelulárneho vápnika

Oj pomocou EGTA 92,5 nM gastrín postupne zvyšoval [Ca⁴ ] zo 17,6 ± 1,0 nM na 88,5 ± 11,6 . nM (n = 3, P < 0,05) čé naznačuje, že gastrínom indukovaný vzostup [Ca²⁺] pochádzal pôvodne z intracelulárnych hotovosti [Ca ].

- 18 Meranie' fosfoinozitolov spustených receptorom GR-1

Charakter odpovede [Ca²⁺] naznačuje, že rekombinantný receptor spúšťa intracelulárnu signalizáciu cestou aktivácie fosfolipázy C; toto bolo overené meraním metabolitov fosfoinozitolov.

Bunky COS-7 transfekované GR-1 boli kultivované 24 hodín v médiu DNEM (GIBCO) bez inozitolu, doplnenom o 10 pCi/ml [³H](myo)-inozitolu (ARC) pred analýzou. Po 1 h ekvilibrácie v modifikovanom pufre KRB (vid vyššie) boli bunky stimulované 10^-6 M gastrínom po dobu 10 sa potom izolované do metanolu:HCl. Vodná fáza bola extrahovaná chloroformom, lyofilizovaná do sucha a analyzovaná pomocou HPLC na silnom anexe (Auger, K. R. et al. , 1989, Celí 57: 167-75).

Meranie metabolitov fosfoinozitolov v bunkách COS-7 transfekovaných GR-1 bolo vykonané 10 s po stimulácii gastrínom (obr. 6b). Bol zvolený čas, ktorý predchádzal vrchol indukovanej [Ca²⁺]. Gastrín (10^-6 M) zvýšil hladinu Ins-1,4,5-P₃ o 741 ± 115 % oproti kontrole (bunky COS-7 transfekované GR-1 bez stimulácie). Ins-1,3,4,5-P₄, ktoré môžu spolu s Ins-1,4,5-P₃ modulovať intracelulárne hladiny vápnika, vzrástli taktiež o 272 ± 15 % (n = 3, P < 0,01). Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcim sdeleniami o tom, že dráhy druhého messengeru sú prepojené s gastrínovým receptorom natívnych parietálnych buniek (Muallem, S. a Sachs, G., 1984, Biochem. Biophys. Acta 805: 181-185, Chew, C. S., a Brown, M. R., 1986, Biochem. Biophys. Acta 888: 116-125, Roche, S. et al. , 1991, FEBS Lett. 282: 147-51). Predbežné dôkazy nasvedčujú, že receptor gastrínu exprimovaný v bunkách COS-7 je navyše prepojený so stimuláciou adenylát cyklázy.

Väzba agonistov a antagonistov, afinitné značenie a transdukcia signálu sú neodlišitelné od predchádzajúcich výsledkov získaných s natívnymi psími parietálnymi bunkami, o ktorých sa preukázalo, že obsahujú jednu homogénnu triedu receptorov. Hojný výskyt transkriptu GR-1 v bunkách psej modzgovej kôry ako aj v parietálnych bunkách (obr. 5) podporuje názor, že receptory CCK-B a gastrínu sú vysoko homologické.

Konštrukcia knižnice expresie cDNA ľudských parietálnych buniek a izolácia cDNA íudského receptoru gastrínu

Ľudské parietálne bunky lebo hlavné bunky,' o ktorých je známe, že sú obohatené receptormi CCK-B, sa dajú použit na konštrukciu knižnice exprexie ľudskej cDNA. Na prípravu knižnice expresie cDNA íudských parietálnych buniek alebo hlavných buniek sa použijú tie isté metódy ako na konštrukciu knižnice expresie cDNA psích parietálnych buniek s tou výnimkou, že segmenty cDNA sú zaligované do vektorov lambda gtlO lebo lambda gtll ako je poísané inde (Sambrook, et al. , 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2: 8.36-38). Prečistená nukleová kyselina z klónu GR-1 podlá tohoto vynálezu sa použije ako sonda na izoláciu cDNA íudského receptrou gastrínu.

Izolácia a sekvenčná analýza cDNA íudského receptoru CCK-B (hCCDB)

Reštrikčný fragment Pstl-Xbal, s 1 400 bázami, kódujúci 3'-koniec receptoru gastrínu z psích parietálnych buniek označený rádioaktívne [alfa- P] dCTP pomocou naviazania náchodných hexamérov (Feinberg, A. P. a Vogelstein, B., 1983, Anál. Biochem. 132: 6-13) bol použitý ako hybridizačná sonda na vyhodnotenie ľudskej knižnice lambda DR2 cDNA ľudských modzgových buniek (Clontech) (Benton, W. D. et al. , 1977, Science 196: 180-182). Filtre boli hybridizované cez noc pri 55°C v 5 % SSC (1 x SSC je

- 20 0,15 M NaCl / 0,015 Μ citrát sodný, pH 7,0) a premyté 2 x SSC /

0,1 %ným SDS pri rovnakej teplote. Jeden pozitívny klón sa našiel medzi 4 x 10⁶ primárnymi rekombinantmi, čo boli vyhodnocované. Po prečistení plaku bol zodpovedajúci inzert cDNA (* 1 kb) subklónovaný do vektoru expresie pcDNA I (Invitrogen, San Diego, CA) a sekvenovaný metódou terminácie reťazca (Tábor, S. a Richardson, C., 1987, PNAS 84: 4767-71) s použitím modifikovanej T7 DNA polymerázy (United States Biochemical Corp.). Porovnanie sledu so sledom cDNA psieho receptoru gastrínu s použitím UWGCG Software programov (Devereux, J. et al. , 1984, Nucleic Acids Pes. 12: 387-395) naznačilo, že pôvodný klón bol fragment zodpovedajúci 3'-koncu predpokladanej cDNA receptoru CCK-B. DNA z plaku bola prečistená a sekvenovaná ako je popísané pre klón GR-1. Sled 66 párov báz vnútri otvoreného čítacieho rámca je ukázaný v obr. 8A (SEKV ID Č: 2). SEKV ID Č: 2 taktiež ukazuje sled aminokyselín CCK-B predpovedaný z cDNA. Týchto 22 aminokyselín je vysoko homológnych s 22 aminokyselinami predpovedaného sledu aminokyselín GR-1 (#281-302 v SEKV ID Č: 1; SEKV ID Č: 3) ako je ukázané v obr 8B.

Inzert cDNA s 1 kb bol potom použitý ako hybridizačná sonda na izoláciu zodpovedajúcej celej cDNA ludského receptoru CCK-B z fetálnej (23, týždeň) íudskej knižnice modzgových buniek v lambda LAS, čo je modifikovaný lambda vektor (Swaroop, et al., 1988, Nucleic Acids. Res. 16: 8739). Vykonalo sa vyhodnotenie x 10⁵ primárnych rekombinantov za podmienok popísaných vyššie. Nukleotidový sled bol analyzovaný pomocou UWGCG Software programov popísaných vyššie (Devereux, J. et al. , 1984, Nucleic Acids Res. 12: 387-395).

cDNA receptoru CCK-B z íudského modzgu kóduje bielkovinu s 447 aminokyselinami (obr. 10, SEKV hmotnosťou 48 419 daltonov. Analýza s inými známymi receptormi svedčí o tom, že receptor CCK-B je členom rodiny receptorov so siedmimi transmembránovými doménami naviazanými na G-proteín. Amínový koniec receptoru obsahuje tri

ID č: 4) s predpovedanou hydropátie a porovnanie

- 21 — možné asparagínové glykozylačné miesta (N-X-S/T), a to v polohách 7, 30, 36. Odvodený sled aminokyselín ukazuje rad štruktúrnych charakteristík, ktoré nachádzame vo väčšine známych receptorov naviazaných na G-proteín. Cysteínové zvyšky, jeden v prvej extracelulárnej slučke (C127) a jeden v druhej extracelulárnej slučke (C205) môžu vytvoriť disulfidovú väzbu vnútri reťazca podobnú tej, čo sa našla v rodopsíne (Karnik,

S. S. et al., 1989, PNAS 85: 8459-63). Zvyšky treonínu a serínu sú nahromadené v tretej cytoplazmatickej slučke ako aj na karboxylovom konci; to môžu byť fosforylačné miesta analogické s tými, čo sa našli v v β2-3<ΐΓθηθ^ίο^ιη receptore a v rodopsíne (Dohlman, H. G. et al. , 1991, Ann. Rev. Biochem. 60: 653-88).

