Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Method and means for maleic imide groups determination
CS276659B6
Czechoslovakia
- Other languages
English - Inventor
Michael Dreher Heinz Hirsch
Worldwide applications
Application CS896935A events
1989-12-07
1992-03-18
1992-07-15
Description
translated from
Vynález se týká způsobu a prostředku ke stanovení maleinimidových skupin, obzvláště ke stanovení reaktivních maleinimidových skupin vázaných na proteiny (enzymy, antigeny, protilátky).
Od poloviny sedmdesátých let byla vyvinuta četná tzv. heterosílovadla s cílem, aby se proteiny vzájemně kovalentně vázaly pomocí různých reaktivních skupin, například aminoskupin, karboxýlových skupin, hydroxylových skupin a thiolových skupin. Obzvláštní význam mají tato heterosílovadla v oblasti reagencií pro zkoušky imunity. Přitom se mohou zdůraznit zejména heterosílovadla nesoucí maleinimidové skupiny, protože jsou schopné specificky reagovat s thiolovými skupinami. Tímto způsobem se mohou fragmenty protilátek, například Fab’- fragmenty, které obsahují volné thiolové skupiny, selektivně vázat na jiné proteiny, například enzymy.
Takovým sílovadlem a heterosílovadlem nesoucím maleinimidové skupiny je například m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester (MBS), m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxy-sulfosukcinimidester (Sulfo-MBS), sukcinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)-cyklohexan-karboxylát (SMCC), sulfosukcinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)-cyklohexan-l-karboxylát (sulfo-SMCC), sukcinimidyl-4-(p-maleinimidofenyl)-butyrát (SMPB), sulfosukcinimidyl-4-(p-maleinimidofenyl)-butyrát (sulfo-SMPB), bis-maleinimidohexan (BMH), N-(4-diazofenyl)-maleinimid,
N-(0-diazofenyl)-ethylmaleinimid.
Pomocí těchto heterosílovadel se mohou vázat thiolové skupiny na aminoskupiny. N-(4-diazofenyl)-maleinimid a n-(B-diazofenyl)-ethylmaleinimid umožňují kromě toho také to, že se thiolové skupiny mohou vázat na imidazolové, fenolové, indolové a další skupiny.
V principu probíhají tyto reakce podle následujících schémat:
R-NH2 + Sukc-O-CO-X-Mal ) R-NH-CO-X-Mal + Sukc-OH (1. stupeň), (1)
R-NH-CO-X-Mal + HS-R í
> R-NH-CO-X-MalH-S-R (II) (2. stupeň), kde R-NH2 znamená protein nesoucí primární aminoskupiny; Mal znamená maleinimidovou skupinu; Suke znamená sukcinimidylovou skupinu; R’- SH znamená protein nesoucí thiolové skupiny; X znamená distanční článek (spacer).
Neočekávaně bylo zjištěno, že pro přípravu účinných reagencií pro zkoušky imunity je rozhodující znát počet a funkčnost maleinimidových skupin vázaných na X v meziproduktu I výše uvedené rovnice než probíhá reakce například s fragmenty protilátek. Tím se může odstranit nákladná ztrátová produkce.
Úkolem vynálezu je dát k dispozici způsob a prostředek, se kterým se může provádět důkaz počtu funkčních, reaktivních maleinimidových skupin ve výše uvedeném meziproduktu I.
Předmětem vynálezu je způsob stanovení maleinimidových skupin, jehož podstata spočívá v tom, že se vzorek obsahující maleinimidové skupiny nechá reagovat s reakčním činidlem obsahujícím'thiolové skupiny a potom s chromogenem nebo fluorogenem reagujícím s thiolovými skupinami a měří se zbarvení nebo změna intenzity fluorescence.
Dalším předmětem vynálezu je prostředek ke stanovení maleinimidových skupin obsahující reakční činidlo obsahující thiolové skupiny ve 2 až 10 násobném molárním přebytku ve vztahu ke proteinu nesoucímu maleinimidové skupiny a 0,1 až 1 mM chromogenu nebo fluorogenu sloužícího k reakci s thiolovými skupinami.
Přímé stanovení maleinimidových skupin vázaných na protein s chromogeny nebo fluorogeny vyžaduje chromatografické dělení. Způsob podle vynálezu se naproti tomu provádí homogenním, tj. jednofázovým způsobem.
Stanovení maleinimidových skupin se provádí tak, že se například přidá k roztoku proteinu nesoucímu maleinimidové skupiny roztok merkaptoalkanolu a inkubuje se. Potom se přidá roztok chromogenu a fluorogenu, který reaguje s thiolovými skupinami. Přebytečný
CS 276 659 06 merkaptoalkanol, tj. nevázaný na maleinimidové skupiny., způsobuje tvorbu barviva nebo změnu fluoroscence, jehož intenzita se měří. Způsob se může provádět jak metoda koncového bodu tak také jako kinetická metoda, přičemž se měří rychlost tvorby barviva nebo změna fluorescence.
