JP2003507429A - 精子機能の刺激 - Google Patents

精子機能の刺激

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JP2003507429A JP2001518069A JP2001518069A JP2003507429A JP 2003507429 A JP2003507429 A JP 2003507429A JP 2001518069 A JP2001518069 A JP 2001518069A JP 2001518069 A JP2001518069 A JP 2001518069A JP 2003507429 A JP2003507429 A JP 2003507429A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 哺乳動物の精子の授精能獲得を増大させるための薬剤及びその方法を提供する。 【解決手段】 哺乳動物の精子の授精能獲得を増大させるための薬剤は（１）カルシトニン、（２）アンギオテンシンＩＩおよび（３）アデノシンレセプター活性のモジュレーターからなる群から選択される二種以上の薬剤からなり、このモジュレーターは授精促進ペプチド（ＦＰＰ）またはアデノシンまたは特定のアデノシンンレセプターアゴニストであってよい。好ましい組み合わせは、カルシトニン、ＦＰＰ（またはＦＰＰ／アデノシン）およびアンギオテンシンＩＩである。薬剤は（１）クリーム、ゼリーまたはペッサリー（ＦＰＰ１００ｎＭ−１００μＭまたはアデノシン１０μＭ−１０ｍＭ、サケカルシトニン５ｎｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌまたはヒトカルシトニン２００ｎｇ／ｍｌ−２００μｇ／ｍｌおよびアンギオテンシンＩＩ１ｎＭ−１μＭを含有する）または（２）ＦＰＰ１２．５−５００ｎＭまたはアデノシン０．５−１００μＭ、サケカルシトニン０．５−１５０ｎｇ／ｍｌまたはヒトカルシトニン２−１０００ｎｇ／ｍｌおよびアンギオテンシンＩＩ０．１−１００ｎＭを含有するヒト不妊症の治療に使用するための精子製剤として処方することができる。農業用途のためには、精子製剤はＦＰＰ１２．５ｎＭ−１μＭまたはアデノシン０．５−１００μＭ、サケカルシトニン０．５−４００ｎｇ／ｍｌまたはブタカルシトニン２−１０００ｎｇ／ｍｌおよびアンギオテンシンＩＩ０．１−１００ｎＭの濃度を含有することができる。哺乳動物の精子の授精能獲得を刺激する医薬の調製のためのアンギオテンシンＩＩの使用も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は精子機能を刺激するための哺乳動物精子の処理に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物の精子は雄の生殖器官を離れたときに形態学的に完成していて、かつ
激しく運動し得るもではあるが、直ぐには卵母細胞を授精させ得るものではない
。卵母細胞を授精させる能力の獲得を授精能獲得と称する。一旦授精能を獲得す
ると、精子はアクロソーム反応（透明帯の浸透および卵母細胞原形質膜との融合
のための前提要件）を受けることができる。このメカニズムに欠陥があると不妊
症の状態となる。現在のところ、この問題に対する実際の治療法はない。
【０００３】 以下の記載全体にわたって、文献中の様々の刊行物が記載されていて、これら
の刊行物の完全なリストは本明細書の末尾に挙げられている。
【０００４】 授精促進ペプチド（ＦＰＰ）はマウス精子（Ｇｒｅｅｎら、１９９４年）およ
びヒト精子（Ｇｒｅｅｎら、１９９６年ａ）の両方で授精能を刺激することが分
かっている。ＦＰＰは数種の哺乳動物の前立腺、精漿および脳下垂体前葉製剤で
検出されているトリペプチド（ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−ＰｒｏＮＨ2）である。脳下
垂体由来のＦＰＰには特別な機能が帰せられてはいないが、ＦＰＰがインビトロ
およびインビボ双方で精子機能を調節するのに重要な役割を果たしている可能性
についての証拠が集められている。ＦＰＰは哺乳動物の精子で二相の応答を示し
、授精能を獲得していない精子（クロルテトラサイクリンン蛍光分析およびイン
ビトロ授精により測定）での授精能獲得を刺激し、次いで授精能獲得精子での自
発的アクロソーム反応を阻害する。自発的アクロソーム反応をした精子は授精す
ることができないので、ＦＰＰに対する両方の反応が重要である。
【０００５】 ＦＰＰはそのレセプター（ＴＣＰＩＩ）への結合により作用する。アデノシン
（精漿にも存在する）はそれ自体のレセプターと結合するとＦＰＰと同一の反応
を刺激する。さらにまた、ＦＰＰプラスアデノシンを使用すると、高い刺激濃度
でもどの化合物も刺激性でない低い濃度でも、いずれかを単独で使用するよりも
授精能獲得を刺激した。このことは、ＦＰＰおよびアデノシンが同一のシグナル
形質導入経路に作用することを示唆していた（Ｇｒｅｅｎら、１９９６年ｂ）。
さらに近年の研究から、両者は経路で共通の成分、即ち、アデノシンレセプター
を有していることが分かった；このＦＰＰレセプターＴＣＰＩＩは、応答を明示
するために、アデノシンレセプターと相互作用をするものと考えられる。応答は
、Ｇタンパク質およびアデニリルシクラーゼ／ｃＡＭＰシグナル形質導入経路を
