CS68091A2 - Synthetic polypeptides - Google Patents

Description

Syntetické polypeptidy

Oblast techniky

Vynález se týká syntetických polypeptidů, zejménatakových syntetických polypeptidů, které mají trojrozměr-»nou strukturu a/nebo elektrostatický povrch a/nebo jinéfyzikální, chemické a strukturní vlastnosti specifickýchobalových virových bílkovin. Zvláštní důraz je kladen namožnost výroby vakcín, imunologicky účinných léčebných lá-tek, diagnostických a dalších léčebných nebo vědeckýchprostředku v souvislosti s virem lidské imunodeficience(HIV), o němž je známo, že vyvolává syndrom získané defi-cience imunologického systému (AIDS).

Dosavadní stav techniky V posledním desetiletí se projevuje AIDS jako závaž-ný lékařský problém na celém světě a je tedy naléhavě nut-né nalézt další látky pro studium, diagnosu, léčbu a/neboprevenci infekce HIV, který je příčinou tohoto onemocnění. V poslední době jsou k dispozici řetězce aminokyselin, kte-ré tvoří bílkoviny virů HIV I a HIVII, tak jak bylo popsá-no například v publikaci Ratner L. a další, Nátuře 313, 277(1985), Neusing M. A. a další, Nátuře 313, 450 (1965),Wain-Hobson S. a další, Cell 40, 9 (19S5). Je tedy možnovyrobit syntetické polypeptidy s antigenními vlastnostmiobalových bílkovin.

Podstata vynálezu

Postatou vynálezu je vývoj syntetických polypeptidů,které mohou vyvolat tvorbu protilátek proti viru HIV, svýhodou tvorbu neutralizujících protilátek, to znamená pro-tilátek, které mohou zabránit vzniku infekce a/nebo omezitdalší nákazu virem HIV pasivní nebo aktivní imunizací. Pa-sivní imunizace těmito protilátkami může představovat vhodný 2 prostředek pro léčbu nemocných IIDS, takže bude možno za- bránit další nákaze a tím zpomalit šíření této choroby.

Podstatou vynálezu je tedy syntetický polypeptids alespoň jednou antigenní vlastností obalové bílkovinyalespoň jednoho kmene viru lidské imunodeficience (HIV),přičemž tento polypeptid je tvořen řetězcem aminokyselinobecného vzorce I X-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-Trp-Gly-

Cys-R8-K9-R10-R11-E12-Cys-Y (I) kde znamená Asp nebo Glu, R2 znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Gly, Ala,

Pro, Ser, Thr, Asn nebo Gin,

Rj znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Gly, Ala,

Pro, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn,Lys, His, Gin nebo Arg, R^, R„ a R^ znamenají nezávisle na sobě jakýkoliv zbytekaminokyseliny,

Rg a Rg znamenají nezávisle na sobě zbytek aminokyselinyze skupiny Gly, Ala, Pro, Ser, Thr nebo Asn, #7 znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Gly, Ala,

Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Asn, Gin, Fne, Tyr, Trp,

Cys, Líet nebo Pro,

Rg a R^p znamenají nezávisle na sobě zbytek aminokyselinyse skupiny Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Fhe,Tyr nebo Trp, R10 znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Lys, Hisnebo Arg a X a Y mohou nezávisle na sobě chybět nebo mohou znamenat 1 nebo větší počet, například tři další zbytky ami- nokyselin. - 3 -

Feptidy obecného vzorce I, a to bez obsahu X a Ybude možno využít například pro výrobu protilátek protiHIV. Jsou-li symboly X nebo Y přítomny, může být jejichdélka jakákoliv, s výhodou však méně než 20, ještě výhod-něji méně než 10, například 3 až 6 zbytků aminokyselin.

Je zřejmé, že řetězec obecného vzorce I může tvořit bílko-vinu, ve které budou tvořit řetězce X a Y převážnou částmolekuly a řetězce, který bude vyvolávat antigenní odpověď,bude například část exponované smyčky na globulární bílko-vině. S výhodou znamená R^ zbytek ze skupiny Gin nebo Thr,R^ zbytek ze skupiny Ser, Asn, Gin, Arg, nebo ala, zbytekze skupiny Leu, Ile, Gin nebo Arg, R^ zbytek Leu nebo Lys,

Rg zbytek Gly nebo Asn, R? zbytek ze skupiny Gly, Ala, Leu,Ile, Val, Met, Cys, Fne, Tyr, Trp nebo Ser, Ηθ zbytek Sernebo Ala, R^ zbytek Gly nebo Fhe, R^q Arg nebo Lys, R^ zby-tek ze skupiny Leu, His, Ile nebo Gin a R^2 zbytek ze sku-piny Ala, Ile nebo Val. Zbytek cysteinu v polohách 10 a 16je popřípadě vázán intramolekulárním disulfidovým můstkem.

Výhodná forma polypeptidů podle vynálezu je tvořenařetězcem aminokyselin obecného vzorce II X-Asp-Gln-RyLeu-R^-Gly-R^-Trp-Gly- (II)

Cys-Ser-Gly-Lys-R11-R12-Cys-Y kde R^, R^, ^2’ X a Y význam, uvedený v obecném vzorci I a R,? znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Gly, Ala,

Leu, Ile, Val, Met, Cys, Fhe, Tyr nebo Trp. S výhodou v řetězci obecného vzorce II R^ znamenáSer, Asn, Gin nebo Arg, R^ znamená Leu, His nebo Ile a Mí -4 - 4 - R.^2 znamená Ile nebo Ala. S výhodou znamená P-γ zbytek zeskupiny Ile, Fhe, Met, Val nebo Leu. Ještě výhodněji zna-mená R^ Ser nebo Asn a R^ znamená Lys. Výhodnou formou polypeptidu obecného vzorce II jeřetězec vzorce X-Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Irp-

Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y kde X a Y mají svrchu uvedený význam a zbytky cysteinu vpolohách 10 až 18 mohou být vázány disulfidovýmimůstky uvnitř molekuly.

Další výhodnou formou polypeptidu obecného vzorce IIje řetězec, v němž R^ znamená Gin nebo Arg, R^ je Leu, Rznamená Ile, Fhe a Met, R^^ znamená Leu, His nebo Ile aznamená ála. Výhodný řetězec má vzorec X-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Jle-Trp-

Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y kde X a Y mají svrchu uvedený význam a cysteinové zbytkyv polohách 10 a 16 mohou být vázány disulfidovýmimůstky uvnitř molekuly.