Vhodnými reagenčními činidly obsahujícími thiolové skupiny jsou merkaptoalkanoly jako merkaptoethanol, merkaptopropanol, merkaptoalkylaminy jako cysteamin, merkaptopropylamin, merkaptoaminokyseliny jako cystein, merkaptokarboxylové kyseliny jako merkaptooctová kyselina, merkaptojantarová kyselina, 2-thiobenzoová kyselina, s výhodou merkaptoethanol Reagenční činidlo obsahující thiolové skupiny musí být vzhledem k proteinu nesoucímu malein
v. imidové skupiny ve dvou až desetinásobném molárnim přebytku, s výhodou 4 až 6ti násobném přebytku.
Jako chromogen reagující s thiolovými skupinami je vhodná například 2,2'-dinitro-5,5'-dithio-dibenzoová kyselina, bis (ρ-nitrofenyl)-disulfid, 2,2'-dipyridyl-disulfid, s výhodou 2,2,-dinitro-5,5*-dithio-dibenzoová kyselina, která je dlouho známá jako Ellmanovo činidlo (Arch. Biochem. Biophys. 82, 70 (1959)). Ve slabě zásaditém prostředí (pH B až 9) se vytvoří pomocí Ellmanova činidla reduktivním štěpením disulfidového můstku intenzivně žlutý 2-nitro-5-thiobenzoan, jehož barevná intenzita v rozmezí 400 až 450 nm je mírou pro počet thiolových skupin. Koncentrace chromogenu je v rozmezí 0,1 až 1 mM, s výhodou při 0,2 mM.
Jako fluorogenní látka je vhodný například (a-nitroanilin-N-ethyldithío)-2-pyridyl-5-thioureido-N'-(5-fluoroscein), 4-jodacetylamido-l-naftol, s výhodou (o-nitroanilin-N- ethyldithio)-2-pyridyl-5~thioureido-N-(5-fluorescein). V zásadě probíhá metoda analogicky podle způsobu popsaného Ellmanem. Při reakci fluorescenčního derivátu se sloučeninami obsahujícími thiolové skupiny se fluorescence fluorescenčních derivátů silně zvýší. Výtěžek fluorescence je vzhledem ke standardu mírou pro počet thiolových skupině Koncentrace fluorogenu je v rozmezí 0,1 až 1 mM, s výhodou při 0,2 mM.
Způsob a prostředek jsou obecně vhodné pro stanovení sloučenin obsahujících maleinimid nebo maleinimidové skupiny. Je vhodný s výhodou pro stanovení citlivosti reagencií pro zkoušky imunity obsahujících maleinimidové skupiny, tj. pro jakostní kontrolu těchto reagen cí.
Přikladl
Stanoveni maleinimidových skupin vázaných na protein
K roztoku křenové peroxidázy nesoucí maleinimidové skupiny (0,062 mM) se přidá roztok merkaptoethanolu. Po 10ti minutové inkubačni době se přidá roztok Ellmanova činidla (2,2'-dinitro-5-5'-dithio-dibenzoové kyseliny). Přebytečný merkaptoethanol, tj. nevázaný na maleinimidové skupiny, způsobuje tvorbu oranžově žlutého barvivá 2-nitro-5-thiobenzoanu.
Intenzita zbarvení se měří ve fotometru při 436 nm a teplotě místnosti. Barva roztoku po reakci je alespoň 1 hodinu stabilní, takže se měření může provádět jako měření koncového bodu. Zvolené barvivo má výhodu, že se absorbuje při vlnové délce, při které se neočekává rušení proteinem. Měření slepého pokusu se provádí podle následujícího pipetačního schématu:
CS 276 659 B6
| Standard | Slepá hodnota standardu | Analýza | Slepá hodnota analýzy | |
| Roztok 1 | 100 | 150 | - | 50 |
| Roztok 2 | - | - | 100 | 100 |
| Roztok 3 | 50 | - | 50 | - |
| 10 minutová inkubace | při 37 °C | |||
| Roztok 4 | 2 500 | 2 500 | 2 500 | 2 500 |
| Po desetiminutové inkubací | se měří extinkce | při 436 nm oproti | vodě | |
| St | StL | A | Al |
Výpočet se provádí podle následující rovnice:
[(St-StL)-(A-AL)] x 5 mM] (St-StL) x 2
Složení roztoků:
roztok 1 = voda roztok 2 = analýza (látka nesoucí maleinimidové skupiny), roztok 3 = standard (merkaptoethanol, 5 mM v odplyněné vodě), roztok A = barevné činidlo (Ellmanovo činidlo, 0,2 mM v 0,05 M boritanu sodném + 0,1% askorbová kyselina, pH = 8,0)
Příklad 2
Stanovení počtu (nebo koncentrace) reaktivních maleinimidových skupin v různých síEovadlech a opětovné zjišíování při různém zředění.
