CS275737B6

CS275737B6 - Process for obtaining insulin substance from extracts

Info

Publication number: CS275737B6
Application number: CS583589A
Authority: CS
Inventors: Jaromir Ing Klancik; Zdenek Cihak; Tomas Ing Csc Kutal; Petr Ing Stary; Vaclav Ing Csc Bartl
Original assignee: Leciva
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1989-10-13
Publication date: 1992-03-18

Abstract

Řešení se týká způsobu izolace insulinu z pankreatického extraktu po odstranění extrahované pankreatické tkáně a aniontu kyseliny přítomně v extrakční směsi a po snížení koncentrace ethanolu a obsahu lipidů, kdy se získaný roztok insulinu zahustí filtrací na semipermeabilní membráně na koncentraci 1 až 100 g/1. Současně se odstraní převážná část balastů i případné s vodou mísitelné organické rozpouštědlo diafiltrací v ultrafiltračním nebo reverzně osmozním ději. Tak se získá koncentrát insulinu pro přímé další obvyklé zpracování na farmaceutickou substanci bez použití vysolovací metodyThe present invention relates to a method for isolating insulin from pancreatic extract after removal extracted pancreatic tissue a the acid anion present in the extraction mixture and after reducing the concentration of ethanol and the content lipids, wherein the insulin solution is obtained concentrated by filtration to semi-permeable membrane to a concentration of 1 to 100 g / l. At the same time most ballasts are removed and optionally water miscible organic solvent diafiltration in ultrafiltration or reverse osmosis. So obtains an insulin concentrate for the next conventional processing into a pharmaceutical substance without using a salting-out method

Description

V současné době výroba insulinu z pankreatu spočívá v desintegraci zmražených žláz, extrakci vodným okyseleným ethanolem, vyčeření extraktu a následném odloučení aniontu kyseliny přítomné v extrakční směsi spolu s některými průvodními látkami organického původu. Z takto upraveného extraktu se za sníženého tlaku oddestiluje ethanol zpravidla ve dvou stupních. V prvním stupni se zredukuje obsah etanolu na 10 až 40 % obj., čímž se z roztoku vyloučí až 80 % hmot, lipidů vyextrahovaných ze základní suroviny. Ve druhém stupni se sníží obsah etanolu pod 2 % obj. a vyloučí se zbývající část lipidů. Vyloučené lipidy se z vodného odparku téměř kvantitativně oddělí dekantací a filtrací. Z čirého vodného odparku se vysolí surový insulin obvykle přídavkem chloridu sodného v množství 27 kg na 100 1. Surový vysolený insulin se po rozpuštění zbaví části bílkovinných příměsí úpravou pH a filtrací. Z filtrátu se izoluje farmaceuticky použitelný insulin řadou všeobecně známých postupů jako je například srážení amorfního insulinu v přítomnosti acetonu a zinečnatých iontů a krystalizací finálního produktu z roztoku amorfního insulinu v přítomnosti citrátu, zinečnatých iontů a acetonu. Nověji jsou zařazovány další čisticí operace jako je například chromatografie na molekulových sítech (například čs. autorské osvědčení č. 186988), popřípadě je neselektivní srážení amorfního insulinu pomocí zinečnatých iontů a acetonu nahraženo srážením soli insulinu s alkalickým kovem nebo amonným iontem (čs. autorské osvědčení č. 261994).Currently, the production of insulin from the pancreas consists in the disintegration of frozen glands, extraction with aqueous acidified ethanol, clarification of the extract and subsequent separation of the acid anion present in the extraction mixture together with some accompanying substances of organic origin. Ethanol is generally distilled off from the extract thus treated under reduced pressure, usually in two stages. In the first stage, the ethanol content is reduced to 10 to 40% by volume, thus eliminating from the solution up to 80% by weight of lipids extracted from the basic raw material. In the second step, the ethanol content is reduced below 2% by volume and the remaining lipids are eliminated. The precipitated lipids are separated almost quantitatively from the aqueous residue by decantation and filtration. Crude insulin is usually salted out of the clear aqueous residue, usually by adding sodium chloride in an amount of 27 kg per 100 l. After dissolution, the crude salted insulin is freed of part of the protein impurities by adjusting the pH and filtering. Pharmaceutically useful insulin is isolated from the filtrate by a number of well-known methods, such as precipitating amorphous insulin in the presence of acetone and zinc ions and crystallizing the final product from a solution of amorphous insulin in the presence of citrate, zinc ions and acetone. More recently, other purification operations are included, such as molecular sieve chromatography (for example, Czech Copyright Certificate No. 186988), or the non-selective precipitation of amorphous insulin with zinc ions and acetone is replaced by precipitation of an insulin salt with an alkali metal or ammonium ion (Czech copyright certificate). No. 261994).