介して媒介されるものと考えられる。受精能を獲得していない細胞での刺激応答
は刺激アデニンレセプターおよびＧα5サブユニットを含むＧタンパク質を包含
し、ｃＡＭＰ生産の増加を生じる（Ｆｒａｓｅｒ＆Ａｄｅｏｙａ−Ｏｓｉｇｕｗ
ａ，１９９９年）。刺激アデノシンレセプターに特異的なアゴニストは受精能を
獲得していない細胞でのＦＰＰおよびアデノシンの効果を最小にすることことが
できるが、一方阻害アデノシンレセプターに特異的なアゴニストは受精能を獲得
した細胞でのＦＰＰおよびアデノシンの効果を最小にすることことができる。こ
れらの特性にも拘わらず、ＦＰＰもアデノシンも本発明が関係する課題を解決す
るのに利用されている。
【０００６】 アンギオテンシンＩＩはその主要な機能が心血管および電解質ホメオスタシス
の調節にある。ヒト精子懸濁液にアンギオテンシンＩＩを添加すると、精子の運
動性を刺激することが観察され、これは精子がアンギオテンシンＩＩレセプター
を有していること、およびアンギオテンシンＩＩが精子機能調節に役割を果たし
ていることを示唆している（Ｖｉｎｓｏｎら、１９９７年）。この開発が国際特
許出願ＷＯ９５／３２７２５の要旨である。しかしながら、克服すべき課題は、
精子の運動性とは別個の精子受精能獲得の課題である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は哺乳動物の精子の授精能獲得を増大させるための薬剤及びその方法を
提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
今や、本発明者らは、精子の運動性の刺激と同様に、アンギオテンシンＩＩが
哺乳動物の精子の授精能獲得を刺激することを見いだした。従って、本発明はこ
の目的のためにアンギオテンシンＩＩを使用することにある。
【０００９】 本明細書中で使用される用語「アンギオテンシンＩＩ」は、インビボおよびイ
ンビトロで同様な活性を有する前駆体および誘導体を包含する。合成均等物も使
用し得る。アンギオテンシンＩＩの生産は、先ずアンギオテンシノーゲンをレニ
ンによりアンギオテンシンＩに変換し、つぎにアンギオテンシンＩをアンギオテ
ンシン変換酵素によりアンギオテンシンＩＩに変換することからなる。このレニ
ンーアンギオテンシンシステムは通常全身系血液由来システムに関連して想到さ
れているが、過去２０年間の研究から、生殖器官中のこのシステムの要因の存在
が明らかとなった。プロレニン、レニンの前駆体、およびアンギオテンシンＩＩ
は共にヒト精漿中で同定された。
【００１０】 カルシトニンは、その主要な機能がＣａ+フラックス及び代謝の調整にある３
２−アミノ酸低カルシウム性ホルモンである。真骨魚類／鳥類、偶蹄類およびラ
ット／ヒトのカルシトニンの三つの主要な系統学的クラスが存在している（Ｐｏ
ｚｖｅｋら、１９９７年）。真骨魚類／鳥類カルシトニンは最も強力であり、サ
ケカルシトニンがヒト代謝系骨障害の治療に広く使用されている。本明細書中で
使用される「カルシトニン」なる用語はいずれの種のカルシトニンをも言うもの
であり、サケ、ウナギ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ラットおよびヒト由来のカルシ
トニン、およびインビトロおよびインビボで同様な活性を有する前駆体および誘
導体を包含する。合成均等物もまた使用し得る。１９８８年代初めに、カルシト
ニンはヒト精漿から同定されたが、その精子に対する効果については否定的な結
論が得られていた。精子の授精能獲得に対するカルシトニンの肯定的な効果は、
本出願人の係属中の出願ＷＯ００／３２２２４で初めて指摘され、開示された。
【００１１】 本発明によれば、本発明者らは、上述したホルモンおよび以下に特定するその
他の物質の二種以上の組み合わせが授精能獲得を増大させ、これを使用して不妊
症の治療に多大の利点が得られることも見いだされた。
【００１２】 本発明は、それぞれの薬剤が（１）カルシトニン、（２）アンギオテンシンＩ
Ｉおよび（３）アデノシンレセプター活性のモジュレーターからなる群から選択
される薬剤の二種以上を包含する哺乳動物の精子の受精能獲得を増大させる組み
合わせ薬剤からなる。
【００１３】 アデノシンレセプター活性のモジュレーターは、ＦＰＰ、アデノシンおよびア
デノシンレセプターアゴニストから選択することができる。本発明の目的のため
には、本明細書中で使用される「ＦＰＰ」なる用語は前駆体、関連ペプチド例え
ばチロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）およびインビボおよびインビトロで同様
な活性を有する誘導体も包含する。
【００１４】 上で特定した物質は、いずれかの二種以上で組み合わせて使用すると、哺乳動
物の精子に対して、いずれか一つのホルモンを単独で使用するよりも精子機能を
顕著に刺激するように作用する。この刺激効果の増大はホルモンを高い濃度で使
用した場合だけではなく、ホルモンを個別に使用したときには非刺激的である低
い濃度でも得られる。この増大の理由は今のところ十分には分かっていないが、
異なったホルモンが同一のシグナル導入経路で何らかの方法で作用をしているこ
と示唆しているものである。これらの個別の薬剤のいずれかの刺激効果を単にあ
るレベル以上の濃度に増加させるだけでは増大させるのが可能であることが見い
だされていないので、このような組み合わせの治療的利点は予期されないことで
