1 Λ CS 276567 Β6 *1 Λ CS 276567 Β6 *
Vynález se týká nového myšieho hybridomu IFNA2-N7 produkujúceho monoklonálnu pro-tilátku, ktorá neutralizuje a viaže ludský interferon alfa 2.The present invention relates to a novel murine IFNA2-N7 monoclonal antibody hybridoma that neutralizes and binds human interferon alpha 2.
Protilátky voči ludskému interferonu alfa 2 se pripravujú vo formě antisér alebo mo-noklonálnych protilátok. Antiséra sa získávájú imunizáoiou pokusných zvierat purifiko-vaným antigénom (ludským interferonom alfa 2). Takto připravené protilátky, sú nestandard-ně a jednotlivé šarže antisér majú rozdielne vazobné a neutralizačně schopnosti vočiludskému interferonu alfa 2. Antiséra výkazujú aj krížovú reaktivitu s příbuznými sub-typmi 1'udského interferonu alfa. Přípravu homogénnych protilátok s neutrálizačnou asúčasne s vazobnou aktivitou voči ludskému interferonu alfa 2 umožňuje iba hybridómo-vá technika přípravy monoklonálnych protilátok. Takéto monoklonálne protilátky umožňujúdókaz přítomnosti ludského interferonu alfa2 v róznych biologických materiáloch pomocou < citlivých neutralizačných a imunochemických stanovení. Hybridómy sa získávájú známýmsposobom opísanýra v literatuře /G.Kohler, C. Milstein: Nátuře, 256 (1975)/. HybridómIFNA2-N7 nebol doteraz připravený.Antibodies to human interferon alpha 2 are prepared in the form of antisera or monoclonal antibodies. Antisera are obtained by immunizing experimental animals with purified antigen (human interferon alpha 2). The antibodies thus prepared are non-standard and individual batches of antisera have different binding and neutralizing abilities in human interferon alpha 2. The antisera also exhibit cross-reactivity with related sub-types of human interferon alpha. The preparation of homogeneous antibodies with neutralizing and concomitant binding activity to human interferon alpha 2 is enabled only by the hybridoma technique of monoclonal antibody preparation. Such monoclonal antibodies allow the presence of human interferon alpha2 in various biological materials to be detected by sensitive neutralizing and immunochemical assays. Hybridomas are obtained by a known method described in the literature (G. Kohler, C. Milstein: Nature, 256 (1975)). HybridomaIFNA2-N7 has not yet been prepared.
Nevýhody konvenčně připravených antisér voči ludskému interferonu alfa 2 v podstat-né j miere odstraňuje vynález, ktorého podstatou je myší hybridóm IFNA2-N7,produkujúcimonoklonálnu protilátku imunoglobulínovej podtriedy Gi voči rekombinantnému ludskémuinterferonu alfa 2. Hybridóm IFNA2-N7 je uložený vo Virologickom ústave SAV, Dúbravskácesta, 842 46 Bratislava. » Výhodou hybridomu IFNA2-N7 je, že produkuje homogénnu protilátku, ktorá je schop-ná Specificky neutralizovat a viazať ludský interferon alfa 2 a nerozoznáva iné subty-py ludského interferonu alfa. Po rozmražení buňky hybridomu IFNA2-N7 pokračujú v pro-dukcii protilátky i bez dalšej imunizácie ludským interferonom alfa 2. PřikladlThe drawbacks of conventionally prepared antisera to human interferon alpha 2 are substantially eliminated by the invention, which is based on the murine hybridoma IFNA2-N7, producing a monoclonal antibody of the immunoglobulin subclass G1 to recombinant human interferon alpha 2. The hybridoma IFNA2-N7 is deposited in the Virological Institute of SAS, Dubravica , 842 46 Bratislava. The advantage of the IFNA2-N7 hybridoma is that it produces a homogeneous antibody that is capable of specifically neutralizing and binding human interferon alpha 2 and does not recognize other human interferon alpha subtypes. After thawing, IFNA2-N7 hybridoma cells continue to produce the antibody even without further immunization with human alpha 2 alpha interferon.
Hybridómy sa získájú fúziou myších myelómových buniek NSO a buniek získaných zosleziny myší kmeňa BALB/c imunizovaných rekombinantným ludským interferonom alfa 2c(Ernst Boehringer-Institute fur Arzneimittelforschung, Viedeň). Po fúzii bol vybratýhybridóm IFNA2-N7, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku imunoglobulínovej podtriedyGl, selektívne neutralizujúcu a viažúcu ludský interferon alfa 2. Hybridóm IFNA2-N7 sapestuje in vitro v kultivačných médiách alebo in vivo v peritoneálnej dutině myší kme-ňa BALB/c. Buňky sa zmrazujú a uchovávájú v tekutom dusíku a po rozmražení pokračujúv produkcii protilátky bez dalšej imunizácie ludským interferonom alfa 2. Buňky hybri-dómu IFNA2-N7 rastů in vitro ako suspenzná kultura a produkujú do kultivačného médiapřibližné 1 pg/ml špecifickej protilátky. Kultivačným médiom je Dulbeccova modifikáciaEaglovho minimálneho esenciálneho média /R. Dulbecco, G. Freeman: Virology 8, 396 (1959)/.Toto médium je pre kultiváciu hybridómov doplněné inaktivovaným koňským sérom (ELÁNCLONĚ). Za účelom získania vačšieho množstva monoklonálnej protilátky voči ludskémuinterferonu alfa 2 sa buňky IFNA2-N7 aplikovali v množstve 5.10^ do peritoneálnej du- ,tiny myší BALB/c. Mys sa desať dní před touto aplikáciou premedikuje parafínovým ole- . jom (0,5 ml intraperitoneálne na myš). Po 10' až 15 dňoch od injekcie buniek XFNA2-N7..... bole myši odobratá ascitická tekutina, ktorá obdahovala požadovánu monoklonálnu proti-látku v koncentrácii 1,1 mg/ml.Hybridomas were obtained by fusing murine NSO myeloma cells and cells obtained from a colony of BALB / c mice immunized with recombinant human interferon alpha 2c (Ernst Boehringer-Institute fur Arzneimittelforschung, Vienna). IFNA2-N7 hybridoma, which produces a monoclonal antibody of immunoglobulin subclass G1, selectively neutralizing and binding to human interferon alpha 2, was selected after the fusion. The IFNA2-N7 hybridoma is in vitro cultured in vivo or in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mice. Cells are frozen and stored in liquid nitrogen and, after thawing, continue to produce antibody without further immunization with human interferon alpha 2. IFNA2-N7 hybridoma cells in vitro as a suspension culture and produce approximately 1 µg / ml of specific antibody into the culture medium. The culture medium is Dulbecco's modification of Eagla's minimal essential medium. Dulbecco, G. Freeman: Virology 8, 396 (1959) This medium is supplemented with inactivated horse serum (ELANCLONA) for hybridoma culture. In order to obtain a greater amount of monoclonal antibody to human interferon alpha 2, IFNA2-N7 cells were applied at 5 µl to the peritoneal duodenum of BALB / c mice. The cape was pre-treated with paraffin oil for ten days prior to this application. mouse (0.5 ml intraperitoneally per mouse). After 10 to 15 days after injection of XFNA2-N7 cells, an ascitic fluid was withdrawn to obtain the desired monoclonal anti-drug at 1.1 mg / ml.