CS273408B1

CS273408B1 - Through-flow measuring cell for optical detection and counting microscopical objects in suspensions

Info

Publication number: CS273408B1
Application number: CS784888A
Authority: CS
Inventors: Jaromir Rndr Csc Plasek; Dana Rndr Gasova; Tomas Krajina
Original assignee: Jaromir Rndr Csc Plasek; Dana Rndr Gasova; Tomas Krajina
Priority date: 1988-11-29
Filing date: 1988-11-29
Publication date: 1991-03-12
Also published as: CS784888A1

Abstract

The flow cell for optical detection and counting of microscopic objects in suspensions consists of two transparent polished sheets (1), between which a non-transparent distance layer (3) is inserted, while the interruption of the layer forms, after connecting the two transparent polished sheets (1), a direct transparent channel (2), whose one end is joined by a central capillary tube (5) for the inlet of analysed suspension and inlet (4) of carrier liquid, which symmetrically embraces the central capillary tube (5), which interferes into 1/3 to 1/2 of the length of the direct transparent channel (2), whose second end narrows into the exhaust channel (6).<IMAGE>

Description

Vynález se týká průtokové kyvety pro určování koncentrace mikroskopických objektů v suspenzích s možností selektivně detegovat různé typy částic, ktoré se liší buč velikostí, nebo fluorescenčními vlastnostmiThe invention relates to a flow cell for determining the concentration of microscopic objects in suspensions with the possibility of selectively detecting various types of particles that differ in either size or fluorescence properties

V řadě technických, biologických a lékařských oborů se často setkáváme s požadavkem analyzovat soubory mikroskopických objektů z hlediska distribuce jejich velikostí nebo podle fluorescenčních vlastností, které mohou být svázány jak s jejich chemickým složením, tak s existencí povrchových receptorů, schopných specificky vázat určité fluorescenčně značené Iigandy. K tomuto účelu slouží optická metoda označovaná jako proudová cytometrie. Název metody úzce souvisí s tím* že se používá převážně v biomedicínských aplikacích k analýze buněčných populací.In a number of technical, biological and medical fields, we often meet the need to analyze sets of microscopic objects in terms of their size distribution or fluorescence properties, which may be associated with both their chemical composition and the existence of surface receptors capable of specifically binding certain fluorescently labeled ligands . An optical method called current cytometry is used for this purpose. The name of the method is closely related to the fact that it is mainly used in biomedical applications to analyze cell populations.

Dosud používaná zařízení pro proudovou cytometrii využívají k vyvolání proudění nosného média a injekci analyzovaného vzorku tlaku stlačeného plynu. Tlak působící na nosné 5 médium činí zpravidla 1 až 1,5 x 10 Pa. Injekce vzorku do nosné kapaliny vyžndujo tlak větší o 10^ Pa. K vybuzení optických signálů se nejčastěji používá laserového záření kvůli možnosti fokusovat laserový paprsek do ohniska o malém průměru, řádově 10 _zum, čímž so dosáhne velmi vysoké intenzity záření, řádově až MW/cm .The current cytometric devices used use compressed gas to induce the flow of the carrier medium and inject the analyzed sample. The pressure applied to the carrier medium is generally 1 to 1.5 x 10 Pa. Injection of the sample into the carrier fluid required a pressure of 10 Pa. The excitation optical signals are most commonly used laser radiation due to the possibility of focusing the laser beam to a focal point of small diameter, of the order _of 10 microns, thereby having achieved a very high intensity radiation, the order of MW / cm.

