CS272772B2 - Method of sound, physiologically normal farming animal's mamma parenchyma's growth increase - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu zvýšení nárůstu parenchymu mléčné žlázy zdravého, fyziologicky normálního hospodářského zvířete.

Produkce mléka savců je ultimativně omezena množstvím parenchymu v mléčné žláze. Srovnání výtěžku mléka s mokrou hmotností a suchou hmotností celkového parenchymu, se suchou hmotností odtučněného parenchymu a celkovou DNA žlázy poskytuje vysoce korelovatelné výsledky. V Proč. N.Z. Soc. Anim. Prod. 43, 71 (1983) Davis a spol. připisují zvýšenou produkci mléka u geneticky vyšších živočichů výhradně zvýšenému objemu vemene, což je také ve vztahu s množstvím parenchymatických buněk.

Klasická tvrzení ukazují, že růst parenchymu mléčné žlázy je řízen hypofýzovými, vaječníkovými, nedledvinkovými a placentárními faktory. Viz Cowie, Monographs on Endocrinology 15 (1980) a US patent č. 4 521 409, udělený Baumanoví a Sejrsenovi 4, června 1985, kde je popsáno, že růst parenchymu mléčné žlázy u přežvýkavců lze zvýšit podáváním růstového hormonu somatotropinu do krevního oběhu přežvýkavců přibližně v době mezi počátkem puberty a prvním porodem, s výhodou na počátku první březosti.

Při podávání do krevního oběhu zvířete se většina mitogenů buněk parenchymu mléčné žlázy váže také na receptory v mnoha jiných tkáních příslušného zvířete. Díky takovému zředění žádoucího účinku na receptory stimulující růst mléčné žlázy lze očekávat, že zvětšení parenchymu mléčné žlázy cestou podávání do krevního oběhu vyžaduje relativně velká množství takových mitogenů. Existuje tedy velká potřeba vyvinout praktickou techniku pra zvýšení kapacity a/nebo účinnosti produkce mléka, která by nebyla závislá na podávání do krevního oběhu savce.

Pomocí králíků, myší a krys, které byly fyziologicky abnormální, tj. bez vaječníků a/nebo s předem vyvolaným pseudotěhotenstvím (např. pomocí reprodukčních hormonů), byly provedeny studie účinků vývoje mléčné žlázy podkožními injekcemi somatotropinu a/nebo jiných hormonů, implantátů, které uvolňují cholera toxin, nebo intraduktální injekcí laktogenního hormonu. Lyons a spol.: Proč. Soc. Exper. Biol. Med. 50, 308 až 311 (1942) a Recent Prog. Hormone Res. 14,219 až 254 (1958), Fiddler a spol,: J. Endocrinol. 49, 459 až 460 (1971), Daniel a spol.: Sci. 224, 1245 až 1247 (1984) a Silberstein a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 4950 až 4954 (1984). Jíní pracovníci studovali účinky mitogenů in vitro, jako je například epidermální růstový faktor, s nebo bez insulinu, na růst kultivovaných mléčných buněk různých živočichů: Imagawa a spol.: Proč. Nati. Acad.'Sci. USA 79,

4074 až 4077 (1982), Taketani a spol.: Endocrin. 113, (3), 871 (1983) a Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 2647 až 2650 (1983), Tonelli a spol.: Nátuře 285, 250 až 252 (1980) a Turkington: Exper. Cell Res. 57, 79 až 85 (1969).

Cílem vynálezu je zvýšení nárůstu parenchymu mléčné žlázy zdravého, fyziologicky normálního hospodářského zvířete aplikaci růstových faktorů a/nebo jiných mitózu ovlivňujících látek v průběhu březosti nebo v době mezi nástupem puberty a první březostí způsobem, při kterém se používá minimálního množství látky ovlivňující zvýšení nárůstu parenchymu a při kterém je minimální možnost, že u zvířete dojde k vyvolání vedlejších biologických účinků.

Podle vynálezu se tohoto· cíle dosahuje tím, že se působí na mléčnou žlázu intracisternální infuzí prostředku, který obsahuje alespoň jednu účinnou látku, vybranou ze skupiny zahrnující epidermální růstový faktor, růstový faktor typu insulinu, somatropin, transformující růstový faktor, insulin, placentální laktogen, prostaglandiny, jejich směs a/nebo jejich syntetické analogy.

Zvířeti se s výhodou aplikuje jednotková dávka obsahující 2 mikrogramy až 100 miligramů účinné látky.

Použití růstových faktorů jinou metodou ke stejnému účelu je známé z EP 146 703, EP

140 998, z dokumentů v nich citovaných (R. Baserge, Carpenter, K. Sejrsen) a z dokumentů citovaných v úvodní části tohoto popisu (Imagawa, Takatani, Tonelli, Turkington).’

Způsobem podle vynálezu, který nevyžaduje aplikaci mitózu ovlivňujících látek do krevního oběhu zvířete, podkožní injekci nebo implantací, ale který místo toho využívá vhodných způsobů aplikace, jakými se v případě většiny krav chovaných pro mléko a některých dalších savců rutinně provádí infuze antibiotik, se neočekávaně dosahuje podstatného nárůstu normálního parenchymu. Podstatného zvýšení -nárůstu parenchymu oproti normálně pozorovanému nárůstu se podle vynálezu dosahuje použitím pouze velmi malých množství mitozu ovlivňujících látek, a to během relativně krátké doby.

Aplikací těchto látek způsobem podle vynálezu se dociluje u hospodářských zvířat chovaných pro mléko významného zvýšení produkce mléka. U březích jalovic byla zvýšena produkce mléka, jak bude dále prokázáno, v průměru o 11 %. .

Způsob podle vynálezu je použitelný pro jakékoliv hospodářské zvíře, u něhož je žádoucí, aby došlo ke zvýšení nárůstu parenchymu mléčné žlázy. Zvláště užitečný je pro přežvýkavce, jako jsou například krávy chované pro mléko, krávy chované pro maso a jalovice obou těchto druhů. Je použitelný u všech známých typů krav chovaných pro mléko, např. Holstein, Friesen, Brown Swiss, Jersey, Guernsey, Ayrshire, Milking Shornthorn a jejích kříženců, a u všech známých typů krav chovaných pro maso, např. Hereford, Angus, Zebu, Charolais, Brangus, Simmental, Chianina, Dutch Belted, Limousin a jejich kříženců.

Je použitelný také u jiných přežvýkavců, jako jsou například ovce a kozy všech typů, stojně jako různých nepřežvýkavců, jako jsou například svině všech typů. Nejpozoruhodnější pro praktickou aplikaci je to, že se vynález používá u savců, kteří jsou fyziologicky normální, což pro tyto účely znamená, že jim nejsou odstraněny vaječníky ani nebyli předem léčeny (např. reprpduktivním hormonem, jako je estrogen, gonadotropin a pod.) na indukci pseudobřezosti nebo puberty.

Termín parenchym mléčné žlázy tak, jak je zde používán, se týká tkáně v mléčné žláze (včetně toho, co se obvykle nazývá mléčné epithelium), která je podstatná pro produkci mléka touto žlázou. U samic dochází k růstu mléčné žlázy po nástupu puberty. Obvykle (např. u jalovic) k většině nárůstu mléčné žlázy dochází během prvého zabřeznutí.

K dalšímá růstu a/nebo opětovnému růstu parenchymu dochází v průběhu následujících březostí.

Pro zvýšení takového růstu se tento vynález provádí tak, že se látka, která má žádaný mitogenní účinek, podává savci mezi asi nástupem puberty (včetně peri/pubertálního období) a první březostí nebo mezi první a kteroukoliv následující březostí. Takové podávání se typicky provádí v suchém období, během něhož savec nelaktuje. U krav chovaných pro mléko a u podobných savců je obvykle výhodné podávání během posledního trimestru před porodem.

Výhodou a překvapivě účinnou technikou podávání podle tohoto vynálezu je způsob, který se nejobvykleji nazývá infuse do mléčné žlázy. U savců, jako jsou například krávy, se této techniky rutinně používá pro podávání mastí obsahujících antibiotika nebo jiných prostředků pro prevenci nebo léčení mastitidy, V praktické aplikaci podle tohoto vynálezu se látka, která má mitogenní účinek, obvykle může podávat podobnou technikou nebo tak, a to dokonce výhodněji, že je obsažena (s nebo bez jiných stimulátorů růstu parenchymu.) v prostředku, který se podává infusně pro prevenci nebo léčení mastitidy, respektive pro nějaký další účel.