Folypeptidy obecného vzorce II napodobují některéepitopy obalové bílkoviny HIV I.

Další výhodnou formou polypeptidu podle vynálezuje řetězec aminokyselin obecného vzorce III X-Rl-R2-R3-R4-R5-Asn-Ser-?rp-Gly-Cys~Ala- (III)

Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y - 5 - kde R^ znamená Glu nebo Asp, R2 znamená Thr nebo Gin, znamená Ser, Asn, Arg, Gin nebo Ala, R^ znamená Leu, Tle, Arg nebo Gin, R^ znamená Lys nebo Leu a X a Y mají svrchu uvedený význam a cysteinové zbytky vpolohách 10 a 16 mohou být vázány disulfidovýmimůstky uvnitř molekuly. Výhodnou formou polypeptidu obecného vzorce III jeřetězec aminokyselin obecného vzorce lila X-Glu-Thr-R^-R.-Lys-Arn-Ser-Trp-Gly- 3 4 (lila)

Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y kde

Rj znamená zbytek Ser, Asn, Arg, Gin nebo Ala, R4 znamená Leu, Ile, Arg nebo Gin, X a Y mají svrchu uvedený význam a cysteinové zbytky v polohách 10 a 16 mohou být vázány disulfidovýmimůstky uvnitř molekuly. S výhodou znamená R^ zbytek ser v případě, Se R^znamená Ile a znamená-li Rg zbytek Ala, pak R^ znamenáArg nebo Gin, s výhodou Arg.

Polypeptidy obecného vzorce III jsou příbuzné ně-kterým epitopům obalových bílkovin viru HIV II. Výhodné polypeptidové řetězce podle vynálezu byly voleny na bázi své topografické podobnosti s v-fce než jednou antigenní determinantou obalových b<lkovin viru HIV.

Například antigenní determinanta, s níž je původně kon- 6 strnován daný polypeptid jako analogický, může také býttopograficky podobná s jednou nebo větším počtem dalšíchoblastí obalové bílkoviny HIV, pravděpodobně následkemduplikace genu nebo z toho důvodu, že polypeptid je ana-logen diskontinuální determinanty nebo také proto, že po-lypeptidy byly konstruovány tak, aby byly polyvalentní.

Liskontinuáln< epitop může být složen ze sekvenciálnfíchepitopů, které jsou si velmi blízké, avšak opačného smys-lu a mohou mít samy o sobě význam jako antigeny, polyvalentní polypeptid může obsahovat dva nebo větší počet konti-nuálních nebo diskontinuálních determinantních analogů vjediném polypeptidovém řetězci, takže je prostředkem kvyvolání tvorby celé řady protilátek, které budou rozpozná-vat dvě nebo větší počet determinant v obalové bílkoviněviru HIV.

Peptidy podle vynálezu mohou být vyrobeny napří-klad při použití standardního postupu pomocí S-fluorenylmethoxykarbonylové skupiny (F-Moc), například podle publi-kace Atherton E. a Sheppard R. C. (1985), J. Chem. Soc.Chem. Comm. 165 nebo postupem s použitím butyloxykarbonátu(T-Boc). Správnost struktury a čistota, která je obvyklenad 85 % se pečlivě kontroluje, zvláště je nutno dbát správnosti uspořádání vnitřních disulfidových můstků. K tomutoúčelu je možno ožít různé chromatografické analýzy včetněvysokotlaké kapalinové chromatografie a také spektrografic-ké analýzy včetně Ramanovy spektroskopie. Všechny řetězce jsou označovány kódem se třemipísmeny podle I.U.P.A.C. takto: Gly-glycín, Ala-alanin,Val-valin, Leu-leucin, Ile-isoleucin, Ser-serin, Thr--threonin, Asp-kyselina asparagová, Glu-kyselina glutamo-vá, Asn-asparagin, Gln-glutamin, Lys-lysin, His-histidin,Arg-arginin, Phe-fenylalanin, Tyr-tyrosin, Trp-tryptofan,Cys-cystein, Met-methionin a Pro-prolin.

Polypeptidy podle vynálezu nebo protilátky protitěmto polypeptidům je možno podávat jako takové nebo spolu - 7 - s dalšími látkami, jako jsou 3 '-azido-3 '-deoxyibyoiáiň.(AZT-zidovudin), které působí na různé úrovái tak, že dojdek interferenci při replikaci genetického materiálu virua/nebo k innibici proteázy HIV, která blokuje činnost en-zymu, který má podstatný význam pro vývoj viru.

Polypeptidy podle vynálezu je mošno užít k produk-ci protilátek, které budou reagovat s bílkovinami obaluviru, které jsou produkovány širokou škálou kmenů viruHIV I a/nebo HIV II. Analýzy prokázaly, že v případě, žetopografické, elektrostatické a/nebo strukturní vlastnostipolypeptidů podle vynálezu jsou takové, že je vysoce pravdě-podobné, že vyvolají tvorbu protilátek, které budou reagovatzkříženou reakcí s obalovými bílkovinami HIV několika nebomnoha kmenů, může být dosaženo dalšího pokroku tak, že seněkolik různých polypeptidů tohoto typu váže za vzniku vět-šího polypeptidů. Takový polypeptid je možno vyjádřit obec-ným vzorcem IV ΜΑΑλ íiv) kde F a G znamenají nezávisle na sobě polypeptidy obecnýchvzorců I až lila, L znamená vazný řetězec, a, b, c znamenají nezávisle na sobě O nebo 1 a man jsou kladná čísla, například 1 až 10 včetně. L znamená s výhodou krátký, flexibilní úsek poly-peptidového řetězce, například Gly-Gly-Gly-Gly-Gly,Gly-Pro-Gly-Fro-Gly-Pro nebo Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala.

Je zřejmé, že v každém opakování je možno užít odlišnouvariantu polypeptidů podle vynálezu.

Folyvalentní analogy determinant obecného vzorce IVjsou vlastně pseudohomopolyvalentní vzhledem k tomu, že va-rianty v podstatě téhož analogu determinanty se opakují vjediném řetězci polypeptidu. Mimoto je možno očekávat, žetaké jednoduché imunogenní hoaopolyvalentní polypeptidy,které obsahují mnohočetné kopie téže varianty téhož analo-gu determinanty obecného vzorce I až lila budou účinné vesvrchu uvedeném smyslu.

