CS276659B6 - Method and means for maleic imide groups determination - Google Patents
Method and means for maleic imide groups determination Download PDFInfo
- Publication number
- CS276659B6 CS276659B6 CS896935A CS693589A CS276659B6 CS 276659 B6 CS276659 B6 CS 276659B6 CS 896935 A CS896935 A CS 896935A CS 693589 A CS693589 A CS 693589A CS 276659 B6 CS276659 B6 CS 276659B6
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- groups
- maleimide
- thiol
- determination
- reagent
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical group O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 2
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 claims description 30
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AEUVIXACNOXTBX-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylpropan-1-ol Chemical compound CCC(O)S AEUVIXACNOXTBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- -1 succinimidyl group Chemical group 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- ZLANMTTYEJHZIE-UHFFFAOYSA-N 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzenediazonium Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C1=CC=C([N+]#N)C=C1 ZLANMTTYEJHZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHYRLCJMMJQUBY-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCC1=CC=C(N2C(C=CC2=O)=O)C=C1 VHYRLCJMMJQUBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYGAMTQMILRCCI-UHFFFAOYSA-N 3-aminopropane-1-thiol Chemical compound NCCCS IYGAMTQMILRCCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- HDFRDWFLWVCOGP-UHFFFAOYSA-N carbonothioic O,S-acid Chemical class OC(S)=O HDFRDWFLWVCOGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000005462 imide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000006894 reductive elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001043 yellow dye Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/145555—Hetero-N
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/17—Nitrogen containing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu a prostředku ke stanovení maleinimidových skupin, obzvláště ke stanovení reaktivních maleinimidových skupin vázaných na proteiny (enzymy, antigeny, protilátky).
Od poloviny sedmdesátých let byla vyvinuta četná tzv. heterosílovadla s cílem, aby se proteiny vzájemně kovalentně vázaly pomocí různých reaktivních skupin, například aminoskupin, karboxýlových skupin, hydroxylových skupin a thiolových skupin. Obzvláštní význam mají tato heterosílovadla v oblasti reagencií pro zkoušky imunity. Přitom se mohou zdůraznit zejména heterosílovadla nesoucí maleinimidové skupiny, protože jsou schopné specificky reagovat s thiolovými skupinami. Tímto způsobem se mohou fragmenty protilátek, například Fab’- fragmenty, které obsahují volné thiolové skupiny, selektivně vázat na jiné proteiny, například enzymy.
Takovým sílovadlem a heterosílovadlem nesoucím maleinimidové skupiny je například m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester (MBS), m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxy-sulfosukcinimidester (Sulfo-MBS), sukcinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)-cyklohexan-karboxylát (SMCC), sulfosukcinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)-cyklohexan-l-karboxylát (sulfo-SMCC), sukcinimidyl-4-(p-maleinimidofenyl)-butyrát (SMPB), sulfosukcinimidyl-4-(p-maleinimidofenyl)-butyrát (sulfo-SMPB), bis-maleinimidohexan (BMH), N-(4-diazofenyl)-maleinimid,
N-(0-diazofenyl)-ethylmaleinimid.
Pomocí těchto heterosílovadel se mohou vázat thiolové skupiny na aminoskupiny. N-(4-diazofenyl)-maleinimid a n-(B-diazofenyl)-ethylmaleinimid umožňují kromě toho také to, že se thiolové skupiny mohou vázat na imidazolové, fenolové, indolové a další skupiny.
V principu probíhají tyto reakce podle následujících schémat:
R-NH2 + Sukc-O-CO-X-Mal ) R-NH-CO-X-Mal + Sukc-OH (1. stupeň), (1)
R-NH-CO-X-Mal + HS-R í
> R-NH-CO-X-MalH-S-R (II) (2. stupeň), kde R-NH2 znamená protein nesoucí primární aminoskupiny; Mal znamená maleinimidovou skupinu; Suke znamená sukcinimidylovou skupinu; R’- SH znamená protein nesoucí thiolové skupiny; X znamená distanční článek (spacer).
Neočekávaně bylo zjištěno, že pro přípravu účinných reagencií pro zkoušky imunity je rozhodující znát počet a funkčnost maleinimidových skupin vázaných na X v meziproduktu I výše uvedené rovnice než probíhá reakce například s fragmenty protilátek. Tím se může odstranit nákladná ztrátová produkce.
Úkolem vynálezu je dát k dispozici způsob a prostředek, se kterým se může provádět důkaz počtu funkčních, reaktivních maleinimidových skupin ve výše uvedeném meziproduktu I.