Podle této techniky se otvorem a kanálkem struku injekční stříkačkou s tupou jehlou zavede do zadržovacího prostoru struku látka, která má mitogenní účinek. Odtud se obvykle rozšíří přes nádržku struku (pres zadržovací prostor struku) do zadržovacího prostoru žlázy a do vývodového systému mléčné žlázy. Tento velmi dobře známý způsob je popsán Spinellim a spol.: Drugs in Veterinary Practice, strana 80 až 83, C. V. Mosby Co., St. Louis, Mo., USA (1978) a Reuterem a spol.: USA patent 4 011 312 (ze dne B. března 1977). Tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkazy. Pro účely podle tohoto vynálezu lze považovat jiné postupy za ekvivalentní infuzi do méčné žlázy tehdy, jestliže takovou látku ukládají V zadržovacím prostoru struku, což vede k rozšíření takové látky do tkáně-mléčné žlázy, kde způsobuje zvýšení nárůstu parenchymu.

Pod výrazy přímé a parakrinní mitogenní účinky, používané v tomto popisu, se rozumí účinky, které nevyžadují, aby látka podávaná infuzí vstupovala do oběhu zvířete v množství, které zvýší její koncentraci na takovou hladinu, která prostřednictvím endokrinní regulace má mitogenní účinnost žádoucí velikostí na parenchymtické buňky zvířete. Souhrnný článek o parakrinní regulaci růstu mléčné žlázy viz: Oka a spol.: Clinics in Endocrin. and Metab. 15, (1), 79 až 97 (1986).

Látky, které mají přímé nebo parakrinní mitogenní účinky, působí lokalizované, tj. ovlivňují buňky v přímé blízkosti stimulujícího prostředku. Takové prostředky buň stimulují epiteliální, myoepiteliální a/nebo stromální buňky tak, že tyto uvolňují mitogenní nebo sekundární látku nebo látky, které stimulují lokální buňky, nebo tyto prostředky přímo vyvolávají odpověň v buňkách přítomných v lokalizovaném okolí.

Existuje mnoho důležitých provedení způsobu podle vynálezu za použití látky, která působí přímo na parenchymatické buňky mléčné žlázy, do níž je zavedena infuze, čímž se zvýší rychlost normální proliferace buněk. V jiných provedeních působí látka přímo na neparenchymatícké buňky ve žláze, což má za následek, že v takových buňkách dochází díky parakrinnímu účinku k místnímu zvýšení množství látky, která má přímou mitogenní účinnost na parenchymatické buňky žlázy (ve žláze do níž vede infuse).

V některých případech, jak lze vidět z dále uvedených specifických příkladů, infuze takové látky do mléčné žlázy vede k podstatnému růstu mléčných žláz, které jsou přilehlé k té, do níž se infuse provádí, aniž by došlo k podstatnému zvýšení hladiny látky podané infuzí v krevním oběhu živočicha. Účinné receptory pro přímé nebo parakrinní efekty některých látek v mléčné žláze však mohou existovat pouze v jistých fázích fyziologického vývoje živočicha. Například v mléčné žláze hovězího dobytka existuje po dobu březosti větší množství receptorů vážících somatotropin než u zvířat, která nejsou březí. Srovnej následující citace: Jean-Francois Beckers v L'Hormone Placentaire Somatomammotrope Bovine, kapitola 5, Universitě de Líege, Faculte de Medicine Veterinaire (1983), Gertler a spol,: Hormonal Control of Casein Synthésis and Organ Culture of the Bovine Lactating Mammary Gland v J. Dairy Res. 49, 387 (19B2) a Akers: Binding Sites, Mammary Growth, Secretory Cell Differentiation, and Milk Biosynthesis in Ruminants v J. Dairy Sci. 68, 501 (1985).

V mnoha uspořádáních podle vynálezu je látkou s mitogennním účinkem polypeptidový růstový faktor. Jisté třídy takových růstových faktorů výhodných pro použití podle tohoto vynálezu mají molekulovou hmotnost obvykle nižší než asi 45 000, typičtěji dokonce nižší než asi 22 500, a v případě růstových faktorů, které mají přímou mitogenní účinnost jak shora popsáno, typicky nižší než asi 10 000. V některých případech se mohou s výhodou použít některé nepolypeptidové látky, například steroidy vaječníků a placenty a jejich agonisty. V kterémkoliv případě může být touto látkou látka přirozeně se vyskytující, látka synthetizovaná tak, aby simulovala látku přirozeně se vyskytující, nebo látka synthetizovaná, ale nepodobající se žádné v přírodě se vyskytující sloučenině, nicméně však mající příslušný mitogenní účinek.

Výhodnou třídou polypeptidových růstových faktorů, které se mohou používat, jsou epidermální růstové faktory (EGF), Tyto faktory interagují s receptory mléčných epitheliálních buněk, což vede k proliferaci těchto buněk. Byly sekvenovány EGF různých živočišných druhů. Byly identifikovány jejich aminokyselinové sekvence a/nebo konfigurace dané vnitřním zkříženým navázáním cysteinových zbytků disulfidovými vazbami. Jedním takovým EGF je dobře charakterizovaný jednořetězový polypeptid o 53 aminokyselinách, který se může isolovat z podčelistních (slinných) žláz dospělých myších samců. Jiný typ EGF, lidský urogastron, je synthetizován v duodenu (dvanáctník) a ve slinných žlázách a lze jej isolovat z lidské moče. Urogastron je ze 70 % homologní (37 z 53 obvyklých aminokyselin) s myším

EGF a má tri disulfidové vazby ve stejných polohách. Dostupná data naznačují, že lidský urogastron a lidský EGF jsou identické látky. Pro více informací o EGF viz: Garpenter a spol.: Epidermal Growth Factor, Ann. Rev. Biochem. 48, 193 až 216 (1976) a Gregory: Nátuře 257, 325 až 327 (1975). Obě citace jsou zde zařazeny jako odkazy.

Je známo, že pro mitogenní účinnost není nutná úplná aminokyselinová sekvence lidské ho nebo myšího EGF. Například: Gamble a spol.: USA patent č. 3 917 824 (ze 4. listopadu 1975) molekulární popisuje variace zkrácené (např. o 2,5 nebo 6 aminokyselin) na karboxylovém konci, Gregory a spal.: USA patent č. 4 035 455 (ze 12. července 1977) popisuje molekulární variace zkrácené o 7 aminokyselin, Cohen: USA patent číslo 3 948 875 (ze 6. dub na 1976) popisuje deriváty EGF, kterým na C-konci chybí zbytky Leu-Arg, Banks a spol.: přihláška PCT 83/04030 popisuje urogastronová analoga, která se liší typem nebo umístěním jedné nebo více aminokyselin, a Komoriya a spol.: přihláška PCT 85/01284 popisuje polypeptidy s aktivitou podobnou EGF, která je založena na přítomnosti sekvence sestávající z 10 aminokyselin, které odpovídají aminokyselinám mezí Cys₂₀ a Cys^^ přirozeného EGF. Všechny tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkazy. Tyto nebo podobné molekulární variace EGF, jejich analoga nebo jiné sloučeniny, které interagují s EGF (nebo funkčně podobnými) receptory v mléčné žláze po infuzi do mléčné žlázy, a které dosahují požadavků podle toho· to vynálezu v podstatné míre, jsou v tomto rozsahu ekvivalenty EGF pro účely podle tohoto vynálezu.

Jsou známé různé postupy přípravy EGF. Např.: V japonské patentové přihlášce 59/ /027858 (Nippon Shinyaku) je popsána kondenzace chráněných 1 až 5 aminokyselinových peptidů za vzniku chráněného tripentakonpeptidu, který se po odstranění chránících skupin oxiduje na EGF. Nebe Lee a spol. v evropské patentové přihlášce 128 733 (publikované 19. prosince 1984) a Bell v patentové přihlášce PCT 85/00369 (publikované 31. ledna 1985) popisují přípravy EGF expresí rekombínované DNA. Sugimoto v tritském patentu 2 092 155 popisuje přípravu EGF multiplikací hybridních buněk. Nishimura a spol. v USA patentu 4 528 186 (z 9. června 1985) popisuje isolaci EGF z lidské moče. Tyto objevy jsou zde zahrnuty jako odkazy.

V jiných výhodných uspořádáních se růstový faktor může vybrat z fetálních EGF, jako jsou například transformující růstové faktory ού-typu. Viz Sporn a spol.: evropská patente vá přihláška 105 014 a Todaro a spol.: evropská patentová přihláška 190 018 (tyto objevy jsou zde zahrnuty jako odkazy). Tyto faktory integrují s receptory mléčné žlázy, čímž dochází k žádané mitogenní účinnosti. Jiná třída různých polypeptidů, které jsou užitečné v tomto vynálezu, je ilustrována virovými proteinovými analogy popsanými Brownem a spol. v evropské patentové přihlášce 199 769 založené na PCT přihlášce 86/02650.