あり、また妊娠可能性の課題の処理に極めて有利なことである。これらのホルモ
ンは別個のレセプターを経て作用するので、個々の患者で変わるこれらのレセプ
ターの一つまたはその他の欠損が正常より劣った生殖能力の原因となり得る。従
って、併用療法によってこの課題に対処するさらに有効な方法が提供される。
【００１５】 授精能獲得を刺激するのに有効なこれらの薬剤の量は、処置すべき精子の当初
の欠損程度に左右される。これは、ＷＯ００／３２２４に指示されているアッセ
イによって測定することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】アンギオテンシンＩＩを使用する刺激効果の証明 クロルテトラサイクリン分析のための精子懸濁製剤 成熟ＴＯ雄マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｏｌａｃ，Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）
からの精巣上体尾の内容物（３−４尾／ｍｌ培地）を３０ｍｌ滅菌培養皿中の２
ｍｌ変性タイロード培地（Ｆｒａｓｅｒ，１９９３年）に入れ、そして５分間分
散させた。次いで、懸濁液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（中間グレード；Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の短いカラムを通して濾過し
て非運動性細胞を除去し、アリコートを取り出して別異の処置グループとし、そ
してなにも処置しない（コントロール）かまたは選択したホルモンで処置した。
【００１７】 ヒトアンギオテンシンＩＩは１および１０ｎＭの最終濃度で使用し；１００ｎ
Ｍの最終濃度で使用するＦＰＰは正のコントロールとして働いた。これらの短期
間のインキュベーションを５％ＣＯ2，５％Ｏ2，９０％Ｎ2の雰囲気中３７℃で
０．５ｍｌプラスチックマイクロ遠心管で実施した。インキュベーション後に、
各々の処理した懸濁液のアリコートをＣＴＣを使用して分析して、授精能獲得に
対して何らかの効果ひいては授精能力の獲得を認めることができたかどうかを測
定した。三度の反復実験を実施した（ｎ＝３）。
【００１８】 全ての実験において、各懸濁液一滴を主観的な運動性評価について簡単に検査
した。実験的処置は運動性に対して有害な効果を有してなく；主観的に判断して
、これらはいずれも未処置コントロール試料で認められるよりもさらに激しい運
動性を促進していた。
【００１９】 クロロテトラサイクリン蛍光分析 クロロテトラサイクリン（ＣＴＣ）蛍光分析はＧｒｅｅｎら（１９９９年）が
記載のごとくして実施した。評価は、広範囲青色−紫色励起キューブ（Ｕ−ＭＷ
ＢＶ）を使用して位相コントラストおよびＢＸ−ＦＬＡエピフルオレッセンス（
ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４０顕
微鏡で行った。励起ビームは４００−４４０ｎｍバンドパスフィルターを通過し
、ＣＴＣ蛍光はＤＭ４５５二色ミラーを通して観察した。各試料において、少な
くとも１００の精子を三種のパターンの一つを表現するものとして分類した：Ｆ
、頭部全体にわたる蛍光を有する、授精能を獲得していない（非授精）、アクロ
ソームがそのままの精子のパターン特性；Ｂ、アクロソーム後の領域で蛍光を有
しないバンドを有する、授精能を獲得している（潜在的に授精性）アクロソーム
がそのままの精子パターン特性；ＡＲ、頭部全体にわたり蛍光が鈍いかまたは存
在しない、アクロソーム反応した（非授精）精子のパターン特性。
【００２０】 インビトロ授精のための精子製剤 二匹の成熟ＴＯ雄マウスからの精巣上体尾の内容物を３０ｍｌ滅菌培養皿中の
２ｍｌ変性タイロード培地に入れ、そして５分間分散させた。次いで、懸濁液を
、各々３０ｍｌ滅菌皿中の三つの処置グループに分け、そしてなにも処置しない
（コントロール）かまたはホルモンで処置した。アンギオテンシンＩＩは１０ｎ
Ｍの最終濃度で使用し；１００ｎＭの最終濃度で使用するＦＰＰは同じように正
のコントロールとして働いた。各懸濁液をオートクレーブ処理した流動パラフィ
ンを上掛けし、そして５％ＣＯ2，５％Ｏ2，９０％Ｎ2の雰囲気中３７℃で４０
分間インキュベーションした。
【００２１】 インビトロ授精分析 成熟雌ＴＯマウス７．５ＩＵウマ絨毛性性腺刺激ホルモンを腹腔内注射、そし
て約５０時間後に５ＩＵヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の腹腔内注射に
より、排卵過度を誘起した。ｈＣＧの約１５時間後に、卵管を摘出し、そして卵
母細胞を含む細胞塊を流動パラフィンで覆った培地中に放出した。プレインキュ
ベーションした精子懸濁液を最初のインキュベーションに使用した同一組成の培
地中に１０倍に希釈した（即ち、ホルモンを有するかまたは有しない）；希釈懸
濁液４００μｌ流動パラフィンで覆った培養皿に移し入れ、そして卵母細胞を加
えた。６５分間コインキュベーションした後、卵母細胞をコントロール培地の小
滴に移し、そして７５分で緩衝化したホルマリン（リン酸緩衝生理食塩水中４％
ホルマリン）で固定した。
【００２２】 卵母細胞を０．７５％アセトーオルセインで染色し、固定し、そして評価した
（Ｆｒａｓｅｒ，１９９３年）。これらの細胞が二次減数分裂を開始し、そして
