CS275737B6 - Způsob získávání insulinové substance z extraktů - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu izolace insulinu z pankreatického extraktu po odstranění extrahované pankreatické tkáně a aniontu kyseliny přítomně v extrakční směsi a po snížení koncentrace ethanolu a obsahu lipidů, kdy se získaný roztok insulinu zahustí filtrací na semipermeabilní membráně na koncentraci 1 až 100 g/1. Současně se odstraní převážná část balastů i případné s vodou mísitelné organické rozpouštědlo diafiltrací v ultrafiltračním nebo reverzně osmozním ději. Tak se získá koncentrát insulinu pro přímé další obvyklé zpracování na farmaceutickou substanci bez použití vysolovací metody

Description

V současné době výroba insulinu z pankreatu spočívá v desintegraci zmražených žláz, extrakci vodným okyseleným ethanolem, vyčeření extraktu a následném odloučení aniontu kyseliny přítomné v extrakční směsi spolu s některými průvodními látkami organického původu. Z takto upraveného extraktu se za sníženého tlaku oddestiluje ethanol zpravidla ve dvou stupních. V prvním stupni se zredukuje obsah etanolu na 10 až 40 % obj., čímž se z roztoku vyloučí až 80 % hmot, lipidů vyextrahovaných ze základní suroviny. Ve druhém stupni se sníží obsah etanolu pod 2 % obj. a vyloučí se zbývající část lipidů. Vyloučené lipidy se z vodného odparku téměř kvantitativně oddělí dekantací a filtrací. Z čirého vodného odparku se vysolí surový insulin obvykle přídavkem chloridu sodného v množství 27 kg na 100 1. Surový vysolený insulin se po rozpuštění zbaví části bílkovinných příměsí úpravou pH a filtrací. Z filtrátu se izoluje farmaceuticky použitelný insulin řadou všeobecně známých postupů jako je například srážení amorfního insulinu v přítomnosti acetonu a zinečnatých iontů a krystalizací finálního produktu z roztoku amorfního insulinu v přítomnosti citrátu, zinečnatých iontů a acetonu. Nověji jsou zařazovány další čisticí operace jako je například chromatografie na molekulových sítech (například čs. autorské osvědčení č. 186988), popřípadě je neselektivní srážení amorfního insulinu pomocí zinečnatých iontů a acetonu nahraženo srážením soli insulinu s alkalickým kovem nebo amonným iontem (čs. autorské osvědčení č. 261994).

Nevýhodou známých postupů je vysolování insulinu z vodného odparku pomocí chloridu sodného nebo jiné ekologicky nežádoucí soli. Sůl odchází z výrobního cyklu v matečných louzích po vysolování do veřejné kanalizační sítě a značně ztěžuje čištění odpadních vod, popřípadě zvyšuje investiční náklady při výstavbě lokálních čističek odpadních vod. Dalším / v vážným nedostatkem tohoto technologického stupně je nutnost dvoustupňového odpařování na zbytkový obsah ethanolu nižší než 2 % obj., protože při vyšších koncentracích ethanolu probíhá vysolování insulinu s výrazně nižší kvantitou. Druhý stupeň odpařování je zdrojem značných ztrát, protože až o několik hodin prodlužuje čas, po který je koncentrovaný roztok insulinu vystaven zvýšeným teplotám do 35 °C. Tato skutečnost je příčinou, proč je dlouhodobě na řadě pracovišť hledán způsob náhrady odpařování a vysolování postupem ekologicky přijatelnějším a méně ztrátovým. Postup zveřejněný jorpesem a kol. (Acta chemica Scandinavica 14, 1966, 1771-1780) popisuje sorpci insulinu z ethanolického extraktu na kyselinu alginovou. Pro praktické využití však není vhodný, zejména pro nízké dosahované výtěžky. Obdobný postup byl zveřejněn Memedovem (Mjasnaja industria SSSR 4, 1979, 27-8). Na měnič kationtů se adsorbuje insulin přímo z vodné ethanolického extraktu a je desorbován amoniakovým pufrem o pH 9,5. Ole dostupných informací ani tento postup nenašel průmyslovou realizaci pro rychlé opotřebení měniče iontů vlivem lipidů přítomných v extraktu.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob získávání insulinové substance pro výrobu lékových forem, po extrakci pankreatu vodným okyseleným ethanolem, odstranění extrahované pankreatické tkáně, odloučení aniontů kyseliny přítomné v extrakční směsi a snížení koncentrace ethanolu a lipidů v extraktu před zakoncentrováním roztoku membránovou filtrací s diafiltrací jehož podstata spočívá v tom, že se získaný roztok insulinu za současné diafiltrace zahustí filtrací na semipermeabilní membráně zadržující insulin v koncentrátu na koncentraci 1 až 100 g insulinu/1, potom se připraví insulinová substance pro výrobu lékových forem.