V jiných uspořádáních může být růstovým faktorem polypetid ze skupiny insulinů, analog takového polypeptidů nebo jiná látka, která integruje s růstovým faktorem podobným insulinu (IGF) nebe s funkčně podobnými receptory v mléčné žláze, čímž dochází k mitogenní účinnosti na parenchym. Jako IGF se s výhodou používá IGF-I (somatomedin) nebo IGF-II. Podobné výsledky se mohou obecně získat použitím insulinu nebo jeho prekursoru (např. pro-insulinu) i když požadovaná množství jsou mnohem vyšší než u IGF.

těchto růstových faktorech z řady insulinů a způsobu jejich přípravy existuje rozsáhlá literatura. Například aminokyselinové sekvence lidského IGF-I a IGF-II a jejich příprava expresí rekombinantní DNA v mikrobiálních hostitelích jsou popsány v evropské patentové přihlášce 128 733 (výše) a 123 228 (Chiron Corp.) (publ. 31. října 1984). Analoga IGF-I s valinem v poloze 59 jsou popsány Niwou a spal. v evropské patentové přihlášce 158 892 (publikované 23. října 1985). Více informací o IGF lze nalézt v práci Rinderknécht a spol. Přec. Nati. Acad. Sci. USA 73 _? 2365 (1976), Zapfa a spol.: Curr. Top. Cell Reg.

19, 257 (1981) a Wilsona a spol,: J. Endocrin. 95, 59 až 64 (1982). Přípravu insulinu a pro-insulinu popsal Johnson v Sci. 219, 632 až 637 (1983), dále je příprava insulinu a pro-insulinu popsána v evropské patentové přihlášce 55 945 firmy Genentech, která byla zveřejněna 14. července 1982.

CS 27.277.2 B2

Při jiných výhodných provedeních se aplikují infuzí některé z látek, vznikajících metabolickou cestou z kyseliny arachidonové, nebo směs těchto látek nebo jejich analogy, které mají mitogenní účinek na epitelové buňky mléčných žláz. K těmto látkám patří prostaglandiny, např. ze serie A až F, a jejich analogy, např. Q.1Z, 13E, 15S][-ll,15-dihydroxy-9-oxoprost-13-en-l-ová kyselina (Ε_χ), [5Z, lloC, 13E, 155^-11,15-dihydroxy-9-oxoprosta-5,13-dien-l-ová kyselina (E₂), [Ϊ3Ε, 15S]-15-hydroxy-9-oxoprosta-10,13-dien-l-ová kyselina (Α_χ), [5Z, 13E, 15S]-15-hydroxy-9-oxoprosta-5,I0,13-trien-l-ová kyselina (Ag), [l3E, 15Sj-15-hydroxy-9-oxoprosta-8|j.2], 13-dien-l-ová kyselina (8_χ), [5Z, 13E, 15S]-15-hydroxy9-oxoprosta-5,8{j.23,13-trien-l-ová kyselina (B₂), [5Z, 9 «C, 13E, 15S]]9,15-dihydroxy-ll-oxoprosta-5,13-dien-l-ová kyselina’(D₂), (9/. , 1113E, 15Sj-9,ll,15-trihydroxyprost-13-en-l-ová kyselina (FjX), (ŠZ, 9<ó, 11 Z, 13E, 15Š]-6,9-epoxy-ll,15-dihydraxyprosta5,13-dien-l-ová kyselina (I₂), které všechny dodává firma Sigma Chemical Co., St. Louis,

MO, Lutalyse (Ř) prostaglandin (F₂Z) od firmy The Upjohn Co., Kalamazoo, MI a oloprostenol. Lze také použít prekursorú a metabolitú těchto látek (např. arachidonové kyseliny a jejích metabolitú), které mají podobnou účinnost pokud se týká ovlivňování mitózy mléčných buněk, přičemž se látek s větěí účinností nebo/a s delším poločasem může použít v příslušně nižších dávkách. Řada těchto látek je popsána v Advances in Prostaglandin, Thromboxane, and Leukotriene Research, sv. 14 (zejména str. 1 až 43, 73 až 129 a 263 až 307), vyd. J. E. Pikem a D. R. Mortonem, Jr., Raven Press, New York, NY (1985) a v článku Prostaglandins and the Arachidonic Acid Cascade, Norman A. Nelson a další, 60 Chem. Eng. News, str. 30 a následující (16. srpen 1982).

Látky, které při podání infuzí dávají parakrinní mitogenní účinek, zahrnují placentální laktogen, jisté předcházející hormony hypofýzy a další polypeptidy a v podstatě podobnou chemickou strukturou tak, aby se dosáhlo v podstatě stejných mitogenních účinků pro účely tohoto vynálezu. Obecné jsou z důvodů účinnosti výhodné předcházející hormony hypofýzy jiné než prolaktin (např. somatotropiny).

Množství potřebná pro mitogenní účinnost použitých látek, požadovanou tímto vynálezem, jsou velmi malá. To ukazuje na neočekávaně vysokou účinnost těchto látek při jejich používání. V některých případech jsou jednotkové dávky pro infuzi do žlázy ne větší než asi 2 mikrogramy. V některých případech mohou být účinné i nižší dávky. Obvykle se mohou podávat jednotkové dávky až asi 100 miligramů nebo i více, aniž by došlo k nežádoucím účinkům. Z ekonomických důvodů jsou však obvykle výhodné menší dávky (např. méně než asi 100 mikrogramů).

Nejvýhodnějšími koncentracemi látky s mitogenní účinnosti v infuzním prostředku jsou obvykle koncentrace mezi asi 5 a asi 500 nanogramy/ml, ačkoliv v některých případech mohou být užitečné i vyšší nebo nižší koncentrace. Nejžádanější dávky, koncentrace, frekvence a počty infuzí lze určit na základě rutinní zkušenosti. V mnoha případech se dobrých výsledků dosáhne jednou až asi pěti infuzemí. Tyto infuze se s výhodou podávají odděleně, např. během I až asi 10 (s výhodou 2 až 5) dnů. Tato skutečnost, tj. to, že podstatného zvýšení růstu parenchymu lze dosáhnout v tak krátkých dobách, byla zcela neočekávaná a má značný komerční význam. Postačující celkové dávky, tj. počet postupných infuzí jednotlivému savci během březosti nebo puberty před březosti, jsou obvykle asi 10 mikrogramů, typicky méně než 500 miligramů, často š výhodou menší než asi 1 miligram látky s mitogenní účinností.

I když lze v praxi podle tohoto vynálezu používat jedinou látku s mitogenní účinností, v některých případech mohou být výhodnější kombinace takových látek. V mnoha případech je žádoucí podávat infuzí takovou látku s mitogenní účinností, která blízce odpovídá látce přirozeně se u příslušného druhu (kterému se podává) vyskytující, např. hovězí EOF, IGF a/nebo somatotropin pro použití u dobytka. Obvykle jsou vhodné také látky, které odpovídají těm, které se přirozeně vyskytují u jiných druhů živočichů. Způsob podle tohoto vynálezu se provádí tak, že se používá prostředek připravený pro podávání savcům infuzí do mléčné žlázy. Tento prostředek obsahuje takové množství látky s mitogenní účinností na mléčné epitheliální buňky u tohoto savce, které je účinné pro zvýšení růstu parenchymu mléčné žlázy shora uvedeného savce. Takové prostředky by měly být z fyziologického hlediska snášenlivé, s výhodou nedráždivé a v podstatě neobsahující endo/toxiny. Oestliže je to žádoucí, lze látku s mitogenní účinností podávat jako pevnou látku, která může být jemně rozemleta nebo slisována do výhodného tvaru a velikosti, např. pro prodloužené uvolňování v nádržce struku (v zásobní oblasti struku). V jiných uspořádáních je žádoucí použít vehikulum, které je v podstatě kapalné při tělesné teplotě savce a s výhodou také za teploty místnosti, při níž dochází k infuzi. ΑΪ už infuzovaný prostředek je pevný nebo kapalný, obvykle je výhodné použít také vehikulum, které podporuje difúzi látky s mitogenní účinností mléčnou žlázou. V některých případech, ale ne ve všech, je výhodné, aby vehikulum bylo v podstatě rozpustné ve vodě.

Nejvíce žádaný typ a množství vehikula pro infuzi látky s mitogenní účinností se určí na základě rutinní zkušenosti. Pro ilustraci je typicky postačující například 1 až 10 ml kapalného vehikula s pH ve fyziologickém rozmezí, např. fyziologický solný roztok, Freundův neúplný adjuvant nebo rostlinný (například sojový nebo sezamový) nebo minerální olej. Obvykle jsou výhodné emulze dvou nebo více takových činidel. Oestliže je to žádoucí, mohou být do prostředku zahrnuty příslušné stabilizátory, např. mono- nebo di-sacharidy, cukr a alkoholy nebo neutrální aminokyseliny.

