CS275662B6 - Nosič na stabilizáciu enzýmov a spósob jeho přípravy - Google Patents

Description

1 CS 275 662 B6

Vynález sa týká nosiča na stabilizáciu enzýmov a spósobu jeho přípravy.

Stabilizácia enzýmov je dóležitá tak pře účely základného výskumu, ako i pře potřebyspoločenskej praxe. Mnohé enzýmy najma pri vysokých stupňoch čistoty sú velmi citlivé nastratu aktivity při skladovaní, a to nielen při laboratórnych teplotách, ale i pri zníže-ných teplotách, čím sa znehodnocuje práca spojená s ich izoláciou a purifikáciou. Sú známerózne spósoby stabilizácie enzýmov tak v roztoku, alebo v pevnom stave ich chemickou modi-fikáciou /R.Axén, P.Marin, Jonson J.: Biopolymers 9,401 /1970/, resp. immobilizáciou/ K.Mosbach: Meth. Enzymol. 44,453 /1976/. Spoločným nedostatkom známých postupov stabilizácieenzýmov je spravidla ich technologická náročnost’, ako i strata značnej časti aktivity enzý-mu v modifikačnom stupni.

Uvedené nedostatky rieši nosič na stabilizáciu enzýmov na báze proteínov podlá vynále-zu, ktorého podstatou je, že je tvořený práškovou formou proteinu, s výhodou vaječnéhobielka alebo hovádzieho albuminu alebo kazeínu, zosieteného epichlórhydrínom v množstve 15až 25 % hmot. na hmotnost’ sušiny proteinu, pričom velkost’ častíc nosiča je v rozsahu 40 až300 mikrometrov a hodnota napúčania vo vodě je v rozsahu 6 až 15 ml/g. Podstatou spósobupřípravy nosiča je, že vodný roztok proteinu o koncentrácii 10 až 13 % hmot., s výhodoučerstvý vaječný bielok, sa sieťuje v prostředí hydroxidu sodného o koncentrácii 0,8 až 1,2 %hmot. při teplote 15 až 25 °C po dobu 12 až 20 h s epichlórhydrínom v množstve 1,5 až 2,5 %hmot. na hmotnost sletovaného proteinového roztoku, načo sa zosietený protein zmixuje v rý-chloobrátkovom mixeri v etanole na velkost častíc 40 až 3.00 mikrometrov, suspenzia sa pre-myje na filtri destilovanou vodou do neutrálnej reakcie a nakoniec sa voda z gélu vytěsníalkoholom a alkohol sa odpaří volné na vzduch alebo vo vákuovej sušiarni pri teplote do 40 °C. Při využití nosiča podl’a vynálezu nedochádza k poklesu aktivity enzýmu a spósob přípra-vy nosiča je technologicky podstatné jednoduchší v porovnaní s doteraz známými postupmi. Výsledný produkt, biely prášok s velkosťou častíc 40 až 300 mikrometrov je vhodný akopevný nosič na stabilizáciu najma hydrolázových enzýmov. Stabilizácia enzýmu na pripravenomnosiči sa robí jednoducho tak, že enzýmový roztok nalejeme na suchý nosič najlepšie v pomě-re 0,75 ml roztoku enzýmu na 1 g suchého nosiča, dobré rozmiešame necháme 5 až 10 minút na-sať kvapalnú fázu do pórov nosiča a potom zvlhčený nosič necháme vol’ne na vzduchu vysušitv tenkej vrstvě. Vysušený nosič s enzýmom sa móže skladovat pri laboratórnej teplote, resp.u citlivějších enzýmov pri teplote 4 až 8 °C dlhú dobu bez zjavnej straty enzýmovej aktivi-ty. Enzým podlá potřeby uvolníme z nosiča miešaním v 20 až 50 násobku destilovanej vody přiizbovej teplote po dobu 15 minút. Zosietený gél sa odcentrifuguje alebo odfiltruje. Super-natant, resp. filtrát s rozpuštěným enzýmom o póvodnej aktivitě použijeme podlá potřeby.

Pochopitelné roztok enzýmu před štabilizáciou s ohladom na pH a ionovú silu upravímena optimálně hodnoty konkrétného enzýmu. Pri navrhovanom spósobe stabilizácie enzýmov napevnej bielkovinovej matrici nedochádza ku kovalentnej vazbě enzýmu na pevný nosič, ale jed-ná sa tu o fyzikálnu adsorbciu enzýmu na pevný nosič, ktorý má protektorové vlastnosti opro-ti molekule enzýmu, ktorá sa při vysušování orientuje na povrchproteinu tak, že aktivně cen-tra uchovávaného enzýmu sú chráněné proti fyzikálno-chemickej dezakťivácii.

Na přípravu navrhovaného nosiča možno použit aj iný typ proteinu, napr. hovadzí albumin,kazeín a.i., no ekonomicky je najvýhodnejší vaječný bielok.