デコンデンシング（ｄｅｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）精子頭部を含んでいると、これ
らの精子は授精されたと見做した。
【００２３】 結果 精巣上体のマウス精子（１および１０ｎＭの両方でアンギオテンシンＩＩ（Ａ
ＩＩ）で処理した）は未処理コントロール精子と比較して有意に一層速い速度で
（***Ｐ＜０．０１）授精能を獲得した（図１）。これは、Ｂパターン細胞（授
精能を獲得した、潜在的に授精性細胞の特徴）の有意により高い比率およびＦパ
ターン細胞（授精能を獲得していない、非授精性細胞の特徴）の相当して有意に
より低い比率によって証明された。ホルモン処置された細胞は未処置コントロー
ルよりも一層活発な運動性を示すことも観察された。インビトロ授精実験により
、アンギオテンシンＩＩ処置精子（９６／１７４＝５５．２％卵母細胞授精した
）およびＦＰＰ処置精子（８１／１４２＝５７．０％卵母細胞授精した）では、
未処置のコントロール精子（２５／１２８＝１９．５％卵母細胞授精した）によ
るよりも有意にさらに授精した卵母細胞（Ｐ＜０．０２５）が得られることが証
明された。
【００２４】ホルモンの組み合わせを使用する刺激効果の証明 カルシトニン、アンギオテンシＩＩおよびＦＰＰはそれぞれでは単独で使用す
るとほぼ同程度（ＣＴＣ分析）に授精能獲得（キャパシテーション）を刺激する
。一旦顕著な応答が得られると、個々のホルモンの用量を増加させることは応答
を顕著に増大しない。例えば、１ｎＭおよび１０ｎＭアンギオテンシンＩＩ（図
１）は１００ｎＭおよび２５０ｎＭＦＰＰ（Ｇｒｅｅｎら、１９９４年）のごと
く極めて類似の応答を示した。しかしながら、今や本発明者らはこれらのホルモ
ン２または３全部の様々の組み合わせで使用するときは、増加された応答が得ら
れることを実証した。幾つかの実験では、「高い」濃度のホルモンを使用し（５
ｎｇ／ｍｌサケカルシトニン；１ｎＭアンギオテンシンＩＩ；１００ｎＭＦＰＰ
），またその他の実験では「低い」非刺激性の濃度を使用した（０．５ｎｇ／ｍ
ｌカルシトニン；０．１ｎＭアンギオテンシンＩＩ；１２．５ｎＭＦＰＰ）。
【００２５】 ５ｎｇ／ｍｌカルシトニン＋１ｎＭアンギオテンシンＩＩ（高濃度；ＨｉＣＴ
＋ＡＩＩ）の組み合わせを評価する場合、ＣＴＣ分析を使用して観察された刺激
的応答はいずれか一つを個別に使用した場合に見られる応答よりも一層大きなも
のであった（**Ｐ＜０，０２５，***Ｐ＜０．０１，未処置のコントロールとの
比較；図３）。個別に使用したとき、０．５ｎｇ／ｍｌカルシトニンも、０．１
ｎＭアンギオテンシンＩＩ（低濃度：ＬｏＣＴ，ＬｏＡＩＩ）も処置マウス精子
懸濁液では検知し得る応答を生じなかったが、組み合わせて使用した二種の低用
量（ＬｏＣＴ＋ＡＩＩ）では有意の刺激的応答を生じた（**Ｐ＜０，０２５，未
処置のコントロールとの比較および低用量処置；図２）。しかしながら、この結
果は二種の活性成分の相加作用に関して説明されるべきものではない。それは、
図２が低濃度で個別に使用した成分は処置をしなかったコントロールにまさる授
精能獲得を改善しなかったことを示しているからである。これらの後者の結果は
、二種のホルモンが、それら自身の別個のレセプターを介して作用することが知
られてはいるものの、同一経路で作用し得ることを示唆している。この仮説は併
用した高い用量に対する促進された反応および単独で使用したときは非刺激性で
あった併用した低い用量に対する顕著な反応の両方に一致するものである。
【００２６】 これらの二種のホルモンをＦＰＰと組み合わせて使用すると、同様な応答が認
められた。低い、非刺激性の濃度を使用すると、１２．５ｎＭＦＰＰ＋０．５ｎ
ｇ／ｌカルシトニン（ＬｏＦ＋ＣＴ）および１２．５ｎＭＦＰＰ＋０．１ｎｇ／
ｌアンギオテンシンＩＩ（ＬｏＦ＋ＡＩＩ）の両方の組み合わせによって、同様
な、顕著な刺激性応答が生じた（**Ｐ＜０，０２５，未処置のコントロールとの
比較；図３）。１２．５ｎＭＦＰＰ＋０．５ｎｇ／ｌカルシトニン＋０．１ｎｇ
／ｌアンギオテンシンＩＩを使用すると（ＬｏＦ＋ＣＴ＋ＡＩＩ）、更に大きな
刺激が得られた（***Ｐ＜０．０１，未処置のコントロールとの比較；図３）；
しかもこの応答の大きさは１００ｎＭＦＰＰ（ＨｉＦ）で得られたのと同様であ
った。最後に、三種のホルモン全部を高い濃度（１００ｎＭＦＰＰ、５ｎｇ／ｌ
カルシトニンおよび１ｎＭアンギオテンシンＩＩ；ＨｉＦＰＰ＋ＣＴ＋ＡＩＩ）
で同時に使用すると、極めて顕著な刺激応答が得られ、１００ｎＭＦＰＰ（Ｈｉ
ＦＰＰ）で得られたものよりも有意に高い（！＝Ｐ＜０．０５）および未処理コ
ントールよりも有意に高い（***Ｐ＜０．００１，図４）ものであった。
【００２７】 ＦＰＰはアデニリルシクラーゼ／ｃＡＭＰシグナル変換経路をモジュレートす
ることが分かっているので、これらの結果はカルシトニンおよびアンギオテンシ
ンもこの同じ経路をともかくもモジュレートし得ることを示唆していた。以下に
示すごく最近のデータは、キャパシテーションが授精能を獲得していない精子で
のｃＡＭＰ生産を顕著に刺激し得ることを確認している。
【００２８】
【表１】
【００２９】 アデノシンはＦＰＰと同一の経路を利用していることが分かっていることを繰
り返しておきたい；これは授精能を獲得していない精子および授精能を獲得して
いる精子においてＦＰＰ及びアデノシン両方に対する応答に異なったレセプター