Předmětem vynálezu je způsob stanovení maleinimidových skupin, jehož podstata spočívá v tom, že se vzorek obsahující maleinimidové skupiny nechá reagovat s reakčním činidlem obsahujícím'thiolové skupiny a potom s chromogenem nebo fluorogenem reagujícím s thiolovými skupinami a měří se zbarvení nebo změna intenzity fluorescence.
Dalším předmětem vynálezu je prostředek ke stanovení maleinimidových skupin obsahující reakční činidlo obsahující thiolové skupiny ve 2 až 10 násobném molárním přebytku ve vztahu ke proteinu nesoucímu maleinimidové skupiny a 0,1 až 1 mM chromogenu nebo fluorogenu sloužícího k reakci s thiolovými skupinami.
Přímé stanovení maleinimidových skupin vázaných na protein s chromogeny nebo fluorogeny vyžaduje chromatografické dělení. Způsob podle vynálezu se naproti tomu provádí homogenním, tj. jednofázovým způsobem.
Stanovení maleinimidových skupin se provádí tak, že se například přidá k roztoku proteinu nesoucímu maleinimidové skupiny roztok merkaptoalkanolu a inkubuje se. Potom se přidá roztok chromogenu a fluorogenu, který reaguje s thiolovými skupinami. Přebytečný
CS 276 659 06 merkaptoalkanol, tj. nevázaný na maleinimidové skupiny., způsobuje tvorbu barviva nebo změnu fluoroscence, jehož intenzita se měří. Způsob se může provádět jak metoda koncového bodu tak také jako kinetická metoda, přičemž se měří rychlost tvorby barviva nebo změna fluorescence.
Vhodnými reagenčními činidly obsahujícími thiolové skupiny jsou merkaptoalkanoly jako merkaptoethanol, merkaptopropanol, merkaptoalkylaminy jako cysteamin, merkaptopropylamin, merkaptoaminokyseliny jako cystein, merkaptokarboxylové kyseliny jako merkaptooctová kyselina, merkaptojantarová kyselina, 2-thiobenzoová kyselina, s výhodou merkaptoethanol Reagenční činidlo obsahující thiolové skupiny musí být vzhledem k proteinu nesoucímu malein
v. imidové skupiny ve dvou až desetinásobném molárnim přebytku, s výhodou 4 až 6ti násobném přebytku.
Jako chromogen reagující s thiolovými skupinami je vhodná například 2,2'-dinitro-5,5'-dithio-dibenzoová kyselina, bis (ρ-nitrofenyl)-disulfid, 2,2'-dipyridyl-disulfid, s výhodou 2,2,-dinitro-5,5*-dithio-dibenzoová kyselina, která je dlouho známá jako Ellmanovo činidlo (Arch. Biochem. Biophys. 82, 70 (1959)). Ve slabě zásaditém prostředí (pH B až 9) se vytvoří pomocí Ellmanova činidla reduktivním štěpením disulfidového můstku intenzivně žlutý 2-nitro-5-thiobenzoan, jehož barevná intenzita v rozmezí 400 až 450 nm je mírou pro počet thiolových skupin. Koncentrace chromogenu je v rozmezí 0,1 až 1 mM, s výhodou při 0,2 mM.
Jako fluorogenní látka je vhodný například (a-nitroanilin-N-ethyldithío)-2-pyridyl-5-thioureido-N'-(5-fluoroscein), 4-jodacetylamido-l-naftol, s výhodou (o-nitroanilin-N- ethyldithio)-2-pyridyl-5~thioureido-N-(5-fluorescein). V zásadě probíhá metoda analogicky podle způsobu popsaného Ellmanem. Při reakci fluorescenčního derivátu se sloučeninami obsahujícími thiolové skupiny se fluorescence fluorescenčních derivátů silně zvýší. Výtěžek fluorescence je vzhledem ke standardu mírou pro počet thiolových skupině Koncentrace fluorogenu je v rozmezí 0,1 až 1 mM, s výhodou při 0,2 mM.
Způsob a prostředek jsou obecně vhodné pro stanovení sloučenin obsahujících maleinimid nebo maleinimidové skupiny. Je vhodný s výhodou pro stanovení citlivosti reagencií pro zkoušky imunity obsahujících maleinimidové skupiny, tj. pro jakostní kontrolu těchto reagen cí.
Přikladl
Stanoveni maleinimidových skupin vázaných na protein
K roztoku křenové peroxidázy nesoucí maleinimidové skupiny (0,062 mM) se přidá roztok merkaptoethanolu. Po 10ti minutové inkubačni době se přidá roztok Ellmanova činidla (2,2'-dinitro-5-5'-dithio-dibenzoové kyseliny). Přebytečný merkaptoethanol, tj. nevázaný na maleinimidové skupiny, způsobuje tvorbu oranžově žlutého barvivá 2-nitro-5-thiobenzoanu.