Dosud používané průtokové kyvety jsou válcovitého tvaru zužující se směrem k ústí, vyžadující přesnou regulaci tlaků, pod kterými jsou vháněny nosné médium a vzorek. Součástí zařízení jsou přetlakové zásobníky stlačeného plynu a regulovatelné zdroje tlaku, které činí zařízení složitým a nedostupným pro jednoduché aplikace například v biologických a lékařských laboratořích. Uvedené nedostatky podstatně snižuje průtoková kyveta k optické detekci a počítání mikroskopických objektů, podle vynálezu. Jeho podstata spočívá v tom, že průtoková kyveta se sestává ze dvou průhledných vyleštěných desek, mezi které je vložena neprůhledná distanční vrstva, jejímž přerušením je vytvořen, po spojení dvou průhledných, vyleštěných desek, přímý, průhledný kanálek, na jehož jednom konci vstupuje centrální kapilára pro přívod analyzované suspenze a přívod nosné tekutiny obklopující symetricky centrální kapiláru. Centrální kapilára zasahuje do 1/3 až 1/2 délky přímého, průhledného kanálku, jehož druhý konec je zúžen do odsávacího kanálku. Analyzovaná suspenze je tenkou tryskou zavedena do osy sloupce nosného média, které laminárně proudí průtokovou kyvetou. Toto médium unáší proud analyzovaného vzorku, který zůstává koncentrován na průměr řádově 0,2 mm téměř po celé délce přímého průhledného kanálku. Při koncentraci částic v suspenzi 1.10³.ml^, činí potom jejich průměrná vzdálenost v tomto proudu asi 3 mm. Necháme-li takový proud procházet úzkým, intenzívním světelným paprskem, vysílají jednotlivé částice oddělené impulsy rozptýleného světla popřípadě fluorescence, ktoré lze postupně detegovat. Rozptýlené záření nese informaci o velikosti jednotlivých částic, fluorescence o jejich chemickém složení nebo povrchových vlastnostech.The flow cells used hitherto are cylindrical in shape tapering towards the mouth, requiring precise control of the pressures under which the carrier medium and sample are blown. The equipment includes pressurized gas reservoirs and controllable pressure sources that make the equipment complex and unavailable for simple applications in, for example, biological and medical laboratories. These drawbacks are substantially reduced by the flow cell for optical detection and counting of microscopic objects according to the invention. Its essence is that the flow cell consists of two transparent polished plates between which an opaque spacer layer is interposed, which is interrupted to form, after joining two transparent, polished plates, a straight, transparent channel, at one end of which the central capillary enters for the supply of the analyzed suspension and for the delivery of the carrier fluid surrounding the symmetrical central capillary. The central capillary extends 1/3 to 1/2 of the length of the straight, transparent duct, the other end of which is tapered into the suction duct. The analyzed suspension is introduced through a thin nozzle into the axis of the column of the carrier medium which flows laminarly through the flow cell. This medium carries a stream of the sample to be analyzed, which remains concentrated to a diameter of the order of 0.2 mm along the entire length of the straight transparent channel. At a concentration of particles in suspension 10.1 .ml ^ ^3, then make their average distance in the stream of about 3 mm. When such a current is passed through a narrow, intense light beam, the individual particles emit separate pulses of scattered light or fluorescence, which can be gradually detected. The scattered radiation carries information about the size of individual particles, fluorescence about their chemical composition or surface properties.

Hlavní výhodou průtokové kyvety podle vynálezu je možnost provádět proudovou cytometrii v takových případech, kdy vysoká citlivost spojená s použitím laserových zdrojů světla není nutná, například prosté stanovení koncentrace buněk v suspenzích nebo selektivní stanovení koncentrací několika buněčných typů na základě rozdílů v intenzitách rozptýleného světla. Další výhody spočívají v možnosti zabezpečení definovaného proudění analyzované suspenze pomocí jediného sacího čerpadla, například rotačního zubového čerpadla, místo dvou regulovatelných zdrojů tlaku. Použitím sání místo přetlaku se navíc vyloučí nutnost používat přetlakových zásobníků stlačeného plynu a nosné kapaliny, čímž se značně zjednoduší konstrukce celého cytometru.The main advantage of the flow cell according to the invention is the possibility to perform current cytometry in cases where high sensitivity associated with the use of laser light sources is not necessary, for example by simply determining the concentration of cells in suspensions or selectively determining concentrations of several cell types based on differences in scattered light intensities. Another advantage lies in the possibility of providing a defined flow of the analyzed suspension by means of a single suction pump, for example a rotary gear pump, instead of two controllable pressure sources. In addition, the use of suction instead of overpressure eliminates the need for pressurized reservoirs of compressed gas and carrier liquid, thereby greatly simplifying the construction of the entire cytometer.

* Vynález a jeho účinky jsou blíže vysvětleny v popise příkladu jeho provedení podle připojených výkresů, kde obr. 1 znázorňuje schematicky v náryse a obr. 2 v půdoryse v řezu, vedeném v horní třetině výšky přímého průhledného kanálku, průtokovou kyvetu pro optickou detekci a počítání mikroskopických objektů v suspenzích padle vynálezu.The invention and its effects are explained in more detail in the description of an exemplary embodiment according to the accompanying drawings, in which Fig. 1 shows schematically in a front view and Fig. 2 a plan view in section taken at the upper third of the height of a straight transparent channel. microscopic objects in suspensions according to the invention.