集団が関与しているアデノシンレセプターを包含しているものである（Ｆｒａｓ
ｅｒ＆Ａｄｅｏｙａ−Ｏｓｉｇｕｗａ，１９９９年）。以下に示す新しいデータ
は、個々に使用したときはいずれも有効ではない低いＦＰＰおよび低いアデノシ
ンの組み合わせはｃＡＭＰの生産を有意に刺激し、生産されるｃＡＭＰの量は高
いＦＰＰまたは高いアデノシンのいずれかに対する応答で生産されるのと極めて
類似していることを実証している。
【００３０】
【表２】
【００３１】 かくして、ｃＡＭＰに作用する化合物の組み合わせにより、授精能を獲得して
いない精子においてｃＡＭＰの生産を結果として増加させる。従って、一つの好
ましい組み合わせはＦＰＰまたはアデノシンの一方プラスカルシトニンノよびア
ンギオテンシンＩＩの組み合わせである。
【００３２】授精能を獲得した懸濁液に対する効果 ＦＰＰおよびアデノシンは、マウスの精子に対して二相性の効果を示すことが
分かっていて、授精能を獲得していない精子における授精能獲得を刺激し、次い
で自発的アロソーム反応を阻害した。カルシトニン及びアンギオテンシンＩＩが
授精能獲得した精子に対してあるとすればどのような効果を有するかを知ること
は重要である。その理由は処理された精子は数時間はホルモンの存在下で生存す
るからである。例えば、これらのホルモンが授精能獲得した精子で自発的アクロ
ソ−ム反応を刺激したとすると、提案された処置の有効性は低減される。それは
アクロソーム反応された精子は不授精であるからである。従って、単独使用また
は組み合わせ（これらのホルモンプラスＦＰＰの組み合わせを包含する）使用さ
れるカルシトニンおよびアンギオテンシンＩＩの授精能獲得した精子に対する効
果をＣＴＣを使用して検討した。
【００３３】 精子懸濁液はＣＴＣ分析について先に記載したようにして調製し、そして９０
分間インキュベーションして授精能を獲得させた。次に、懸濁液を濾過して非運
動性の細胞を除去し、そして試料をＣＴＣで染色した。残りの懸濁液をアリコー
トで取り出して別異の処理グループとし、そして何物でも処理しないかまたはホ
ルモン、単独または組み合わせ（１００ｎＭＦＰＰ；５ｎｇ／ｍｌサケカルシト
ニン；１ｎＭアンギオテンシンＩＩ；カルシトニン＋アンギオテンシンＩＩ；Ｆ
ＰＰ＋カルシトニン＋アンギオテンシンＩＩ）で処置した。更に４０分間（合計
１３０分）インキュベーションした後、精子はＣＴＣ分析の用意ができた。予備
実験（カルシトニンは効果を有したが、アンギオテンシンＩＩは有していなかっ
たことを指示した）を基にして、二種の追加の処置が包含されていた：即ち、１
００ｎＭＦＰＰ＋１００ｎｇ／ｍｌ百日咳毒素；５ｎｇ／ｍｌカルシトニン＋１
００ｎｇ／ｍｌ百日咳毒素。
【００３４】 結果（図５）は、ＦＰＰ（Ｆ）およびカルシトニン（ＣＴ）共に自発的アクロ
ソーム反応を有意に阻害し（***Ｐ＜０．０１，１３０分で未処置のコントロー
ルと比較）、これに対してアンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）は阻害しなかったこ
とを示した。従って、授精能を獲得していない精子で得られた結果はこれらの三
種のホルモンは同一の経路に作用するが、これらの結果は一つではない作用機序
がおそらくは包含されていることを指示している。百日咳毒素（ＰＴ）が包含さ
れているとＦＰＰ（Ｆ＋ＰＴ）およびカルシトニン（ＣＴ＋ＰＴ）の効果がなく
なり、これらの二種のホルモンに対する授精能を獲得している精子での応答が阻
害Ｇαi/oサブユニットを有するＧタンパク質を包含することを示唆している。
アンギオテンシンＩＩが自発的アクロソーム反応を阻害しなかった事実は、阻害
Ｇタンパク質を包含しない異なったメカニズムがこのホルモンに応答して包含さ
れていることを示唆している。カルシトニン＋アンギオテンシンＩＩ（データを
示していない）またはＦＰＰ＋カルシトニン＋アンギオテンシンＩＩ（ＦＰＰ＋
ＣＴ＋ＡＩＩ；図５）の組み合わせの使用により、自発的先体（アクロソーム）
喪失の顕著な阻害が結果として生じた（***Ｐ＜０．０１，１３０分で未処置の
コントロールと比較）。従って、アンギオテンシンＩＩが二相応答を誘起できな
いことは、ＦＰＰおよびカルシトニン（その各々は二相応答を誘起する）に対す
る応答を阻害しなかった。これらの結果は、これらのホルモンの組み合わせに精
子を永く暴露しても有害な効果を有していないが、代わりに潜在的に授精する精
子の比率が高くなることを示唆している。
【００３５】臨床適用 治療方法 非常に好ましい一つの組み合わせとして、本発明者らはインビトロおよびイン
ビボの両方でＦＰＰまたはアデノシン、カルシトニンおよびアンギオテンシンＩ
Ｉの併合使用を提案するものである。このホルモンの組み合わせが共に授精能獲
得を刺激し、次いで自発的アクロソーム反応を阻害する事実は試料中の潜在的に
授精する精子（授精能を獲得し、アクロソームが損なわれていない）の数を最大
にすべきものである。個々の男性は、これらのホルモンによって制御されるレセ
プター媒介応答の一つまたは二つ以上で欠陥を有する精子を有していることがあ
る。ホルモンン全部の混合物の使用により、精子が混合物の少なくとも一種また
は二種に応答するチャンスが増える。
【００３６】 不妊症クリニックでのインビトロの使用 インビトロ授精または子宮内授精のいずれかのためにヒト精子試料を準備する