Tento vynález poskytuje také způsob přípravy prostředků, které jsou užitečné pro zvýšení růstu parenchymu mléčné žlázy u savců. V obecném uspořádání takový způsob zahrnuje spojení (např. dispergování) látky s mitogenním účinkem na epitheliální buňky mléčné žlázy shora uvedeného savce s vehikulem (pojivém), které zvyšuje difúzi látky mléčnou žlázou shora uvedeného savce. Shora uvedený prostředek se upraví shora uvedeným spojením pro podání savci infuzi do mléčné žlázy.

Následující popisy specifických uspořádání podle vynálezu jsou pouze ilustrativní a ne znamenají jekékoliv omezení rozsahu vynálezu. Všechna zvířata v těchto pokusech byla fyziologicky normální (jak shora popsáno). Všechny teploty jsou uvedeny ve stupních Celsia. Díly a procenta jsou hmotnostní díly a procenta, pokud není jinak uvedeno.

Příklad 1 a 2

Epidermální růstové faktory

Dvanáct březích nelaktujících krav různých plemen chovaných pro maso se v období po-,, sledních 40 až 80 dnů březosti volně ustájí. Krmí se dávkou vojtěškového sena a peletovaného koncentrátu. Do každé čtvrtiny vemene se infuzi do mléčné žlázy kanálkem struku 1.,

3., 5., 7. a 9. den této studie podá 10 ml excipientu (Freundův neúplný adjuvant emulgovaný se stejným množstvím 0,9% sterilního solného roztoku). Infuze se provádějí plastickou strukovou kanylou (pro infuzi) (délky 3,2 cm, přibližně 12 gauche) od firmy Oorgensen Laboratories, Loveland Co. Protože zadní a přední půlka vemene nemají stejnou velikost, byla srovnávání zpracovaných a kontrolních části dělána mezi vzájemně opačnými čtvrtinami, tj. čelní pravá versus zadní levá a zadní pravá versus čelní levá. Pro kontrolu a zpracování byly náhodně vybrány dvě čtvrtiny v každém vemenu. Při infuzích excipient obsahuje 25 mikrogramů lidského EGF (hEGF) získaného od G. D. Searle and Co., Ltd., Anglie (6 zvířat) nebo myšího EGF (mEGF) získaného od Collaborative Research Corp., Lexington, Ma., USA (jiných 6 zvířat). hEGF byl připraven firmou Searle expresí rekombinantní DNA a následně dalším čištěním filtrací na filtru (mol. hm. 10 000) na vyšší čistotu než na 90 % (jak bylo stanoveno HPLC), mEGF (kultivovaný, č. katalogu 40001) z myšších podčelistních žláz byl připraven způsobem podle Savage a spol.: J. Biol. Chem. 247, 7609 (1972) v 98% čistotě (stanoveno na SDS polyakrylamldovém gelu).

Před podváváním se struky každého zvířete 3 po sobě následující dny máčí. Každý struk se v den podání předem vyčistí 70% vodným ethanolem. Čtrnáctý den se krávy zabijí. Provede se excise mléčných žláz. Z každého vemene (pokud je to nutné, vydojí se) se odstraní kůže a vemeno se rozdělí na čtyři čtvrtiny: přední pravou, přední levou, zadní pravou

Ί

CS 272772 02 a zadní levou. Každá čtvrtina vemen se rozemele. Representativní vzorek (200 g) se zhomogenízuje se čtyřnásobkem svého objemu vody. Změří se celkový objem každého homogenátu.

Při stanovení suché hmotnosti každé čtvrtiny vemene se tři 10 ml podíly homogenátu zředěného 1 : 5 umístí do předem odvážených pánví, vysuší se přes noc při 60 °C a pak se suší do konstatní hmotnosti.

Při stanovení hmotnosti suché odtučněné tkáně každé čtvrtiny vemene se tři 5 ml podíly nezředěného homogenátu extrahují způsobem podle Andersona; J. Anim. Sci. 41, 118·(1975) s tím, že se vzorky umístí do předem odvážených skleněných centrifugačních zkumavek ( o velikosti 25 x 150 mm), extrahují se přes noc 10 ml směsi ethanolu s etherem v poměru 3:1, potom se centrifugují (5 minut, při 500 otáčkách za minutu) a supernatant se odebere. Provede se druhá extrakce dalšími 10 ml směsi ethanolu s etherem. Vzorek se vysuší pod dusíkem do konstantní hmotnosti.

DNA v každé čtvrtině vemene se stanoví způsobem podle Burtona: Methods in Enzymol. 12B, 165 až 166 (1968). Jako testovací roztok se používá roztok 15% trichloroctové kyseliny (TCA) ve 2N kyselině chlorovodíkové. Pří tomto stanovení se alikvotní část (podíly homogenátu) žlázy zředí vodou v poměru 1:5a vše se zhomogenizuje. Používají se tři 0,25 ml nebo 0,5 ml podíly těchto homogenátů. Každý podíl se smíchá se 2 ml testovaného roztoku. Po 30 minutách se vzorky deset minut odstřeďují při 3 000 otáčkách za minutu. Výsledné pelety se promyjí 2 ml 10% roztoku trichloroctové kyseliny v destilované vodě. Po opětovném odstřeďování se výsledné pelety rozbijí ve 2 ml 0,5% kyseliny chlorísté a směs se zahřívá 30 minut na 70 °C, aby se extrahovala DNA. Vzorky se odstřeďují. Jeden ml výsledného/každého supernatantu se umístí do zkumavek 12 x 75 mm. Přidají se 2 ml roztoku 1,5 g difenylaminu a 1,5 ml kyseliny sírové ve 100 ml ledové kyseliny octové (bezprostředně před použitím se ke 20 ml tohoto činidla přidá 0,1 ml 1,6% vodného acetaldehydu). Vzorky se míchají vířením a inkubují se při 27 °C. Jako standard se používá DNA brzlíku telete.

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

Tabulka 1

Účinnosti hEGF podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso

-	mokrá hmotnost 0	suchá hmotnost S	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
A, zpracování průměr	389,9	120,0	63,2	794,5
D. kontrola průměr (pouze excipient) ’	357,3	111,4	58,3	710,0
C. průměrné zvýšení (A-B)	32,6	8,6	4,9	84,5
D. % zvýšení (A-B)/8	9,1	7,7	8,4	11,9
E. průměrné % zvýšení/zvíře	12,9	13,1	16,1	14,8
F. hladina významnosti % zvýšení p je menší než	0,01	0,09	0,16	0,06

Tabulka 2

Účinnosti mEGF podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso

	mokrá hmotnost S	suchá hmotnost S	suchá odtučněná hmotnost 0	DNA /ug
A. zpracováni průměr	419,6	150,2	69,6	905,1
B. kontrola průměr (jen excipient)	402,0	147,9	64,6	794,9
C. průměrné zvýšení (A-B)	17,6	2,3	5,0	110,2
D. % zvýšení (A-B)/B	4,4	1,6	7,9	13,8
E. průměrné % zvýšení na zvíře	1,8	2,1	5,2	12,0
F. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,22	0,40	0,19	0,05

Jak ukazují výsledky v tabulkách 1 a 2, čtvrtiny vemene, do nichž byl infuzně podán hEGF nebo mEGF, byly důsledně těžší a obsahovaly více DNA než jejich stranově opačné kontrolní čtvrtiny, kterým byl podán pouze excipient a obvykle při vysokých hladinách statistické významnosti.

Příklad 3 až 6

Epidermální růstové faktory březích nelaktujících krav chovaných pro maso se rozdělí do 4 skupin po 6 zvířatech; účinky infuze lidského EGF do mléčné žlázy na čtvrtiny vemene byly u těchto zvířat určovány _gf,_e způsobem jako v příkladu 1 až na to, že A) jako excipient byla u skupiny 1 použita Freundova emulze a u skupin 2, 3 a 4 emulze obsahující 60 dílů sezamového oleje a 40 dílů 0,9¾ sterilního injektovatelného solného roztoku, který obsahoval 0,5 % Tweenu 20, a že B) u skupin 1 a 2 se používá 25 mikrogramů hEGF v každé infuzi, u skupiny 3 2,5 mikrogramu a u skupiny 4 250 mikrogramů. Stanovení DNA se provádějí jako v příkladech 1 až 2 až na to, že se původní tři 0,5 ml podíly homo,f9nstu^ex'*^:raliují 1 hodinu 2 ml směsi ethanol - ether (v poměru 3:1), odstřeďují se 15 minut při 3 000 otáčkách za minutu, promyjí se během 10 minut 2 ml 70% ethanolu, odstřeďují se 15 minut při 3 000 otáčkách za minutu a před emícháním každého podílu s roztokem kyseliny trichloroctové se ethanol odstraní. Výsledky pro skupiny 1 až 4 jsou uvedeny v tabulkách 3 až 6.