Nevýhodou známých postupů je vysolování insulinu z vodného odparku pomocí chloridu sodného nebo jiné ekologicky nežádoucí soli. Sůl odchází z výrobního cyklu v matečných louzích po vysolování do veřejné kanalizační sítě a značně ztěžuje čištění odpadních vod, popřípadě zvyšuje investiční náklady při výstavbě lokálních čističek odpadních vod. Dalším / v vážným nedostatkem tohoto technologického stupně je nutnost dvoustupňového odpařování na zbytkový obsah ethanolu nižší než 2 % obj., protože při vyšších koncentracích ethanolu probíhá vysolování insulinu s výrazně nižší kvantitou. Druhý stupeň odpařování je zdrojem značných ztrát, protože až o několik hodin prodlužuje čas, po který je koncentrovaný roztok insulinu vystaven zvýšeným teplotám do 35 °C. Tato skutečnost je příčinou, proč je dlouhodobě na řadě pracovišť hledán způsob náhrady odpařování a vysolování postupem ekologicky přijatelnějším a méně ztrátovým. Postup zveřejněný jorpesem a kol. (Acta chemica Scandinavica 14, 1966, 1771-1780) popisuje sorpci insulinu z ethanolického extraktu na kyselinu alginovou. Pro praktické využití však není vhodný, zejména pro nízké dosahované výtěžky. Obdobný postup byl zveřejněn Memedovem (Mjasnaja industria SSSR 4, 1979, 27-8). Na měnič kationtů se adsorbuje insulin přímo z vodné ethanolického extraktu a je desorbován amoniakovým pufrem o pH 9,5. Ole dostupných informací ani tento postup nenašel průmyslovou realizaci pro rychlé opotřebení měniče iontů vlivem lipidů přítomných v extraktu.A disadvantage of the known processes is the salification of insulin from an aqueous residue with sodium chloride or another environmentally undesirable salt. The salt leaves the production cycle in the mother liquors after salting out into the public sewerage network and significantly complicates the treatment of wastewater, or increases the investment costs in the construction of local wastewater treatment plants. Another serious disadvantage of this technological step is the need for two-stage evaporation to a residual ethanol content of less than 2% by volume, because at higher ethanol concentrations the salting out of insulin takes place at a significantly lower quantity. The second stage of evaporation is a source of considerable losses, because it prolongs the time for which the concentrated insulin solution is exposed to elevated temperatures up to 35 ° C by up to several hours. This fact is the reason why a number of workplaces have long been looking for a way to replace evaporation and salting with a more environmentally friendly and less unprofitable procedure. The procedure published by jorpes et al. (Acta chemica Scandinavica 14, 1966, 1771-1780) describes the sorption of insulin from an ethanolic extract to alginic acid. However, it is not suitable for practical use, especially for low yields. A similar procedure was published by Memedov (Mjasnaja industria SSSR 4, 1979, 27-8). Insulin is adsorbed onto the cation exchanger directly from the aqueous ethanolic extract and is desorbed with ammonia buffer pH 9.5. Neither available information nor this procedure found an industrial implementation for the rapid wear of the ion exchanger due to the lipids present in the extract.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob získávání insulinové substance pro výrobu lékových forem, po extrakci pankreatu vodným okyseleným ethanolem, odstranění extrahované pankreatické tkáně, odloučení aniontů kyseliny přítomné v extrakční směsi a snížení koncentrace ethanolu a lipidů v extraktu před zakoncentrováním roztoku membránovou filtrací s diafiltrací jehož podstata spočívá v tom, že se získaný roztok insulinu za současné diafiltrace zahustí filtrací na semipermeabilní membráně zadržující insulin v koncentrátu na koncentraci 1 až 100 g insulinu/1, potom se připraví insulinová substance pro výrobu lékových forem.These disadvantages are eliminated by the method of obtaining insulin substance for the production of dosage forms, after extraction of the pancreas with aqueous acidified ethanol, removal of extracted pancreatic tissue, separation of acid anions present in the extraction mixture and reduction of ethanol and lipids in the extract before concentrating the solution by membrane filtration by concentrating the obtained insulin solution with diafiltration by filtration on a semipermeable membrane retaining insulin in a concentrate to a concentration of 1 to 100 g insulin / 1, then an insulin substance is prepared for the production of dosage forms.