ために不妊症クリニックで使用される操作には精子を洗浄して精漿、ひいてはそ
のなかのホルモンを除去することを包含している。単独のホルモンンまたは三種
のホルモンン全部を含む混合物をこれらの準備した精子試料に使用前に添加する
ことができる。運動性精子は、適当な培地例えばアール培地（例えば、アール培
地中の９５、７０および５０％ＰｕｒｅＳｐｅｒｍ）で調製した例えばＰｕｒｅ
Ｓｐｅｒｍのような濃厚な材料の不連続勾配の頂部に未洗浄の精液を積層し、５
−１０分間６００ｇで遠心分離し、そして組み合わせたホルモンを含有する新し
い培地中５ｘ１０6精子／ｍｌの濃度にペレット化した細胞を再懸濁することに
より、選択すべきである。
【００３７】 何人かの男性については、調製した精子懸濁液に最終濃度０．１−１００ｎＭ
（好ましくは０．５−１００ｎＭ）となるようにアンギオテンシンＩＩを添加す
ることが勧められる。さらに一般的な使用については、本発明者らは調製した懸
濁液において最終濃度ＦＰＰ１２．５−５００ｎＭ（好ましくは０．５−５００
ｎＭ）またはアデノシン０．５−１００μＭ、サケカルシトニン０．５−１５０
ｎｇ／ｍｌ（好ましくは２−１５０ｎｇ／ｍｌ）またはヒトカルシトニン２−２
０００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは２０−１０００ｎｇ／ｍｌ）およびアンギオテン
シンＩＩ０．１−１００ｎＭ（好ましくは０．５−１００ｎＭ）となるように添
加することを勧めるものである。それで、本発明者らは５％ＣＯ2の雰囲気中３
７℃で最短１−３時間ＦＰＰ／アデノシン＋カルシトニン＋アンギオテンシンＩ
Ｉの存在下に精子懸濁液をインキュベーションし、次に、インビトロ授精または
子宮内授精のために子宮腔中への授精をするときは、卵母細胞と混合することを
勧めるものである。
【００３８】 機能不全精子を有する男性に使用することに加えて、これらの操作はＩＶＦの
ために使用される全ての精子懸濁液のための不妊クリニックに通常使用すること
ができる。ホルモンンハ殆どの精子試料の対して正の効果を有していなければな
らず、そして各試料の授精能獲得、潜在的に授精する精子の数を増加させること
により、インビトロでの授精のための精子をより少ない数で使用することができ
た。これは多精子授精（２又はそれ以上の精子による授精）の発生率を低減する
こととなり、望ましいゴールであろ。それは多精子性胎芽は異常であって、決し
て移動されないものだからである。非配偶者間人工授精に使用する精液試料は使
用前少なくとも六カ月間は隔離して凍結、保存されなければならない。
【００３９】 精子の凍結および解凍は損傷の原因となることがあり、場合によっては、精子
が自発的アクロソーム反応を受ける可能性がより高くなる；これは授精能力を損
なうものである。これらのホルモン（殊に組み合わせでの）の自発的アクロソー
ム反応を阻害する能力は精子をこのような損傷から防護することを可能とする。
これらのホルモンはいずれも精漿中に存在し、それ故凍結されている精子に存在
することとなる。しかしながら、凍結前には、精液を存在するホルモンの濃度を
低下させる凍結保護物質と混合する。凍結および解凍の結果として自発的アクロ
ソーム反応を蒙ることから精子を保護するために、本発明者らはホルモンを凍結
前の新鮮な精液または解凍直後の解凍精液に、授精前に、加えることを勧めるも
のである。本発明者らは精液中での最終濃度が添加ＦＰＰ１２．５ｎＭ−１μＭ
、またはアデノシン０．５−１００μＭ、サケカルシトニン０．５−４００ｎｇ
／ｍｌ、またはヒトカルシトニン２−１０００ｎｇ／ｍｌ、およびアンギオテン
シンＩＩ０．１−１００ｎＭとなるようにホルモンを加えることを勧めるもので
ある。
【００４０】 インビボでの使用 雌の生殖路に入った時点で精子に利用可能なこれらのホルモンの濃度を増加さ
せるために、ＦＰＰまたはアデノシン、カルシトニンおよびアンギオテンシンＩ
Ｉの混合物を含むクリーム、ゼリーまたはペッサリーを使用することができる。
射精された精子と相互作用をするのに十分なホルモンが存在するのを確実にする
ために、使用されたホルモンの濃度は好ましくはインビトロで調製した精子に加
えるのに使用した濃度よりも高くすべきである。本発明者らは次のホルモン濃度
を含む製剤の使用を勧めるものである：ＦＰＰ１００ｎＭ−１００μＭ、または
アデノシン１０μＭ−１０ｍＭ、サケカルシトニン５ｎｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌ
、またはヒトカルシトニン２００ｎｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌ、およびアンギオテ
ンシンＩＩ１ｎＭ−１μＭ。
【００４１】農業での適用 本発明は家畜での精子の授精能力を刺激するのにも適用できる。多くの農業上
重要な種（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ）で、新鮮なまたは凍結／解凍精液試料
を使用する人工授精を妊娠確立のために使用する。これは、これらの系統に導入
される特異的な遺伝的に定められた形質を有することが農家にとって商業上有利
であるコントロール繁殖プログラムに特に重要である。ＦＰＰ，アデノシン、カ
ルシトニンおよびアンギオテンシンＩＩはマウス精子での授精能力を刺激するの
で、これらの種々の動物からの精子に対して同様な刺激効果が予想される。これ