Tabulka 3

Účinnosti celkově 125 mikrogramů hEGF ve Freundově emulzi podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemene březích krav chovaných pro maso (skupina 1)

	mokrá hmotnost S	suchá hmotnost g	suchá odtuěněná hmotnost g	DNA yiig
A. zpracování průměr	364,9	107,2	60,3	723,0
B. kontrola průměr (jen excipient)	349,5	101,0	56,B	629,0
C. Průměrné zvýšení (A-B)	15,4	6,2	3,5	94,0
D. % zvýšení (A-B)/B	4,4	6,1	6,2	14,9
E. průměrné % zvýšení/zvíře	8,1	10,3	8,3	23,0
F. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,15	0,11	0,13	0,18

Tabulka 4

Účinnosti celkově 125 mikrogramů hEGF v emulzi sezamového oleje podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemene březích krav chovaných pro maso (skupina 2)

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
A. zpracování průměr	370,2	122,1	71,0	995,0
B. kontrola průměr (jen excipient)	356,2	111,1	68,8	703,0
C. průměrné zvýšeni (A-B)	14,0	11,0	2,2	292,0
D. % zvýšení (A-B)/B	3,9		3,2	41,5

CS 272772 D2

Tabulka 4 - pokračování

	mokrá hmotnost g	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
E. průměrné % zvýšení na zvíře	10,4	20,2	15,9	70,0
F. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,2	0,02	0,3	0,09

Tabulka 5

Účinnosti celkově 12,5 mikrogramů hEGF v emulzi sezamového oleje podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemene březích krav chovaných pro maso (skupina 3)

	mokrá hmotnost g	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
A. zpracování průměr	397,8	132,4	79,4	867,6
B. kontrola průměr (pouze excipient)	400,0	127,0	72,7	896,6
C. průměrné zvýšení (A-B)	(2,2)	5,4	6,7	(29,0)
D. % zvýšení (A-B)/B	(0,5)	4,2	9,2	(3,3)
E. průměrné % zvýšení na zvíře	(0,6)	7,8	16,3	(2,2)
F. hladina významnosti % zvýšení p menší než		0,17	0,1

CS 272722 B2

Tabulka 6

Účinnosti 1,25 miligramů hEGF v emulzi sezamového oleje podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemene březích krav chovaných pro maso (skupina 4)

	mokrá hmotnost g	suchá hmotnost s	suchá odtučněná hmotnost a	DNA /ug
A. zpracování průměr	391,9	131,5	81,7	733,2
B. kontrola průměr (pouze excipient)	360,2	117,9	’ 75,1	729,2
C. průměrné zvýšení (A-B)	31,7	13,6	6,6	4,0
D. % zvýšení (A-B)/B	8,8	11,6	8,8	0,5
E. průměrné % zvýšení na zvíře	9,9	12,2	11,9	1,6
F. % zvýšení, hladina významnosti p menší než	0,001	0,004	0,03	-

Jak ukazují výsledky v tabulkách 3 až 6, čtvrtiny vemene, do nichž byl infuzně podán hEGF, byly podstatně těžší a obsahovaly více DNA než jejich stranově opačné kontrolní čtvrtiny, kterým byl podán pouze excipient.

Příklady 7 až B březích nelaktujících krav různých plemen chovaných pro maso se náhodně rozdělí do 3 skupin po 8 zvířatech v každé skupině. Účinky infuze lidského EGF do mléčné žlázy na čtvrtiny vemene byly u těchto zvířat určovány stejným způsobem jako v příkladu 1 až 2 až na to, že množství hEGF v každé infuzi bylo 25 mikrogramů u skupiny 1, 250 mikrogramů u skupiny 2, a 2,5 mikrogramů u skupiny 3. Hmotnosti žláz a DNA byly určovány stejným způsobem jako v příkladech 1 až 2. Výsledky s nízkou dávkou u skupiny 3 byly nejasné vzhledem k napuchnutí některých žláz. Výsledky pro skupiny 1 a 2 jsou uvedeny v tabulkách 7 a 8.

Tabulka 7

Účinnosti 125 mikrogramů hEGF podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemene březích krav chovaných pro maso (skupina 1}

	mokrá hmotnost a	suchá hmotnost a	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
A. zpracování průměr	363,0	113,0	52,8	396,9
B. kontrola průměr (bez účinné látky)	350,0	109,7	50,7	358,9
C. průměrné zvýšení (A-B)	5,0	5,3	2,1	38,0
D. % zvýšení (A-B)/B	1,5	3,0	4,1	10,6
E. hladina významnosti % zvýšení p menši než	0,34	0,21	0,16	0,12

Tabulka B

Účinnosti celkově 1,25 miligramů hEGF podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso (skupina 2)

	mokrá hmotnost a	suchá hmotnost a	suchá odtučněná hmotnost 8	DNA /ug
A. zpracováni průměr	392,5	122,0	63,8	344,0
B. kontrola průměr (pouze excipient)	388,2	115,7	61,4	384,0
C. průměrné zvýšení (A-B)	4,3	6,3	2,4	(40,0)
0. % zvýšení (A-B)/8	1,1	5,3	3,9	(10,4)
E. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,4	0,12	0,26

Jak ukazují výsledky v tabulkách 7 až 8, čtvrtiny vemene, do nichž byl infuzně podán hEGF, bylytěžší a obsahovaly více DNA než jejich stranově opačné kontrolní čtvrtiny, kterým byl podán pouze excipient.

Příklad 9 březích jalovic Holstein se v době přibližně 40 posledních dnů březosti volně ustájí, krmí se dávkou vojtěškového sena a peletového koncentrátu. Infuzi do mléčné žlázy se kanálkem struku do každé čtvrtiny vemene každý třetí den až do porodu podá 10 ml exclpientu všem jalovicím kromě jedné, které se aplikuje lidský EGF, jak popsáno v tomto příkladu, pouze do 15 dnů před porodem. Infuze se provádějí plastickou kanylou pro infuzi,

3,2 cm dlouhou, přibližně číslo 12, s tupým koncem od firmy Jorgensen Laboratories, Loveland, Co. Zvířata se náhodně vyberou vždy po 12 pro následující 4 zpracování: A) 250 mikrogramů lidského EGF, získaného od firmy G. D. Searle and Co., Ltd., Anglie, rozpuštěného v ¢62,5 mikrogramů/ml) 0,9% fyziologickém roztoku pro injekce, obsahujícím 0,5% Tweenu 20, a pak emulgovaného těsně před použitím v sterilním sezamovém oleji, obsahujícím 5 % Arlacel A manidmonooleátu, (olej: fyziologický roztok v poměru 3 : 2) o konečné koncentraci 25 mikrogramů lidského EGF v ml excipientu, B) 250 mikrogramů hovězího IGF-I, připraveného jako v příkladech 10 až 12, vyčištěného a pak rozpuštěného a emulgovaného, jak bylo právě popsáno pro hEGF, C) 50 miligramů N-methionylovaného hovězího somatropinu (BST), připraveného jako v příkladech 19 až 20 a pak zředěného na 10 mg/ml ve sterilním sezamovém oleji a 0) kontrola za použití samotného excipientu (sterilní sezamový olej). U každého zvířete se všechny 4 čtvrtiny vemene zpracují stejným způsobem. Každé vemeno se před zpracováním postříká 70% ethanolem a vysuší do sucha a po zpracování se dezinfikuje roztokem jodu. Při porodu se 4 zvířata z každé skupiny zabijí a jejich mléčné žlázy se oddělí pro analýzu. Zbývajících 8 zvířat z každé skupiny se normálně dojí každé dopoledne a každé odpoledne prvních 105 dnů laktace.

Během těchto 105 dnů dává jalovice, které byl aplikován lidský EGF pouze do 15 dnů před porodem, za den průměrně 9,6 kg mléka, tj. 34,8 %, více než dají průměrně kontrolní krávy. V průměru nepřesahuje produkce mléka krav zpracovávaných až do porodu produkci mléka kontrolních krav.