Vhodné semipermeabilní membrány, které nepropouštějí insulin, a tím jej koncentrují v tzv. retentátu a které propouštějí vodu, s vodou mísitelná organická rozpouštědla a anorganické i organické průvodní látky o mol. hmot, nižší než je mol. hmot, insulinu (cca 6 000) do tzv. permeátu jsou při ultrafiltračním ději membrány na bázi celulózy, acetátu celulózy, polysulfonů, fluoropolymerů nebo polyakrylonitrilbutadienstyrenu a při reversně osmotickém ději membrány na bázi derivátů celulózy, nebo tenkovrstvé kompozitní membrány na bázi polysulfonů a polyamidů. Pro průběh koncentračního procesu i následného zpracování je účelné snížit koncentraci organického s vodou mísitelného rozpouštědla a balastních látek organického nebo anorganického původu o mol. hmot, nižší než asi 6 000 tím, že se k retentátu obsahujícímu insulin již v průběhu zahušťování ultrafiltrací nebo reverzníSuitable semipermeable membranes which do not permeate insulin and thus concentrate it in the so-called retentate and which permeate water, water-miscible organic solvents and inorganic and organic concomitant substances by mol. wt, less than mol. In the ultrafiltration process, membranes based on cellulose, cellulose acetate, polysulfones, fluoropolymers or polyacrylonitrile butadiene styrene and in the case of reverse osmosis action, membranes based on cellulose derivatives or thin-film composite membranes based on polysulfones and polyamines. For the course of the concentration process and subsequent processing, it is expedient to reduce the concentration of the organic water-miscible solvent and ballast substances of organic or inorganic origin by mol. less than about 6,000 by contacting the insulin-containing retentate already during thickening by ultrafiltration or reverse

CS 275 737 B6 2 osmozou, nebo až po dosažení žádané koncentrace insulinu přidává voda v objemu, který odpovídá požadovanému snížení koncentrace organického rozpouštědla a balastních látek, jež se ponechají spolu s přidaným objemem vody přejít v rovnovážné koncentraci do permeátu (diafiltrace). Potom se získaný koncentrát insulinu zpracuje některou z obvyklých metod na substanci vhodnou pro farmaceutické použití.CS 275 737 B6 2 osmosis, or only after reaching the desired insulin concentration, water is added in a volume that corresponds to the required reduction in the concentration of organic solvent and ballast substances, which are allowed to pass into the permeate at equilibrium concentration (diafiltration) together with the added volume of water. The insulin concentrate obtained is then processed by any of the customary methods into a substance suitable for pharmaceutical use.

Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se u· vodně ethanolického pankreatického extraktu o koncentraci ethanolu 60 až 80 % obj. a o pH 1,5 až 4,5 sníží koncentrace ethanolu na 40 až 0,1 % obj. buď naředěním vodou, nebo odpařením za sníženého tlaku, odloučí se nejméně 80 % hmot, přítomných lipidů a takto upravený roztok se podrobí ultrafiltraci nebo reverzní osmóze tak, aby výsledná koncentrace insulinu v retentátu činila 1 až 100 g/1. Obsahuje-li roztok ethanol a je-li pro způsob dalšího zpracování nutno jeho koncentraci v retentátu snížit, provede se diafiltrace buď v ultrafiltračním, nebo reverzně osmotickém ději. Ultrafiltraci nebo reverzní osmózou v kombinaci s diafiltrací se současně odstraní až 80 % hmot, balastních látek organického i anorganického původu. Koncentrát připravený popsaným způsobem a obsahující 1 až 100 g insulinu/1 lze zpracovat na farmaceuticky čistý insulin celou řadou všeobecně známých postupů jako je například vysrážení v izoelektrickém bodě a krystalizace v přítomnosti zinečnatých iontů a acetonu, nebo například přípravou sodné nebo amonné soli insulinu a krystalizací v přítomnosti zinečnatých iontů a acetonu. Při vyšších koncentracích insulinu v retentátu řádově od 10 g/1 lze retentát přímo podrobit finálnímu chromatografickému čištění, například na měniči iontů a po následné krystalizací v přítomnosti zinečnatých iontů a acetonu připravit insulin o vysokém stupni chemické čistoty.The process according to the invention is carried out by reducing the ethanolic pancreatic extract extract with an ethanol concentration of 60 to 80% by volume and a pH of 1.5 to 4.5 to 40 to 0.1% by volume, either by dilution with water or by evaporation under reduced pressure, at least 80% by weight of the lipids present are separated off and the solution thus treated is subjected to ultrafiltration or reverse osmosis so that the final concentration of insulin in the retentate is 1 to 100 g / l. If the solution contains ethanol and if it is necessary to reduce its concentration in the retentate for the further processing, diafiltration is performed in either an ultrafiltration or reverse osmosis process. Ultrafiltration or reverse osmosis in combination with diafiltration simultaneously removes up to 80% by weight of ballast substances of organic and inorganic origin. The concentrate prepared as described and containing 1 to 100 g insulin / l can be processed into pharmaceutically pure insulin by a variety of well-known methods such as isoelectric point precipitation and crystallization in the presence of zinc ions and acetone, or by preparing sodium or ammonium insulin and crystallizing. in the presence of zinc ions and acetone. At higher concentrations of insulin in the retentate of the order of 10 g / l, the retentate can be directly subjected to final chromatographic purification, for example on an ion exchanger and after subsequent crystallization in the presence of zinc ions and acetone to prepare insulin of high chemical purity.

