CS277474B6

CS277474B6 - Method for catalase inactivation

Info

Publication number: CS277474B6
Application number: CS896718A
Authority: CS
Inventors: Michal Ing Csc Rosenberg; Ernest Doc Ing Csc Sturdik
Original assignee: Univ Slovenska Tech
Priority date: 1989-11-29
Filing date: 1989-11-29
Publication date: 1993-03-17
Also published as: CS671889A3

Abstract

Způsob ireverzibilní inaktivace katalázy v buňkách Aspergillus niger a v technických glukózaoxidázových preparátech se provádí tak, Že se mycelium Aspergillus niger nebo technický preparát glukózaoxidázyuvede do styku s 0,1 až 5 % hmot. metanalem a 0,5 až 5 % hmot. peroxidem vodíku při 4 až 15 °C a po 5 až 30 minutách se glukózaoxidáza izoluje a puriflkuje známými postupy. Tímto způsobem je možné jednoduchým způsobem připravit preparáty glukózaoxidázy bez katalázové aktivity, výsledný preparát neobsahuje složky inaktivační směsi.The method of irreversible inactivation of catalase in Aspergillus niger cells and in technical glucose oxidase preparations is carried out in such a way that the mycelium of Aspergillus niger or the technical preparation of glucose oxidase is brought into contact with 0.1 to 5% by weight of methanol and 0.5 to 5% by weight of hydrogen peroxide at 4 to 15 °C and after 5 to 30 minutes the glucose oxidase is isolated and purified by known methods. In this way it is possible to prepare glucose oxidase preparations without catalase activity in a simple way, the resulting preparation does not contain the components of the inactivation mixture.

Description

Vynález se týká způsobu inaktivace katalázy v buňkách vláknitých hub i v jejich bezbuňkových extraktech.The invention relates to a process for the inactivation of catalase in filamentous fungal cells and in their cell-free extracts.

Enzym glukózaoxidáza má široké použití v klinické diagnostice, desacharizaci potravinářských výrobků, stabilizaci nápojů i v dalších odvětvích. I když je glukózaoxidáza produkovaná různými mikroorganismy, v průmyslovém měřítku se používají jako zdroj tohoto enzymu vláknité houby Aspergillus niger a Penicillium species. V takto získaných enzymových preparátech je však glukózaoxidáza doprovázená enzymem katalázou, který je při mnohých aplikacích glukózaoxidázy nevýhodný, protože působí rušivě na specifickou reakci, kterou tento enzym katalýzuje (Bergmeyer, V. H.: In Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 2, Verlag, Weinheim, 1983). Tak tomu je například při přípravě testů, respektive indikátorových papírků na stanovení cukrů, především glukózy v médiích a v tělních tekutinách.The enzyme glucose oxidase is widely used in clinical diagnostics, desaccharization of food products, stabilization of beverages and in other industries. Although glucose oxidase is produced by various microorganisms, filamentous fungi Aspergillus niger and Penicillium species are used on an industrial scale as a source of this enzyme. However, in the enzyme preparations thus obtained, glucose oxidase accompanied by the enzyme catalase is disadvantageous in many applications of glucose oxidase because it interferes with the specific reaction catalyzed by this enzyme (Bergmeyer, VH: In Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 2, Verlag, Weinheim, 1983). This is the case, for example, in the preparation of tests or indicator papers for the determination of sugars, in particular glucose in media and body fluids.

K separaci glukózaoxidázy od katalázy se nejčastěji používá ionová chromatografie se slabým anexem (Pat. ČSSR 103 453, Sasaki et al.: J. Biochem. 91, 1555 (1982), Mikeš, O. et al.: J. of Chromatog. 148, 237 (1978)), ionová hydrofóbní chromatografie na Amberlitě CG-50, gélová filtrace na Sefadexu G-150 a 200 (Brochert, A.: J. of Chromatog. 244, 49, (1982)), afinitní chromatografie na imunosorbentu (Clark, L. C.: Ann. N. Y. Acad. Sci. 102, 29 (1962)) a další metody.Weak anion exchange chromatography is most commonly used to separate glucose oxidase from catalase (Pat. CSR 103 453, Sasaki et al .: J. Biochem. 91, 1555 (1982); Mikeš, O. et al .: J. of Chromatog. 148 , 237 (1978)), ionic hydrophobic chromatography on Amberlite CG-50, gel filtration on Sefadex G-150 and 200 (Brochert, A .: J. of Chromatog. 244, 49, (1982)), affinity chromatography on immunosorbent ( Clark, LC: Ann. NY Acad. Sci. 102, 29 (1962)) and other methods.