Porovnanie sledov ostatných známych receptorov naviazaných na G-protein ukazuje, že odvodený sled aminokyselín receptoru CCK-B vykazuje najvyšší stupeň identity aminokyselín s psím receptorom gastrínu (91 %), potom následuje potkaní receptor CCK_A (49 %). Priradenie sledov aminikyselín troch predpokladaných podtypov receptorov CCK/gastrínu (obr. 11) ukazuje vysoký stupeň sekvenčnej identity týchto troch receptorov a to nielen v transmembránových doménach, ale aj pokial ide o extracelulárne a intracelulárne slučky. Ďalšie receptory, ktoré vykazujú vysoký stupeň identity aminokyselín s receptorom CCK-B sú receptory peptidových hormónov, potkanieho neuropeptidu Y (30 %), ludského vasopressínu V2 (30 %), ludského oxytocínu (28 %), a receptory biogénnych amínov, ludského β-adrenergického (26 %) a potkanieho serotonínu (23 %).

Hybridizačná skúška CCK-B pomocou Northern prenosu

Dva mikrogramy poly(A)⁺ RNA, izolovanej z deviatich rôznych ludských tkáni boli oddelené v denaturačnom agarózovom géle vo formaldehyde a prenesená na nylonovú membrány (Human MTN Blot, Clontech). Pstl-Xbal fragment hCCKB s velkosťou 1 400 báz,

- 22 označený rádioaktívne [alfa-³²P] dCTP naviazaním náhodných hexamérov (Feinberg, A. P. a Vogelstein, B., 1983, Anál. Biochem. 132: 6-13) bol hybridizovaný na membránu cez noc pri 42°C %ný formamid (obj./obj.), 5 x SSC/ 6,6, 1 x Denhardtov roztok, 0,5 %ný SDS, (hmot./obj.) a potrhanú (sheared) DNA μg/ml). Membrána bola premývaná 40 min Prenos bol znova sondovaný bola premytá 0,2 x SSC autorádiografický signál

Eur. J. Bioche. s 2,2 kb najskôr v roztoku obsahujúcom 20 mM fosfát sodný, pH 10 %ný dextránsulfát z lososej spermy (100 v 0,2 x SSC s 0,1 %ným SDS pri 69°C. cDNA ludského β-aktínu a mebrána v 0,15 %nom SDS pri 55°C. Silný β-aktínu bol pozorovaný vo všetkých dráhach po trojhodinovej expozícii (výsledky neuvádzme).

Výskyt transkriptu hCCKB v tkáňach bol posudzovaný pomocou Northern prenosu za stringentných podmienok, obr. 12. Transkript RNA so zhruba 2,2 kb bol nájdený v ludskom modzgu, žalúdku a pankrease, o ktorých je známe, že podlá funkčných údajov lebo údajov o väzbe receptrov obsahujú podtypy receptorov CCK/gastrínu. Hybridizačný signál mRNA izolovanej zo žalúdka ukazuje na identitu lebo krížovú reaktivitu s transkriptom receptoru gastrínu íudských parietálnych buniek. Je však takisto možné, že sonda hybridizuje s iným príbuzným podtypom receptoru CCK/gastrínu. Dva pankreatické signály naznačujú expresiu receptorov CCK/gastrínu taktiež v pankrease. I ked to doteraz nebolo popísané pre ludský materiál, fotoafinitným značením bolo dokázané, že psí pankreas obsahuje významné množstvo receptorov gastrínu navyše k receptorom CCK-A (Fourmy, D. et al., 1987, 165: 683-92). Tak teda hybridizačný signál predsavuje transkript receptoru gastrínu lebo CCK-B. Väčší, menej intenzívny signál môže byť odrazom mRNA receptoru CCK_A, alternatívne procesovanej varianty transkriptu s 2,2 kb alebo mRNA pankreatického receptoru.

kódujúcou doteraz neznámy subtyp

Meranie [Ca²⁺1 spustenej receptorom GR-1

Štyridsaťosem hodín po transfekcii hCCKB-pcDNA I bol k bunkám COS-7 pridaný Ca²⁺ flurofór fura-2 v modifikovanom Krebs-Ringerovom hydrouhličitanovom pufre. Zmeny v pomere emisie fluorescencie (^A34q/^a3S0 nm’ P° ^sti^mulácii buniek 10^-7 M CCK-8 boli merané ako je popísané prvšie (Rajan, A. S. et al., 1989, Diabetes 38: 874-80).

Meranie metabolitov fosfoinozitolov spustených receptorom CCK-B

Bunky COS-7 transfekované hCCKB-pcDNA boli kultivované v médiu DNEM (GIBCO) bez inozitolu, doplnenom o 10 μθί/ιη1 [³H](myo)-inozitolu (ARC) 24 h pred analýzou. Po 1 h ekvilibrácie v modifikovanom pufre Krebs-Ringerovm hydrouhličitane (vid vyššie) boli bunky stimulované 10 do metanolu:HCl, lyofilizovaná a (Ins-1,4,5-P₃) (Ins-1,3,4,5-P₄)

M CCK-8 po 10 s a izolované

Vodná fáza bola extrahovaná chloroformom, analyzovaná na inozitol-1, 4, 5-trifosfát a inozitol-1, 3, 4, 5-tetrakisfosfát pomocou HPLC na silnom anexe (Auger, K. R. et al. , 1989, Celí 57: 167-75).

Aby sa overilo, že hCCKB kóduje funkčný receptor bola meraná signalizácia druhého messenger ako odpoved na stimuláciu buniek

COS-7, exprimujúcich rekombinantný receptor, pomocou CCK-8.

CCK-8 (10^-7 M) spúšťal výrazný vzostup volného cytozólového vápnika [Ca^2_r]i (obr. 13A, lavý panel), zatial čo netransfekované bunky nevykazovali žiadnu odpoved (obr. 6A). Po chelatácii 2 + extracelulárneho vápnika pomocou 2,5 mM EGTA (1,5 mM Ca v pufre) prídavok CCK-8 (10^-7 M) dočasne zvyšoval [Ca²⁺]i (obr. 13A, lavý panel), čo svedčí o tom, že pôvodný vrchol vzostupu [Ca²⁺]i indukovaný CCK-8 pochádzal primárne z intracelulárnych hotovostí CCK-8 k

Ca²⁺. Charakter odpovede [Ca rekombinantnému receptoru ²⁺]i naznačuje, že väzba spúšťa intracelulárnu

- 24 signalizáciu cestou aktivácie lipázy C. To bolo overené meraním metabolitov fosfatidyl inozitolov v bunkách COS-7 transfekovaných hCCKB-pcDNA 10 sekúnd po stimulácii pomocou CCK-8 (obr. 13B). Tento čas bol zvolený tak, aby práve predchádzal vrchol [Ca²⁺]i indukovaný CCK-8. CCK-8 (10^-7 M) zvyšoval hladinu Ins-1,4,5-P₃ o 453 % oproti kontrole (n = 3, P <0,01). Ins-1,3,4,5-P₄, bezprostredný metabolit Ins-1,4,5-P₃, takisto vzrástol o 186 % oproti kontrole (n = 3, P < 0,01). Tieto výsledky takisto potvrdzujú, že izolovaný klón kóduje funkčný receptor.

Väzba na receptor CCK-B

10⁶) boli rozprestreté na kultivačné (Nunc) a kultivované v DNEM/10 %nom % vzduchu boli bunky

Bunky COS-7 (1,5 x misky s priemerom 10 cm fetálnom teíacom sére v atmosfére 5 % CO₂ / v inkubátore pri 37°C. Po inkubácii cez noc transfekované (Pacholczyk, T. et al. , 1991, Náture 350: 350-354) pomocou 5-7 μg pcDNA I vektoru expresie, ktorý obsahová hCCKB (hCCKB-pcDNA I). Dvadsaťštyri hodín po transfekcii boli bunky rozdelené do misiek s 24 jamkami (Costar, 2 x 10⁴ buniek Po áaíších 24 h sa vykonali pokusy s kompetitívnou Hankovom pufri, ktorý bol doplnený o 25 mM HEPES 0,1 %ný hovädzí sérový albumín a 0,15 mM PMSF.

