CS271593B1 - Method of mammals' embryos cryopreservation - Google Patents
Method of mammals' embryos cryopreservation Download PDFInfo
- Publication number
- CS271593B1 CS271593B1 CS885758A CS575888A CS271593B1 CS 271593 B1 CS271593 B1 CS 271593B1 CS 885758 A CS885758 A CS 885758A CS 575888 A CS575888 A CS 575888A CS 271593 B1 CS271593 B1 CS 271593B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- embryos
- medium
- liquid nitrogen
- vitrification
- cryopreservation
- Prior art date
Links
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 title claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title abstract description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 claims abstract description 24
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 14
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 12
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 abstract 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 abstract 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 41
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 15
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 12
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 12
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 11
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241001414983 Trichoptera Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu kryokonzervace embryí savců a různých produktů mikrochirurgických a genetických manipulací (PMGM) na embryích jejich přímým nakapáním do kapalného dusíku.
Techniky v oblasti řízené reprodukce a experimentální embryologie umožňují získávat preimplantační embrya od všech běžně využívaných laboratorních a hospodářsky významných* savců, řady zoofonních eavců a člověka a současně řeší práci se získanými embryi mimo mateřský organismus (např. izolaci z výplachu, selekci různého typu, mikrochirurgické a genetické zásahy do embryí na buněčné (subbuněčné) genové úrovni a jiné) se zachováním možnosti přenést tato embrya do vhodných příjemců, a umožnit tak dokončení započatého vývoje. Řízené hormonální stimulace ovariálních cyklů umožňují získávat 2 až 20krát více embryí než ve spontánních cyklech, což umožňuje rozsáhlejší využití genetického a reprodukčního potenciálu vybraných samic. Zcela nové možnosti pro celou uvedenou oblast představuje úspěšné zmrazení a uložení intaktních nebo geneticky manipulovaných savčích embryí v bankách. Reverzibilní zastavení vývoje představuje jedinečné možnosti nejen pro základní a aplikovaný výzkum, ale nachází rozsáhlé uplatnění v zemědělské praxi, jako jsou např. banky genofondu, efektivní využití vybraných zvířat, transport zmrazených embryí místo živých zvířat, řízené zásahy do genetické výbavy jedinců.
Techniky umožňující úspěšnou kryokonzervaci embryí se značně liší v principech i v jednotlivých částech vlastních technik: tj. v přípravě embryí před zmrazením, v cyklu zmrazení - uchování - rozmražení a ve způsobu ošetření embryí po rozmražení (Heytnan et al., Contracept-Fertil-Sex 15: 579, 1987; Kaseip et al., Ann Med. Vet 131: 515, 1987; Mobraaten, J In Vitro Fert Emryo Transfer 3: 28, 1986; Petters et al., Theriogenology 27: 507, 1987; Prather et al., Theriogenology 28: 195, 1987; Rall et al., J Reprod Fertil 70: 293, 1984; SchieWe et al., Cryobiology 24: 238, 1987; Takeda et al., Theriogenology 27: 285, 1987; Trounson et al., Fertil Steril 48: 843, 1987; Yoahiki et al., Exp Anim (Tokyo) 36: 379, 1987). NejrozSířenější jsou techniky založené na částečné dehydrataci embryí pomocí pomalého zmrazování rychlostí 0,2 až 0,5 °C za minutu, při indukci tvorby ledu v extracelulárním médiu v teplotě kolem -7 °C do teplot nižších než -25 °C, nejčastěji -30 až -40 °C, přenesení embryí z těchto teplot do kapalného dusíku a jejich uchování v tomto prostředí a na rychlém rozmražení 200 až 2 000 °C za minutu, které zabraňuje rekrystalizaci intraceluldrně zmrzlé vody a tím i zničení nebo poškození embryí. Příprava embryí ke zmrazení je založená na jedno nebo vícestupňovém, nejčastěji 2 až 3 stupňovém přidání kryoprotektivní látky, např. dimethylsulfoxid, glycerol, propandiol, do zmrazovacího média a ekvilibraci embryí ve finální koncentraci kryoprotektiva, nejčastěji 1 až 2 molární po dobu 10 až 20 minut. Ošetření po rozmražení je založeno na postupném snížení koncentrace kryoprotektiva nejčastěji ve 2 až 6 krocích, v rozmezí 10 až 15 minut; v poslední době je úspěšně využíváno jednostupňové vymytí kryoprotektiv přenesením embryí do roztoku 0,5 až 1,5 M sacharozy po dobu 10 až 20 minut před promytím v manipulačním médiu. Ve všech používaných postupech jsou embrya zmrazována v různých typech obalů, např. plastikové dutinky různých typů, nádobky pro konzervaci buněk a tkání v kapalném dusíku, skleněné dutinky a atnpule.