を支持するものとして、近年の研究ではＦＰＰおよびアデノシンが雄ブタ精子に
対して、授精能獲得の刺激および自発的アクロソーム喪失に対する二相の効果を
有することが実証されている（Ｆｕｎａｈａｓｉら、２０００年）。精子をこれ
らのホルモンで処理することでは、特に凍結／解凍精液を使用している場合、妊
娠率を改善することが企図されている。
【００４２】 哺乳動物の精液は往々にして凍結および解凍により損傷され、そしてこれによ
り授精能が低下することになる。生存精子の性能を改善することにより、授精に
使用される精子製剤に添加されるＦＰＰまたはアデノシン、カルシトニンおよび
アンギオテンシンＩＩを含む混合物発情周期当たりより高い妊娠率を促進すべき
であり、受胎を確実にするのに必要な周期の数を減少させ、ひいては人工授精の
総コストを低減させている。同時に、非常に望ましい形質を持つ動物からの精液
を使用してより多くの雌に授精能を獲得させることができる。それは、いずれか
一匹の雌での受胎を確実にするのに周期をより少なく必要とするからである。本
発明者らは凍結前にまたは解凍後で授精前に精液試料にホルモンを以下の最終濃
度となるように加えることを勧めるものである：添加ＦＰＰ１２．５ｎＭ−１μ
Ｍ（好ましくは、５０ｎＭ−１μＭ）またはアデノシン０．５−１００μＭ、サ
ケカルシトニン０．５−４００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは２−４００ｎｇ／ｍｌ）
またはブタカルシトニン２−１０００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは２０−１０００ｎ
ｇ／ｍｌ）、およびアンギオテンシンＩＩ０．１−１００ｎＭ（好ましくは０．
５−１００ｎＭ）。
【００４３】 アンギオテンシンＩＩ単独を使用するいずれの哺乳動物適用のために、本発明
者らは１ｎＭ−１μＭアンギオテンシンＩＩを含む組成物または０．５−１００
ｎＭアンギオテンシンＩＩを含む精子製剤を勧めるものである。
【００４４】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウス精子に対する１ｎＭおよび１０ｎＭ両方でのアンギオテンシンＩＩの刺
激効果を示す。
【図２】 授精能を獲得したマウス精子での高濃度および低濃度両方での組み合わせで使
用するカルシトニンおよびアンギオテンシンＩＩの効果を示す。
【図３】 個別に使用すると顕著な応答を生じないＦＰＰの低濃度と組み合わせて使用す
る低濃度のカルシトニンおよびアンギオテンシンＩＩの効果を示す。
【図４】 組み合わせて使用する高濃度のＦＰＰ，カルシトニンおよびアンギオテンシン
ＩＩの効果を示す。
【図５】 自発的アクロソーム喪失受精能を獲得しないマウス精子のＦＰＰおよびカルシ
ウムによる阻害が百日咳毒素によって無くなることを示す。アンギオテンシンＩ
Ｉは、ＦＰＰおよびカルシトニンと組み合わせて使用するときは、この阻害を妨
害しない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｐ 15/08 45/00 Ａ６１Ｋ 37/30 Ａ６１Ｐ 15/08 37/24 // Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B065 AA91X AA93X AC20 BA30 CA43 CA44 4C076 AA09 AA16 BB21 BB30 CC17 4C084 AA01 AA02 AA16 BA01 BA08 BA19 DB01 DB31 MA02 MA27 MA28 MA56 NA05 NA14 ZA812 ZC542 4C086 AA01 AA02 EA08 MA02 MA03 MA04 MA05 MA27 MA28 MA56 NA05 NA14 ZA81 ZC54

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （１）カルシトニン、（２）アンギオテンシンＩＩおよび（
    ３）アデノシンレセプター活性のモジュレーターからなる群から選択される二種
    以上の薬剤からなる哺乳動物の精子の授精能獲得を増大させる薬剤。
  2. 【請求項２】 アデノシンレセプター活性のモジュレーターが授精促進ペプ
    チド（ＦＰＰ）またはアデノシン、または特定のアデノシンレセプターアゴニス
    トである請求項１記載の薬剤。
  3. 【請求項３】 アデノシンレセプター活性のモジュレーターがＦＰＰ、アデ
    ノシンまたはＦＰＰとアデノシン（ＦＰＰ／アデノシン）との混合物である請求
    項１記載の薬剤。
  4. 【請求項４】 カルシトニンおよびＦＰＰの二種の薬剤からなる請求項１記
    載の薬剤。
  5. 【請求項５】 カルシトニン、ＦＰＰ（またはＦＰＰ／アデノシン）および
    アンギオテンシンＩＩからなる請求項１記載の薬剤。
  6. 【請求項６】 請求項１−５のいずれか１項記載の二種以上の薬剤を含有す
    る製薬上許容し得る担体からなるヒト不妊症の治療用組成物。
  7. 【請求項７】 ホルモンＦＰＰ（またはＦＰＰ／アデノシン）、カルシトニ
    ンおよびアンギオテンシンＩＩの二種以上を含有する局所適用のための製薬上許
    容し得る担体からなるヒト不妊症の治療用組成物。
  8. 【請求項８】 クリームまたはゼリーまたはペッサリーの形態である請求項
