CS658490A3 - Process and apparatus for treating electrophoresis carrier - Google Patents

Description

(KM'4 O

Vynález se týk á1· způsobu zpracovánínosiče pro elektroforézu a zařízení k provádění tohoto způ-sobu, v němž použitá kapalina proudí podél nosiče.

Analytické stanovení koloidních a makromolekulárních látek, například bílkovin se s výhodou provádí pomocí elektroforézy. Tento známý způsob stanovení spočívá v elektroforetickém dělení a následném zpracování, přičemž frakce vzorku jsou fixovány na nosiči a tím připra-»' vény k následnému vyhodnocení. V případě, že frakce majíbýt prokazovány optickými postupy, slouží následné zpracová-ní k jejich zviditelnění na nosiči. K tomu je nutno užítchemických reakcí, jako zbarvení a odbarvení. Tyto reakcejsou od sebe odděleny stupni, v nichž je nosič promýván.Některé nosiče je nutno promýt již před použitím, napříkladproto, -aby byly odstraněny, nežádoucí složky, například mo-nomery, zbývající po polymeraci, nebo z toho důvodu, že jenutno do nosiče vnést vodu, roztok pufru nebo určité činid-lo, například močovinu. Běžnými elektroforetickými nosičijsou gely, například agarosový nebo polyakrylamidový. Tytogely se užívají jako takové nebo uložené na pevném nosiči.Gely je například možno napolymerovat na folie nebo vlítna desku v případě horizontální elektroforézy nebo vlít • mezi dvě desky v případě vertikální elektroforézy. Je takémožno užít gely, zpevněné zesítěním. Vhodné velikosti Uži-tých nosičů jsou například (v cm): 30 x 20, lo x 18, 3x8, 10 x 15» 7 x 15, 5x1 nebo 5x2. Tyto nosiče seužívají běžným způsobem při různé tloušíce. Je také možnoužít nosiče ve tvaru válce. Uvedené nosiče je většinou mož-no užít jak pro elektroforézu v jednom směru, tak pro dvou-rozměrnou elektroforézu. Způsob podle vynálezu je vhodnýpro všechny uvedené nosiče. Přitom je účelné menší částinosiče ukládat do rámů jednotlivě nebo ve větším počtu. V US patentovém spisu č. 4 391 589se popisuje přístroj, který obsahuje větší množství vani-ček, které jsou určeny pro jednotlivé stupně stanovení. Vtomto přístroji postupuje nosič mechanicky z jedné nádržkydo druhé. V US patentovém spisu č. 4 222 643 se popisujepřístroj s obsahem bubnu, na němž je upevněn nosič, kterýje opakovaně ponořován do materiálu v nádobce, která se na-chází podáním. Kapaliny, které jsou ke zpracování nutné,se uvádějí do nádobky jedna po druhé. V patentové přihlášceč. WO 87/05111 se popisuje přístroj pro následné zpracovánínosičů, který je tvořen nádobkou, která je na svém víkuopatřena otočným přídržným zařízením, v němž jsou upevněnyelektroforetické nosiče. Pomocí tohoto zařízení se gel po-hybuje do nádobek a v použitých kapalinách. Všechny tyto přístroje jsou svoukonstrukcí ovlivněny ještě starými postupy, při nichž senosič ručně přenášel z jednoho stupně do druhého, z jednénádobky s určitou kapalinou do jiné nádobky a v nádobkách 4 byl oplachován ručně nebo jen s pomocí jednoduchého kyv-ného zařízení. Šlo tedy o diskontinuální způsob, v němžbučí byly kapaliny přiváděny jedna po druhé nebo byl nosičpostupně přenášen ;z jedné nádobky do druhé.