Intenzita zbarvení se měří ve fotometru při 436 nm a teplotě místnosti. Barva roztoku po reakci je alespoň 1 hodinu stabilní, takže se měření může provádět jako měření koncového bodu. Zvolené barvivo má výhodu, že se absorbuje při vlnové délce, při které se neočekává rušení proteinem. Měření slepého pokusu se provádí podle následujícího pipetačního schématu:
CS 276 659 B6
| Standard | Slepá hodnota standardu | Analýza | Slepá hodnota analýzy | |
| Roztok 1 | 100 | 150 | - | 50 |
| Roztok 2 | - | - | 100 | 100 |
| Roztok 3 | 50 | - | 50 | - |
| 10 minutová inkubace | při 37 °C | |||
| Roztok 4 | 2 500 | 2 500 | 2 500 | 2 500 |
| Po desetiminutové inkubací | se měří extinkce | při 436 nm oproti | vodě | |
| St | StL | A | Al |
Výpočet se provádí podle následující rovnice:
[(St-StL)-(A-AL)] x 5 mM] (St-StL) x 2
Složení roztoků:
roztok 1 = voda roztok 2 = analýza (látka nesoucí maleinimidové skupiny), roztok 3 = standard (merkaptoethanol, 5 mM v odplyněné vodě), roztok A = barevné činidlo (Ellmanovo činidlo, 0,2 mM v 0,05 M boritanu sodném + 0,1% askorbová kyselina, pH = 8,0)
Příklad 2
Stanovení počtu (nebo koncentrace) reaktivních maleinimidových skupin v různých síEovadlech a opětovné zjišíování při různém zředění.
Protože jsou různá sííovadla špatně rozpustná ve vodě nebo se sukcinimidylová skupina vodou rychle hydrolýzuje, rozpustí se všechny látky v dioxanu.
Vzorek 1: 8,60 mg sukcinimidyl-4-(p-maleinimidofenyl)-butyrátu se rozpustí v 9,65 ml dioxanu (2,5 mM).
Vzorek 2: 3,34 mg m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxosukcinimidesteru se rozpustí v 4,25 ml dioxanu (2,5 mM).
Vzorek 3: 3,80 mg bismaleinimidohexanu se rozpustí v 5,5 ml dioxanu (2,5 mM).
Test se provádí podle pipetačního schématu v příkladu 1.
Výsledek (v mM, % opětovného zjištění):
Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3
| vypoč. | měřeno | % | vypoč. | měřeno | % | vypoč. | měřeno % | |
| 0,5 | - 0,565 | 113 | 0,5 | 0,605 | 121 | 0,5 | 0,540 108 | |
| 1,0 | 1,025 | 103 | 1,0 | 1,155 | 116 | 1,0 | í,095 110 | H |
| 1,5 | 1,515 | 101 | 1,5 | 1,625 | 108 | |||
| 2,0 | 2,005 | 100 | 2,0 | 2,135 | 107 | SH-skupiny | ||
| 2,5 | 2,475 | 99 | 2,5 | 2,490 | 100 | spotřebovány | ||
| Z | výsledku této tabulky je | zřejmé, | že různá | sííovadla obsahující maleinimidové skupí- | ||||
| ny jsou | správně | zachycena. Test | je v dostatečně | velkém | koncentračním | intervalu lineární. |
CS 276 659 B6
Příklad 3
Stanovení počtu (nebo koncentrace) maleinimidových skupin na křenové peroxidáze
5,37 mg křenové peroxidázy nesoucí maleiniraidové skupiny (HRP) se rozpustí v-1 ml odplyněné vody. Při přijetí molekulové hmotnosti 45000 se dosáhne koncentrace 0,119 mM. Tento základní roztok se zředí odplyněnou vodou ve více stupních; 1+4, 2+3, 3+2, 4+1. Měření se provádí podle pipetačního schématu uvedeného v příkladu 1.
r. Výsledek:
| HRP-maleinimid vypočteno, mM | Maleinimidové skupiny měřeno, mM | Počet maleinimidových skupin na enzym |
| 0,0238 | 0,1965 | 8,26 |
| 0,0476 | 0,4760 | 10,00 |
| 0,0714 | 0,7600 | 10,64 |
| 0,0952 | 0,8000 | 8,40 |
| 0,1190 | 1,0150 | 8,53 |
Z těchto výsledků jasně vyplývá, že stanovení neruší přítomnost proteinu. Měření je v dostatečně velkém koncentračním rozmezí lineární. Správnost výsledku se přezkouší stanovením počtu primárních aminoskupin po a před reakcí s heterosííovadlem. V prostředku je spotřebováno 10 aminoskupin na vazbu heterosííovadla. Tímto se kryjí získané hodnoty obou metod velice dobře. Zatímco poslední způsob umožňuje zdlouhavě pomocí dvojnásobného stanovení primárních aminoskupin výpočet vázaných maleinimidových skupin, získají se s novou metodou stejné výsledky v kratším čase. Kromě toho je nová metoda především proto lepší, že jsou přitom zachyceny výlučně aktivní maleinimidové skupiny, tj. schopné vázání thiolových skupin.