Protože jsou různá sííovadla špatně rozpustná ve vodě nebo se sukcinimidylová skupina vodou rychle hydrolýzuje, rozpustí se všechny látky v dioxanu.
Vzorek 1: 8,60 mg sukcinimidyl-4-(p-maleinimidofenyl)-butyrátu se rozpustí v 9,65 ml dioxanu (2,5 mM).
Vzorek 2: 3,34 mg m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxosukcinimidesteru se rozpustí v 4,25 ml dioxanu (2,5 mM).
Vzorek 3: 3,80 mg bismaleinimidohexanu se rozpustí v 5,5 ml dioxanu (2,5 mM).
Test se provádí podle pipetačního schématu v příkladu 1.
Výsledek (v mM, % opětovného zjištění):
Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3
| vypoč. | měřeno | % | vypoč. | měřeno | % | vypoč. | měřeno % | |
| 0,5 | - 0,565 | 113 | 0,5 | 0,605 | 121 | 0,5 | 0,540 108 | |
| 1,0 | 1,025 | 103 | 1,0 | 1,155 | 116 | 1,0 | í,095 110 | H |
| 1,5 | 1,515 | 101 | 1,5 | 1,625 | 108 | |||
| 2,0 | 2,005 | 100 | 2,0 | 2,135 | 107 | SH-skupiny | ||
| 2,5 | 2,475 | 99 | 2,5 | 2,490 | 100 | spotřebovány | ||
| Z | výsledku této tabulky je | zřejmé, | že různá | sííovadla obsahující maleinimidové skupí- | ||||
| ny jsou | správně | zachycena. Test | je v dostatečně | velkém | koncentračním | intervalu lineární. |
CS 276 659 B6
Příklad 3
Stanovení počtu (nebo koncentrace) maleinimidových skupin na křenové peroxidáze
5,37 mg křenové peroxidázy nesoucí maleiniraidové skupiny (HRP) se rozpustí v-1 ml odplyněné vody. Při přijetí molekulové hmotnosti 45000 se dosáhne koncentrace 0,119 mM. Tento základní roztok se zředí odplyněnou vodou ve více stupních; 1+4, 2+3, 3+2, 4+1. Měření se provádí podle pipetačního schématu uvedeného v příkladu 1.
r. Výsledek:
| HRP-maleinimid vypočteno, mM | Maleinimidové skupiny měřeno, mM | Počet maleinimidových skupin na enzym |
| 0,0238 | 0,1965 | 8,26 |
| 0,0476 | 0,4760 | 10,00 |
| 0,0714 | 0,7600 | 10,64 |
| 0,0952 | 0,8000 | 8,40 |
| 0,1190 | 1,0150 | 8,53 |
Z těchto výsledků jasně vyplývá, že stanovení neruší přítomnost proteinu. Měření je v dostatečně velkém koncentračním rozmezí lineární. Správnost výsledku se přezkouší stanovením počtu primárních aminoskupin po a před reakcí s heterosííovadlem. V prostředku je spotřebováno 10 aminoskupin na vazbu heterosííovadla. Tímto se kryjí získané hodnoty obou metod velice dobře. Zatímco poslední způsob umožňuje zdlouhavě pomocí dvojnásobného stanovení primárních aminoskupin výpočet vázaných maleinimidových skupin, získají se s novou metodou stejné výsledky v kratším čase. Kromě toho je nová metoda především proto lepší, že jsou přitom zachyceny výlučně aktivní maleinimidové skupiny, tj. schopné vázání thiolových skupin.
Claims (4)
Hide Dependent
translated from
Claims (4)
Hide Dependent
translated from
1. Způsob stanovení maleinimidových skupin, vyznačený tím, že se vzorek obsahující maleinimidové skupiny nechá reagovat s reakčnim činidlem obsahujícím thiolové skupiny a potom s chromogenem nebo fluorogenem reagujícím s thiolovými skupinami a měří se zbarvení nebo změna intenzity fluorescence.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako reakční činidlo obsahující thiolové skupiny použije merkaptoalkanol, například merkaptoethanol nebo merkaptopropanol.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako chromogen použije 2,2 ’-dinitro-5,5 -dithiodibenzoová kyselina.
4. Prostředek ke stanovení maleinimidových skupin, vyznačující se tím, že obsahuje reakční činidlo obsahující thiolové skupiny ve 2 až 10 násobném molárním přebytku ve vztahu k proteinu nesoucímu meleinimidové skupiny a 0,1 až 1 mM chromogenu nebo fluorogenu reagujícího s thiolovými skupinami.