Vynález sa týká nového myšieho hydridómu IFNA2-N10 produkujúceho monoklonálnu protilátku, ktorá sa viaže s 1’udským interferónom alfa 2.The present invention relates to a novel murine IFNA2-N10 producing monoclonal antibody that binds to human alpha alpha 2 interferon.
Protilátky voči ludskému interferónu alfa 2 sa pripravujú vo formě antisér alebo monoklonálnych protilátok. Antiséra sa získavajú imunizáciou pokusných zvierat purifikovaným antigénom (1’udským interferónom alfa 2). Takto připravené protilátky sú nestandardně a sú vždy zmesou protilátok s vazobnými a s neutralizačnými schopnosťami voči ludskému interferonu alfa 2. Antiséra vykazujú aj krížovú reaktivitu s příbuznými subtypmi 1’udského interferonu alfa. Přípravu homogénnych protilátok s výlučné vazobnou aktivitou voči ludskému interferónu alfa 2 umožňuje iba hybridómová technika přípravy monoklonálnych protilátok. Takéto monoklonálne protilátky umožňujú dókaz přítomnosti ludského interferónu alfa 2 v róznych biologických materiáloch pomocou citlivých imunochemických stanovení. Hybridómy sa získavajú známým spósobom opísaným v literatúre /G. Kóhler, C. Milstein: Nátuře, 256 (1975)/. Hybridóm IFNA2-N10 nebol doteraz připravený.Antibodies to human interferon alpha 2 are prepared as antisera or monoclonal antibodies. Antisera are obtained by immunizing experimental animals with purified antigen (1'human interferon alpha 2). The antibodies thus prepared are non-standard and are always a mixture of antibodies with binding and neutralizing capabilities to human interferon alpha 2. The antisera also exhibit cross-reactivity with related human interferon alpha subtypes. Only hybridoma monoclonal antibody preparation techniques allow the production of homogeneous antibodies with exclusive human interferon alpha 2 binding activity. Such monoclonal antibodies allow evidence of the presence of human interferon alpha 2 in various biological materials by sensitive immunochemical assays. Hybridomas are obtained in a manner known in the literature / G. Kohler, C. Milstein: Nature, 256 (1975)]. The IFNA2-N10 hybridoma has not yet been prepared.
Nevýhody konvenčně připravených antisér voči ludskému interferónu alfa 2 v podstatnej miere odstraňuje vynález, ktorého podstatou je myší hybridóm IFNA2-N10, produkujúci monoklonálnu protilátku imunoglobulínovej podtriedy Gl, ktorá má schopnost’ Specificky reagovať s rekombinantným 1’udským interferónom alfa 2. Hybridóm IFNA2-N10 je uložený vo Virologickom ústave SAV, Dúbravská cesta 9, 842 46 Bratislava. Výhodou hybridómu IFNA2-N10 je, že produkuje homogénnu protilátku, ktorá je schopná špecificky reagovať iba s ludským interferónom alfa 2 a nerozoznáva iné subtypy ludského interferónu alfa. Po rozmražení buňky hybridómu IFNA2-N10 pokračujú v produkcii protilátky i bez óalšej imunizácie ludským interferónom alfa 2. Příklad 1The disadvantages of conventionally prepared antisera to human interferon alpha 2 are substantially eliminated by the invention, which is based on the murine hybridoma IFNA2-N10, producing a monoclonal antibody of the immunoglobulin G1 subclass, which is capable of specifically reacting with recombinant human alpha interferon 2. IFNA2-N10 hybridoma is stored in the Virological Institute of SAS, Dubravska cesta 9, 842 46 Bratislava. The advantage of the IFNA2-N10 hybridoma is that it produces a homogeneous antibody that is capable of specifically responding only to human interferon alpha 2 and does not recognize other human interferon alpha subtypes. After thawing the IFNA2-N10 hybridoma cells continue to produce the antibody even without further immunization with human alpha interferon 2. Example 1