Příklad 10 až 12

Růstové faktory podobné inzilinu březích nelaktujících krav různých plemen chovaných pro maso se v době posledních 40 až 80 dnů březosti volně ustájí, krmí se dávkou vojtěškového sena a peletovaného koncentrátu. Infuzi do mléčné žlázy se jim kanálkem struku do každé čtvrtiny vemene 1., 3.,

5., 7. a 9, den této studie podá 10 ml excipientu (emulze sezamového oleje stejného druhu jako byla emulze použitá v příkladech 4 až 6). Kontrolní a testované čtvrtiny vemene se náhodně vyberou. Srovnání kontrolní a testované čtvrtiny vemene se provádí jako v příkladech 1 a 2. Při infuzích testované sloučeniny obsahoval excipient růstový faktor I podobný hovězímu inzulínu (bIGF-I), který se připraví expresí v E. coli (Pria kmen 079) rekombinantní ONA kódující bIGF-I napojený na proteinovou signální sekvenci stěn “lam'' B buněk, sekrecí do periplasmového prostoru E. coli a izolací vyčištěním konvenčními způsoby (včetně gelové filtrace, HPLC na latexu a na obrácených fázích). Tento bIGF-I má aminokyselinovou sekvenci a sekundární strukturu shodnou s AMgenovým lidským IGF-I používaným v příkladu 14. Ve standardních L6 myoblastových testech je jeho aktivita v podstatě stejná (90 až 123 %) jako aktivita bIGF-I z příkladu 14, V infuzi byla použita následující množství bIGF-I: skupina 1 - 2,5 mikrogramů, skupina 2-25 mikrogramů, skupina 3 - 250 mikrogramů. Příprava zvířat, infuze a stanovení hmotnosti čtvrtin jejich vemen a DNA se provádí shodně jako v příkladech 3 až 6. Výsledky pro skupinu 1 jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 9

Účinnosti celkově 12,5 mikrogramů bIGF-Ι na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso při podávání infuzí do mléčné žlázy (skupina 1)

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost 9	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
A. zpracování· průměr	408,4	111,7	54,9	1307
B. kontrola průměr (pouze excipient)	369,0	102,7	48,0	1219
C. průměrné zvýšení (A-B)	39,4 '	9,0	6,9	88
D. % zvýšení (A-B)/B	10,7	8,7	14,2	7,2
E. průměrné procento zvýšení na zvíře	11,0	8,8	16,0	12,5
F, hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,01	0,003	0,03	0,2

V této studii dvě vyšší dávky bIGF (skupiny 2 a 3) neposkytovaly větší nárůst zpracovaných čtvrtin ve srovnání s kontrolními čtvrtinami. Byl však pozorován podstatný růst čtvrtin, jimž nebyla infuze podána. Jestliže se postupy popsané pro skupiny 1 až 3 zopakují, získají se v podstatě shodné výsledky. Ze shrnutí výsledků z původní studie a jeho opakování bylo zjištěno, že zpracované a kontrolní čtvrtiny vemene rostly následujícím způsobem:

Tabulka 10

dávky	kontroly	zpracování	spojeno
střední vs. nízká	+ 27 % p menší'než 0,00 .	+ 23,1 % 0,12	. 25 %
vysoká vs. střední	+ 34,4 % p menší než 0,08	+ 31,5 % 0,09	+ 33 %
vysoká vs. nízká	+ 71,3 % p menší než 0,007	+ 62 % 0,01	+ 67 %

Ke shora uvedenému růstu kontrolních čtvrtin vemene dochází i když se plasmová hladina bIGF-Ι během studia významně nezvýšila. Výsledky prakticky jsou shodné, jestliže se tyto testy opakují s jinými březími nelaktujícími kravami chovanými pro maso, které jsou seskupeny na základě v podstatě stejných počátečních objemů vemene, aby se co nejvíce z výsledků odstranily různé proměnné faktory.

Příklad 13

Různé faktory podobné inzulínu

Jetliže se jalovicím, chovaným pro maso nebo pro mléko, nebo březím kravám podá infuzí postupem podle příkladů 10 až 12 celkem 125 mikrogramů až 12,5 miligramu růstového faktoru II podobného inzulínu, vyčištěného v podstatě od všech jiných hovězích peptidů jako v přikladu 1 US patentové přihlášky 388 996 z 31. července 1986, odpovídající evropské patentové přihlášce 86870128.5, jsou výsledky v podstatě stejné jako v příkladech 10 až 12, tj. podstatné se zvýší hmotnosti a DNA zpracovaných čtvrtin vemene.

Příklad 14

Kombinace IGF s EGF ovcí smíšeného plemene se v posledních 35 až 45 dnech březosti krmí dávkou vojtěškového sena a ovčího krmivá. Do každé poloviny vemene se jim infuzí do mléčné žlázy kanálkem struku podává 1., 3., 5., 7. a 9. den této studie 2,5 ml excipientu. 15 ovcím se podá Freundova emulze stejného druhu jako v příkladech 1 a 2, dalším 15 ovcím se podá 0,9¾ fyziologický roztok. Infuze se provádí pomocí A-cath teflonové kanyly, dlouhé 3,2 cm, číslo 16, od firmy C. B. Bard lne., s tupým koncem pro umístění do katetrů. U každého zvířete se náhodně označí poloviny vemene pro zpracování excipientem, který dále obsahuje 2,5 mikrogramu myšího EGF toho druhu, který byl použit v příkladech 1 až 2, a 2,5 mikrogramu lidského IGF-I připraveného expresí rekombínantní DNA a podávaného firmou AMgen Biological Corp., Thousands Oaks, Ca. (Catalog No. 04111, Lot 407; o čistotě vyšší než 90 % podle HPLC). Druhá půlka vemene každého zvířete je určena jako kontrolní, neboí se infuzí do ní podává pouze excipient. Před tím byly struky každého zvířete máčeny 7 po sobě jdoucích dnů. V den zpracování byl každý struk předem očištěn 70% ethanolem.

Třináctý den se ovce zabijí. Provede se excise jejich mléčných žláz. Z každého vemene (vydojené, jestliže je to nutné) se odstraní kůže, načež se rozdělí na pravou a levou polovinu. Každá polovina vemene se homogenizuje se čtyřnásobkem (hmotnostním) vody. Změří se celkový objem homogenátu.

Při stanovení suché hmotnosti každé poloviny vemene se tři lOml podíly homogenátu zředěného 1 i 5 umísti do předem odvážených pánví, vysuší se přes noc při 60 °C a pak se suší do konstantní hmotnosti.

Při stanovení hmotnosti suché odtučněné tkáně každé poloviny vemene se tři 5ml podíly nezředěného homogenátu extrahují způsobem podle Andersona: J. Anim. Sci. 41, 118, (1975) s tím, že se vzorky umístí do předem odvážených skleněných centrifugačních zkumavek (o velikosti 25 x 150 mm), extrahují se přes noc 10 ml směsi ethanolu s etherem v poměru 3:1, potom se centrifugují (5 minut při 500 otáčkách za minutu) a supernatant se odebere. Provede se druhá extrakce dalšími 10 ml směsí ethanolu s etherem. Vzorek se suší pod dusíkem do konstantní hmotnosti.

ONA v každé polovině vemene se stanoví způsobem podle Burtona: Biochemistry 62315 (1956). Jako testovací roztok se používá roztok 15% trichloroctové kyseliny (TCA) ve 2N kyselině chlorovodíkové. Při tomto stanovení se alikvotní podíly homogenátu žlázy zředí vodou v poměru 1:5a vše se zhomogenizuje. Používají se troje 0,25ml nebo 0,5ml podíly těchto homogenátů. Každý podíl se smíchá se 2 ml testovaného roztoku. Po 30 minutách se vzorky 10 minut odstřelují při 3 000 otáčkách za minutu. Výsledné pelety se promyjí 2 ml 10% roztoku kyseliny trichloroctové v destilované vodě. Po opětovném odstřelováni se výsledné pelety rozbijí ve 2 ml 0,5% kyseliny chloristé a směs se zahřívá 30 minut na 70 °C, aby se extrahovala DNA. Vzorky se odstřeďují. Jeden mililitr každého výsledného supernatantu se umístí do zkumavek 12 x 75 mm. Přidají se 2 ml roztoku 1,5 g difenylaminu a 1,5 ml kyseliny sírové ve 100 ml ledové kyseliny octové (bezprostředně před použitím se ke 20 ml tohoto činidla přidá 0,1 ml 1,6% vodného acetaldehydu). Vzorky se smíchají, míchají se vířením a inkubují se při teplotě 27 °C. Jako standard se používá DNA brzlíku telete.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11.