Dvadsať pM ¹²⁵I-CCK-3 (New Englan Nuclear) bol použitý, ako rádioligand. Rovnovážna väzba sa ustálila po 80 min inkubácie pri 37°C. Monovrstvy buniek sa potom tri razy premývali, na jamku). väzbou v (PH7, 4), hydrolyžovali kvantitatívne. (Penisula) a

N NaOH a Neoznačení antagonisti, naviazaná rádioaktivita sa stanovila agonisti, CCK-8, gastrín I, CCK-4

L364,718 a L365,260 (Glaxo) boli nestovaní v koncentračnom rozsahu 0,1 pM až 10 μΜ. Všetky väzobné pokusy sa opakovali 3 až 5 razy. Údaje o kompetícii boli analyzované pomocou počítačovej nelineárnej aproximácie kriviek (Inplot 4.0 GraphPad, San Diego, CA)

Farmakologická charakterizácia ľudského modzgového receptoru CCK-8 exprimovaného na bunkách COS-7 ukázala agonistické aktivity, ktoré zodpovedali receptoru typu CCK-B (Innis, R. B. et al. , 1980, PNAS 77: 6917-6921; Saito, A. et al., 1980, Science 208: 1155-1156; Lotti, V. J. et al. , 1989, Eur. J. Pharmacol. 162: 273-280; Hays, S. et al., 1980, Neuropeptides, 1: 53-62). Štruktúrne príbuzní agonisti CCK-8, gastrín I a CCK-4 súťažili všetci o väzbu ¹²⁵I-CCK-8 na bunky COS-7 exprimujúce rekombinantný receptor spôsobom, ktorý prejavoval koncentračnú závislosť. Vypočítané hodnoty IC₅₀ pre CCK-8, gastrín I a CCK-4 boli 0,14 nM, 0,94 nM resp. 32 nM (obr. 14A). Ako sa dalo očakávať pri prototype receptoru CCK-B, rekombinantný receptor má vysokú afinitu ako pre CCK-8 tak aj pre gastrín I, pričom afinita pre CCK-8 je 7násobná. Tento rozdiel v relatívnych afinitách (CCK-8 versus gastrín I) je v dobrom súhlase s lOnásobným rozdielom, ktorý je poísaný v štyroch prácach, čo čtudovali izolované modzgové membrány morčaťa a potkana (Innis, R. B. et al. , viď vyššie; Saito, A. et al. , viď vyššie; Lotti, V. J. et al. , viď vyššie; Hays, S. et al. , viď vyššie). Drobné odchýlky v pomeroch afinity, ktoré sa objavujú pri porovnaní so skoršími prácami sa dajú prisúdiť variabilite v experimentálnych podmienkach vrátane podmienok prípravy tkáni, vo zdroji peptidu a použitých radioligandov.

Afinita k CCK-4 poskytuje ďalší dôkaz, že rekombinantný ľudský modzgový receptor je skôr receptor CCK-B ako receptor CCK_A. V prácach s izolovanými modzgovými membránami morčiat (Innis, R. B. et al. , viď vyššie), myší (Hughes, J. et al. , 1990, PNAS 87: 6728-6732) a potkanov (Saito, A. et al. , viď vyššie) bol pomer hodnôt IC^q receptoru CCK-B pre CCK-4 (versus CCK-8) v rozmedzí 10 až 110. V tejto štúdii ľudského rekombinantného receptoru bol nájdený pomer hodnôt IC₅₀ (CCK-4 versus CCK-8) ako rovný 230, čo súhlasí s vyššie citovanými hodnotámi. Naproti tomu receptor CCK-A charakterizovaný na potkaních pankreatických

- 26 membránach viaže CCK-4 (oproti CCK-8) s hodnou pomeru IC_5Q rovnou 30 000 až 40 000 (Jensen, R. T. et al. , 1989, Trends Pharmacol. Sci. 10: 418-423, Hughes, J. et al., viď vyššie) .

Väzba nepetidových antagonistov L364,718 a L365,260 na rekombinantný receptor ďalej potvrdzuje správnosť jeho klasifikácie ako receptoru CCK-8 (Hughes, J. et al., viď vyššie, Chang, R. S. a Lotti, V. J., 1986, PNAS 83: 4923-6). Hodnoty IC_5Q pre L364,718 a L365,260 sú 145 nM resp. 3,8 nM (obr. 14B) , čo je hodnota, ktorá dobre zapadá do rozmedzia 6 až 125násobnej afinity popísaného v literatúre (Hughes, J. et al., viď vyššie; Lotti, V. J. et al. , viď vyššie). Hodnota ^IC50' ktorú rekombinantný receptor vykazuje pre L365,260 je rovnako v dobrom súhlase s referenčnou hodnotou stanovenou s izolovanými modzgovými membránami (2,4 nM) (Lotti, V. J. et al. , viď vyššie) .

Čistenie polypeptidovych receptorov gastrínu a CCK-B

Polypeptidový receptor gastrínu a polypepticový receptor CCK-B môžu byť prečistené pomocou konvenčných metód, ktoré sú známe tým, kto sú zaškolení v obore, ako sú napr. ale nie výlučne metódy zrážacie, chromatografické, imunoadsorbčné lebo afinitné techniky. Polypeptid môže byť prečistený z východzieho materiálu pričom sa použije cDNA GR-1 v bunkách COS-7, cDNA CCK-B v bunkách COS-7 alebo rekombinantná forma týchto cDNA zabudovaná do buniek superprodukčnej línie.

Vyber kandidátov na antagonistov

Aktivácia receptoru gastrínu indukovaná gastrínom lebo CCK poskytuje test na vyhodnotenie kandidátov na antagonistov blokujúcich vzostup cytozóloveho [Ca²⁺], vzostup hydrolýzy fosfatidylinozitolov lebo vzostup adenylát cyklázy. Tak napr. kandidáti na antagonistov sa pridajú ku kultivovaným bunkám, napr. bunkám COS-7, ktoré exprimujú cDNA receptorov GR-l lebo CCK-B. Agonisti sú, pričom výčet sa neobmedzuje len na nich, gastrín, CCK, CCK-8s, CCK-8d, CCK-4, lebo CCK-5 (Penisula Co.). Vápnik [Ca²⁺] lebo fosfatidylinozitoly sa zmerajú ako je popísané vyššie (obr. 6A a 6B). Na stanovenie hladín cAMP sa použije komerčná súprava (Amersham). Za kandidáta na antagonistu sa považujú látky, ktoré blokujú aktiváciu receptoru, ako je ukázané v obr. 6A a 6B lebo v obr. 13A a 13B. Kanditáti na antagonistov zahrnujú aj peptidové aj nepeptidové látky.

Ináč sa dajú pokusy s kompeptitívnou väzbou vykonať: na bunkách COS-7 transfekovaných c DNA receptoru GR-l lebo CCK-B ako je popísané v obr. 3 a 14. Zmeria sa väzba agonistu na receptor. Tieto merania sa porovnajú s kontrolnou vzorkou buniek inkubovaných za rovnakých podmienok avšak bez prítomnosti potenciálneho antagonistu. Ako použitelní antagonisti sa dajú definovať tie molekuly, ktoré inhibujú väzbu agonistu na receptor, ako je ukázané Hillovým výnosom podobným tomu, čo je na obr. 3.

Terapia

Títo antagonisti, akonáhle boli identifikovaní, sa dajú použiť na inhibíciu aktivity receptoru gastrínu lebo CCK-B in vivo. Antagonisti receptoru gastrínu môžu byť užitoční napr. na liečenie Zollinger-Ellisonovho syndrómu, rakoviny žalúdka, zhubnej anémie, refluxnej ezofágitídy, vredovej žalúdočnej choroby alebo rakovinných nádorov tým, že znižujú aktiváciu receptoru gastrínu a hladinu kyseliny v žalúdku. Tak napr. Omeprazole^R (Merck), o ktorom je známe, že znižuje hladinu kyseliny v žalúdku, zvyšuje pri dlhodobej aplikácii hladinu gastrínu, čo u potkanov spôsobuje vznik rakovinných nádorov. Proti tomuto účinku by bolo možné aplikovať antagonistu receptoru gastrínu, čím by sa dosiahlo toho, že Omeprazole^R by sa mohol používať na liečenie po dlhší čas. Pretože gasstrín sa môže

- 28 uplatňovať taktiež pri raste a diferenciácii, antagonisti receptorov gastrínu by sa dali použiť k liečbe niektorých druhov rakoviny vrátane, nievšak len, rakoviny malých buniek plúc lebo rakoviny hladkého svalstva.