Pseudohomopolyvalentní imunogenní polypeptidy bu-dou pravděpodobně zvláště cenné jako vakcíny vzhledem ktomu, Že by měly vyvolávat produkci celé řady neutralizu-jících protilátek s podobnou, avšak nikoliv stejnou spe-cifičností, které by zkříženě reagovaly s obalovou bílko-vinou širší škály kmenů HIV a jejich účinnost by tedjr bylazvýšena a za"jištovala ochrannou imunitu. Bude patrně takévýhodné konstruovat heteropolyvalentr.í polypeptidy s obsa-hem jedné nebo většího počtu kopií polypeptidu podle vyná-lezu v jakémkoliv pořadí a mimoto budou obsahovat jeden ne-bo větší počet dalších polypeptidu jako analogů determinant.Tyto polypeptidy je možno vyjádřit obecným vzorcem V

La-[ (v) kde F znamená polypeptió, kteréhokoliv ze vzorců I až rlj a, G znamená polypeptid obecného vzorce I až lila nebo ještě jiný řetězec, man jsou kladná čísla, například 1 až 10 včetně ad, e znamenají nezávisle na sobě 0 nebo 1. S výhodou znamená L krátký flexibilní úsek poly- peptidového řetězce, například Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, - 9 -

Giy-Pro-Gly-Pro-GIy-Pro nebo Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala.Ve výhodné formě peptidu obecného vzorce V znamená G poly-peptidový řetězec obecného vzorce I až lila nebo následu-jící řetězec:

X-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Gly-Gly-Glu-Leu-Y kde každý ze zbytků Gly může být nahrazen jakoukoliv jinouaminokyselinou a/nebo X a Y mohou nezávisle na sobě chybětnebo mohou znamenat jeden nebo větší počet, například třizbytky aminokyselin nebo může G znamenat ještě jiný poly-peptidcvý řetězec, příbuzný antigenním bílkovinám HIV.

Je zřejmé, že podle vynálezu je možno do peptiduzařadit jakékoliv antigenně významné subfragmenty a/nebovarianty svrchu uvedených polypeptidových řetězců, kterési v podstatě udrží strukturu a funkci původního polypeptidu. Zejména je možné nahradit kterýkoliv zbytek zbytkem sesrovnatelnými strukturními a/nebo fyzikálními vlastnostmivčetně substituce vzácnými, avšak přirozeně se vyskytují-cími zbytky, jako D-stereoisomery nebo je možno zařaditsyntetické analogy aminokyselin. Je například možné pro-vést substituci zbytku za jiný zbytek v sestavách, kterébudou dále definovány a které rovněž rvoří podstatu vyná-lezu: sestava 1 - Ala, Val, Leu, Ile, Fhe, Tyr, Trp a Met,sestava 2 - Ser, Thr, Asn, a Gin, sestava 3 - Asp a Glu,sestava 4 - Lys, His a Arg, sestava 5 - Asn a Asp, sesta-va 6 - Glu a Gin, sestava 7 - Gly, Ala, Pro, Ser a Thr.D-stereoisomery všech typů aminokyselin je možno nahraditnapříklad zbytky D-Fne, D-Tyr a D-Trp.

Ve výhodném provedení vynálezu mohou X a Y nezá-visle na sobě obsahovat jeden nebo větší počet segmentůřetězce bílkoviny se schopností účinnosti epitopu proT-buňky. Například segmenty řetězce aminokyselin obecnéhovzorce 1-2-3-4, kde 1 znamená Gly nebo aminokyselinu, 10 - která nese náboj, například Lys, His, Arg, Asp nebo Gly, 2 znamená hydrofobní aminokyselinu, jako Ile, Leu, Val,

Met, Tyr, Fhe, Trp nebo Ala, 3 znamená hydrofobní aminoky-selinu ve svrchu uvedeném významu nebo polární aminokyse-linu bez náboje, jako Asn, Ser, Thr, Pro, Gin, nebo Gly a4 znamená polární aminokyselinu, jako Lys, Arg, His, Glu,Asp, Asn, Gin, Ser, Thr nebo Pro se chovají alespoň v ně-kterých případech jako epitopy pro T-buňky, jak bylo po-psáno v Rothbard J. B. a Taylor W. R. (1988), A sequencepattern in common to T-cell epitopes, v EMBO Journal 7 (1),93 - 100. Fodobné segmenty je možno vyjádřit řetězcem1 -2 -3 "4 -5 , kde 1 má obdobný význam jako 1 svrchu, 2* má význam jako 2, 3* a 4' mají význam jako 3 a 5' mávýznam jako 4. Obě formy těchto segmentů jsou zahrnuty dooboru vynálezu a mohou obsahovat jeden nebo větší početepitopň pro T-buňky (s výhodou méně než 5), které mohoubýt svrchu uvedeného typu nebo mohou mít odlišnou struk-turu a mohou být od sebe odděleny dělicími segmenty jaké-koliv délky a jakékoliv struktury, s výhodou obsahují ty-to dělicí,segmenty méně než pět zbytků aminokyselin, na-příklad zbytky Gly, Ala, Pro, Asn, Thr nebo Ser, nebo můžejít o polyfunkční vazné řetězce, jako aminokyseliny s vý-jimkou a-aminokyselin. C— nebo R-terminální vazný řetězecmůže představovat úplnou bílkovinu, takže odpadá nutnostkonjugace s nosnou bílkovinou.

Vynález zahrnuje také deriváty polypeptidů obecné-ho vzorce I, v němž X nebo Y jsou nebo znamenají "retro--inverso" aminokyselinu, to znamená bifunkční amin s funkč·ní skupinou, která odpovídá aminokyselině. Například můžebýt vyjádřen analog podle vynálezu s obsahem retro-inversoaminokyseliny obecným vzorcem

I i - 11 - r A1-N-C-N-A2 í i i

Η Η H kde R znamená jakoukoliv funkční skupinu, například glycino-vý postranní řetězec a AI a A2 znamenají kopie jednoho se svrchu uvedenýchanalogů (avšak nikoliv nezbytně téhož analogu),které jsou připojeny na K- nebo C-terminální za-končení .