Vynález si klade za úkol navrhnoutzpůsob a zařízení, umožňující zpracování a zejména následnézpracování nosičů pro elektroforézu jednoduchým, pracovněnenáročným způsobem a v případě potřeby automaticky. ✓ Předmětem vynálezu je tedy způsobzpracování nosičů pro elektroforézu, který spočívá v tom,že kapalina, užitá ke zpracování, proudí podél nosiče. Vy-nález se rovněž týká zařízení k provádění tohoto způsobu,které je tvořen® nádobkou s přítokem a odtokem pro použitoukapalinu, přičemž kapalina proudí v části nádobky mezi pří-tokem a odtokem a nosič se při zpracování nachází v tétoprotékané části. V případě, že se zpracování nebo následnézpracování nosiče provádí ve větším počtu stupňů, vedou seodpovídající kapaliny nádobkou v příslušném pořadí. Způsobpodle vynálezu a zařízení je možno použít ke zpracovánínosiče před elektroforézou, například pro·· svrchu uvedenépromytí nebo nasycení některými látkami nebo k následnémuzpracování, například barvení nosičů, které již obsahujífrakce zpracovávaného vzorku. V průběhu způsobu podle vynálezu jenosič uložen při všech stupních zpracování v téže nádobce. Příslušná kapalina se do nádobky přivádí a opět se odvádí. V případě, že některý stupeň má trvat delší dobu, nechá sekapalina v průběhu této menší doby nádobkou kontinuálněprotékat. Tímto způsobem proudí podél nosiče. Tím docházík intenzifikaci chemických reakcí nebo promývacího postupuvzhledem k tomu, že kapalina, která je ve styku s povrchemnosiče je stále vyměňována. Není zapotřebí nosičem mecha-nicky pohybovat. Je možno přivádět kapalinu stále čerstvounebo ji nechat proudit v uzavřeném oběhu.

Zařízení podle vynálezu pro zpraco-vávání nosičů pro elektroforézu buň před elektroforézounebo po ní, kdy nosič obsahuje frakce vzorku je tvořenanádobkou s přítokem a odtokem pro kapalinu. Přítok a odtokjsou uloženy na různých místech nádobky, například proti-lehlé. Kapalina volně proudí nádobkou mezi přítokem a od-tokem. Nosič se v průběhu zpracováni nachází v té oblastinádobky, kterou proudí kapalina. Řízení tlaku kapaliny jemožno řídit také rychlost průtoku kapaliny v nádobce. Za-řízení může být upraveno tak, že kapalina proudí v podsta-tě vertikálně nebo v podstatě horizontálně. Úpravou příto-ku a odtoku v nádobce je možno také zajistit proudění šikmomezi vertikálním a horizontálním směrem. Výhodné je zaříze-ní, v němž proudí kapalina v podstatě vertikálně směremzdola nahoru. V případě, že je do takového přístroje uložennapříklad SDS-gel (polyakrylamidový gel s přísadou dodecyl-síranu sodného) bez pevného nosiče, udržuje se gel proudem kapaliny v plovoučívrstvě. V případě, že je rychlost prou-dění dostatečná, je mimoto nosič uložen tak, že jeho velkáplochy leží v podstatě paralelně se směrem proudění kapaliny.

Nosiče pro elektroforézu je možnodo nádobky uložit v určité poloze pomocí běžných přídržnýchpomůcek. Tyto pomůcky jsou upevněny k nosiči shora a/nebozespoda a/nebo se strany. Mohou mít také tvar rámu. Tytorámy mohou být upraveny například tak, že vytvářejí komorunebo větší počet komor, jejichž stěny jsou tvořeny jemnýmimřížkami. V případě, že je nosič přidržován v těchto pomůc-kách nebo rámech, jsou tyto pomůcky nebo rámy uloženy s vý-hodou rovnoběžně se směrem proudění kapaliny. Je taká možnoužít tyto pomůcky při proudění kapaliny směrem shora dolů.

Vynález bude dále osvětlen formoupříkladů v souvislosti s přiloženými výkresy.

Na obr. 1 je znázorněno jednoduchéprovedení zařízení podle vynálezu.

Na obr. 2 je znázorněn příčný řez prstencovitým přívodem.

Na obr. 3 je znázorněn pohled shorana přítok a na prstencovitý přívod.

Na obr. 4 je znázorněno další pro-vedení zařízení podle vynálezu.