Způsob podle vynálezu lze využít v případech, kdy je nutné šetrně a kvantitativně zvýšit koncentraci insulinu v roztoku až o několik řádů a popřípadě současně snížit koncentraci s vodou mísitelného organického rozpouštědla nebo průvodních balastních látek o mol. hmot, menší než je mol. hmot, insulinu.The process according to the invention can be used in cases where it is necessary to gently and quantitatively increase the concentration of insulin in the solution by up to several orders of magnitude and optionally simultaneously reduce the concentration of water-miscible organic solvent or accompanying ballast substances by mol. mass, less than mol. matter, insulin.

Způsob podle vynálezu umožňuje nejméně z 90 % hmot, omezit ekologicky nežádoucí používání chloridu sodného, vyloučit rizikový faktor druhého stupně odpařování ethanolu za sníženého tlaku, zkrátit celkový čas procesu, fyzicky namáhavou práci nahradit kvalifikovaným dohledem nad správnou funkcí ultrafiltračního nebo reverzně osmozního zařízení. Toto se projevuje významným snížením spotřeby surovin a energií a zvýšením výtěžku žádaného produktu, vThe process according to the invention makes it possible to at least 90% by weight, to reduce the environmentally undesirable use of sodium chloride, to eliminate the risk factor of the second stage evaporation of ethanol under reduced pressure, to shorten the overall process time. This is reflected in a significant reduction in the consumption of raw materials and energy and an increase in the yield of the desired product, in

Autory vynálezu bylo prokázáno, že postupem podle vynálezu se sníží spotřeba chloridu sodného nejméně o 90 % hmot, a výtěžek insulinu se zvýší o 2 až 20 % hmot.The inventors have shown that the process according to the invention reduces the consumption of sodium chloride by at least 90% by weight and increases the yield of insulin by 2 to 20% by weight.