Vhodné semipermeabilní membrány, které nepropouštějí insulin, a tím jej koncentrují v tzv. retentátu a které propouštějí vodu, s vodou mísitelná organická rozpouštědla a anorganické i organické průvodní látky o mol. hmot, nižší než je mol. hmot, insulinu (cca 6 000) do tzv. permeátu jsou při ultrafiltračním ději membrány na bázi celulózy, acetátu celulózy, polysulfonů, fluoropolymerů nebo polyakrylonitrilbutadienstyrenu a při reversně osmotickém ději membrány na bázi derivátů celulózy, nebo tenkovrstvé kompozitní membrány na bázi polysulfonů a polyamidů. Pro průběh koncentračního procesu i následného zpracování je účelné snížit koncentraci organického s vodou mísitelného rozpouštědla a balastních látek organického nebo anorganického původu o mol. hmot, nižší než asi 6 000 tím, že se k retentátu obsahujícímu insulin již v průběhu zahušťování ultrafiltrací nebo reverzní

CS 275 737 B6 2 osmozou, nebo až po dosažení žádané koncentrace insulinu přidává voda v objemu, který odpovídá požadovanému snížení koncentrace organického rozpouštědla a balastních látek, jež se ponechají spolu s přidaným objemem vody přejít v rovnovážné koncentraci do permeátu (diafiltrace). Potom se získaný koncentrát insulinu zpracuje některou z obvyklých metod na substanci vhodnou pro farmaceutické použití.

Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se u· vodně ethanolického pankreatického extraktu o koncentraci ethanolu 60 až 80 % obj. a o pH 1,5 až 4,5 sníží koncentrace ethanolu na 40 až 0,1 % obj. buď naředěním vodou, nebo odpařením za sníženého tlaku, odloučí se nejméně 80 % hmot, přítomných lipidů a takto upravený roztok se podrobí ultrafiltraci nebo reverzní osmóze tak, aby výsledná koncentrace insulinu v retentátu činila 1 až 100 g/1. Obsahuje-li roztok ethanol a je-li pro způsob dalšího zpracování nutno jeho koncentraci v retentátu snížit, provede se diafiltrace buď v ultrafiltračním, nebo reverzně osmotickém ději. Ultrafiltraci nebo reverzní osmózou v kombinaci s diafiltrací se současně odstraní až 80 % hmot, balastních látek organického i anorganického původu. Koncentrát připravený popsaným způsobem a obsahující 1 až 100 g insulinu/1 lze zpracovat na farmaceuticky čistý insulin celou řadou všeobecně známých postupů jako je například vysrážení v izoelektrickém bodě a krystalizace v přítomnosti zinečnatých iontů a acetonu, nebo například přípravou sodné nebo amonné soli insulinu a krystalizací v přítomnosti zinečnatých iontů a acetonu. Při vyšších koncentracích insulinu v retentátu řádově od 10 g/1 lze retentát přímo podrobit finálnímu chromatografickému čištění, například na měniči iontů a po následné krystalizací v přítomnosti zinečnatých iontů a acetonu připravit insulin o vysokém stupni chemické čistoty.

Způsob podle vynálezu lze využít v případech, kdy je nutné šetrně a kvantitativně zvýšit koncentraci insulinu v roztoku až o několik řádů a popřípadě současně snížit koncentraci s vodou mísitelného organického rozpouštědla nebo průvodních balastních látek o mol. hmot, menší než je mol. hmot, insulinu.

Způsob podle vynálezu umožňuje nejméně z 90 % hmot, omezit ekologicky nežádoucí používání chloridu sodného, vyloučit rizikový faktor druhého stupně odpařování ethanolu za sníženého tlaku, zkrátit celkový čas procesu, fyzicky namáhavou práci nahradit kvalifikovaným dohledem nad správnou funkcí ultrafiltračního nebo reverzně osmozního zařízení. Toto se projevuje významným snížením spotřeby surovin a energií a zvýšením výtěžku žádaného produktu, v

Autory vynálezu bylo prokázáno, že postupem podle vynálezu se sníží spotřeba chloridu sodného nejméně o 90 % hmot, a výtěžek insulinu se zvýší o 2 až 20 % hmot.