Na obr. 1 je znázorněno jednoduchéprovedení zařízení podle vynálezu pro zpracování vždy jedno-ho nosiče. Toto zařízení je tvořeno nádobkou 1 válcovéhotvaru s přítokem 2 a-odtokem 4. Přítok 2 se rozšiřuje doprstencovitého přívodu 3» V nádobce 1 může být zavěšenamřížka 5, která překrývá celý horní otvor nádobky 1. Pří-tok 2 a odtok 4 jsou opatřeny potřebnými řídícími prvky.Odtok 4 je opatřen na svém konci, zasahujícím do nádobky-sítem. Prstencovitý přívod 3 je tvořen trubicí, která pro-bíhá rovnoběžně s vnitřní stěnou nádobky 1 a je na svéhorní polovině opatřena otvory. Kapalina je v každém stup-ni zpracování přiváděna přítokem 2 pod tlakem, vystupujeuvedenými otvory do nádobky 1 a pak odtéká odtokem 4. Vzhle-dem k tomu, že kapalina proudí otvory do nádobky 1 pod tla-kem, vzniká proudění. Tlak kapaliny se upravuje tak, že no-sič plave na kapalině, aniž by se dostal nad mřížku 5· Mříž-ka 5 slouží pouze k tomu, aby přidržovala nosič v případě,že by v důsledku poruchy bylo proudění příliš silné.

Na obr. 2 je znázorněn příčný řezprstencovítým přívodem 3· Otvor 6 je vybráním stěny trubice,které probíhá radiálně v úhlu přibližně 45° vzhledem ke dnunádobky 1.

Na obr. 3 je znázorněn pohled napřítok 2 a prstencovitý přívod 3. Otvory 6 jsou provedenyve stejné výšce nade dnem nádobky 1. Kruh je uložen na té straně trubice přítoku 2, která je přivrácena ke středunádobky 1«

Velikost nádobky 1 se volí tak, abynosič byl uložen v protékané části nádobky 1 bez ohybu. V případě, že se užije zařízení z obr. 1 až 3 napříkladpro zpracování SDS-gelu o velikosti 7 x 15 až 10 x 15 cm,aá aít nádobka 1 s výhodou následující rozměry: rvnitřní průměr nádobky 1 180 aa vnitřní výška nádobky 1 240 aa odstup odteku-4 od dna nádobky 1 180 aa odstup prstencovitého přívodu 3 od dna 2 aazevní průaěr prstencovitého přívodu 3 120 aa zevní průaěr přítoku 2 10 mm světlá šířka otvorů prstencovitého přívodu 3 4 1. ma počet otvorů 10

Kapalina se přivádí pod tlakemalespoň 6 kPa'. Tím dochází k tomu, že gel plave na kapa-lině, aniž by docházelo k oplachování mřížky 5.

Na obr. 4 je znázorněno další pro-vedení zařízení podle vynálezu. Toto zařízení jď tvořenonádobkou 7 válcového tvaru s konickým dnem, opatřenýmotvorem·10 a přívodní trubicí 8 a odtokovou trubicí 9.lýto části jsou analogické zařízení z obr. 1. Válcováčást nádobky 1 je rozdělena ochrannou mřížkou 11, která - 9 odděluje válcovou ďást nádobky 1 od její spodní skosenéčásti. Tato ochranná mřížka 11 zajišžuje, aby gel neucpalotvor 10. Také přívodní trubice 8 a odtoková trubice 9jsou opatřeny odpovídajícími řídícími prvky. Při tomto provedení je mo’žno odvéstkapalinu rychle a úplně z nádobky 1 otvorem 10. V případěkrátkého stupně zpracování nebo v případě vymývání nádobky1 je možno odpovídající kapalinu otvorem 10 přivádět a po-případě odvádět. Příklad 1

Zařízení z obr. 4 bylo použito probarvení SDS-elektroforetického gelu modří Coomassie.