Claims (4)
1. Způsob stanovení maleinimidových skupin, vyznačený tím, že se vzorek obsahující maleinimidové skupiny nechá reagovat s reakčnim činidlem obsahujícím thiolové skupiny a potom s chromogenem nebo fluorogenem reagujícím s thiolovými skupinami a měří se zbarvení nebo změna intenzity fluorescence.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako reakční činidlo obsahující thiolové skupiny použije merkaptoalkanol, například merkaptoethanol nebo merkaptopropanol.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako chromogen použije 2,2 ’-dinitro-5,5 -dithiodibenzoová kyselina.
4. Prostředek ke stanovení maleinimidových skupin, vyznačující se tím, že obsahuje reakční činidlo obsahující thiolové skupiny ve 2 až 10 násobném molárním přebytku ve vztahu k proteinu nesoucímu meleinimidové skupiny a 0,1 až 1 mM chromogenu nebo fluorogenu reagujícího s thiolovými skupinami.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3842657A DE3842657A1 (de) | 1988-12-19 | 1988-12-19 | Verfahren und mittel zur bestimmung von maleimidgruppen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS693589A3 CS693589A3 (en) | 1992-03-18 |
| CS276659B6 true CS276659B6 (en) | 1992-07-15 |
Family
ID=6369494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS896935A CS276659B6 (en) | 1988-12-19 | 1989-12-07 | Method and means for maleic imide groups determination |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5132226A (cs) |
| EP (1) | EP0374620A3 (cs) |
| JP (1) | JPH02227098A (cs) |
| CS (1) | CS276659B6 (cs) |
| DE (1) | DE3842657A1 (cs) |
| IL (1) | IL92777A0 (cs) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5350674A (en) * | 1992-09-04 | 1994-09-27 | Becton, Dickinson And Company | Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof |
| US5791868A (en) * | 1996-06-14 | 1998-08-11 | Capstone Turbine Corporation | Thrust load compensating system for a compliant foil hydrodynamic fluid film thrust bearing |
| US6437092B1 (en) * | 1998-11-06 | 2002-08-20 | Conjuchem, Inc. | Conjugates of opioids and endogenous carriers |
| RU2156454C2 (ru) * | 1998-11-12 | 2000-09-20 | Алтайский государственный университет | Определение малеинимидов в виде солей аци-форм |
| RU2164678C2 (ru) * | 1999-03-26 | 2001-03-27 | Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова | Способ количественного определения n-фенилмалеинимида |
| RU2163371C2 (ru) * | 1999-04-14 | 2001-02-20 | Алтайский государственный университет | Способ количественного определения n-замещенных малеинимидов |
| RU2175124C1 (ru) * | 2000-02-14 | 2001-10-20 | Алтайский государственный университет | Способ количественного определения дималеинимидов |
| US7666661B2 (en) | 2001-08-27 | 2010-02-23 | Platypus Technologies, Llc | Substrates, devices, and methods for quantitative liquid crystal assays |
| RU2215283C2 (ru) * | 2001-10-10 | 2003-10-27 | Алтайский государственный университет | Способ количественного определения гексаметилендималеинимида |
| US7018838B2 (en) * | 2002-05-22 | 2006-03-28 | Platypus Technologies, Llc | Substrates, devices, and methods for cellular assays |
| RU2229698C2 (ru) * | 2002-07-02 | 2004-05-27 | Алтайский государственный университет | Определение малеинимидов в смесях |
| JP4950663B2 (ja) | 2003-07-25 | 2012-06-13 | プラティパス テクノロジーズ エルエルシー | 液晶ベースの分析物検出 |
| AU2004290432B2 (en) | 2003-11-10 | 2008-11-20 | Platypus Technologies, Llc | Substrates, devices, and methods for cellular assays |
| JP4581571B2 (ja) * | 2004-09-06 | 2010-11-17 | 富士ゼロックス株式会社 | 粒子のマレイミジル基量を測定する定量方法 |
| RU2288463C1 (ru) * | 2005-05-03 | 2006-11-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Алтайский государственный университет | Способ количественного определения малеинимида |
| CA2606916A1 (en) * | 2005-05-06 | 2006-11-16 | Platypus Technologies, Llc | Liquid crystal based analyte detection |
| US7662572B2 (en) | 2005-08-25 | 2010-02-16 | Platypus Technologies, Llc. | Compositions and liquid crystals |
| US7842499B2 (en) * | 2006-08-07 | 2010-11-30 | Platypus Technologies, Llc | Substrates, devices, and methods for cellular assays |