Nevýhodou těchto metod z hlediska průmyslového použití je vysoká cena a dostupnost chromatografických náplní, kapacita kolon, časová náročnost a často i nutnost zařazení nových technologických operací (například odsolení). Při přípravě technického preparátu glukózaoxidázy běžné metody separace enzymu, jako je srážení síranem amonným (Pat. ČSSR 103 453, 143 103), diaminoetoxyakridínlaktátem (Pat. NSR 2 308 013) neumožňuje přípravu glukózaoxidázového preparátu bez katalázové aktivity. Také přídavek inhibitorů katalázy (těžké kovy, azidy, soli hydroxylamínu, 2,4-dichlorfenol, tiazolové deriváty a další) není při mnohých aplikacích glukózaoxidázy žádoucí a navíc je účinek mnohých inhibitorů reverzibilní (Webb J. L.: In Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academie Press, New York, (1966)).The disadvantage of these methods in terms of industrial use is the high cost and availability of chromatographic packings, column capacity, time consuming and often the need to include new technological operations (such as desalination). In the preparation of a technical preparation of glucose oxidase, a conventional enzyme separation method such as ammonium sulfate precipitation (Pat. ČSSR 103 453, 143 103), diaminoethoxyacridine lactate (Pat. NSR 2 308 013) does not allow the preparation of a glucose oxidase preparation without catalase activity. Also, the addition of catalase inhibitors (heavy metals, azides, hydroxylamine salts, 2,4-dichlorophenol, thiazole derivatives, etc.) is not desirable in many glucose oxidase applications, and the effect of many inhibitors is reversible (Webb JL: In Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academic Press, New York, (1966)).

Inaktivace katalázy způsobem podle vynálezu je velmi výhodná, protože je možné jednoduchým způsobem vysoce selektivně ireyerzibilně inaktivovat enzym katalázu v glukózaoxidázových preparátech, získaných z buněk vláknitých’ hub. Navíc je možné katalázu inaktivovat přímo v buňkách vláknitých hub a glukózaoxidázu potom izolovat z buněk běžnými separačními postupy, což zjednodušuje podstatně celý izolační proces. Enzymové preparáty, získané způsobem podle vynálezu, neobsahují reziduální látky z inaktivační směsi, protože peroxid vodíku je rozkládán v průběhu inaktivace působením enzymu katalázy a zbytkový formaldehyd se odseparuje od enzymu glukózaoxidázy v procesu izolace enzymu (ultrafiltrace, precipitace).Inactivation of catalase by the process according to the invention is very advantageous because it is possible in a simple manner to selectively in a highly selective irreversibly inactivate the enzyme catalase in glucose oxidase preparations obtained from filamentous fungal cells. In addition, catalase can be inactivated directly in filamentous fungal cells and glucose oxidase can then be isolated from the cells by conventional separation procedures, which greatly simplifies the entire isolation process. The enzyme preparations obtained by the process of the invention do not contain residual substances from the inactivation mixture because hydrogen peroxide is decomposed during inactivation by the enzyme catalase and the residual formaldehyde is separated from the enzyme glucose oxidase in the enzyme isolation process (ultrafiltration, precipitation).

Způsob inaktivace katalázy podle vynálezu spočívá v tom, že se buněčná hmota vláknité houby Aspergillus niger nebo z ní izolovaný hrubý enzymový preparát glukózaoxidázy uvede do styku s roztokem obsahujícím 0,1 až 5 % metanal a 0,5 až 5 % peroxid vodíku a směs se míchá při 4 až 20 °C po dobu 5 až 20 minut. Po inaktivaci katalázy se glukózaoxidáza izoluje z buněk Aspergillus niger a dále purifikuje běžnými postupy.The method of inactivating catalase according to the invention consists in contacting the cell mass of the filamentous fungus Aspergillus niger or the crude enzyme preparation glucose oxidase isolated therefrom with a solution containing 0.1 to 5% methanal and 0.5 to 5% hydrogen peroxide and the mixture being stirred at 4 to 20 ° C for 5 to 20 minutes. After catalase inactivation, glucose oxidase is isolated from Aspergillus niger cells and further purified by conventional procedures.