Gel byl po provedené elektroforézeuložen bez nosné destičky do nádobky 7. Roztok barviva bylpřiváděn pod tlakem přívodní trubicí 8 a odváděn odtokovoutrubicí 9 a tímto způsobem obíhal roztok pomocí čerpadla20 až 30 minut. V průběhu této doby plaval gel v kapalině.Pak byla nádobka 7 zcela vyprázdněna otvorem 10. Pak bylpřiváděn přívodní trubicí 8 pod tlakem 30 minut odbarvova-cí roztok, který byl odváděn odtokovou trubicí 9. V tomtopřípadě byl přiváděn stále čerstvý roztok, bylo by věaktaké možné přivádět roztok v uzavřeném okruhu se zařazenýmregeneračním stupněm. V průběhu tohoto stupně gel opět 10 - v kapalině. Toto odbarvování se provádí tak dlouho, až jezákladní vrstva (téměř) bezbarvá. Pak se roztok zcela od-straní otvorem 10 a přívodní trubicí 8 se přivádí 2% vod-ný roztok glycerolu, který se odvádí odtokovou trubicí 9a nechá se proudit 20 minut v uzavřeném okruhu. Pak se gelvyjme z nádobky 7 a usuší. Příklad 2 V provedení z obr. 4 se barví SDS--pólyakry1 amidový gel stříbrem podle Oakleye.

Po skončení elektroforézy se geluloží do nádobky 7 bez nosné destičky.

Stupeň 1

Odbarvovací roztok, sloužící k od-stranění bromthymolové modři (označení čela) se pod tlakempřivádí přívodní trubicí 8 a odvádí se odtokovou trubicí 9v uzavřeném okruhu. V průběhu tohoto postupu plave gel vkapalině. Postup trvá 20 minut, odbarvovací roztok se pakvypustí otvorem 10. 11 -

Stupen 2 Nádobka 7 se naplní deionizovanouvodou a ihned se opět vyprázdní. Voda se přivádí i vy-pouStí otvorem 10.

Stupeň 3

Do přívodní trubice 8 se přivádí10% roztok glutardealdehydu pod tlakem a odvádí se odtoko-vou trubicí 9. Gel plave v kapalině. Postup trvá 20 minut,roztok proudí v uzavřeném okruhu pomocí čerpadla. Pak seroztok vypustí otvorem 10.

Stupeň 4

Vypláchnutí nádobky 7 deionizovanouvodou se provádí obdobným způsobem jako ve stupni 2. Totovypláchnutí nádobky 7 se provádí alespoň třikrát.

Stupeň 5

Gel se 30 minut intensivně proplachu-je deionizovanou vodou, voda se přivádí pod tlakem přívodnítrubicí 8 a odvádí odtokovou trubicí 9. Přivádí se stálečerstvá deionizovaná voda, voda se pak zcela vypustí otvo-rem 10. 12 -

Stupeň 6

Vyplachování nádobky se provádístejně jako ve stupni 2.

Stupeň 7

Otvorem 10 se přivede do nádobky 7roztok dusičnanu stříbrného v amoniaku. Roztoku se přivedetolik, že je gel překryt. Pak se nechá roztok v nádobce 715 minut stát.

Tento stupeň je možno provést takétak, že se roztok dusičnanu stříbrného přivádí přívodnítrubicí 8 pod tlakem a odvádí se odtokovou trubicí 9. Stu-peň pak trvá 10 minut při proudění roztoku v oběhu. V každém případě se pak roztok du-sičnanu stříbrného bezezbytku vypustí otvorem 10. Nádobka7 se pak krátce vypláchne 3 až 5krát, přičemž se otvorem10 přivádí i vypouští deionizovaná voda. V případě, že by-lo použito přívodní trubice 8 a odtokové trubice 9, jenutno důkladně vyčistit také tyto části zařízení.

Stupeň 8 Přívodní trubicí 8 se přivádí vy-víjecí roztok. Roztok se odvádí odtokovou trubicí 9 aproudí v uzavřeném oběhu. Po 5 až 10 minutách se roztok - 13 - vypustí otvorem 10. Doba zpracování v tomto stupni se řídípodle zpracovávaného vzorku.

Stupeň 9

Deionizovaná voda se přivádí stálečerstvá 1/2 hodiny přívodní trubicí 8 pod tlakem a odvádíse odtokovou trubicí 9.