Hybridómy sa získajú fúziou myších myelómových buniek NSO a buniek získaných zo sleziny myší kmeňa BALB/c imunizovaných rekombinantným ludským interferónom alfa 2c (ErnstBoehringer-Institut fór Arzneimittelforschung, Viedeň). Po fúzii bol vybratý hybridóm IFNA2-N10, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku imunoglobulínovej podtriedy Gl, selektívne sa viažúcu s ludským interferónom alfa 2. Hybridóm IFNA2-N10 sa pestuje in vitro v kultivačných médiách alebo in vivo v peritoneálnej dutině myši kmeňa BALB/c. Buňky sa zmrazujú a uchovávajú v kvapalnom dusíku a po rozmražení pokračujú v produkcii protilátky bez óalšej imunizácie ludským interferónom alfa 2. Buňky hybridómu IFNA2-N10 rastů in vitro ako suspenzná kultúra a produkujú do kultivačného média přibližné 1 ug/ml špecifickej protilátky. Kultivačným médiom je Dulbeccova modifikácia Eagleovho minimálneho esenciálneho média /R. Dulbecco, G. Freeman: Virology 8, 396 (1959)/. Toto médium je pre kultiváciu hybridómov doplněné inaktívovaným koňským sérom (ELÁN CLONĚ). Za účelom získania vačšieho množstva monoklonálnej protilátky proti ludskému interferónu alfa 2 sa buňky IFNA2-N10 aplikovali v množstve 5.10^ do peritoneálnej dutiny myši BALB/c. Myš sa desať dní před touto aplikáciou premedikuje parafínovým olejom (0,5 ml intraperitoneálne na myš). Po 10 až 15 dňoch od injekcie buniek IFNA2-N10 bola myši odobratá ascitická tekutina, ktorá obsahuje požadovanú monoklonálnu protilátku v koncentrácii přibližné 1 mg/ml.Hybridomas are obtained by fusing murine NSO myeloma cells and spleen cells from BALB / c mice immunized with recombinant human interferon alpha 2c (ErnstBoehringer-Institut Arzneimittelforschung, Vienna). After fusion, the IFNA2-N10 hybridoma, which produces a monoclonal antibody of the immunoglobulin G1 subclass, selectively binding to human interferon alpha 2, was selected. The IFNA2-N10 hybridoma was grown in vitro in culture media or in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mice. Cells are frozen and stored in liquid nitrogen and, after thawing, continue to produce antibody without further immunization with human alpha interferon 2. In vitro IFNA2-N10 hybridoma cells as a suspension culture and produce approximately 1 µg / ml of specific antibody into the culture medium. The culture medium is Dulbecco's modification of Eagle's minimal essential medium. Dulbecco, G. Freeman: Virology 8, 396 (1959)]. This medium is supplemented with inactivated horse serum for the cultivation of hybridomas (ELAN CLONA). In order to obtain a greater amount of anti-human interferon alpha 2 monoclonal antibody, IFNA2-N10 cells were applied at 5 µl to the BALB / c peritoneal cavity. The mouse is pre-treated with paraffin oil (0.5 ml intraperitoneally per mouse) ten days prior to this application. 10-15 days after injection of IFNA2-N10 cells, an ascitic fluid was collected from the mouse containing the desired monoclonal antibody at a concentration of approximately 1 mg / ml.
Myší hybridóm IFNA2-N10 sa používá ako zdroj homogénnej protilátky imunoglobulínovej podtriedy Gl, ktorá selektívne viaže ale neneutralizuje l’udský interferon alfa 2, pričom nereaguje s inými subtypmi ludského interferónu alfa. Připravená protilátka sa používá na detekciu ludského interferónu alfa 2 v imunochemických testoch ELISA, RIA, imunoblot a v imunohistochémii. Protilátka je vhodná aj na imunoafinitnú purifikáciu ludského interferónu alfa 2.Mouse hybridoma IFNA2-N10 is used as a source of a homogeneous antibody of the immunoglobulin G1 subclass, which selectively binds but does not neutralize human human interferon alpha 2, without reacting with other human interferon alpha subtypes. The prepared antibody is used to detect human interferon alpha 2 in immunoassay ELISA, RIA, immunoblot and immunohistochemistry. The antibody is also suitable for immunoaffinity purification of human interferon alpha 2.