CS 273408 BlCS 273408 Bl

Průtoková kyveta je tvořena dvěma leštěnými skleněnými deskami 2, které jsou paralelně připojeny na neprůhlednou distanční vrstvu 3 neprůhledného nekorodujícího materiálu, například gumy nebo nerezavějící oceli, o tlouštce 0,4 mm. Distanční vrstva 2 jo tvořena dvěma oddělenými pásy, vytvářejícími přímý průhledný kanálek 2 ⁰ šířce 1,2 mm. Do tohoto přímého, průhledného kanálku 2 vstupují na jedné straně centrální kapilára 5 pro přívod analyzované suspenze a přívody £ nosné tekutiny s vnějším průměrem 0,4 mm a světlosti 0,2 mm. Ve vzdálenosti 10 mm od ukončení centrální kapiláry 2 se nachází ústí průtokové kyvety zakončené odsávacím kanálkem 6, které je připojeno na odsávací zařízení. Po zapojení sání vtéká do kyvety přívody 2 nosná kapalina a centrální kapilára 2 přivádí analyzovanou suspenzi.The flow cell consists of two polished glass plates 2 which are connected in parallel to an opaque spacer layer 3 of an opaque non-corrosive material, for example rubber or stainless steel, of 0.4 mm thickness. Spacer layer jo 2 consists of two separate belts, forming a straight duct 2 ⁰ clear width of 1.2 mm. Into this straight, transparent channel 2 enter on one side the central capillary 5 for the inlet of the analyzed suspension and the inlet of the carrier fluid with an outer diameter of 0.4 mm and a clearance of 0.2 mm. At the distance of 10 mm from the end of the central capillary 2 there is a mouth of the flow cell terminated by a suction channel 6, which is connected to the suction device. After the suction is connected, carrier liquid 2 flows into the cuvette and the central capillary 2 supplies the analyzed suspension.

V popsaném provedení je proud buněk vzdálen od stěn přímého, průhledného kanálku 2 0 0,5 mm. Při použití takových klasických světelných zdřojů jako jsou vysokotlaké výbojky nebo halogenové žárovky můžeme jejich světelné záření bez problému fokusovat do svazku ' o průměru - 0,2 mm. Tímto zářením lze potom detegovat mikroskopické částice proudící z centrální kapiláry 2 hez rušivého vlivu rozptylu světla na stěnách kanálu.In the described embodiment, the cell flow is spaced from the walls of a straight, transparent channel 20 0.5 mm. By using conventional light sources such as high-pressure lamps or halogen lamps, their light radiation can be easily focused into a beam of - 0.2 mm diameter. This radiation can then detect microscopic particles flowing from the central capillary 2 of a fairly disturbing effect of light scattering on the channel walls.

Potřebnému odstupu mezi jednotlivými částicemi procházejícími světelným svazkem se dosáhne větším zředěním suspenze, pro kapiláru o světlosti 0,2 mm postačí ředění 10³ až 10^ částic ml^-'''.The required spacing between the individual particles passing through the light beam is achieved by diluting the suspension is greater, for a capillary of 0.2 mm inner diameter sufficient dilution of 10 @ ³ to 10 particles ml ^- '''.

Pomocí proudové cytometrie prováděné v popsané kyvetě lze počítat mikroorganismy, somatické buňky i jiné mikroskopické částice. Na základě rozdílů v intenzitě a spektrálních vlastnostech detegovaných světelných pulzů lze navíc selektivně stanovit koncentraci definovaných typů částic v analyzované suspenzi.Micro-organisms, somatic cells and other microscopic particles can be counted using current cytometry performed in the described cell. Moreover, based on differences in intensity and spectral properties of detected light pulses, the concentration of defined particle types in the analyzed suspension can be selectively determined.

Claims

Flow cell for optical detection and counting of microscopic objects, characterized in that it consists of two transparent polished plates (1) between which an opaque spacer layer (3) is interposed and is interrupted by interrupting them after joining two transparent polished plates (1) , a straight, transparent duct (2), at one end of which the central capillary (5) enters for the inlet of the analyzed suspension and the fluid supply (4) surrounding the symmetrical central capillary (5), the central capillary (5) extending to 1/3 to 1/2 the length of the straight, transparent duct (2), the other end of which is tapered into the suction duct (6).