Příklad 1Example 1

100 kg vepřového pankreatu bylo opakovaně extrahováno pomocí celkem 250 1 ethanolu o koncentraci 68 % obj. při hodnotě pH 3,2 až 3,4 nastavené pomocí kyseliny fosforečné. Extrahovaná tkáň byla odstraněna centrifugací a spojené extrakty byly vyčeřeny filtrací s aktivním uhlím. Anion kyseliny fosforečné byl odloučen pomocí měniče aniontů pracujícím v hydroxylovém cyklu, čímž došlo k zvýšení pH na hodnotu 8,2 a vysrážení některých balastních látek organického původu. Po filtraci a okyselení pomocí kyseliny sírové na hodnotu pH 3,5 byl upravený extrakt zakoncentrován odpařením za sníženého tlaku při teplotě do 35 °C na objem 40 1, přičemž koncentrace ethanolu v zahuštěném extraktu poklesla na 15 % obj. Vyloučené lipidy byly odstraněny dekantací a filtrací. Filtrát obsahující insulin byl zahuštěn reverzní osmózou na kompozitní polymerní membráně HC 50 P firmy Dow Denmark na objem 2 1. Ke koncentrátu bylo přidáno 8 1 vody a roztok byl podroben diafiltrací v reverzně osmotickém ději až do opětovného dosažení objemu koncentrátu 2 1. Získaný koncentrát obsahoval 7,1 g/1 insulinu; 1 až 2 % obj. ethanolu a 58 % hmot, původního obsahu sušiny balastních látek. Z takto připraveného koncentrátu byl insulin vysrážen v izoelektrickém bodě při hodnotě pH 5,2 až 5,4. Sraženina amorfního insulinu byla rozpuštěna v 650 ml destilované vody s přídavkem 13 g kyseliny citrónové. Roztok byl zfiltrován přes celulózo100 kg of porcine pancreas was repeatedly extracted with a total of 250 l of ethanol at a concentration of 68% by volume at a pH value of 3.2 to 3.4 adjusted with phosphoric acid. The extracted tissue was removed by centrifugation and the combined extracts were clarified by activated charcoal filtration. The phosphoric acid anion was separated using an anion exchanger operating in the hydroxyl cycle, raising the pH to 8.2 and precipitating some ballast substances of organic origin. After filtration and acidification with sulfuric acid to pH 3.5, the treated extract was concentrated by evaporation under reduced pressure at up to 35 ° C to a volume of 40 l, the ethanol concentration in the concentrated extract dropping to 15% by volume. filtration. The insulin-containing filtrate was concentrated by reverse osmosis on a Dow Denmark HC 50 P composite polymer membrane to a volume of 2 L. 8 L of water was added to the concentrate and the solution was diafiltered in reverse osmosis until the concentrate volume reached 2 L again. 7.1 g / l insulin; 1 to 2% by volume of ethanol and 58% by weight, of the original dry matter content of ballast substances. From the concentrate thus prepared, insulin was precipitated at the isoelectric point at a pH of 5.2 to 5.4. The precipitate of amorphous insulin was dissolved in 650 ml of distilled water with the addition of 13 g of citric acid. The solution was filtered through cellulose

CS 275 737 86 vou filtrační vložku Slávia č. 7. K filtrátu bylo přidáno 156 ml acetonu a 20 ml 5 % hmot, roztoku chloridu zinečnatého. Pomocí 12 % hmot, roztoku hydroxidu amonného byla nastavena hodnota pH krystalizační směsi 6,5. Po vyloučení prvních krystalů byla hodnota pH postupně snižována až na 5,8 pomocí 1,5M kyseliny chlorovodíkové. Po 24 h krystalizace byly insulinové krystaly odsáty na fritě č. 4, promyty destilovanou vodou a odvodněny acetonem. Zbytky acetonu byly vymyty diethyletherem a krystalický insulin byl dosušen v exsikátoru za sníženého tlaku v přítomnosti oxidu fosforečného.CS 275 737 86 Slavia filter cartridge No. 7. 156 ml of acetone and 20 ml of 5% by weight zinc chloride solution were added to the filtrate. The pH of the crystallization mixture was adjusted to 6.5 with 12% by weight ammonium hydroxide solution. After precipitation of the first crystals, the pH was gradually lowered to 5.8 with 1.5M hydrochloric acid. After 24 h of crystallization, the insulin crystals were filtered off with suction on a No. 4 frit, washed with distilled water and dehydrated with acetone. The acetone residues were washed with diethyl ether and the crystalline insulin was dried in a desiccator under reduced pressure in the presence of phosphorus pentoxide.

Výtěžek činil 13,2 g insulinu.The yield was 13.2 g of insulin.