Antagonisti receptorov CCK-B sa dajú použiť na inhibíciu aktivity receptoru CCK-B in vivo. Antagonisti receptoru CCK-B môžu priniesť úžitok pri liečení bolesti, depresií a stiesnenosti, porúch pamäti, porúch pocitu sýtosti a porúch v jedle a panikových stavov. Tak napr. analógy CCK, napr. CCK-4, spôsobujú záchvaty paniky u ludí. Keď je receptor CCK-B blokovaný napr. antagonistom receptoru CCK-B, potom sa nával paniky nedostaví.

Účinné množstvá antagonistov by v obidvoch prípadoch bolo možné podať pacientovi intravenózne s použitím zariadenia pre pomalé dávkovanie alebo per os konvenčným spôsobom.

Iné príklady

Iné príklady sú zahrnuté do následujúcich návrhov.

Tak napr. sa môžu izolovať iné ekvivalentné klóny pomocou hybridizčných vyhodnocovacích techník dobre známych tým, čo bežne ovládajú obor a to s použitím cDNA podlá tohoto vynálezu na vyhodnocovanie knižníc expresie cDNA psích lebo ludských parietálnych buniek. Podobne je možné získať prečistenú nukleovú kyselinu kódujúcu receptor E₂ s použitím týchto knižníc cDNA.

Knižnica cDNA expresie môže byť pripravená ligáciou cDNA do iných vektorov, t.j. vektorov iných ako pcDNA-1, lambda gtlO lebo lambda gtll, ktoré sú schopné exprimovat produkty biologicky aktívnych bielkovín v eukarytických bunkách.

Vynález zahrnuje akúkolvek bielkovinu, ktorá je v podstate homologická s psím receptorom gastrínu (obr. 1, SEKV ID Č: 1), s ludským receptorom gastrínu a s ludským receptorom CCK-B (obr. 2, SEKV ID Č: 4), práve tak ako iné, v prírode

- 29 sa vyskytujúce člený rodiny receptorov gastrínu/CCK-B. Takisto sú zahrnuté alelové varianty, prirodzené mutanty, indukované mutanty, bielkoviny kódované DNA, ktorá hybridizuje za podmienok vysokej lebo nízkej stringencie (t.j. premývaní 2 x SSC pri 40°C s dĺžkou sondy prinajmenej 40 nukleotidov) na nukleovú kyselinu. Patria sem aj chimérické polypeptidy, ktoré obsahujú jeden člen rodiny receptorov gastrínu/CCK-B.

Vynález zahrnuje aj hociktorý biologicky aktívny fragment lebo analóg receptoru z rodiny receptorov gastrínu/CCK-B. Pod pojmom biologicky aktívny sa rozumie, že má akúkolvek aktivitu in vi vo lebo in vitro, ktorá je charakteristická pre rodinu receptorov gastrínu/CCK-B. Vzhíadom na to, že rodina cicavčích receptorov gastrínu/CCK-B má velký rad fyziologických vlastností a vzhíadom k tomu, že tieto vlastnosti sa dajú vztiahnuť k rôznym častiam molekuly receptoru gastrinu/CCK-B, je užitočný fragment receptoru gastrínu/CCK-8 ten, ktorý vykazuje biologickú aktivitu v ktoromkoívek teste na receptory gastrínu/CCK-8 alebo ktorý má jednu z následujúcich aktivít: a) schopnosť receptoru viazať agonistu lebo b) schopnosť zvýšiť cytozólový vápnik [Ca^z j po indukcii agonistom lebo c) schopnosť indukovať fosfolipázu C po indukcii agonistom lebo d) schopnosť aktivovať po indukcii agonistom adenylát cyklázu, aby vzrástla hladina cAMP. Fragment lebo analóg receptoru z rodiny cicavčích receptorov gastrínu/CCK-8, ktorý vykazuje 10 %, lepšie 40 % alebo najmenej 90 % aktivity polypeptidového cicavčieho receptoru gastrínu/CCK-8 (napr. toho, čo je ukázaný v obr. 1, SEKV ID Č: 2) v ktoromkoívek teste in vivo lebo in vitro na cicavčie receptory gastrínu/CCK-B (napr. v tých, čo sú popísané vyššie) sa považuje za biologicky aktívny a užitočný podía tohoto vynálezu.

Pedpokíadané biologicky aktívne fragmenty receptrov gastrínu/CCK-8 je možné vytvoriť metódami, ktoré sú známe tým, čo sú zbehlí v obore. Schopnosť fragmentu vyhovieť testom, ktoré sú popísané vyššie, je možné odhadnúť pomocou metód, ktoré sú známe tým, čo sú zbehlí v obore, napr. metódami popísanými nižšie.

- 30 Preferované analógy zahrnujú členov rodiny receptorov gastrín'u/CCK-8 (alebo ich biologicky aktívne fragmenty) ktorých sledy aminkyselín sa líšia od sledov aminokyselín divokých typov len konzervatívnymi zámenami aminokyselín napr. zámenou jednej aminokyseliny aminokyselinou s podobnými vlastnosťmi (napr. zámena valínu za glycín, arginínu za lyzín atd.) alebo jednou či viac nekonzervatívnymi zámenami aminokyselín, deléciami alebo inzerciami, ktoré neodstraňujú biologickú aktivitu polypeptidu. Iné užitočné modifikácie sú tie, ktoré zvyšujú stabilitu peptidu: takéto analógy môžu obsahovať napr. jednu či viac nepeptidových väzieb (ktoré nahrádzajú peptidovú väzbu) alebo D-aminokyseliny v slede aminokyselín peptidu.

Analógy sa môžu odlišovať od prirodzených receptorov gastrínu/CCK-B v slede aminokyselín alebo v modifikáciách, ktoré neovplyvňujú sled aminokyselín alebo v obidvom. Analógy podía tohoto vynálezu budú obecne vykazovať najmenej 70 %nú, lepšie 80 %nú, ešte lepšie 90 %nú a vôbec najlepšie 95 %nú či dokonca 99 %nú homológiu so segmentom s 20 zvyškami aminokyselín, ale radšej so 40 zvyškami aminokyselín alebo ešte lepšie s celým sledom aminokyselín prirodzeného receptoru gastrínu či CCK-B.

Zmeny v primárnej sekvencii zahrnujú genetické varianty, aj prirodzené aj indukované. Sú zahrnuté aj analógy, ktoré majú aj iné zvyšky ako prirodzené L-aminokyseliny, napr. D-aminokyseliny lebo aminokyseliny nevyskytujúce sa v prírode či syntetické, napr. β lebo gama aminokyseliny. Ináč je možné zvýšiť štabilitu cyklizáciou peptidovej molekuly. Vystavením polypeptidu účinkom enzýmov, ktoré menia fosforyláciu, napr. kinázam lebo fosfatázam; modifikácie zahrnujú chemickú derivatizáciu in vivo lebo in vitro, ako napr. acetyláciu, metyláciu, fosforyláciu, karboxyláciu lebo glykozyláciu; glykozyláciu je možné pozmeniť napr. zmenou miesta glykozylácie búd počas syntézy a opracovania (processingu) polypeptidu alebo až v dalších stupňoch opracovania, napr vystavením polypeptidu účinkom enzýmov, ktoré ovplyvňujú glykozyláciu, čo sú enzýmy z buniek, ktoré normálne takéto opracovanie vykonávajú, ako sú napr. cicavčie glykozylačné

- 31 enzýmy. Fosforylácia sa dá modifikovať vystavením polypeptidu účinkom enzýmov, ktoré ovplyvňujú fosforyláciu, ako sú napr. kinázy či fosfatázy.