Analogickým způsobem je možno zařa-dit ještě další stupně zpracování. Po ukončeném zpracováníse gel vyjme a připraví sek vyhodnocení. Příklad 3

Zařízení je možno užít také ke zpra-cování pólyakrylamidového gelu před použitím pro elektro-forézu.

Postupy, uvedené v příkladové částije možno užít také ke zpracování jiných nosičů, a to vesvrchu uvedených rámech nebo při použití přídržných pomů-cek.

Zařízení podle vynálezu je možnoještě pozměňovat a doplňovat různým způsobem. Přítok s prstencovým přívodem, takjak byl svrchu popsán, může být vytvořen také jiným způsobem. i - 14 - Může jít o prstencový přívod, pevně spojený se stěnou ná-dobky. Otvory mohou být nahrazeny také dnem, opatřenýmsítem. Zvláště v menších nádobkách může být prstencovýpřívod nahrazen trubicí rovného tvaru s odpovídajícímiotvory. Místo otvorů mohou být provedeny pro přívod a po-případě i pro odvod kapaliny ve stěně nádoby štěrbiny.

Toto uspořádání je vhodné zvláště v tom případě, že nosičmá být zpracováván v horizontální poloze. Pak může být za-řízení upraveno tak, že kapalina proudí horizontálně, ná-dobka má malou výšku, štěrbiny pro přívod a odtok kapalinyjsou uloženy na opačných stranách nádobky v prodlouženípodélného směru nosiče.

Dno nádobky může být rovné nebo zvlněné. V případě, že má být v jedné nádobcezpracováván větší počet nosičů, je účelné, aby přívod aodtok kapaliny byl uspořádán tak, že kapalina bude rovno-měrně rozdělena v protékané části nádobky. Toho je možnodosáhnout například tak, že bude vedle sebe uložen většípočet prstencových přívodů, přívodních trubic nebo štěrbin,počet bude s výhodou odpovídat počtu nosičů.

Velikost zařízení s výhodou odpovídávelikosti zpracovávaného nosiče. Nosič by měl být obklopenna všech stranách vrstvou kapaliny alespoň 1 až 10, s výho-dou 3 až 5 on. - 15 - V případě, že nosiče mají velmi roz-dílnou velikost a mají být zpracovávány v tomtéž zařízeni,je účelné upravit odtok v zařízení z obr. 1 z obr. 4 tak,aby bylo možno výšku vrstvy kapaliny upravovat v závislosti *na velikosti nosiče. Toho je možno dosáhnout například tak,že v různé výšce nádobky jsou provedeny výstupní otvory. Při zpracování malého nosiče se pak užije spodního výtoko-vého otvoru. Další možnost spočívá v tom, že výstupní otvorje upraven posuvně v části výšky stěny nádobky. Při použití svrchu uvedených rámůje možno užít různé přídržné pomůcky, například kolejnice,z nichž jsou rámy posuvně uloženy.

Zařízení může být také opatřeno vy-hřívací spirálou nebo výměníkem tepla. Mimoto je možno při-vádět do zařízení kapalinu s různou teplotou. Tím je možnokaždý stupeň provádět při optimální stálé teplotě. Teplot-ní průměr je možno upravovat také s ohledem na sériová vy-šetření. V případě použití vyšší teploty je možno dosáhnoutzkrácené doby zpracování. K lepšímu pohybu kapaliny je možnodo zařízení zařadit míchací zařízení, s výhodou magnetickémíchadlo.

Postiip je možno také automatizovattak, že se přívod a odtok kapaliny řídí příslušnou řídícíjednotkou, například počítačem. - 16 -

Zařízení může být provedeno také tak,že obsahuje větší počet svrchu popsaných nádobek, takže jesoučasně možno provést větší počet zpracování. Podle úpravy,například počítačem, je možno tato zpracování provádět sou-běžně nebo zcela nezávisle. V řadě postupů pro zpracování nosičů,zejména v případě barvení je účelné zařadit do zařízení zá-sobník pro poměrně koncentrované reakční roztoky. Tyto re-akční složky se mísí před přívodem do nádobky přímo v pří-vodním potrubí nebo ve zvláštní mísící komoře s odpovídají-cím množstvím rozpouštědla.