Příklad 2Example 2

Postupem podle příkladu 1 bylo společně extrahováno 70 kg vepřového a 30 kg hovězího pankreatu. Vodný odparek o objemu 24 1 a koncentraci ethanolu 0,6 % obj. byl zakoncentrován ultrafiltrací na membráně GR 90 PP firmy Dow Denmark na objem 2 1. Koncentrát byl zředěn přídavkem 8 1 vody a podroben diafiltraci v ultrafiltračním ději. Koncentrát o objemu 1 1, obsahující 11,8 g/1 insulinu a 26 % hmot, původního obsahu sušiny balastních látek byl upraven na hodnotu pH 8,2 pomocí 5M hydroxidu sodného a na hodnotu měrné vodivosti 81 mS/cm přídavkem chloridu sodného. Vyloučená pevná fáze obsahující 82 ¾ hmot, insulinu byla rozpuštěna v 150 ml destilované vody při hodnotě pH 2,2 a po filtraci podrobena chromatografii na sloupci o rozměrech 12x100 cm polydextranového gelu při eluci pomocí 0,01M kyseliny chlorovodíkové. Z hlavní frakce eluátu byl izolován insulin v amorfní formě vysrážením pomocí octanu zinečnatého a acetonu při hodnotě pH 6,35. Krystalizace byla provedena postupem podle příkladu 1.Following the procedure of Example 1, 70 kg of porcine and 30 kg of bovine pancreas were extracted together. The 24 L aqueous residue with an ethanol concentration of 0.6% by volume was concentrated by ultrafiltration on a GR 90 PP membrane from Dow Denmark to a volume of 2 L. The concentrate was diluted by adding 8 L of water and diafiltered in an ultrafiltration process. A 1 L concentrate containing 11.8 g / L insulin and 26% by weight of the original ballast solids content was adjusted to pH 8.2 with 5M sodium hydroxide and to a specific conductivity of 81 mS / cm by the addition of sodium chloride. The precipitated solid containing 82% by weight of insulin was dissolved in 150 ml of distilled water at pH 2.2 and, after filtration, subjected to column chromatography on a 12 * 100 cm polydextran gel eluting with 0.01 M hydrochloric acid. Insulin was isolated from the main fraction of the eluate in amorphous form by precipitation with zinc acetate and acetone at pH 6.35. Crystallization was performed according to Example 1.

Výtěžek činil 10,6 g insulinu.The yield was 10.6 g of insulin.

Příklad 3Example 3

Postupem podle příkladu 2 bylo zpracováno 100 kg vepřového pankreatu. 1 1 koncentrátu obsahujícího 12,4 g/1 insulinu a 23 % hmot, původního obsahu sušiny balastních látek byl upraven na hodnotu pH 8,2 a po filtraci nanesen na sloupec o rozměrech 12x25 cm měniče aniontů pracujícím v chloridovém cyklu, založeném na bázi diethylaminoethyl celulózy. Eluce byla provedena v gradientu trishydroxymethylaminomethanu, chloridu sodného a kyseliny chlorovodíkové. Z hlavní frakce byl insulin izolován postupem podle příkladu 2.Following the procedure of Example 2, 100 kg of porcine pancreas was processed. 1 l of a concentrate containing 12.4 g / l of insulin and 23% by weight of the original dry matter content of ballast substances was adjusted to pH 8.2 and, after filtration, applied to a 12x25 cm column of an anion exchanger operating in a chloride cycle based on diethylaminoethyl cellulose. Elution was performed in a gradient of trishydroxymethylaminomethane, sodium chloride and hydrochloric acid. Insulin was isolated from the main fraction according to the procedure of Example 2.

Výtěžek činil 9,9 g insulinu.The yield was 9.9 g of insulin.

Příklad 4Example 4

Postupem podle příkladu 1 bylo zpracováno 100 kg vepřového pankreatu s tím, že 62 1 vyčeřeného odparku o koncentraci ethanolu 37 % obj. bylo zahuštěno na membráně HC 50 P firmy Dow Denmark na 4 1, potom bylo přidáno 6 1 destilované vody a roztok byl zakoncentrován reverzní osmózou při současně probíhající diafiltraci na objem 2 1. Bylo přidáno dalších 18 1 vody a objem koncentrátu byl snížen diafiltraci v reverzně osmotickém ději na 2 1. Koncentrát obsahoval 6,6 g/1 insulinu a 51 % hmot, původního obsahu sušiny balastních látek. Z koncentrátu byl připraven insulin postupem podle příkladu 1.Following the procedure of Example 1, 100 kg of porcine pancreas were treated, concentrating 62 L of a clarified residue with an ethanol concentration of 37% by volume on a Dow Denmark HC 50 P membrane to 4 L, then adding 6 L of distilled water and concentrating the solution. by reverse osmosis with simultaneous diafiltration to a volume of 2 l. An additional 18 l of water was added and the volume of the concentrate was reduced by diafiltration in a reverse osmosis process to 2 l. The concentrate contained 6.6 g / l insulin and 51% by weight, original dry matter content . Insulin was prepared from the concentrate according to the procedure of Example 1.

Výtěžek činil 12,8 g insulinu.The yield was 12.8 g of insulin.