Hlavnou výhodou navrhovaného spósobu přípravy nosiča na stabilizáciu enzýmov je jehovšeobecná dostupnost’, jednoduchost přípravy a vysoká účinnost stabilizácie hydrolázovýchenzýmov. Příklad 1 K 100 g vaječného bielka so sušinou 12,6 % sa přidá 1,5 ml epichlórhydrínu a mieša sapři laboratórnej teplote 30 min., kedy je epichlórhydrín homogénne rozpuštěný v celom obje-me bielka. Potom sa přidá za zrýchleného miešania 1,5 ml 17,5 % hydroxid sodný a nechá sa

Claims (3)

CS 275 662 B6 2 při laboratórnej tepláte sieťovat 20 hodin. Po zosietení sa pevný gél mixuje v mixeri priotáčkách 1500/min v 200 ml etanolu po dobu 2 minut. Zmixovaný gél sa potom odfiltruje cezsklený filter a na filtri sa premýva destilovanou vodou do neutrálnej reakcie filtrátu. Voda sa z gélu vytěsní etanolom a etanol sa odpaří na vzduchu z tenkej vrstvy gelu na fil-tračnom papieri, alebo sa odpaří vo vákuovej sušiarni při teplote do 40 °C. Vysušený gélsa presituje cez šitá 0,04 a 0,3 mm. Hrubšie částice, ktoré ostáné na site 0,3 mm, sa zo-melú za sucha tak, až celý podiel častíc přejde cez šito 0,3 mm. Frakcia, ktorá přejde si-tom 0,04 sa pře účely stabilizácie enzýmov nepoužije, ale len frakcia v rozsahu 0,04 až0,03 mm. Výťažok použitelnej frakcie sa pohybuje v rozsahu 90 až 95 % hmot. na hmotnost’ su-šiny použitého proteinu. Stabilizácia enzýmu: Na 10 g připraveného suchého proteinového no-siča sa naleje naraz 7,5 ml roztoku oó-amylázy pankreatickej o aktivitě 6,0 yukat vo fos-fátovom pufri 0,05 H o pH 7,0 a dobře sa zamieša, aby sa kvapalná fáza rovnoměrně rozdělilana pevnom nosiči. Po 15 min možno vzorku v tenkej vrstvě na celofáne nechať vysušit’ cez nocpři izbovej teplote. Po vysušení sa vzorka homogenizuje v trecej miske a uskladní při izbo-vej teplote. Po polročnom skladovaní aktivita enzýmu poklesla len o 4,5 %. Ak sa rovnaký roztok enzýmu naniesol na rovnaké množstvo suchej mikrokryštalickejcelulózy a nechal sa rovnako vysušit, tak sa regenerovalo ihned po vysušení už len 2 %pSvodnej aktivity, tj. mikrokryštalická celulóza nemá žiadné protektorové vlastnostipře uchovávanie enzýmovej aktivity při skladovaní enzýmov. Příklad 2 Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že na sieťovanie sa použije 2,5 ml epichlór-hydrínu a sieťovanie trvá 12 hodin pri laboratórnej teplote. Výsledný produkt má obdobnévlastnosti ako produkt v příklade 1. Příklad 3 Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že ako protein sa použije hovádzí albumin roz-pustný v destilovanej vodě na koncentráciu 12,0 « hmot. Výsledný produkt má porovnatelnévlastnosti ako produkt z příkladu 1. Příklad 4 Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že ako enzým na štabilizáciu sa použije slinnáalfa-amyláza. Stabilita enzýmu je obdobná po pol roku ako v příklade pankreatickej alfaamylázy. Vynález má použitie všade, kde je potřebné skladovat hydrolázové enzýmy bez straty ak-tivity, napr. pri přípravě enzýmových štandardov slinnej a pankreatickej alfa amylázy pridiagnostikovaní funkčných porúch pankreasu v humánněj medicíně. PATENTOVÉ NÁROKY

1. Nosič na štabilizáciu enzýmov na báze proteínov, vyznačujúci sa tým, že je tvořený práš-kovou formou proteinu, s výhodou vaječného bielka alebo hovádzieho albuminu alebo kazeínu,zosieteného epichlórhydrínom v množstve 15 až 25 % hmot. na hmotnost sušiny proteiny, pri-čom velkost’ častíc nosiča je v rozsahu 40 až 300 mikrometrov a hodnota napúčania vo vodě jev rozsahu 6 až 15 ml/g.

2. Spósob přípravy nosiča na štabilizáciu enzýmov podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že vod-ný roztok proteinu o koncentrácii 10 až 13 % hmot., s výhodou čerstvý vaječný bielok, sasieťuje v prostředí hydroxidu sodného o koncentrácii 0,8 až 1,2 % hmot. pri teplote 15 až

3 CS 275 662 Β6 30 °C po dobu 12 až 20 h s epichlórhydrínom v množstve 1,5 až 2,5 % hmot. na hmotnost sleto- vaného proteinového roztoku, načo sa zosietený protein zmixuje v etanole na velkost částic 40 až 300 mikrometrov suspenzia sa premyje na filtri destilovanou vodou do neutrálnej reak- cie, voda sa z gélu vytěsní alkoholem a alkohol sa odpaří při teplote do 40 °C.