Popřípadě může struktura obsahovat epitopy pro T--buiňky, jak již bylo uvedeno svrchu.

Retro-inverso modifikace peptidů zahrnuje změnujedné nebo většího počtu peptidových vazeb za vzniku analo-gů, které jsou vzhledem k enzymatické degradaci odolnějšínež původní molekula a jsou vhodnou eestou pro vznik roz-větvených imunogenů s obsahem vysoké koncentrace epitopů .

Je možno předpokládat možné využití těchto látek pro syn-tézu retro-inverso analogů s krátkým řetězcem a s vysokoubiologickou aktivitou ve velkém měřítku.

Je nutno uvést, že analogy s obsahem retro-inversoderivátů aminokyselin nelze vyrobit přímo s využitím re-kombinantní DNA. Avšak je možno vyrobit základní analogy,"které je pak možno čistit a chemicky vázat na retro-inver-so aminokyseliny metodami, obvyklými v chemii peptidů.

Vhodným novým postupem pro syntézu na řevné fázi je postup s použitím pryskyřice polyamidového typu, který byl pro retro-inverso peptidy poprán v publikaci Gazerro H., Pinori M. a Verdini A. S. , (1590), A new generál proceduře for the soiid-phase synthesis of retro-inverso peptides, v Innovation 12 and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Ed. Roger Epton, SPCC (GB), Ltd, Birmingham, Velká Británie.

Polypeptidy je možno vázat na nosná molekuly buopřes chemická skupiny, a to v rámci polypeptidů nebo přespřidaná aminokyseliny na C- nebo N-terminálním zakončení,tyto skupiny mohou být obklopeny jednou nebo větším počtemdalších aminokyselin nebo odděleně od polypeptidů tak, abybylo možno dosáhnout dobrá imunologické funkce. Sada vazebje vhodná pro tento účel, například je možno zařadit postran-ní řetězce zbytků Tyr, Cys a Lys. Vhodným nosičem je takéčištěný bílkovinný derivát tuberkulinu (PPD) toxoid tetanu,choleratoxin a jeho podjednotka B, ovalbumin, albumin zesera skotu, inhibitor trypsinu ze sojových bobů, muramyl-dipeptidy a jejich analogy a taká Braunův lipoprotein,přesto že je možno užít taká jiné nosiče, jak bude odborní-kům zřejmá, při použití PPD jako nosiče pro polypeptidypodle vynálezu je možno dosáhnout vyššího titru protilátekv případě, že příjemce konjugátu polypeptidů-PPD je jižcitlivý na rubErkulin, například protože byla dříve prove-dena vakcinace BCG. Pro vakcínu v lidském lékařství jenutno uvést, že ve Velké Britanii a dalších státech seběžně vakcinace BCG zdarma provádí a populace je protove své většině citlivá na PPD. Z tohoto důvodu se považujePPD v těchto státech za výhodný nosič.

Způsob vazby polypeptidů na nosič bude záviset napovaze materiálů, které jsou na sebe vázány. Napříkladzbytek lysinu v nosiči je možno vázat na C-terminální ne-bo jiný cysteinový zbytek v polypeptidů působením N-gamma--maleimidobutyryloxysukcinimidu podle publikace Kitagawa T. a Ackawa T. (1976), J. Biochem. 79 Ž33> Další vaznéreakce a vhodné reakční složky pro tyto reakce byly rov-něž popsány v literatuře.

Polypeptidy jako takové nebo vázané na molekulunosiče je možno podávat jakýmkoliv způsobem, jako paren- 13 - terálně do nosu, perorálně, rektálně nebo intravaginálně, popřípadě spolu s běžnými pomocnými látkami jako je hydro-^xid hlinitý jako Freundův úplný nebo neúplný pomocný pro-středek, a/nebo jiná látka, která může způsobit potenciaciimunologického účinku. Vynález rovněž zahrnuje prostředkys obsahem polypeptidů podle vynálezu, z nichž se tyto poly-peptidy uvolňují pomalu, může jít o podkožní implantát neboo depotní formu, jako jsou liposomy, popsané v publikaciAllison A. C. a Gregoriadis G., (1974) Nátuře (Londýn) 252,252 nebo jde o mikrokapsle, vyrobené z kopolymeru kyselinymléčné a kyseliny glykolové podle publikace Gresser J. D. aSanderson J. Ξ. (1984) v Eiopolymer Controlled ReleaseSystems, str. 127 - 138, vyd. D.L. Wise.

Polypeptidy podle vynálezu je možno syntetizovatjakýmkoliv běžným způsobem, jako přímo při použití manuál-ní nebo automatizované syntézy peptidů nebo nepřímo přessyntézu RNA nebo DNA postupy, které jsou obvyklé v moleku-lární biologii a genetickém inženýrství. Tyto techniky jemožno užít také k výrobě hybridních bílkovin s obsahem jed-noho nebo většího počtu polypeptidů, zařazených do dalšíhopolypeptidového řetězce.

Vynález tedy zahrnuje také molekulu DNA, která jekódem pro alespoň jeden syntetický polypeptid podle vyná-lezu, s výhodou je tato molekula zařazena do vhodného vek-toru pro expresi, schopného replikace v mikroorganismechnebo v buňkách ssavců. Tato DNA může také tvořit část ře-tězce DNA pro delší produkt, to znamená, že k expresi po-lypeptidů podle vynálezu dochází jako části jiných bílkovin,do nichž byly tyto polypeptidy vřazeny genetickým inženýr-stvím. Praktickým popisem těchto technik je publikaceMolecular cloning: a laboratory manual, Sambrook J., FritschΞ. F. a Maniatis T., 2. vydání, 1989.