Tabulkall

Účinnosti kombinace mEGF a hIGF-I podané infuzí do mléčné žlázy na ploviny vemen březích ovcí

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
A. zpracování průměr	277,3	73,6	75,2	1021,2
B. kontrola průměr (pouze excipient)	264,7	66,2	56,4	849,5
C. průměrné zvýšení (A-B)	12,5	7,4	18,8	171,7
D. % zvýšení (A-B)/B	4,7	11,0	33,0	20,2
E. hladina významnosti zvýšení p je menší než	0,016	0,03	0,001	0,002

Data v tabulce 11 ukazují, že ONA a suchá hmotnost, mokrá hmotnost a suchá hmotnost odtučněných polovin vemen zvířat zpracovaných podle vynálezu byly podstatně zvýšeny ve srovnání s nezpracovanými polovinami, a tos mimořádně vysokými hladinami statistické významnosti .

Příklad 15

Kombinace IGF s EGF

Osm nebřezích jalovic Holstein ve stáří asi IB měsíců bylo testováno na účinky kombinace IGF-I a lidského EGF podané infuzí do mléčné žlázy podle postupů použitých v příkladech 10 až 12 s tím, že A) objem excipíentu v každé infuzí byl 2,5 ml a B) každá infuze obsahovala 6,25 mikrogramu b.iGF-I a 625 mikrogramů hEGF druhů použitých v příkladech 10 až 12, resp. 1 a 2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12.

Tabulka 12

Účinnosti kombinace hEGF a biGF-I na čtvrtiny vemen jalovic Holstein při podání infuzí do mléčné žlázy

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost 9	suchá odtučněná hmotnost 9
A. zpracování průměr	205,1	93,2	10,7
B. kontrola průměr (pouze excipient)	188,2	89,0	9,5
C. průměrné zvýšení (A-B)	16,9	4,2	1,2
D. % zvýšení (A-B)/B	8,9	4,7	12,1
E. průměrné % zvýšení na zvíře	11,3	7,7	18,8
F. hladina významnosti zvýšení p menší než	0,06	0,2	0,09

Data v tabulce 12 ukazují, že mokrá hmotnost, suchá hmotnost a suchá hmotnost odtučnených čtvrtin vemene jalovic Holstein, zpracovaných podle vynálezu, byly podstatně větší než jejich stranově opačných čtvrtin, kterým byl podán pouze excipient, a to ve vysokých hladinách statistické významnosti.

Příklad 16

Kombinace IGF s EGF

Účinky kombinace hovězího IGF-I a lidského EGF při podání infuzí do mléčné žlázy 8 březím nelaktujícím kravám různého plemene, chovaných pro maso, během jejich posledních 40 až 80 dnů březosti se stanoví podle postupů, které jsou popsány v příkladech 10 až 12. Každá podaná infuze obsahovala 25 mikrogramů hEGF toho druhu, který je používán v příkladech 1 až 2, a 250 mikrogramů biGF.I toho druhu, který je používán v příkladech 10 až 12. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13.

Tabulka 13

Účinnosti kombinace biGF-ϊ (celkem 1,25 miligramu) a hEGF (celkem 125 mikrogramů) podané infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
A, zpracování průměr	496,1	156,4	72,0	1392

Tabulka 13 - pokračování

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA /ug
B. kontrola průměr (pouze excipient)	474,0	144,0	60,7	1· 243
G. průměrné zvýšení , (A-B)	22,1	12,4	11,3	149
D. % zvýšení (A-B)/B	4,7	8,6	18,7	12,0
E. průměrné % zvýšení na zvíře	8,2	13,0	11,0	12,0
F. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,1	0,03	0,08	0,15

Jak ukazuje tabulka 13, ty čtvrtiny vemen, které obdržely kombinaci bIGF-I s hEGF, byly důsledně těžší a obsahovaly více DNA než jejich stranově opačné čtvrtiny, které obdržely pouze excipient, a to ve vysokých hladinách statistické významnosti.

Příklad 17 až 18 březích jalovic Holstein se ve svých posledních 40 až 60 dnech očekávaného otelení volně ustájí a krmí se dávkou vojtěškového sena' a peletovaného koncentrátu. Infuzi do mléčné žlázy se jim kanálkem struku do každé čtvrtiny vemene každý třetí den.podá 10 ml excípientu (sterilní sezamový olej) pro řadu níže uvedených zpracování. Jalovice ve skupinách 1 a 3 se zpracovávají pouze do pátého dne před porodem, kdežto jalovice ve skupinách 2 a 4 se zpracovávají ještě i v posledních pěti dnech před porodem. Do obou čtvrtin vemen na jedné straně zvířete byl aplikován excipient obsahující mitogenní látku, zatímco do obou čtvrtin vemene na opačné straně zvířete byl podán samotný excipient. Všechny infuze se provádějí infuzní kanylou od firmy Jorgensen Laboratories, jaká byla použita v příkladech 1 a 2. Každý struk se před infuzi postříká 70% ethanolem a vysuší se a po infuzi se dezinfikuje roztokem jodu.

Skupina	Počet jalovic	Mitogenní látka v excípientu	Počet zpracováni
rozmezí	průměr
1	4	hEGF a IGF-l* (po 0,25 mg)	10	10
2	5		7 až 20	14
3	5	BST** (50 mg)	10 až 20	12
4	4	11	4 až 16	9

x Získané jako v příkladech 1 až 2 a 9 až 11, rozpuštěné (každý 62,5 mikrogramů/ml) v sterilním 0,9% fyziologickém roztoku pro injekce,obsahujícím 0,5 % Tweenu 20, a emulgované ve sterilním sezamovém oleji (olej: fyziologický roztok v poměru 3 : 2) a 5 % Arlacelu A od firmy Sigma Chemical Co., St. Louis).

xx Připravený jako v příkladech 19 až 20 a zředěný na 10 mg/ml v sezamovém oleji jako excipientu. Výsledky viz příklady 21 až 22.

Tato zvířata se během prvních 30 dnů po porodu normálně dojí každé dopoledne a odpoledne, přičemž se produkce mléka odděleně zaznamenává pro každou čtvrtinu vemene.

V průměru nepřesahuje produkce mléka polovin vemene zpracovaných ve skupině 2 produkci jejich kontrolních polovin vemene.

Tabulka 14

Účinnosti kombinace hEGF a IGF-I podané infusí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemen březích jalovic (skupina 1)

průměrná produkce mléka kg/den	% zvýšení (A-B)/B	hladina významnosti zvýšení
zpracovaná strana (A)	kontrolní strana (B)		p menší než
10,0	9,0 -	11	0,14

Jak je zřejmé z tabulky 14, daly čtvrtiny vemen, do kterých byla infuzi vpravena kombinace hEGF a IGF-I pouze do pátého dne před porodem, v průměru podstatně více mléka, nežli jejich protilehlé strany, kterým byl aplikován pouze excipient.

Příklady 19 až 20

Somatropiny březích nelaktujících krav různého plemene se v jejich posledních 40 až 80 dnech březosti rozdělí do dvou skupin. Testují se účinky infuze do mléčné žlázy podle postupů Z příkladů 3 až 6 s tím, že A) objem excipientu v každé infuzi byl 5 ml a B) každá podávaná infuze obsahovala 1 % soli zinku N-methionylovaného hovězího somatropinu (BST) (a to skupina 1 - 100 mg, skupina 2-40 mg), který se připraví expresí rekombinantní DNA a vyčistí v podstatě tak, jak popisují příklady IA US patentové přihlášky 787 873 ze 16. října 1985, založené na evropské patentové přihlášce Í77 478, zveřejněné 9. dubna 1986. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 15 a 16.

Tabulka 15

Účinnosti BST, podaného infuzi do mléčné žlázy v celkovém množství 500 miligramů, na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso (skupina 1)

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost 9	suchá odtučněná, hmotnost 9	DNA /ug
A. zpracování průměr	790,1	207,6	146,7	2 185
B. kontrola průměr (pouze excipient)	736,6	190,6	141,5	2 054
C. průměrné zvýšení (A-B)	53,5	17,0	5,2	131
0. % zvýšení (A-B)/B	7,3	8,9	3,6	6,4
E. průměrné % zvýšení na zvíře	9,8	10,7	7,9	10,5
F. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,004	0,03	0,18	0,3

Tabulka 16

Účinnosti celkem 200 miligramů BST podaného infuzí do mléčné žlázy na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso (skupina 2)

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost 9	suchá odtučněná hmotnost 9	DNA /ug
A. zpracování průměr	396,9	96,4	49,5	1 371
B. kontrola průměr (pouze excipient)	345,4	85,1	44,8	1 299
C. průměrné zvýšení (A-B)	51,5	11,3	4,7	72
D. % zvýšení (A-B)/B	14,9	13,3	10,5	5,5
E, průměrné % zvýšení na zvíře	13,4	10,7	7,0	15,0
F. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,007	0,06	0,06	0,1

Data v tabulkách 15 a 16 ukazují na tc, že mokrá hmotnost, suchá hmotnost a suchá hmotnost odtučněných čtvrtin vemene březích krav chovaných pro maso, kterým byla podána infuze podle vynálezu, byly podstatné větší než u jejich stranově opačných čtvrtin, kterým byl podán pouze excipient, a že hladina statistické významnosti rozdílů mezi zvětšeními zpracovaných čtvrtin a kontrolních čtvrtin je vysoká.