    ７記載の組成物。
  9. 【請求項９】 ＦＰＰ１００ｎＭ−１００μＭまたはアデノシン１０μＭ−
    １０ｍＭ、サケカルシトニン５ｎｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌまたはヒトカルシトニ
    ン２００ｎｇ／ｍｌ−２００μｇ／ｍｌおよびアンギオテンシンＩＩ１ｎＭ−１
    μＭを含有する請求項７または８記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 （１）カルシトニン、（２）アンギオテンシンＩＩおよび
    （３）アデノシンレセプター活性のモジュレーターからなる群から選択される二
    種以上の薬剤を含有する不妊症の治療用精子製剤。
  11. 【請求項１１】 ＦＰＰ２５−５００ｎＭまたはアデノシン０．５−１００
    μＭを含有する請求項１０記載の精子製剤。
  12. 【請求項１２】 サケカルシトニン２−１５０ｎｇ／ｍｌまたはヒトカルシ
    トニン２０−１０００ｎｇを含有する請求項１０または１１記載の精子製剤。
  13. 【請求項１３】 ０．５−１００ｎＭのアンギオテンシンＩＩを含有する請
    求項１０、１１、または１２記載の精子製剤。
  14. 【請求項１４】 請求項１０−１３のいずれか１項に記載された濃度で、前
    記の請求項のいずれか１項に記載された薬剤の二種以上を含有する不妊症の治療
    用精子製剤。
  15. 【請求項１５】 ＦＰＰ１２．５−５００ｎＭまたはアデノシン０．５−１
    ００μＭを含有する請求項１０記載の精子製剤。
  16. 【請求項１６】 サケカルシトニン０．５−１５０ｎｇ／ｍｌまたはヒトカ
    ルシトニン２ｎｇ／ｍｌ−１０００ｎｇ／ｍｌを含有する請求項１０または１５
    記載の精子製剤。
  17. 【請求項１７】 ０．１−１００ｎＭのアンギオテンシンＩＩを含有する請
    求項１０、１５または１６記載の精子製剤。
  18. 【請求項１８】 請求項１５−１７のいずれか１項に記載された濃度で、前
    記の請求項のいずれか１項に記載された薬剤の二種以上を含有する不妊症の治療
    用精子製剤。
  19. 【請求項１９】 ヒト臨床用途用の請求項１０−１８のいずれか１項記載の
    精子製剤。
  20. 【請求項２０】 農業用途用の請求項１０記載の精子製剤。
  21. 【請求項２１】 ＦＰＰ１２．５ｎＭ−１μＭ（好ましくは５０ｎＭ−１μ
    Ｍ）またはアデノシン０．５−１００μＭ、サケカルシトニン０．５−４００ｎ
    ｇ／ｍｌ（好ましくは２−４００ｎｇ／ｍｌ）またはブタカルシトニン２−１０
    ００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは２０−１０００ｎｇ／ｍｌ）およびアンギオテンシ
    ンＩＩ０．１−１００ｎＭ（好ましくは０．５−１００ｎＭ）の添加濃度で含有
    する請求項２０記載の精子製剤。
  22. 【請求項２２】 請求項１０−２１のいずれか１項記載の凍結精子製剤。
  23. 【請求項２３】 解凍後で授精前に添加する請求項１０−２１のいずれか１
    項記載の薬剤を含有する解凍精子製剤。
  24. 【請求項２４】 哺乳動物の精子の授精能力を促進させるための請求項１−
    ２３のいずれか１項記載の併用投薬、組成物または精子製剤の用途。
  25. 【請求項２５】 ホルモンを同時に、引き続いてまたは別個に投与する請求
    項２４記載の用途。
  26. 【請求項２６】 哺乳動物の精子の授精能力を促進させるためＦＰＰ／アデ
    ノシンおよびヒトアンギオテンシンＩＩと合体したヒト、ブタまたはサケカルシ
    トニンの用途。
  27. 【請求項２７】 同時に、引き続いてまたは別個に投与する請求項１−５の
    いずれか１項記載の薬剤の二種以上を投与することを特徴とする哺乳動物の授精
    を促進する方法。
  28. 【請求項２８】 授精の促進を必要とする哺乳動物に、ホルモンＦＰＰ／ア
    デノシン、カルシトニンおよびアンギオテンシンＩＩの二種または三種を投与す
    ることを特徴とする哺乳動物の授精を促進する方法。
  29. 【請求項２９】 使用する前の精子に、ホルモンカルシトニン、ＦＰＰ（ま
    たはＦＰＰ／アデノシン）およびアンギオテンシンＩＩの二種または三種を添加
    することを特徴とするインビトロ授精または人工授精を改良する方法。
  30. 【請求項３０】 哺乳動物の精子の授精能獲得を刺激するための医薬を調製
    するためのアンギオテンシンＩＩの用途。
  31. 【請求項３１】 精子製剤にアンギオテンシンＩＩを添加するかまたはアン
    ギオテンシンＩＩを精子の授精能獲得を刺激する必要のある患者または女性生殖
    路に投与することを特徴とする精子の授精能獲得を刺激する方法。
  32. 【請求項３２】 アンギオテンシンＩＩからなる精子の授精能獲得を刺激す
    るための組成物。
  33. 【請求項３３】 １ｎＭ−１μＭアンギオテンシンＩＩを含有するか、また
    は０．５−１００ｎＭアンギオテンシンＩＩを含有する精子製剤である請求項３
    ２記載の組成物。
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