Polypeptidy podle vynálezu je možno použít jako ta-kové nebo vázané na vhodný nosič, jako: 14 - a) peptidové vakciny k zábraně infekce jednim nebo většímpočtem kmenů HIV, b) jako vazné látky například při diagnostice ser nemocných,pozitivních na HIV, c) ke kontrole kvality v testech, například při vazbě proti-látek proti těmto polypeptidům, d) jako antigenní látky pro tvorbu monoklonálních nebopolyklonálnícn protilátek při imunizaci živočichů,tyto protilátky je možno využít například k i) vědeckým studiím viru HIV, ii) jako diagnostický prostředek, například jako částhistocheraických reakčních činidel, iii) k pasivní imunizaci nemocných virem HIV, buS k léčběAIDS nebo v kombinaci s dalšími účinnými látkami, jako AZT a/nebo inhibitory proteázy HIV, a iv) jako prostředek k zacílení účinku jiných-látek, jakojsou ΑΖΪ nebo inhibitor proteázy viru HIV v buňkách,infikovaných virem HIV, u nichž dochází k expresiobalových bílkovin HIV na jejich povrchu, přičemžtyto látky jsou bučí kovalentně vázány nebo jinak spojeny, například ve formě iiposomů, které tyto látky obsahují, tyto prostředky mohou rovněž obsahovatprotilátky, vytvořené proti jakémukoliv polypeptidus antigenním účinkem. Vynález se rovněž týká foremnebo fragmentů, vzniklých genetickým inženýrstvím,zejména oblastí V^ protilátek proti těmto polypepti-dům a humanizovaných forem protilátek, vytvořenýchproti těmto polypeptidům u jiných živočichů, a e) k léčbě infekcí HIV, buč omezením vazby viru HIV na buňky člověka nebo živočichů nebo rozrušením trojroz- měrné organizace viru in vivo, jakož i k vědeckým stu- diím virů HIV in vitro. - 15 -

Pokud jde o detekci a diagnózu HIV nebo protilátekproti HIV, odborníkům bude zřejmé, že existuje celá radaimunologických zkoušek, které jsou v oboru známy, jako jsoupoužití laminátových struktur, kompetitivní a nekompetitiv-vní zkoušky a přímé a nepřímé značení.

Vynález zahrnuje rovněž sestavu pro průkaz viru HIVnebo protilátek proti tomuto viru, tato sestava obsahujealespoň jeden syntetický polypeptid podle vynálezu.

Polyklonální nebo monoklonální protilátky, humani-zované formy těchto protilátek, uvedené například v publi-kaci Thompson K. M. a další, (1936), Immunology 58, 157 až160, protilátky proti jediné doméně, například podle publi-kace Ward S. S., Gussow D., Griffiths A. D., Jones P. aWinter G. (1989), Hature 341, 544 až 546 a protilátky, kte-ré by mohly procházet barierou mezi krevním oběhem v mozkua mimo mozek a které jsou schopné se specificky vázat nasyntetický polypeptid podle vynálezu je možno syntetizovatobvyklým způsobem, tyto protilátky jsou rovněž předmětemvynálezu. Protilátky podle vynálezu je možno užít mimo jinék diagnostice infekce HIV u ssavců tak, že se inkubuje vzo-rek tkáně nebo tělesné tekutiny ssavce s účinným množstvímprotilátky a pak se stanoví, zda došlo ke zkřížené reakcimezi vzorkem a protilátkou, a to jakou rychlostí a v jakémrozsahu. Diagnostická sestavg s obsahem alespoň jedné tako-vé protilátky rovněž tvoří součást vynálezu.

Vynález se rovněž týká syntetických polypeptidů,určených pro léčbu nebo profylaxi infekce HIV u ssavcůa/nebo ke stimulaci imunologického systému ssavců a/nebok blokování buněčných receptorů pro virus HIV a pro výrobuléků, vhodných k tomuto účelu. Vynález zahrnuje také far-maceutické prostředky, které jako účinnou složku obsahujialespoň jeden polypeptid nebo konjugát polypeptidů a nosičespolu s jedním nebo větším počtem farmaceutických pomocnýchlátek, a/nebo nosičů. Prostředky mohou být určeny' pro per· - 16 orální, rektální, nosní a zejména parenterální podánívčetně podání do centrálního nervového systému.

Peptidy podle vynálezu je tedy možno užít k léčběa profylaxi infekce HIV u člověka a/nebo ke stimulaci imu-nologického systému ssavců a/nebo k blokování buněčnýchreceptorů pro virus HIV, v těchto případech se podává účin-né množství těchto polypeptidů jako takových.nebo v kombi-naci s jinými látkami, určenými pro léčbu AIDS, jako jsouAZT a/nebo inhibitory proteázy HIV.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno násle-dujícími příklady, které však vynález nemají omezovat. Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Byla syntetizována C-terminálně extendovaná formazákladního peptidu a) s řetězcem

Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-GIy-Ile-Trp-

Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys při použití standardního postupu na pevné fázi (F-moc)a pak byl vytvořen intramolekulární disulfidový můstekmezi oběma cysteinovými zbytky. Peptid byl odštěpen odpryskyřice kyselinou trifluoroctovou a pak byl čištěnfiltrací na gelu, chromatografií na iontoměniči a vysoko-tlakou kapalinovou chromatografií v reversní fázi. Čisto-ta výsledného peptidu byla vyšší než 85 %· Do molekulybyl zařazen G-terainální alaninový zbytek, aby bylo možnosnáze uskutečnit konjugaci. Feptid byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem(PBS, 5 mg/ml) a pak byl přidán stejný objem ovalbuminu - 17 - (5 mg/ml) a pak byl přidán glutaraldehyd v konečná koncen-traci 0,1 %. Saěs konjugátu byla ponechána 30 minut stát apak byla emulgována s Freundovým pomocným činidlem. Každáovce (5 ovcí/skupina) byla imunisovéna 250/Ug peptidu veFreundově úplném pomocném prostředku (FCA) a po 14 dnechbylo podáno ještě stejné množství ve Freundově neúplném po-mocném prostředku (FIA). Další dávky byly podány po 3 až 4týdnech ve FIA. Vzorky krve byly odebrány 7 až 10 dnů poposlední dávce a byly zkoumány na vazbu na obalovou bílkovi-nu HIV.