Ve srovnání s běžným ručním zpraco-váním nebo se známými zařízeními pro toto zpracování majízpůsob a zařízení podle vynálezu následující zřejmé výhody. 1. Ve srovnání s ručním zpracovánímse získává velké množství času odborného pracovníka. Při provádění způsobu podle vynále-zu zahájí pracovník jednotlivé stupně pouze přepnutím ří-dicí jednotky a dále již nemusí do zpracování zasahovat.Řízení je možno provádět také počítačem. Naproti tomu přiručním zpracování je zapotřebí častá manipulace s nosičem,zvláště náročná jsou déletrvající stupně, například odbar-vování a proplachování mezi barvicím a odbarvovacím stupněm,při němž je zapotřebí alespoň pětkrát nosič opláchnout vždypo 5 až 10 minutách. Při provádění způsobu podle vynálezu - 17 - je naproti toau nosič oplachován kontinuálně celkea 30 ii-nut, aniž by ausel být pracovník přítomen. 2. Doba zpracování v jednotlivýchstupních je zkrácena vzhledem k tomu, že kapalina je prou-děním stále obnovována. 3. Při provádění způsobu podle vy-nálezu se při kontinuálním provozu může optimalizovat ve-likost zařízení v závislosti na velikosti zpracovávanéhokovu, čímž je možno optimalizovat spotřebu reakčních čini-del, Regenerací spotřebovaných činidel je možno dále snížitspotřebu jednotlivých činidel, takže pak odpovídá spotřeběpři běžných postupech. 4* Zařízení podle vynálezu je jedno-duché a nevyžaduje použití žádných mechanicky pohyblivýchčástí. Je vhodné pro všechny běžné nosiče a také pro různévelikosti těchto nosičů. Současně je možno zpracovávatvětší počet nosičů v případě, že jsou vhodným způsobemupevněny například v rámu. Uložení nosičů do zařízení jejednoduché například při použití rámů, zasunutelných donádobek. Odpadá například obtížná montáž nosičů do pohyb-livých přídržných pomůcek.

Claims (6)

- 18 - ΙΨ G ..... PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob zpracování nosiče pro IV elektroforézu, vyznačující se tím, že kapalina, "užitá ke zpracování proudí podél povrchu nosiče»

2. Způsob podle bodu 1, pro zpraco-vání ve větším počtu stupňů, vyznačující se tím, že se ka-paliny, užité ke zpracování přivádějí jedna po druhé aproudí podél povrchu nosiče.

3* Zařízení k provádění způsobupodle bodu 1, vyznačující se tím, že je tvořeno nádobkou(1, 7) s přítokem (1, 8) a odtokem (4, 9) pro použitoukapalinu, přičemž kapalina protéká oblastí nádobky (1, 7)mezi těmito jejími částmi a nosič je v průběhu zpracováníuložen v tomto úseku nádobky (1, 7)·»

4. Zařízení podle bodu 3 ke zpraco-vání nosičů ve větším počtu stupňů, vyznačující se tím, žeje tvořeno nádobkou (1, 7) s přítokem (2,8) a odtokem (4, 9)pro použité kapaliny, přičemž přítok (2,8) a odtok (4,9)jsou provedeny v různých částech nádobky (1, 7), kapalinyvolně protékají jedna po druhé úsekem nádobky (1, 7) mezitěmito jejími částmi a nosič je v průběhu zpracování uloženv tomto úseku nádobky (1, 7). - 19 -

5. Zařízení podle bodu 3 nebo 4,vyznačující se tím, že přítok (2, 8) a odtok (4, 9) jsouupraveny tak, že kapaliny nebo kapaliny proudí v podstatěvertikálně nebo horizontálně.

6. Zařízení podle bodů 3» 4 nebo 5»vyznačující se tím, že přítok (2,8) a odtok (4, 9) jsouuloženy ve spodní a horní části nádobky (1, 7) tak, že ka-palina, přiváděná pod tlakem proudí směrem zdola nahoru. 60 7J99/KO

Zastupují

Z