CS277474B6 - Způsob inaktlvace katalázy - Google Patents

Abstract

Způsob ireverzibilní inaktivace katalázy v buňkách Aspergillus niger a v technických glukózaoxidázových preparátech se provádí tak, Že se mycelium Aspergillus niger nebo technický preparát glukózaoxidázyuvede do styku s 0,1 až 5 % hmot. metanalem a 0,5 až 5 % hmot. peroxidem vodíku při 4 až 15 °C a po 5 až 30 minutách se glukózaoxidáza izoluje a puriflkuje známými postupy. Tímto způsobem je možné jednoduchým způsobem připravit preparáty glukózaoxidázy bez katalázové aktivity, výsledný preparát neobsahuje složky inaktivační směsi.

Description

Vynález se týká způsobu inaktivace katalázy v buňkách vláknitých hub i v jejich bezbuňkových extraktech.

Enzym glukózaoxidáza má široké použití v klinické diagnostice, desacharizaci potravinářských výrobků, stabilizaci nápojů i v dalších odvětvích. I když je glukózaoxidáza produkovaná různými mikroorganismy, v průmyslovém měřítku se používají jako zdroj tohoto enzymu vláknité houby Aspergillus niger a Penicillium species. V takto získaných enzymových preparátech je však glukózaoxidáza doprovázená enzymem katalázou, který je při mnohých aplikacích glukózaoxidázy nevýhodný, protože působí rušivě na specifickou reakci, kterou tento enzym katalýzuje (Bergmeyer, V. H.: In Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 2, Verlag, Weinheim, 1983). Tak tomu je například při přípravě testů, respektive indikátorových papírků na stanovení cukrů, především glukózy v médiích a v tělních tekutinách.

K separaci glukózaoxidázy od katalázy se nejčastěji používá ionová chromatografie se slabým anexem (Pat. ČSSR 103 453, Sasaki et al.: J. Biochem. 91, 1555 (1982), Mikeš, O. et al.: J. of Chromatog. 148, 237 (1978)), ionová hydrofóbní chromatografie na Amberlitě CG-50, gélová filtrace na Sefadexu G-150 a 200 (Brochert, A.: J. of Chromatog. 244, 49, (1982)), afinitní chromatografie na imunosorbentu (Clark, L. C.: Ann. N. Y. Acad. Sci. 102, 29 (1962)) a další metody.

Nevýhodou těchto metod z hlediska průmyslového použití je vysoká cena a dostupnost chromatografických náplní, kapacita kolon, časová náročnost a často i nutnost zařazení nových technologických operací (například odsolení). Při přípravě technického preparátu glukózaoxidázy běžné metody separace enzymu, jako je srážení síranem amonným (Pat. ČSSR 103 453, 143 103), diaminoetoxyakridínlaktátem (Pat. NSR 2 308 013) neumožňuje přípravu glukózaoxidázového preparátu bez katalázové aktivity. Také přídavek inhibitorů katalázy (těžké kovy, azidy, soli hydroxylamínu, 2,4-dichlorfenol, tiazolové deriváty a další) není při mnohých aplikacích glukózaoxidázy žádoucí a navíc je účinek mnohých inhibitorů reverzibilní (Webb J. L.: In Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academie Press, New York, (1966)).

Inaktivace katalázy způsobem podle vynálezu je velmi výhodná, protože je možné jednoduchým způsobem vysoce selektivně ireyerzibilně inaktivovat enzym katalázu v glukózaoxidázových preparátech, získaných z buněk vláknitých’ hub. Navíc je možné katalázu inaktivovat přímo v buňkách vláknitých hub a glukózaoxidázu potom izolovat z buněk běžnými separačními postupy, což zjednodušuje podstatně celý izolační proces. Enzymové preparáty, získané způsobem podle vynálezu, neobsahují reziduální látky z inaktivační směsi, protože peroxid vodíku je rozkládán v průběhu inaktivace působením enzymu katalázy a zbytkový formaldehyd se odseparuje od enzymu glukózaoxidázy v procesu izolace enzymu (ultrafiltrace, precipitace).

Způsob inaktivace katalázy podle vynálezu spočívá v tom, že se buněčná hmota vláknité houby Aspergillus niger nebo z ní izolovaný hrubý enzymový preparát glukózaoxidázy uvede do styku s roztokem obsahujícím 0,1 až 5 % metanal a 0,5 až 5 % peroxid vodíku a směs se míchá při 4 až 20 °C po dobu 5 až 20 minut. Po inaktivaci katalázy se glukózaoxidáza izoluje z buněk Aspergillus niger a dále purifikuje běžnými postupy.

Výhodou navrhovaného způsobu inaktivace katalázy v přítomnosti glukózaoxidázy v buňkách vláknitých hub a v technických preparátech glukózaoxidázy v porovnání s doposud používanými postupy je, že předmětný způsob je ekonomicky nenáročný s jednoduchými technologickými operacemi, inaktivace katalázy je ireverzibilní a výsledný preparát neobsahuje složky inaktivační směsi. Navíc je možné inaktivovat selektivně katalázu přímo v buňkách vláknitých hub, což podstatně zjednodušuje přípravu technických preparátů glukózaoxidázy.

Vynález ilustrují následující příklady provedení, kterými se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.

Příklad 1

Do 500 ml vodní suspenze mycelia Aspergillus niger CCM 8004 (sušina 15 g/dm³) s aktivitou glukózaoxidázy 40.10³U/g (suchá váha) a katalázy 2,5.10⁶ U/g (suchá váha) (definice U - viz Wortington Enzyme Manual, Wortington Biochemical Corp. Freehold, New Yersey, 1972) bylo přilito 500 ml vodního roztoku obsahujícího metanal (1 % hmot.) a peroxid vodíku (1 % hmot.). Směs se míchala při 6 °C po dobu 10 min a potom se mycelium oddělilo od tekutého podílu filtrací. Mycelium obsahovalo 94 % glukózaoxidázové a 2 % katalázové aktivity, původně obsažené v myceliu. ’

Příklad 2

Do 50 ml vodního roztoku technické glukózaoxidázy (aktivita glukózaoxidázy 130 U/cm³, katalázy 7 500 U/cm³) bylo přilito 50 ml vodního roztoku obsahujícího 1 % (hmot.) metanalu a 2 % (hmot.) peroxidu vodíku. Směs se míchala při 4 °C po dobu 5 minut. Enzymy byly v daném čase precipitované ledovým etanolem (poměr voda : etanol =9 : 5) a oddělené centrifugací. Po resuspendování sedimentu obsahoval preparát 90 % původní glukózaoxidázové a 1 % katalázové aktivity.

Claims (1)

1. Způsob inaktivace katalázy vedle glukózaoxidázy, vyznačující se tím, že se buňky vláknité houby Aspergillus niger nebo vodné technické glukózaoxidázové preparáty připravené z mycélia vláknité houby Aspergillus niger uvedou do styku s vodným roztokem, obsahujícím metanal v koncentraci 0,1 až 5 % hmot, a peroxid vodíku v koncentraci 0,5 až 5 % hmot, a směs se míchá při 4 až 15 °C po dobu 5 až 30 minut.

   Konec dokumentu