Stanovení protilátek proti syntetickému peptidu,které rozpoznávají obalovou bílkovinu HIV bylo provedenopři použití rekombinantního viru vaccinia (například Macket14. a Smitn G. L. (1986), J. gen. Virol. 6? > 2067, obecnámethologie), tento virus byl konstruován tak, aby došlo kexpresi obalové bílkoviny HIV na povrchu infikovaných buněk.Tento postup je výhodný vzhledem k tomu, že vazba na anti-gen je měřena na povrchu buněk, infikovaných virem a z toho-to důvodu může být průkaznější než vazba na antigenv roz-toku, protože některé potenciální epitopy obalové bílkovinymohou být in vivo maskovány v důsledku interakce s fosfoli-pidy v membráně. Ledvinové buňky opic CV1, pěstované v jednévrstvě na mikrotitračních plotnách s 96 vyhloubeními bylyinfikovány rekombinantním virem vaccinia. Tato konstrukceviru obsahovala gen, který je kódem pro obalový glykoproteinHIV a je známo, že k expresi této látky a také ke zpracovánítéto látky dochází na povrchu infikovaných buněk. Byly pro-vedeny zkoušky s antiserem ovcí ve dvojnásobném opakování.Množství 50/ul antisera v různé koncentraci bylo přidáno dovyhloubení a směs byla inkubována 4 hodiny, pak byly buňkydvakrát promyty a bylo přidáno antiserum proti ovčím bílko-vinám, značené peroxidázou. Kladná reakce byla stanovenaodečtením optické hustoty příslušným zařízením.

Bylo prokázáno, že antisera proti peptidu mají

/ X zkříženou reakci a vysokou afinitu k obalové bílkovině 18 HIV, k jejíž expresi dochází na povrchu infikovaných buněk,jak je zřejmé z tabulek 1 a 1A. Tyto výsledky potvrzují, žeuvedené protilátky proti peptidu budou cenné pro výzkum ipro diagnostické líčely.

Tabu lkal

Zkřížená reakce mezi šerem ovcí, imunizovaných konjugátempeptidu (a) a rekombinantní obalovou bílkovinou HIV, kjejíž expresi dochází na povrchu buněk opičích ledvin zkřížená reakce kontrolní buněčná linie buněk opi linie opičích ledvin ledvin s expres obalové bílkoviny _____________________________HIV__________________________________ sérum imunisovaných ovcí - +++ kontrolní sérum

X) '•H

Tabulka IA

Typické titry positivních antiser z ovcí, imunisovanýchkonjugátem peptidu (a) při reakci s rekombinantní obalo-vou bílkovinou HIV, k jejíž expresi dochází na povrchubuněk opičích ledvin - 19 -

Střední hodnota optickéhustoty (ředění sera) vzorek sera (titr) 1_ 50 1_ 250 1 - 1250 1 1 156250 31250 kontrolní sérum ovce 0,344 0,288 0,197 0,012 0,016 sérum ovcí, jímž bylopředem podáno sérum 0,736 0,636 0,432 0,140 0,052 1 : 5000 a peptid (a) Z uvedené tabulky je zřejmé, že i při velkém zředě-ní sera z pokusných ovcí relativně po kontrole je titr pod-statně zvýšen. Příklad 2

Jednou z úloh neutralizujících protilátek je inni-bice přenosu viru z infikovaných buněk na buňky neinfiko-vané. Prevence nebo omezení rychlosti přenosů viru z T-bu-něk na makrofágy má podstatný význam, protože takto je mož-no podstatně prodloužit život nemocných s AIDS. Antiseraproti peptidu byla zkoumána na svou schopnost způsobit in-hibici tvorby syncitií in vitro. Jde o velké buňky s mnohajádry, které vzniknou v důsledku tvorby "můstků’’ mezi buň-kami, infikovanými HIV. Hýla syntetizována C-terminálně extendovaná formazákladního peptidu a) s řetězcem

Asp-Gln-Ser-L-eu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys s intramolekulárním disulfidovým můstkem mezi dvěma cys- teinovýai zbytky. Tato forma bylo syntetizována, čištěna, konjugována a užita k imunizaci skupin ovcí stejně jako 20 - v přikladu 1. Antisera proti peptidu byla užita při pokusuna neutralizaci HIV in vitro. Protilátky proti peptidu bylypřidány ke kultuře lidských T-lyafocytů in vitro, infikova-ných vysoce virulentním kmenem HIV a ke kultuře neinfikova-ných lidských makrofágů. Bylo prokázáno, že antisera protipeptidu způsobují inhibici tvorby syncitií v této směsnépopulaci ϊ-buněk a makrofágů, vystavené ÚSinku virulentní-ho kmene HIVI, což znamená, že došlo k inhibici přenosu in-fekce z T-buněk na makrofágy.

Bylo prokázáno, že protilátky mohou zabránit infek-ci makrofágů virem HIV a jsou tedy v tomto pokusu in vitroneutralizační, kdežto v kontrolní kultuře došlo k infekcimakrofágů, jak je zřejmé z tabulky 2.

Tanu fcZ. 3.

Neutralizace virulentního kmene HIV v kultuře in vitrolidských ϊ-lymf ocytů., infikovaných HIV a neinfikovanýchmakrofágů. +++ znamená vysokou úroveň infekce, zname- ná účinnou ochranu proti infekci buněčná kultura úroveň mí esce

T-lynfocyty, infikované virem HIV a neinfikované makrofágy +++ ϊ-lyiafocyty, infikované virem HIV, neinfikované makrofágy a protilátky proti peptidu a) positivní pokusu na tvorbu syncitií byla rovněž vyhodnocenaantisera proti peptidu A. Tento pokus určuje schopnost antisera zabránit přenos živého HIV z infikova-ných na neinfikované buňky a zabránit fúzi buněk, ke kterémůže docházet reaktivitou mezi glykoproteinem viru (gplóO) 21 a molekulou CD4· Stanoveni bylo prováděno detekcí syncitiía stanovením jejich počtu.

Fokus byl proveden takto: známá koncentrace buněčnélinie, která produkuje HIV (CD+4) a podporuje aktivní re-plikaci viru se třikrát promyje a pak se přidá zkoumané an-tiserum v různém ředění. Směs se inkubuje 20 minut při tep-lotě 27 °C, pak se buňky smísí v určitém poměru s indikáto-rovou buněčnáu linií CD4+, vysoce infikovatelnou HIV a snad-no vytvářející syncitia. Buňky se denně pozorují a sledujese tvorba těchto velkých buněčných útvarů.

Jak je zřejmé z tabulky 2» mohou protilátky protipeptidu a) zabránit tvorbě syncitií.

Tabulka 2

Inhibice tvorby syncitií mezi buňkami, produkujícími HIVa indikátorovou buněčnou linií antiserem vzorek sera inhibice· tvorby syncitií antiserum proti peptidu a) + (2/5 zvířat) normální sérum ovci Příklad 2 Různá sera nemocných, infikovaných HIV I v různýchstádiích postupu choroby AIDS, od asymptomatických nemocnýchaž k nemocným s plně vyvinutými příznaky byla odebrána tak,aby bylo možno získat representativní obraz reaktivity sertěchto nemocných se syntetickými peptiay při zkoušce ELISA.