Výhodou navrhovaného způsobu inaktivace katalázy v přítomnosti glukózaoxidázy v buňkách vláknitých hub a v technických preparátech glukózaoxidázy v porovnání s doposud používanými postupy je, že předmětný způsob je ekonomicky nenáročný s jednoduchými technologickými operacemi, inaktivace katalázy je ireverzibilní a výsledný preparát neobsahuje složky inaktivační směsi. Navíc je možné inaktivovat selektivně katalázu přímo v buňkách vláknitých hub, což podstatně zjednodušuje přípravu technických preparátů glukózaoxidázy.The advantage of the proposed method of inactivating catalase in the presence of glucose oxidase in filamentous fungal cells and in glucose oxidase technical preparations compared to previously used methods is that the present method is economically undemanding with simple technological operations, catalase inactivation is irreversible and the resulting preparation does not contain components of inactivation mixture. In addition, it is possible to selectively inactivate catalase directly in filamentous fungal cells, which considerably simplifies the preparation of technical preparations of glucose oxidase.

Vynález ilustrují následující příklady provedení, kterými se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.The invention is illustrated by the following examples, which do not limit the scope of the invention in any way.

Příklad 1Example 1

Do 500 ml vodní suspenze mycelia Aspergillus niger CCM 8004 (sušina 15 g/dm³) s aktivitou glukózaoxidázy 40.10³U/g (suchá váha) a katalázy 2,5.10⁶ U/g (suchá váha) (definice U - viz Wortington Enzyme Manual, Wortington Biochemical Corp. Freehold, New Yersey, 1972) bylo přilito 500 ml vodního roztoku obsahujícího metanal (1 % hmot.) a peroxid vodíku (1 % hmot.). Směs se míchala při 6 °C po dobu 10 min a potom se mycelium oddělilo od tekutého podílu filtrací. Mycelium obsahovalo 94 % glukózaoxidázové a 2 % katalázové aktivity, původně obsažené v myceliu. ’To 500 ml of an aqueous suspension of Aspergillus niger CCM 8004 mycelia (dry matter 15 g / dm ³ ) with glucose oxidase activity 40.10 ³ U / g (dry weight) and catalase 2.5.10 ⁶ U / g (dry weight) (definition U - see Wortington Enzyme Manual, Wortington Biochemical Corp. Freehold, New Jersey, 1972) was added 500 ml of an aqueous solution containing metanal (1% by weight) and hydrogen peroxide (1% by weight). The mixture was stirred at 6 ° C for 10 min and then the mycelium was separated from the liquid portion by filtration. The mycelium contained 94% glucose oxidase and 2% catalase activity, originally contained in the mycelium. '

Příklad 2Example 2

Do 50 ml vodního roztoku technické glukózaoxidázy (aktivita glukózaoxidázy 130 U/cm³, katalázy 7 500 U/cm³) bylo přilito 50 ml vodního roztoku obsahujícího 1 % (hmot.) metanalu a 2 % (hmot.) peroxidu vodíku. Směs se míchala při 4 °C po dobu 5 minut. Enzymy byly v daném čase precipitované ledovým etanolem (poměr voda : etanol =9 : 5) a oddělené centrifugací. Po resuspendování sedimentu obsahoval preparát 90 % původní glukózaoxidázové a 1 % katalázové aktivity.To 50 ml of an aqueous solution of technical glucose oxidase (glucose oxidase activity 130 U / cm ³ , catalase 7,500 U / cm ³ ) was added 50 ml of an aqueous solution containing 1% (w / w) methanal and 2% (w / w) hydrogen peroxide. The mixture was stirred at 4 ° C for 5 minutes. The enzymes were precipitated with ice-cold ethanol (water: ethanol ratio = 9: 5) at that time and separated by centrifugation. After resuspension of the sediment, the preparation contained 90% of the original glucose oxidase and 1% of catalase activity.

Claims

Method for inactivating catalase in addition to glucose oxidase, characterized in that Aspergillus niger fibrous fungal cells or aqueous technical glucose oxidase preparations prepared from Aspergillus niger fibrous fungal mycelium are contacted with an aqueous solution containing methanal in a concentration of 0.1 to 5% by weight and peroxide. of hydrogen at a concentration of 0.5 to 5% by weight, and the mixture is stirred at 4 to 15 ° C for 5 to 30 minutes.

End of document