Okrem polypeptidov, ktoré majú v podstate celú dĺžku reťazca vynález navyše zahrnuje aj biologicky aktívne fragmenty polypeptidov. Termín fragment ako sa tu používa je vztiahnutý na polypeptid s najmenej ... zvyškami aminokyselín, ale skôr typicky s najmenej 40 zvyškami, najlepšie ale s najmenej 60 zvyškami aminokyselín. Fragmenty receptorov gastrínu lebo CCK-B sa dajú pripraviť metódami, ktoré sú známe tým, čo sú zbehlí v obore. Schopnosť kandidáta na fragment vykazovať biologickú gastrínu lebo CCK-B sa dá odhadnúť tu známymi tým, čo sú školení v obore. Takisto

I sú zahrnuté polypeptidové receptory gastrínu/CCK-B obsahujúce aminokyseliny, ktoré sú normálne odstraňované počas opracovania (processingu.) , vrátane dalších aminokyselín, ktoré nie sú vyžadované pre biologickú aktivitu polypeptidu alebo vrátane ďalších aminokyselín, ktoré sú dôsledkom zostrihu mRNA či iných javov, ku ktorým dochádza pri opracovaní (processingu) bielkovín.

aktivitu receptoru popísanými metódami

- 32 Zoznam sekvencií (1) Obecná informácia (i) Žiadate!: Alan S. Kopin (ii) Názov vynálezu: cDNA kódujúce receptory gastrínu a CCK-B (iii) Počet sekvencií: 4 (iv) Adresa pre korešpondenciu:

(A)	Adresát:	Fish & Richardson
(B)	Ulica:	225 Franklin Street
(C)	Mesto:	Boston
(D)	Štát:	Massachusettts
(E)	Krajina:	U.S.A.
(F)	PSČ	02110-2804

(v) Forma čitatelná počítačom:

(A) Typ prostredia: 3,5 disketa

1,44 Mb (B) Počítač: IBM PS/2 Model 50Z lebo 55SX (C) Operačný systém: MS-DOS (verzia 5,0) (D) Software: WordPerfect (verzia 5,1) (vi) Údaje o žiadosti (A) Číslo žiadosti:

(B) Podaná dňa:

(C) Klasifikácia:

(vii)

Údaje o predchádajúcich žiadostiach

(A)	Číslo žiadosti:	07/832,841
(B)	Podaná dňa:	7. februára 1992
(A)	Číslo žiadosti:	07/941,373
(B)	Podaná dňa:	3. septembra 1992

(viii) Informácie o právnom zástupcovi a agentúre:

(A) Meno: Paul C. Clark (B) Číslo registrácie: 30,162 (C) Referencia/číslo záznamu: 00398/065003 (ix) Telekomunikačné informácie:

	(A) Telefón: (B) Telefax: (C) Telex:	(617) 542-5070
(617) 542 200154	-8906
Informácia o sekvencii s iden	tifikačným	číslom:
(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A) Dĺžka:	1440
	(B) Typ:	nukleová	kyselina
	(C) Vlákno:	dvojité
	(D) Topológia:	lineárna

(xi) Popis sekvencie pod SEKV ID Č: 1

ATG Met

GAG Glu

CTG Le’-

CTA Leu

AAG Lvs 5*

CTG Leu

AAC Aan

CGG Arg

AGC Ser

Ala 10

CAG Gin

GGG Gly

TCC Ser

GGA Gly

GCC Ala 15

GGG Gly

7

20

CCG

GGG

GCT

TCC

CTG

TGC

CGC

GCG

GGC

GCC

CTC

CTC

AAC

AGC

AGC

105

Gly

ALä.

Ser

Leu

Cys

Arg

Ala

G Ly

Gly

Ala

Leu

Leu

Asn

Ser

Ser

20

2Ξ*

30

GGT

<?^.G

GGC

AAT

CTC

AGC

T·*- — i.

GAG

CCG

CCT

CGC

CTC

CGC

GGA

GCC

GGG

1Ξ Ξ

Gly

Ala

— 1 , -

Asn

Leu

Ser

Cys

G iU

?rc

?ro

Arg

Leu

Arg

Gly

Ala

Gly

2 5

2 5

40

45

ACA

CGA

GAA

TTG

GAG;

CTG

GCC

ATT

AGG

GTC

ACC

CTT

TAT

GCA

GTG

ATC

201

T5 -

Arg

Glu

Leu

Glu

Leu

Ala

Zle

Arg

Val

Thr

Leu

Ty*

Ala

Val

Zle

50

c ΐ

ó0

30

---

CTG

ATG

AGT

GTT

GGA

GGA

AAT

GTG

CTC

ATC

ATC

GTG

GTC

CTG

GGA

24?

Phe

Leu

Met

Ser

Val

GIv

Gly

Asn

Val

Leu

Zle

Zle

Val

Val

Leu

Gly

5 5

70*

75

80

CTG

AGT

CGC

CGG

CTG

AGG

ACT

GTC

ACC

AAC

GCC

TTC

CTG

CTC

TCA

CTG

297

Leu

Ser

Arg

Arg

Leu

Arg

Thr

Val

Thr

Asn

Ala

Phe

Leu

Leu

Ser

Leu

35

as

90

95

GCA

GTC

AGC

GAC

CTC

CTG

CTG

GCT.

GTG

GCT

TGC

ATG

ccc

TTC

ACC

CTC

34 5

Ala

Val

Ser

Asp

Leu

Leu

Leu

Ala

Val

Ala

Cys

Met

Pro

Phe

Thr

Leu

100

105

110

CCG CCC Leu Pro

AAT Asn 115

CTC Leu

ATG Met

GGC Glv

ACG Chr

CTC Phe 120

ACC Íle

Phe

GGC Gly

ACA Thr

GCC Val 125

GTC Val

CGT Cys

AAG Lys

393

GCA GTT

TCC

CAC

CTC

ATG

GGG

GTG

CGC

GTG

AGC

GTG

TCC

ACA

CTA

AGC

A _ a. V a i

Ser

Ty r

Leu

Met

Glv

Val

Ser

val

Ser

Val

Ser

Thr

Leu

Ser

130

135

140

CTT GTG

GCC

ACC

GCC

CCG

GAG

CGA

CAC

AGC

GCC

ATC

TGC

CGG

CCG

CCA

429

Leu Val

Au a

TLe

Ale

Leu

Glu

A. r z

Tvr

Ser

Ala

1 ie

Cys

Are

Pro

Leu

_ «n 2

250

155

150

CAA GCA

CGC

GTG

CGG

CAG

ACG

CGT

“ÄC

CAC

GCG

GCT

CG l a

. GTG

ATC

ACC

- - -

Gi λ i £

A. r c

Val

Trp

Gin

u

Arg

Ser

HlS

Ala

Ala

Arg

Val

íle

íle

U 3 3

- f \J

175

GCC ACC

TGG

A. - G

CCC

CCC

uGA.

CCG

CTC

A i G

GCG

CCC

TAC

r* ľf— U'wSj

GTG

CAC

535

i ’ Ä “’·»··

—r

Met

Leu

Ser

Glv

Leu

Leu

Mg-

Val

Pro

Tvr

Pro

val

Tvr

130

135

190

ACC GCC

GCA

CAG

CCC

GCA

GGA

GGG

GCC

CGG

r* vw

CTG

CAG

TGC

GTG

CAC

52 3

. r. r A. _ a

Val

\J 7.

?rc

λ- a

Glv

Glv

Ala

Arg

Ala

Leu

Gin

Cys

Val

Hl s

20Ó

205

u G - . GG

CCC

AGC

GCG

CGC

GCC

CGC

CAA

ACC

CGG

TCG

GCA

CTG

CTG

CTC

551

i ·— *** —»

?rc

Ser

A· a

A. r z

val

Aro

Gin

— u, —

T ro

Ser

val

Leu

Leu

Leu

U U U

215

220

u _ G C . -'

TTG

-?r

TTC

GCC

CCA

GGC

GCG

GCC

ATG

GCT

GTG

GCC

TAC

GGG

729

Leu Leu

Leu

Phe

Phe

Val

Aro

Glv

Val

Val

Met

Ala

Val

Ala

T' »»

Glv

2 2 5

230

225

240

C7C ACC

CCC

CGC

GAG

CCC

CAC

TTA

/“ <· *

v. · .