Zkouška ELISA může stanovit stupeň reaktivity syn-tetických peptidů (analogických oblasti gpl20 nebo gp41 transmembránové bílkoviny HIV I, s protilátkou proti povr- chovému glykoproteinu HIV I v seru nemocných, která jsou positivní na tento virus. 100 entiser od positivních nemocných bylo uvedenodo reakee se syntetickým peptidem a). Dvě z těchto ser(od asymptomatických nemocných) obsahovala neutralizujícíprotilátky proti HIV a tato sera vykazovala zkříženou re-akci s peptidem a), jak je zřejmé z tabulky 4.

Tabulka 4

Zkřížená reakce peptidu a) se dvěma positivními antiseryna HIV od asymptomatických nemocných

Vzorek optická hustota (peptid a)) pufr normální sérum 1/1001/1000 HIV positivní (1) 1/1001/1000 HIV positivní (2) 1/100 0,056 0,476 0,140 s2,02,0>2,0 > >2,0 ί1,37' opakování

Claims (25)

1. - 23 - FATEK ϊ Ο V Ε NÁROKY

   1. Syntetický polypeptid s alespoň jednou antigenmvlastností obalové bílkoviny alespoň jednoho kmene virulidské imunodéficience HIV·, vyznačující že je tvořen řetězcem aminokyselin obecného vzor- ce i X- Rl~ R 2- Ry Ry Ry Rg - R? - Tr p-Gly -Gys-Hg-Rj-^O-^l-Rlj-Cy-Y (I) kde R„ znamená Asp nebo Glu, znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Gly, Ala.Pro, Ser, Thr, Asn, nebo Gin, znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Gly, Ala,Pro, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Lys, His, Gin neboArg, a E-j^ znamenají nezávisle na sobě jakýkoliv zbytekaminokyseliny, Eg a Eg znamenají nezávisle na sobě zbytek aminokyselinyze skupiny Gly, Ala, Pro, Ser, Thr nebo Asn, znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Gly, Ala,Val, Leu, Ile, Ser, Zhr, Asn, Gin, Pne, Tyr, Trp,Cys, Met nebo Pro, ri4 '7 Rr xO X a Y E^2 znamenají nezávisle na sobě zbytek aminokyselinyze skupiny Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Phe,Tyr nebo Trp, znamená zbytek aminokyseliny ze skupiny Lys, Hisnebo Arg a mohou nezávisle na sobě chybět nebo mohou znamenatl'nébo větší počet, například tři další zbytkyaminokyselin. 24 -
2. 2. Způsob výroby syntetického polypeptidu podlenároku 1, vyznačující se tím, že se zbyt-ky aminokyselin váží chemickým nebo biologickým způsobemnebo rekomoinantni technikou a polypeptid se izoluje. 3·' Způsob podle nároku 2, vyznačuj t i m , že Rg znamená Gin nebo Thr, R^ znamená Ser,Asn, Gin, Ar^ nebo Ala, íb znamená Leu, Ile, Gin nebo Arg,R^ je Leu nebo Lys, R^ je Gly nebo Asn, R? znamená Gly, AI Leu, rle, Val, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp nebo Ser, Ηθ znamená Ser nebo Ala, R^ znamená Gly nebo Fhe, R^q zname-ná Arg. nebo Lys, R-jznamená Ala, Ile nebo Val. znamená Leu, His, Ile, Gin a ‘12
3. 4·. Způsob podle nároku 3, vyznačujícíse t í m , že polypeptid je tvořen řetězcem aminokyselinobecného vzorce II X-Ásp-Gln-R^-Leu-R^-Gly-Ry-Trp-Gly- (II) Cys-Ser-Gly-Lys-R11-R12-Cys-Y kde R-, R^, R-q a R^2 mají význam, uvedený v nároku 3, Ry znamená zbytek Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Phe, Tyr nebo Trp a X a Y mohou nezávisle na sobě chybět nebo znamenat jedennebo větší počet zbytků aminokyselin.
4. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačujícíse t i □ , že R^ znamená Ser, Asn, Gin, nebo Arg, R.^znamená Leu, His nebo Ile a R^^ znamená Ile nebo Ala.
5. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačujícíse t i m , že R~ je Ile, Phe, Met, Val nebo Leu. - 25 - '•H
6. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačujícíse tím, že R^ znamená Ser nebo Asn a R^ je Lys.
7. 8. Způsob podle nároků 2 až 7 , vyznačujc í se t í □ , že polypeptid je možno vyjádřit vzorcem X-Asp-Gln-3er-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp- Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y kde X a Y mohou nezávisle na sobe chybět nebo znamenat jedennebo větší počet dalších zbytků aminokyselin.
8. 9. Způsob podle nároku 4, vyznačujíc! se t í ta , že Rj znamená Gin nebo Arg, R^ je Leu, R?.znamená lie, Rhe a Met, znamená Leu, His nebo Ile a R, znamená Ala , z /
9. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačujícíse t í m , že polypeptid je možno vyjádřit vzorcem 'A s ρ- LI n- Gln-Le u-Le u~ Oly- Ile-Trp- Gly-Cys-Ser— Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y kde λ Y muiL ’ nezávis' jeuen nebo ve-sx nebo znamenat.uyti<u xUGtiy .. ’. ”
10. 11. Způsob podle nároku 3, vyznač j i cse tím, že polypeptid je tvořen řetězcem aminokyse-lin obecného vzorce III X-R^-í^-Rn-R^-fic-Asn-Ser-Trp-Bly-Cys-Ala- Ph e - Ar g - G1 η - V a i - C y s - Y (III) kde znamená Glu nebo Asp, R, R- E, 26 znamená Tnr nebo Gin, je Ser, Asn, Arg, Gin nebo Ala, znamená Leu, Ile, Arg nebo Gin, znamená Lys nebo Leu a mohou nezávisle na sobě chybět nebo znamenat ječennebo větší počet zbytků aminokyselin.
11. 12. Způsob podle nároku 3 nebo 11, vyzná tím, že polypeptid je tvořen řetězcem aminokyselin obecného vzorce lila X-Glu-Thr-Ro-R,-Ly s-Asn-Ser-Tr-p-Gly--> 4 C y s - Ai a- Ph e - Ar g- Gin- V a 1- C y s - Y (lila) kde R3 znamená Ser, Asn R, znamená Leu, Ile 4 X a 1 mohou nezávisle sobě chybět nebo znamenat jedennebo vetší počet zbytků aminokyselin.
12. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačuji-t í m , že R^ znamená Ser v případě, že zna- mená Ile nebo R~ znamená Ala v případě, že R^ znamená Argnebo GLn.
13. 14. Způsob podle nároků 2 až 13, v y z n a č u -jící se tím, že cysteincvé zbytky v polohách 10a 16 polypeptidu jsou vázány uvnitř molekuly disulfidovýmimůstky..
14. 15. Způsob výroby syntetického polypeptidu obecné-ho vzorce IV Cl — r] — CLi—0] — .o a m b n c (IV) - 27 - kde F a G mohou znamenat nezávisle na sobě polypeptid obecné-ho vzorce I až lila, L je vazný řetězec, přičemž různé řetězce L mohou být stejné nebo různé, a, b, c mohou nezávisle na sobě znamenat číslo O nebo 1 aman jsou kladná čísla, vyznačující se timnebo biologicky nebo rekombinantnízbytky a polypeptid se izoluje. že se postupně chemickytechnikou na sebe váží
15. 16. Způsob výroby syntetického polypeptidu obecného vzorce V L^-rc-L^-F-tL-Gln-Le (Ví kde ičemž jed..utl4vé řetězce Lo různá, na i 0 nebo 1, je polypeptid podle některého ze vzorců I až lila, je polypeptid podle některého ze vzorců I až lila,nebo jiný řetězec, je vazný řetěze* "n; být sJ jsou in .~"ná číslamohou nezávisle z žt -c chemicky, biolo- vyznaeu^ici se t i agicky nebo rekombinantní technikou váži zbytky aminokyse-lin a výsledný polypeptid se izoluje.
16. 17. Způsob podle nároků 2 až 16, vyznačuj ci se tím, že polypeptid obsahuje retro-inverso aminokyseliny. c i se