| WO2009026359A2 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Platypus Technologies, Llc | Improved devices for cell assays |
| US8472683B2 (en) * | 2008-05-09 | 2013-06-25 | General Electric Company | Motion correction in tomographic images |
| WO2010031047A2 (en) | 2008-09-15 | 2010-03-18 | Platypus Technologies, Llc | Detection of vapor phase compounds by changes in physical properties of a liquid crystal |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5110986B2 (cs) * | 1972-10-05 | 1976-04-08 | ||
| US4615986A (en) * | 1979-03-05 | 1986-10-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for competitive protein binding assays inhibiting non-specific interference |
| JPS6015559A (ja) * | 1983-07-06 | 1985-01-26 | Shiraimatsu Shinyaku Kk | アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬 |
| DE3516001A1 (de) * | 1985-05-03 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Lipasefarbtest |
| US4680272A (en) * | 1985-10-23 | 1987-07-14 | University Of California | Method for detecting molecules containing amine or thiol groups |
-
1988
- 1988-12-19 DE DE3842657A patent/DE3842657A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-12-07 CS CS896935A patent/CS276659B6/cs unknown
- 1989-12-08 EP EP19890122651 patent/EP0374620A3/de not_active Ceased
- 1989-12-18 US US07/451,708 patent/US5132226A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-18 IL IL92777A patent/IL92777A0/xx unknown
- 1989-12-19 JP JP1327483A patent/JPH02227098A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0374620A2 (de) | 1990-06-27 |
| EP0374620A3 (de) | 1991-09-18 |
| US5132226A (en) | 1992-07-21 |
| JPH02227098A (ja) | 1990-09-10 |
| DE3842657A1 (de) | 1990-06-21 |
| CS693589A3 (en) | 1992-03-18 |
| IL92777A0 (en) | 1990-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS276659B6 (en) | Method and means for maleic imide groups determination | |
| US5089423A (en) | Immunoassay methods and reagents and methods for producing the latter | |
| US4492762A (en) | Fluorescent polarization immunoassays | |
| EP0347138B1 (en) | Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use | |
| JP2870704B2 (ja) | ホモシステインアッセイ | |
| EP0242095A1 (en) | Cleavable labels for use in binding assays | |
| US4489165A (en) | Chromogenic tracers for use in an assay | |
| US5395938A (en) | Biotinylated chemiluminescent labels and their conjugates, assays and assay kits | |
| JP2750003B2 (ja) | 光活性化可能ビオチン誘導体およびイムノアッセイでの干渉を軽減させるためのその使用 | |
| US6395503B1 (en) | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same | |
| US4880731A (en) | Process and reagent for the determination of a reaction partner of an immunological reaction | |
| DK0381450T3 (da) | Assay for basisk phosphatase fra knogler. | |
| Yang et al. | Time-resolved fluorescence immunoassay with measurement of a europium chelate in solution: dissociation conditions and application for determination of cortisol | |
| US5780243A (en) | Methods for the quantitative analysis of organic compounds | |
| Takahashi et al. | Fluorometric determination of glutathione by N-(9-Acridinyl)-maleimide and its application to biological materials | |
| EP0100543B1 (en) | Method for quantitative analysis of low molecular weight components contained in protein-containing liquid sample | |
| CA1263601A (en) | Conjugate for enzyme immuno determinations | |
| US6171520B1 (en) | Reagents for labeling SH groups, process for the preparation of them and method for labeling with them | |
| CZ83393A3 (en) | Process of treating humors when determining neopterin and means for carrying out said process | |
| US11614445B2 (en) | Background blockers for binding assays | |
| US5552297A (en) | Lead detection method and reggents utilizing aminolevulinic acid dehydratase and tertiary phosphines | |
| EP0420170A2 (en) | Stabilizing reagent for membrane immunoassay | |
| JP3174729B2 (ja) | アクリジン誘導体、その製法およびこれを用いた標識法 | |
| JPH0666800A (ja) | 複合体の分離方法 | |
| CA1300007C (en) | Immunoassay methods and reagents and methods for producing the latter |