CGC

CTC

GAC

GAG

.AAC

AGC

---

” 5 U 2 2 €

Ser

A. r c

Glu

Leu

'•y —

Leu

G 1 y

Leu

Arp

Phe

Asn

Glu

A. s o

Ser

245

2 50

255

GAC AGC

GAA

AGC

CGA

GCC

CGA.

AGC

GGA.

Gw

CTG

Uvj'.j

GGT

(AGG

GCG

225

Asp Ser

G u u

Ser

A r r

v a i

Are

Ser

G - Ω

Glv

Glv

Leu

Arg

Glv

Gly

Ala

260

255

270

GGA CCA

GGC

CCC

GCC

CCC

CCC

ΛΖ*. -

A.GT

_ J'—

<·<*<·

CCG

GAG

GGC

GGG

22

Glv Pro

G . y

?Γ3

Ala

?rc

?rc

A s r.

G - v

Ser

C'.’S

> m Λ- 5

Pro

Glu

Glv

Glv

275

220

225

CCG GCC

GGC

GAG

G Au

GGC

GAC

GGC

CAC

GCG

CAG

CTT

CCG

CGC

521

Leu ALa

Gly

Glu

Α.3Ό

Glv

Aso

Glv

CVS

Tvr

Val

Gin

Leu

?ro

Arg

Ser

290

295

300

CGC CAG

C i G

GAG

CTG

CCC

GCG

CTG

ACC

G v-

CCC

ACT

CCT

GGG

CCC

955

Are Gin

Leu

·— 1 .. nj ·

Leu

Ser

A. a

Leu

·* U ·“

Ala

?rc

Τ' p ·»

?rc

Gly

?rz

7 Z

210

215

2 2 0

GGC

CCC

CGG

CCC

CAC

CAG

GCC

AAG

U . nj

CCG

GCC

AAG

PAG

CGC

1012

Glv Gly

G 2y

Pro

Arg

Pro

Tvr

ο-Ω

**.—a

Lvs

Leu

Leu

Ala

Lys

Lvs

Arg

325

230

235

GTG GTG

CGG

ATG

CTG

CCG

GCG

ACC

GTC

GTG

CCC

TTT

TTC

CTG

TGT

TGG

1065

v a . v a í

Αζς

Met

Leu

Leu

Val

ľ le

Val

Val

Leu

Phe

Phe

Leu

Cvs

Tro

240

245

350

TTG CCA

CCG

CAC

hv .

GCC

AAC

ACG

CGC

GCC

CCC

GAC

AGC

CCC

GGT

2 i * -

Leu Pro

Leu

Tvr

Ser

Ala

Asn

2h_r

ľrc

A. r c

Ala

Phe

Aso

Ser

Ser

Gly

25 5

3óC

3 65

GCA CAC

CCC

TC A

yur.

GCG

CCA

A.TC

CCC

CCC

ATC

CAC

CCG

CTG

1151

Ala H i s

Aro

Ala

Leu

Ser

Glv

Ala

2xr

Zle

Ser

Phe

ľ le

H i s

Leu

Leu

270

375

330

'> ·' Ο . I im <) . 1 Ο .c ο Ο (J , 1 t.) r»: r-l Q (J

AG<.

GAC

GGG

7GA

G s- G

1GC

GTC

AAC

r* r·'“· <w w w

GGG

ZZZ

TAC

TGC ZZZ

ATG

CAC

5er

’t· —

Ala

Ser

AL a

Cvs

Val

Asn

Leu

Val

** ·» w

C-.-3 ?ňe

“e;

His

2 5 5

2?0

2 9 5

400

«. wf -

GGC

CAG

Nj*- U

?GC

<jAo

ACG

zzz

GCC

u«jG GGC

TGC

GGG

Λ- -5

A

?he

G - “

Ala

Cys

Leu

G L u

«U w

Cvs

Ala

Ar? Cvs

G v 3

3 w-

«n C

.« · Λ -» U‘J

A ’ ± w w

f r*»

U *J ·“·

zzz

zzz

zzz

CGA

GAC

<jaG GAC

zzz

zzz

Ar z

? Γ3

? rc

A r r

A. a

Ar r

? rc

Arg

? zz

Leu

Asp

G * u A S c

?ro

a--

422

-» 2 2

430

—

ACG

CCľ

TCG

177

TCA

CTG

7CG

AGA

zzz

AGC

TAC

ACC ACC

ATC

AGC

“·- —

? rc

Ser

ľ L e

Alä

Ser

leu

Ser

Arg

Leu

Ser

7y g

G ľ; r Cľir

Íle

Ser

t J 2

440

445

SGG 7GAGGGG7A GCGGGAGAG7 GGAGnjCTGA GACGn^GACA

5' si w . Λ w»w .

7r.r Leu Gly ?r: 4 SO — .λx—«-x-A. .G u.-ACAoGs^A kzws^rtCGGAC AGnC.tC • t tk.

(2) Informácia o sekvencii s identifikačným číslom: 2 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:· (C) Vlákno:

(D) Topológia:

nukleová kyselina dvojité lineárna (xi) Popis sekvencie s identifikačným číslom: 2

- 36 GGG CG GC CGG CCT GAG AC GGC GCG G77 GGC GAA GAC AGC GAT GGC 2 0 Gív Arg Cys Arg ?ro GLu br Gív Ala '-'a L. GLy GLu Asg 5 a r Aaa GLy

GGC GAC - G GAA CGG CCA Cvs Tvr Vai Gin Ce·- ?rc

Informácia o sekvencii s identifikačným číslom: 3 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka:	22
(B) Typ: (C) Vlákno:	aminokyselinová
(D) Topológia:	lineárna
(xi) Popis sekvencie v:	SEKV ID Č: 3
5er Cys Arg ?-a. Glu- GLy GLy Leu 5	Alí G-Τ’ G.lu Aso G—y Asc G L v »· 5
vr Val Gin Leu ?rr 20

Informácia o sekvencii s identifikačným číslom:
(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A) Dĺžka:	1356
	(B) Typ:	nukleová kyselina
	(C) Vlákno:	dvojité
	(D) Topológia:	lineárna

(xi) Popis sekvencie pod

SEKV ID Č: 4

GAG CTG CTA AAG CTG AAC CGG AGC GTG CAG GGA ACC GGA CCC GGG

Giu Leu Leu Lvs Leu Asn Are Ser Val· Gin Glv Thr Giy Pro Glv

5' ' 10 ' 15'

CCG

GGG

GCT

TCC

CTG

TGC

CGC

CCG

GGc

GCG

CCT CTC

CTC

AAC

AGC

AGC

9 ó

15

?rc

Gly

A la

Ser

Leu

CVS

Arg

Pro

Gly

Ala

Pro Leu

Leu

Asn

Ser

Ser

20

2 5

30

AGT

GTG

GGC

AAC

CTC

AGC

TGC

GAG

CCC

CCT

CGC ATT

CGC

GGA

GCC

GGG

144

Ser

Val

Gly

Asn

Leu

Ser

Cys

G r u

?rc

Pro

Arg Íle

Arg

Gly

Ara

Giy

3 3 ’

40

45

2 0

ACA

CGA

GAA

TTG

GAG

CTG

GCC

Λ i i

.“.y.

ATC

ACT CTT

TAC

GCA

GTG

ATG

192

T h r

Arg

Giu

Leu

Giu

Leu

Aia

Σ L e

Are

Íle

Thr Leu

Tvr

Ala

Val

I ie

50

3 3

50

TTC

CTG

ATG

AGC

GTT

GGA

GGA

AAT

« Λ · 'J

CTC

ATC ATC

r· *r>f^ M .M

GTC

CTG

GGA

240

?he

Leu

Met

Ser

Val

Glv

Giy

Asr.