Příklad 1

100 kg vepřového pankreatu bylo opakovaně extrahováno pomocí celkem 250 1 ethanolu o koncentraci 68 % obj. při hodnotě pH 3,2 až 3,4 nastavené pomocí kyseliny fosforečné. Extrahovaná tkáň byla odstraněna centrifugací a spojené extrakty byly vyčeřeny filtrací s aktivním uhlím. Anion kyseliny fosforečné byl odloučen pomocí měniče aniontů pracujícím v hydroxylovém cyklu, čímž došlo k zvýšení pH na hodnotu 8,2 a vysrážení některých balastních látek organického původu. Po filtraci a okyselení pomocí kyseliny sírové na hodnotu pH 3,5 byl upravený extrakt zakoncentrován odpařením za sníženého tlaku při teplotě do 35 °C na objem 40 1, přičemž koncentrace ethanolu v zahuštěném extraktu poklesla na 15 % obj. Vyloučené lipidy byly odstraněny dekantací a filtrací. Filtrát obsahující insulin byl zahuštěn reverzní osmózou na kompozitní polymerní membráně HC 50 P firmy Dow Denmark na objem 2 1. Ke koncentrátu bylo přidáno 8 1 vody a roztok byl podroben diafiltrací v reverzně osmotickém ději až do opětovného dosažení objemu koncentrátu 2 1. Získaný koncentrát obsahoval 7,1 g/1 insulinu; 1 až 2 % obj. ethanolu a 58 % hmot, původního obsahu sušiny balastních látek. Z takto připraveného koncentrátu byl insulin vysrážen v izoelektrickém bodě při hodnotě pH 5,2 až 5,4. Sraženina amorfního insulinu byla rozpuštěna v 650 ml destilované vody s přídavkem 13 g kyseliny citrónové. Roztok byl zfiltrován přes celulózo

CS 275 737 86 vou filtrační vložku Slávia č. 7. K filtrátu bylo přidáno 156 ml acetonu a 20 ml 5 % hmot, roztoku chloridu zinečnatého. Pomocí 12 % hmot, roztoku hydroxidu amonného byla nastavena hodnota pH krystalizační směsi 6,5. Po vyloučení prvních krystalů byla hodnota pH postupně snižována až na 5,8 pomocí 1,5M kyseliny chlorovodíkové. Po 24 h krystalizace byly insulinové krystaly odsáty na fritě č. 4, promyty destilovanou vodou a odvodněny acetonem. Zbytky acetonu byly vymyty diethyletherem a krystalický insulin byl dosušen v exsikátoru za sníženého tlaku v přítomnosti oxidu fosforečného.

Výtěžek činil 13,2 g insulinu.

Příklad 2

Postupem podle příkladu 1 bylo společně extrahováno 70 kg vepřového a 30 kg hovězího pankreatu. Vodný odparek o objemu 24 1 a koncentraci ethanolu 0,6 % obj. byl zakoncentrován ultrafiltrací na membráně GR 90 PP firmy Dow Denmark na objem 2 1. Koncentrát byl zředěn přídavkem 8 1 vody a podroben diafiltraci v ultrafiltračním ději. Koncentrát o objemu 1 1, obsahující 11,8 g/1 insulinu a 26 % hmot, původního obsahu sušiny balastních látek byl upraven na hodnotu pH 8,2 pomocí 5M hydroxidu sodného a na hodnotu měrné vodivosti 81 mS/cm přídavkem chloridu sodného. Vyloučená pevná fáze obsahující 82 ¾ hmot, insulinu byla rozpuštěna v 150 ml destilované vody při hodnotě pH 2,2 a po filtraci podrobena chromatografii na sloupci o rozměrech 12x100 cm polydextranového gelu při eluci pomocí 0,01M kyseliny chlorovodíkové. Z hlavní frakce eluátu byl izolován insulin v amorfní formě vysrážením pomocí octanu zinečnatého a acetonu při hodnotě pH 6,35. Krystalizace byla provedena postupem podle příkladu 1.

Výtěžek činil 10,6 g insulinu.