Příklady 21 až 22

V tabulce 17 jsou uvedeny výsledky, dosažené u jalovic ve skupině 3 z příkladů 17 až 18. V průměru byla produkce mléka, docílená u polovin vemene, které byly zpracovány ve skupině 4 z příkladů 17 až 18, mírně vyšší (o 2 %, p menší než 0,4) nežli produkce mléka jejich kontrolních'polovin vemene.

Tabulka 17

Účinnosti infuze BST podané do mléčné žlázy na čtvrtiny vemen březích jalovic Holstein (skupina 4)

průměrná produkce mléka kg/den	% zvýšeni (A-B)/B	hladina významnosti zvýšení p menší než
zpracovaná strana (A)	kontrolní strana (B)
10,9	9,8	11	0,15

Jak je zřejmé z tabulky 17, daly čtvrtiny vemen, do kterých byl aplikován BST nejdéle do pátého dne před porodem, v průměru podstatně více mléka, nežli jejich protilehlé strany, kterým byl podáván samotný excipient.

Příklady 23 až 26 Transformující růstové faktory

Jestliže se jalovicím, které se chovají pro mléko nebo pro maso, nebo březím kravám podá infuzí podle postupů a dávkování z příkladů 3 až 6 lidský transformující růstový faktor alfa-typu (od Bachen lne. Fine Chemicals, Torrance, Ca., USA, katalog č. PGRD-30), získají se v podstatě stejné výsledky, tj. dojde k podstatnému a statisticky významnému zvýšení hmotností a DNA zpracovaných čtvrtin vemene.

Příklady 27 až 29

Inzulín

Jestliže se jalovicím, které se chovají pro mléko nebo pro maso, nebo březím kravám, které se chovají pro mléko nebo pro maso podle postupů z příkladů 3 až 6 podá 25, 100 nebo 250 mg hovězího pankreatického inzulínu (od Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA, katalog č. 1-5500, 24 mezinárodních jednotek na miligram) v jedné infuzí, získají se podobná výsledky, tj. dojde k podstatnému a statisticky významnému zvýšení hmotností a DNA zpracovaných čtvrtin vemene.

Příklady 30 až 32

Placentální laktogeny

Jestliže se jalovicím, které se chovají pro mléko nebo pro maso, nebo březím kravám, které se chovají pro mléko nebo pro maso, infuzí podle postupů z příkladů 3 až 6 podá celkem 0,25, 10 nebo 250 miligramů přirozeného hovězího placentálního laktogenu (který se vyčistí způsobem podle Bayatta: Endocrin. 119, 1343 až 1350 (1986), dosáhne se velmi podobných výsledků, tj. dojde k podstatnému a statisticky významnému zvýšení hmotností a DNA zpracovaných čtvrtin vemene.

Příklady 33 až 36

Prostaglandiny březích nelaktujících krav různých plemen, chovaných pro maso, se volně ustájí a krmí se dávkou vojtěškového sena a peletovaného koncentrátu. Do každé čtvrtiny vemene se jim infuzí do mléčné žlázy kanálkem struku aplikuje 1., 3., 5., 7. a 9. den této studie 5 ml excipientu (olej MCT od firmy Mead Johnson Corp., což je triglycid se středně dlouhým řetězcem, a sice lipidová frakce kokosového oleje, tvořená zejména triglycidy mastných kyselin s 8 a 10 uhlíky a obsahující C₀ - 67 %, C_1Q - 23 %, 4 Cg - 6 %, >-C^g- 4 %). 48 předních a zadních polovin vemen se náhodně rozdělí do 4 skupin, přičemž vždy do jedné čtvrtiny každé poloviny vemene se aplikuje excipient a její podélně protilehlá čtvrtina vemene se použije jako kontrola. Při těchto infuzích obsahoval excipient Prostaglandin (PG) E^ nebo E₂ od firmy Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO.' (katalog č. 86F-0406 a -0404). Množství PG v každé infuzi činila: skupina 1 - 87,5 mikrogramů £2» skupina 2 - 875 mikrogramů E₂, skupina 3 - 87,5 mikrogramů Ej, skupina 4 - 875 mikrogramů Ej. Zvířata byla připravena a infuze byly aplikovány j.ako v příkladech 17 až 18. Účinnosti byly stanoveny jako v příkladech 1 až 2. Výsledky pro skupiny 1 až 4 jsou uvedeny v tabulkách 18 až 21.

Tabulka 18

Účinnosti Prostaglandinu E₂ podaného infuzí do mléčné žlázy v celkovém množství 0,4375 miligramů na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso (skupina 1)

	mokrá hmotnost S	suchá hmotnost S	suchá ' odtučněná hmotnost g	DNA mg
A. zpracování průměr	1 966,9	525,5	351,8	5 203
B. kontrola průměr (pouze excipient)	1 735,5	484,9	297,8	4 724
C. průměrné zvýšení (A-B)	231,4	40,6	54,0	479
D. % zvýšení (A-B)/B	13,3	8,3	18,1	10,1
E. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,01	0,04	0,18	0,02

Tabulka 19

Účinnosti Prostaglandinu E₂ podaného infuzí do mléčné žlázy v celkovém množství 4,375miligramů na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso (skupina 2)

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA mg
A, zpracování průměr	1 030,8	312,7	194,5	3 397
B. kontrola průměr (pouze excipient)	742,0	219,0	144,3	2 348
C. průměrné zvýšení (A-B)	288,8	93,7	50,2	1 049
D. % zvýšení (A-8)/B	38,9	42,8	34,8	44,6
E. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,0003	0,0001	0,004	0,001

Tabulka 20

Účinnosti Prostaglandinu E^ podaného infuzí do mléčné žlázy v celkovém množství 0,4375 miligramů na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso (skupina 3)

	mokrá hmotnost g	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA mg
A. zpracování průměr	972,5	259,3	180,9	2 881
8. kontrola průměr (pouze excipient)	778,0	210,6	200,3	2 284
C. průměrné zvýšení (A-B)	194,5	48,7	(19,4)	597
D. % zvýšení (A-B)/B	25,0	23,0	(9,7)	26
E. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,002	0,002	0,58	0,07

Tabulka 21

Účinnosti Prostaglandinu E^ podaného infuzí do mléčné žlázy v celkovém množství 4,375 miligramů na čtvrtiny vemen březích krav chovaných pro maso (skupina 4)

	mokrá hmotnost 9	suchá hmotnost g	suchá odtučněná hmotnost g	DNA mg
A. zpracování průměr	1 435,5	379,6	247,7	4 218
6. kontrola průměr (pouze excipient)	949,3	268,2	189,0	2 792
C. průměrné zvýšení (A-B)	486,2	111,4	58,7	1 426
D. % zvýšení (A-B)/B	51,2	41,5	31,0	51,1
E. hladina významnosti % zvýšení p menší než	0,03	0,02	0,07	0,06

Jak je zřejmé z tabulek 18 až 21, byly čtvrtiny vemen, kterým byly aplikovány prostaglandlny, vždy těžší a obsahovaly více DNA nežli jejioh podélně protilehlé kontrolní čtvrtiny, kterým byl podán pouze excipient, a to obvykle při velmi vysokých hladinách statistické významnosti.

I když biologické mechanismy tohoto vynálezu nejsou zcela jasné, je zřejmé, že je lze využít v souladu s konvenčně uznávanými kriterii ke zvýšení parenchymu mléčné žlázy a k odpovídajícímu zvýšení produkce mléka žovočicha, jemuž byla aplikována infuze, a že tato schopnost bude přetrvávat v následujícím laktačním období živočicha a v mnoha případech při mnoha dalších laktacích.

Claims (2)

1. Způsob zvýšení nárůstu parenchymu mléčné žlázy zdravého, fyziologicky normálního hospodářského zvířete aplikací růstových faktorů a/nebo jiných mitózu ovlivňujících látek v průběhu březosti nebo v době mezi nástupem puberty a první březostí, vyznačující se tím, že se působí na mléčnou žlázu intracisternální infuzí prostředku, který obsahuje alespoň jednu účinnou látku, vybranou ze skupiny zahrnující epidermální růstový faktor, růstový faktor typu inzulínu, somatropin, transformující růstový faktor, insulin, placentální laktogen, prostaglandiny, jejich směs a/nebo jejich syntetické analogy.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se aplikuje jednotková dávka obsahující 2 mikrogramy až 100 miligramů účinné látky.