H e r

Leu

Íle íle

Val

Val

Leu

Glv

25'

6 5

70*

73

30

CTG

AGC

CGC

CGC

CTG

AGG

ACT

GTC

ACC

AAT

GCC TTC

CTC

CTC

CCA

CTG

2 35

Lee

Ser

Arg

Arg

Leu

Arg

T hr

v a r

~*hr

A s n

Aia ?he

Leu

Leu

Ser

Leu

a 3

90

95

GCA

GTC

AGC

G AC

CTC

CTG

CTG

GCT

GTG

GCT

TGC ATG

CCC

‘P**’/··

ACC

CTG

235

30

Ala

Val

Ser

Asa

Leu

Leu

Leu

Ala

Val

,-._a

Cys Met

Pro

?h.e

Thr

Leu

100

.05

110

CTG

CCC

AAT

CTC

ATG

GGC

ACA

TTC

ATC

TTT

Gs/i. ACC

GTC

ATC

TGC

AAG

354

Lee

?ro

Asn

Leu

Met

Giy

“hr

?'ne

Íle

?he

Gly Thr

Val

T 2 λ

Cys

Ly s

113

120

125

3 5

GCG

GTT

TCC

TAC

CTC

ATG

GGG

u i G

TCT

GTG

AGT GTG

TCC

ACG

CTA

AGC

432

A i. a.

Val

Ser

Ty »·

Leu

Met

Glv

Val

Ser

Val

Ser Val

Ser

Thr

Leu

Ser

130

133

140

40

GTG Leu 145

GTG Val

GCG Ala

ATC Íle

GCA Aia

CTG Leu 150

kjAG Gl'j

t** r· ~ Are

TAC

AGC Ser

GCC Ala

ATC íle

TGC Cys

CGA Arg

CCA Pro

CTG Leu 160

430

CAG

GCA

CGA

GTG

TGG

CAG

ACG

CGC

TCC

CAC

GCG

GCT

CGC

GTG

ATT

GTA

5 23

o - n

Aia

Arg

Val

Tra

G!r.

Thr

Arg

Ser

Mis

A 4. a

Ala

Arg

Val

1 le

Val

135

170

175

GGC

ACG

TGG

CTG

CTG

TCC

GGA

CTA

CTC

ATG

GTG

CCC

TAC

CCC

GTG

TAC

5 ” 6

4 5

Aia

Thr

Tra

Leu

Leu

Ser

Gly

Leu

Leu

Met

Val

Pro

Tvr

Pro

Val

Ty r

130

135

190

ACT

GTC Val

GTG val ' 195

CAA Gin

CCA Pro

GTG Val

GGG Gly

CCT Pro 200

CGT Arg

GT^j Val

CTG Leu

CAG Gin

TGC Cvs 205

GTG Val

CAT Kis

CGC Arg

524

TGG

CCC

AGT

GCG

CGG

GTC

CGC

CAG

ACC

TGG

TCC

GTA

CTG

CTG

CTT

CTG

572

5

Trp

?ro

Ser

Ala

Arg

Val

Arg

Gin

Thr

Trp

Ser

Val

Leu

Leu

Leu

Leu

210

215

220

CTC

TTG

TTC

- CC

ATC

CCG

GGT

GTG

GTT

ATG

GCC

GTG

GCC

TAC

GGG

CTT

720

Leu

Leu

Phe

? h©

1 le

Pre

Gly

Val

Val

Ker

A L a

val

Ala

Tyr

Gly

Leu

2 2 5

230

235

240

10

A7C

TCT

CGC

GAG

CTC

TAC

TTA

GGG

CTT

CGC

GAC

GGC

GAC

AGT

GAC

7 53

2 le

Ser

Arg

Glu

Leu

Tyr

Leu

Gly

Leu

Arg

Phe

Asp

Gly

Asp

Ser

Asp

243

250

255

AGC

GAC

AGC

CAA

AGC

AGG

GTC

CGA

AAC

CAA

GGC

GGG

CTG

CCA

GGG

GCT

315

Ser

Asp

Ser

Gin

Ser

Arg

Val

Arg

Asn

Gin

Giv

Gly

Leu

Pro

Gly

Ala

15

250

255

270

GTT

CAC

CAG

AAC

GGG

CGT

TGC

CGG

CCT

GAG

ACT

GGC

GCG

GTT

GGC

GAA

364

val

Hl S

G L r.

A. s n

Gly

Arg

Cys

Arg

Pro

Glu

Thr

Gly

Ala

Val

Gly

Glu

275

2S0

235

GAC

AGC

GAT

GGC

TGC

TAC

GTG

CAA

CTT

CCA

CGT

TCC

CGG

CCT

GCC

CTG

512

20

Asp

Ser

Asp

Gly

Cys

T vr

Val

G i r.

Leu

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Aia

Leu

290

295

300

GAG

CTG

ACG

CG

CTG

ACG

GCT

CCT

GGG

CCG

GGA

TCC

GGC

TCC

CGG

CCC

950

Glu

Leu

Thr

Ala

Leu

Thr

Ala

Pro

Gly

Pro

Gly

Ser

Gly

Ser

Arg

Pro

205

210

315

320

25

ACC

CAG

GCC

AAG

CTG

CTG

GCT

AAG

AAG

CGC

G. G

GTG

CGA

ATG

‘•''n/·' i i O

CTG

1003

—

Gln

Aia

1 y s

Leu

Leu

A i a

Lys

Lys

Val

Val

Arg

Ker

Leu

Leu

2 z 5

2 30

335

30

GTG V a r

ATC i. e

G . i Val·

GTG Val 340

CTT Leu

Phe

Phe

CTG Leu

—«<·«·» . J . Cys T Λ C

TGG Trp

TTG Leu

CCA Pro

Val

TAT vi 350

AGT Ser

GCC Aia

1056

AAC

ACG

TGG

CGC

GCC

TTT

G AT

GGC

CCG

GGT

GCA

CAC

CGA

GCA

CTC

TCG

1104

Asn

Thr

Trp

Arg

Aia

Phe

Asp

Glv

Pro

Gly

Ala

Kis

Arg

Ala

Leu

Ser

355

360

365

GGT

GCT

CCT

ATC

TCC

TTC

ATT

CAC

TTG

CTG

AGC

TAC

GCC

TCG

GCC

TGT

1152

3 5

Gly

Ala

Pro

íle

Ser

Phe

íle

His

Leu

Leu

Ser

Tvr

Ala

Ser

Aia

Cys

370

375

33C

GTC

AAC

CCC

CTG

GTC

TAC

TGC

ATG

CAC

CGT

CGC

TrpT

CGC

CAG

GCC

1200

Val

Asn

Pro

Leu

val

Cys

Phe

Ker

Kis

Arg

Arg

Phe

Arg

Gin

Aia

335

390

395

400

40

TGC

CTG

GAA

ACT

TGC

GCT

CGC

TGC

TGC

CCC

CGG

CCT

CCA

CGA

GCT

CGC

1248

Cys

Leu

Glu

Thr

Cys

Aia

Arg

Cys

Cys

?ro

Arg

Pro

Pro

Arg

Ala

Arg

405

410

415

CCC

AGG

GCT

CTT

CCC

G AT

GAG

GAC

CCT

CCC

ACT

CCC

TCC

ATT

GCT

TCG

1296

Pro

Arg

Ala

Leu

Pro

Asp

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

?ro

Ser

íle

Ala

Ser

45

420

£ —i —

430

- 39 C7G

Leu

TCC AGG CTT AGC TAC ACG ACC A7C AGC ACA C7G GGC CCT GGC TGA Ser Arg Leu Ser Tvr Thr Thr íle Ser Thr Leu Gly ?ro Gly

435 ’ 440 445

134^

GAG GGG

- 40 £3 — 73

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Prečistená nukleová kyselina kódujúca člena rodiny cicavčích receptorov, gastrínu/cholecystokinínu B (CCK-B) ^lebo jeho fragment či analóg.
2. 2. Nukleová kyselina podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že zmienený člen je receptor gastrínu
3. 3. Nukleová kyselina podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že zmienený člen je receptor CCK-B
4. 4. Prečistená nukleová kyselina podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že zmienený člen leží na povrchu parietálnych buniek, buniek, modzgových buniek lebo buniek hladkého svalstva.
5. 5. Prečistená nukleová kyselina podlá nároku 4, vyznačujúca sa tým, že zmienené bunky sú psie bunky.
6. 6. Prečistená nukleová kyselina podlá nároku 4, vyznačujúca sa tým, že zmienené bunky sú ludské bunky.
7. 7. Homogénna populácia buniek, vyznačujúca sa tým, že každá zo zmienených buniek obsahuje klónovanú nukleovú kyselinu kódujúcu člena rodiny cicavčích receptorov gastrínu/CCK-8.
8. 8. Homogénna populácia buniek podlá nároku 7, vyznačujúca sa tým, že zmienené bunky exprimujú biologicky aktívny peptid z rodiny receptorov gastrínu/CCK-8.
9. 9. Homogénna populácia buniek podlá nároku 7, vyznačujúca sa tým, že zmienené bunky sú eukaryotické bunky.
10. 10. Homogénna populácia, buniek podlá nároku 7, vyznačujúca sa tým, že zmienené bunky sú bunky COS-7.