Příklad 3

Postupem podle příkladu 2 bylo zpracováno 100 kg vepřového pankreatu. 1 1 koncentrátu obsahujícího 12,4 g/1 insulinu a 23 % hmot, původního obsahu sušiny balastních látek byl upraven na hodnotu pH 8,2 a po filtraci nanesen na sloupec o rozměrech 12x25 cm měniče aniontů pracujícím v chloridovém cyklu, založeném na bázi diethylaminoethyl celulózy. Eluce byla provedena v gradientu trishydroxymethylaminomethanu, chloridu sodného a kyseliny chlorovodíkové. Z hlavní frakce byl insulin izolován postupem podle příkladu 2.

Výtěžek činil 9,9 g insulinu.

Příklad 4

Postupem podle příkladu 1 bylo zpracováno 100 kg vepřového pankreatu s tím, že 62 1 vyčeřeného odparku o koncentraci ethanolu 37 % obj. bylo zahuštěno na membráně HC 50 P firmy Dow Denmark na 4 1, potom bylo přidáno 6 1 destilované vody a roztok byl zakoncentrován reverzní osmózou při současně probíhající diafiltraci na objem 2 1. Bylo přidáno dalších 18 1 vody a objem koncentrátu byl snížen diafiltraci v reverzně osmotickém ději na 2 1. Koncentrát obsahoval 6,6 g/1 insulinu a 51 % hmot, původního obsahu sušiny balastních látek. Z koncentrátu byl připraven insulin postupem podle příkladu 1.

Výtěžek činil 12,8 g insulinu.

Příklad 5 kg hovězího pankreatu byl extrahován pomocí 5 1 extrakčního činidla o složení: 50 % obj. methanolu, 10 % obj. acetonu a 40 % obj. vody při hodnotě pH 2,2 nastavené pomocí kyseliny sírové. Po odfiltrování extrahované tkáně bylo upraveno pH extraktu na hodnotu 7,8 pomocí 5M hydroxidu sodného. Po odfiltrování vyloučené sraženiny bylo přidáno 20 1 destilované vody a pH bylo nastaveno na hodnotu 4,4 pomocí 1,5M kyseliny chlorovodíkové a vyloučené lipidy byly odstraněny vakuovou filtrací. Takto upravený extrakt byl zakoncentrován reverzní osmózou na membráně HC 50 P firmy Dow Denmark na objem 450 ml. Z koncentrátu o ob

CS 275 737 B6 4 sáhu insulinu 0,170 g/1 byl izolován amorfní insulin srážením acetonem a octanem zinečnatým při hodnotě pH 6,8. Krystalizace byla provedena podle příkladu 1 s tím, že krystalizační roztok obsahoval 30 ml destilované vody, 6 ml acetonu, 0,8 ml 5 % hmot, roztoku chloridu zinečnatého a 0,5 g kyseliny citrónové.

Výtěžek činil 0,0775 g insulinu.

Příklad 6

1 suspenze o původní koncentraci insulinových krystalů a amorfního insulinu 16,6 g/1 z expirovaných lékových forem bylo rozpuštěno při hodnotě pH 2,0 přídavkem 1,5M kyseliny chlorovodíkové. Roztok byl zakoncentrován reverzní osmózou na membráně CA 865 PP firmy Dow Denmark na objem 1,1 1. Koncentrát o obsahu insulinu 100 g/1 byl podroben chromatografii na sloupci o rozměrech 37x90 cm polydextranového gelu při eluci pomocí 0,01M kyseliny chlorovodíkové. Z hlavní frakce byl připraven insulin postupem podle příkladu 2 s tím, že krystalizační roztok obsahoval 6 000 ml destilované vody, 100 g kyseliny citrónové, 1 200 ml acetonu a 160 ml 5 % hmot, roztoku chloridu zinečnatého.

Výtěžek činil 98,5 g insulinu.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Způsob získávání insulinové substance pro výrobu lékových forem, po extrakci pankreatu vodným okyseleným ethanolem, odstranění extrahované pankreatické tkáně, odstranění aniontů kyseliny přítomné v extrakční směsi a snížení koncentrace ethanolu a lipidů v extraktu před zakoncentrováním roztoku membránovou filtrací s diafiltrací, vyznačující se tím, že se získaný roztok insulinu za současné diafiltrace zahustí na semipermeabilní membráně zadržující insulin v koncentrátu na koncentraci 1 až 100 g insulinu/1, potom se izoluje insulinová substance pro výrobu lékových forem.