Příklad 5 kg hovězího pankreatu byl extrahován pomocí 5 1 extrakčního činidla o složení: 50 % obj. methanolu, 10 % obj. acetonu a 40 % obj. vody při hodnotě pH 2,2 nastavené pomocí kyseliny sírové. Po odfiltrování extrahované tkáně bylo upraveno pH extraktu na hodnotu 7,8 pomocí 5M hydroxidu sodného. Po odfiltrování vyloučené sraženiny bylo přidáno 20 1 destilované vody a pH bylo nastaveno na hodnotu 4,4 pomocí 1,5M kyseliny chlorovodíkové a vyloučené lipidy byly odstraněny vakuovou filtrací. Takto upravený extrakt byl zakoncentrován reverzní osmózou na membráně HC 50 P firmy Dow Denmark na objem 450 ml. Z koncentrátu o obExample 5 kg of bovine pancreas was extracted with 5 l of an extractant consisting of: 50% by volume of methanol, 10% by volume of acetone and 40% by volume of water at pH 2.2 adjusted with sulfuric acid. After filtering off the extracted tissue, the pH of the extract was adjusted to 7.8 with 5M sodium hydroxide. After filtering off the precipitate formed, 20 l of distilled water were added and the pH was adjusted to 4.4 with 1.5M hydrochloric acid and the precipitated lipids were removed by vacuum filtration. The extract thus prepared was concentrated by reverse osmosis on a HC 50 P membrane from Dow Denmark to a volume of 450 ml. From the concentrate of ob

CS 275 737 B6 4 sáhu insulinu 0,170 g/1 byl izolován amorfní insulin srážením acetonem a octanem zinečnatým při hodnotě pH 6,8. Krystalizace byla provedena podle příkladu 1 s tím, že krystalizační roztok obsahoval 30 ml destilované vody, 6 ml acetonu, 0,8 ml 5 % hmot, roztoku chloridu zinečnatého a 0,5 g kyseliny citrónové.0.175 g / l insulin amorphous insulin was isolated by precipitation with acetone and zinc acetate at pH 6.8. The crystallization was carried out according to Example 1, except that the crystallization solution contained 30 ml of distilled water, 6 ml of acetone, 0.8 ml of 5% by weight, zinc chloride solution and 0.5 g of citric acid.

Výtěžek činil 0,0775 g insulinu.The yield was 0.0775 g of insulin.

Příklad 6Example 6

1 suspenze o původní koncentraci insulinových krystalů a amorfního insulinu 16,6 g/1 z expirovaných lékových forem bylo rozpuštěno při hodnotě pH 2,0 přídavkem 1,5M kyseliny chlorovodíkové. Roztok byl zakoncentrován reverzní osmózou na membráně CA 865 PP firmy Dow Denmark na objem 1,1 1. Koncentrát o obsahu insulinu 100 g/1 byl podroben chromatografii na sloupci o rozměrech 37x90 cm polydextranového gelu při eluci pomocí 0,01M kyseliny chlorovodíkové. Z hlavní frakce byl připraven insulin postupem podle příkladu 2 s tím, že krystalizační roztok obsahoval 6 000 ml destilované vody, 100 g kyseliny citrónové, 1 200 ml acetonu a 160 ml 5 % hmot, roztoku chloridu zinečnatého.1 suspension of the original concentration of insulin crystals and amorphous insulin 16.6 g / l from the expired dosage forms was dissolved at pH 2.0 by adding 1.5M hydrochloric acid. The solution was concentrated by reverse osmosis on a Dow Denmark CA 865 PP membrane to a volume of 1.1 L. The 100 g / l insulin concentrate was chromatographed on a 37 x 90 cm polydextran gel column eluting with 0.01 M hydrochloric acid. Insulin was prepared from the main fraction according to the procedure of Example 2, except that the crystallization solution contained 6,000 ml of distilled water, 100 g of citric acid, 1,200 ml of acetone and 160 ml of 5% by weight zinc chloride solution.

Výtěžek činil 98,5 g insulinu.The yield was 98.5 g of insulin.

Claims

PATENT CLAIMS

Process for obtaining insulin substance for the production of dosage forms, after extraction of the pancreas with aqueous acidified ethanol, removal of extracted pancreatic tissue, removal of acid anions present in the extraction mixture and reduction of ethanol and lipids in the extract before concentrating the solution by diafiltration membrane filtration. the insulin solution obtained, while diafiltration, is concentrated on a semipermeable membrane retaining insulin in a concentrate to a concentration of 1 to 100 g insulin / l, then the insulin substance is isolated for the production of dosage forms.