    41
11. 11. V podstate čistý polypeptidový receptor gastrínu pripravený pomocou nukleovej kyseliny podlá nároku 1.
12. 12. Polypeptid podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že zmienený polypeptidový receptor gastrínu má sled aminokyselín v podstate zhodný so sledom aminokyselín 1 až 453 sekvencie uvedenej v SEKV ID Č: 1:

    1 60 .^u.ELI,XLílRSA<2GSGAG?GASLCSAGGALLMSSGAGNI,SCS?PRLRGAG7RELELAIRVTL

    10 61 120

    YAV1FLMSVGGNVL1 ZWLGLSRRLRTV7NA?LLSLAVSDLLLAVÄCJíPFTLL?NLilGT?

    121 130 lEGTWCXAVSYL.'tGVSVSVSTLSLVAIALERYSAICRPZ.QARVWQTRSEÄARVIIÄTWM

    131 240

    15 Z.SGZ.LMV?Y?VY7AVQPAGGARALQC/KRMPSAR’/R0TWSVLLLtLL??VPGWMAVAYG

    241 300

    EZSRELYiGLSECE050SESRVRSQGGZ.RGGAG?G?APPNGSCRPEGGLAGEDGOGCYVQ

    301 360

    LPRSRQTLELSALTAPTPGPGGGPRPYQAXLĽAXXRVVRMI.I.VIVVLEEI.CWI.PI.Y'SANT

    20361 420 «RA?0SSGAHSAtSGA?:S?IHLtSYASAe/N?Í.VYC?MKRR?aQACi2tCÄRCC?RPPR

    421 453

    ARPR?LPDEDPPT?SIÄSLSar.SYTriSTXG?G
13. 13. Polypeptid podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že zdanlivá molekulová hmotnosť zmieneného polypeptidu (ak je glykozylovaný) je asi 76 000 daltonov.
14. 14. Polypeptid podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že polypeptid nie je glykozylovaný.
15. 15. Polypeptid podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že polypeptid je glykozylovaný.
16. 16. Polypeptid podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že zmienený polypeptid je exprimovaný ludskými bunkami.
17. 17. Polypeptid podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že zmienený polypeptid je exprimovaný ludskými parietálnymi bunkami, modzgovými bunkami lebo bunkami hladkého svalstva.
18. 18. V podstate čistý polypeptidový receptor CCK-B pripravený pomocou nukleovej kyseliny podlá nároku 1.
19. 19. Polypeptid podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že zmienený polypeptidový receptor CCK-B má sled aminokyselín v podstate zhodný so sledom aminokyselín 1 až ^447 sekvencie uvedenej v SEKV ID Č: 4:

    10 1 ÓO

    MEl.LXl.írRSVQGTG?G?GA51.CRPGAPLLMSSSVGNLSCEPPRIRGAGTaSLSLAIilTL

    5 L 120

    ÍAVIFLHSVGGNMĽirľVÚGLSRRLRCV’ľNAŤLLSLÄVSaLLĹ.AVÄCMPľ'rLLPírLHGTľ

    L21 130

    L 5 I PGTVICXAVS'ÍLXGVSVSSTtStVÄZAL£?.YSArcPP£.QAAVWQTRSKAAaVIVATWL

    131 240

    LSGLilMV? r P’mWQPVG? RVLQCVKPW? S AtlVPQTWSVLLLLl.I.FF IPGWMA.VSYGL

    241 300

    ISPEI.rLGE.PFDGOSOSOSQSPVRNQGGI.?GAVKQNGSCBPETGÄVGEDSDGC£VQLPSS
20. 20 301 ^3S0

    PPALELTAl.TAPGPGSGSRPTQAKI.jlAXXKVVPHLLVlWLFFl.CWLPVYSAírrWRAFDG

    361 ⁴²⁰

    PGAHRALSGAPISF IHLlSYASACVN?l.'ríCFMHPRFRQACl.FTCAPCC?RPPHARP5AL

    421 447

    2 5 POEDPPTPSIASCSRLSY’ľTISTl.GPG

    20. Polypeptid podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že zmienený polypeptid je glykozylovaný.
21. 21. Polypeptid podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že zmienený polypeptid nie je glykozylovaný.
22. 22. Polypeptid podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že zmienený polypeptid je exprimovaný ludskými bunkami.
23. 23. Polypeptid podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že zmienený polypeptid je exprimovaný ludskými parietálnymi bunkami, modzgovými bunkami lebo bunkami hladkého svalstva.
24. 24. Knižnica cDNA expresie parietálnych buniek.
25. 25. Knižnica podlá nároku 24, vyznačujúca sa tým, že segmenty cDNA zmienenej knižnice sú odvodené z psích parietálnych buniek.
26. 26. Knižnica podlá nároku 24, vyznačujúca sa tým, že segmenty cDNA zmienenej knižnice sú odvodené z buniek obsahujúcich ludské parietálne bunky lebo ludské hlavné bunky.
27. 27. Knižnica podlá nároku 24, vyznačujúca sa tým, že vektor expresie používaný vo zmienej knižnici cDNA má začiatok replikácie SV40.
28. 28. Knižnica podlá nároku 24, vyznačujúca sa tým, že vektor expresie používaný vo zmienej knižnici cDNA má cytomegalovírusový (CMV) promótor.
29. 29. Knižnica podlá nároku 24, vyznačujúca sa tým, že zmienená knižnica sa konštruuje s vektorom expresie, ktorý zahrnuje pcDNA-l, lambda gtlO lebo lambda gtll.
30. 30. Metóda na izoláciu nukleových kyselín kódujúcich polypeptidy, ktoré sú v parientálnych bunkách vrátane hodnotenia knižnice expresie cDNA podlá nároku 24.
31. 31. Metóda podía nároku 30, vyznačujúca se tým, že zmienené nukleové kyseliny kódujú receptor prostaglandínu E₂ (PGE₂).
32. 32. Metóda na identifikáciu antagonistu člena rodiny cicavčích receptorov gastrímu/CCK-B, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje dodanie agonistu člena rodiny receptorov gastrínu/CCK-B do kultivovaných buniek, transfektovaných prečistenou nukleovou kyselinou podía nároku 1, v prítomnosti kandidáta na antagonistu a stanovenie schopnosti zmieneného kandidáta na antagonistu búd a) brániť väzbe zmieneného antagonistu na zmieneného člena lebo b) blokovať vzrast voíného cytozólového vápnika indikovaný agonistom lebo c) blokovať aktiváciu fosfolipázy C indukovanú agonistom lebo

    d) blokovať aktiváciu adenylát cyklázy indukovanú agonistom, čo je indikáciou antagonistickej aktivity.
33. 33. Metóda podía nároku 32, vyznačujúca se tým, že zmienený agonista je gastrín.
34. 34. Metóda podía nároku 32, vyznačujúca se tým, že zmienený agonista je cholecystokinin (CCK).
35. 35. Metóda podľa nároku 32, vyznačujúca se tým, že zmienený agonista obsahuje CCK-8s, CCK-8d, CCK-4 lebo pentagastrín (CCK-5).
36. 36. Bakteriálna bunka transfekovaná prečistenou nukleovou kyselinou podía nároku 2, uložená v ATCC a označená č. 75195.
37. 37. Bakteriálna bunka transfekovaná prečistenou nukleovou kyselinou podía nároku 3, uložená v ATCC a označená č. 75196.
38. 38. Bakteriálna bunka transfekovaná prečistenou kyselinou podlá nároku 3, uložená v ATCC a č. 75303.

    nukleovou označená

    Antagonista člena rodiny cicavčích receptorov gastrínu/CCK-B identifikovaný metódou podlá nároku 32.