    16. Způsob podle nároků 2 až 14, vyznačují- cí m , že polypeptid obsahuje antigenně významný 2δ - subfragment nebo variantu polypeptidu, tak, jak byl popsánv nárocích'2 až 14.
17. 19. Způsob podle nároků 2 až 18, vyznačujcí se tím, že polypeptid navíc obsahuje alespoň je·den epitop T-buněk.
18. 20. Způsob podle nároků 2 až 19, vyznačujc í se tím, že polypeptid je dále vázán na nosič p,vakeinu. '•HO Ol '•H | Íh ·Η 'H
19. 21. Způsob výroby vakciny, vyznačujícíse t 1 m , že se misi alespoň jeden syntetický poiypeptpodle nároků 2 až 20, který může vyvolat imunitu protínalspon jednomu kmeni HIV s jedním nebo větším počtem farma-ceuticky přijatelných pomocných látek a/nebo nosičů. HIV, valespoň
20. 22. Sestava pro detekci HIV nebo protilátek protiyznačujicí se tím, že obsahujejeden syntetický polypeptid podle nároků 2 až 19. 23. c í se tnantní DNA. Způsob podle nároků 2 až 19. vy z n a č u jí □ , že se užije postupu s využitím rekombi- 24· Způsob výroby farmaceutického prostředku, v yzradující se tím, Že prostředek obsahujejako svou účinnou složku alespoň ječen polypeptid podlenároků 2 až 20 a jeden nebo větší počet pomocných láteka/nebo nosičů. 25· Použití syntetického polypeptidu , vyrobeného podle nároků 2 až 20 pro výrobu fsrmaceutickýeh prostřed- ků pro léčbu a profylaxi infekce HIV u ssavců a/nebo pro stimulaci imunologického systému ssavců a/nebo pro bloko- váni buněčných receptorů pro virus HIV. 29 -
21. 26. Způsob výroby protilátek nebo jejich fragmentů,které se mohou vázat na antigen, zejména syntetický poly-peptid, vyrobený podle nároků 2 až 14, vyzná č u j ι-οί se t í m , že se imunizuje ssavec-. syntet ickým poly-peptidem, vyrobeným podle nároků 2 až 21 a protilátky seizolují.
22. 27. Diagnostická sestava pro detekci HIV nebo pro-tilátek proti HIV, vyznačující se tím, žeobsahuje alespoň jednu protilátku nebo fragment této pro-tilátky, který váže antigen, specificky syntetický poly-peptid podle nároků 2 až |4.

    26.Způsob výroby farmaceutického prostředku, vy-značující se tím, že jako svou účinnou slož-ku obsahuje protilátku nebo fragment této protilátky, kte-rý se specificky váže na syntetický polypeptid, vyrobenýpodle nároků 2 až 14 a jednu nebo větší počet pomociiýchlátek a/nebo nosičů, přijatelných z farmaceutického hle-diska .
23. 29. Způsob podle nároku 24 nebo 26, vyznaču-jící se tím, že se dále mísí ÁZT a/nebo inhibitorproteázy HIV se syntetickým polypeptidem nebo protilátkounebo fragmentem této protilátky, který se váže na antigen.
24. 30. Způsob diagnostiky infekce virem HIV u ssav-ců, vyznačující se tím, že se inkubujevzorek tkáně nebo tělesné tekutiny tohoto sssvce s účinnýmmnožstvím protilátky nebo fragmentu této protilátky, kterýje schopen vazby na antigen a specificky se váže na synte-tický polypeptid, vyrobený podle nároků 2 až 14, načež seprokazuje zda a do jaké míry a/nebo jakou rychlostí do-chází ke vzniku zkřížené reakce mezi uvedeným vzorkem aprotilátkou. 30 -
25. 31. Způsob diagnostiky infekce virem HIV nebo pří-tomnosti protilátek proti HIV nebo fragmentů této proti-látky, které jsou schopné se vázat na antigen, vy z n a -Sující se tím, že se inkubuje vzorek tělesnétekutiny s alespoň jedním polypeptidem, který byx. vyrobenzpůsobem podle nároků 2 až 20. 'Zastupuje:

    advokátka