Zásadní nevýhodou uvedených technik je nutnost používat nákladná programovatelná zařízení. Mezi další nevýhody patří časová náročnost např. příprava a zmrazení trvá 1 až 3 hodiny, pracnost podmíněná mnohonásobnou manipulaci 8 embryi, prodloužený pobyt embryí v nepříznivých podmínkách a nutnost dovážet vhodné obaly ke zmrazování. Uvedené techniky nezaručují vyšěí než 80 % viabilitu rozmražených embryí.
V posledních letech se rozvíjejí kryokonzervační techniky založené na přímém ponoření obalů obsahujících embrya, např. různé typy dutinek z plastu, do kapalného duCS 271593 Bl siku (Bielanski, Cryo-Lettere 8: 293, 1987; Friedler et al. Fertil Steril 48: 306, 1987; Hsu et al. Jpn J Anim Reprod 32: 106, 1986; Massip et al. Cryo-Letters 7: 270, 1986; Massip et al. Theriogenology 27: 69, 1987; Miyamoto and iBhibashi, J Reprod Fertil 78; 471, 1986; Rall Cryobiology 23: 548, 1986; Rall and Fahy, Nátuře 313: 575, 1985; Scheffen et al, Cryo-Lettera 7; 260, 1986; Szell and Schelton, J Reprod Fertil 78: 699, 1986). Při použití těchto technik je předpokladem úspěšné kryokonzervacc vysoký stupeň dehydratace embryí již před začátkem zmruzování. Potřebného stupně dehydratace je dosahováno především převedením embryí do zařazovacích vitrifikačních médií s vysokou koncentrací jedné kryoprotektivní látky, např. 30 až 50 % roztoku glycerolu nebo 30 až 40 % roztoku dimethylsulfoxidu, nebo několika kryoprotektivních látek, např. 25 % roztok glycerolu a 25 % roztok propandiolu nebo 20 % roztok dimethylsulfoxidu, 15 % roztok acetamidu, 10 % roztok propylenglykolu a 6 % polyethylenglykolu. Vitrifikační média odnímají embryím vodu a zabraňují tvorbě intracelulárního ledu. Embrya zmrazená vitrifikačními technikami vyžadují rozmražení rychlostí 500 až 2000 °C za minutu. Příprava embryí před zmrazením probíhá při teplotě kolem 0 °C a představuje jedno nebo dvoustupňové přidání kryoprotektivních látek. Po rozmražení jsou kryoprotektivní látky odstraňovány jedno- nebo dvoustpňovým použitím manipulačního média s 0,5 až 1,0 M roztokem sacharózy. Ve většině případů byla embrya zmrazována v plastikových dutinkách o obsahu 0,25 ml, které jsou ve většině států používány ke zařazování ineeminačních dávek u skotu. Dutinky jsou plněny tak, že kapka vitrifikačního média s embryi je od vymývacího média se sacharozou oddělena vzduchovou bublinkou. Po rozmražení je nutné obě média protřepáním spojit & umožnit tak vymytí kryoprotektiv. Přes značné zjednodušení zůstává použití této techniky omezeno na dvoubuněčná a osmibuněčná embrya, moruly a blastocysty myší a na moruly skotu. Viabilita rozmražených embryí myší se pohybuje v rozmezí 70 až 80 % a viabilita embryí skotu nepřesahuje 50 %.
Nevýhodou dosavadních vitrifikáČních technik je toxicita používaných vitrifikačních médií vyžadující přidávání kryoprotektiv při teplotách kolem 0 °C, realtivně nízká viabilita embryí po rozmražení, možnost úspěšného použití pouze u některých vývojových stádií a druhů, např. myší, skotu a používání dovážených dutinek a jejich komplikované plnění.
Nevýhody dosud používaných technik kryokonzervace odstraňuje způsob kryokonzervace podle vynálezu spočívající v tom, že embrya a produkty mikromanipulací a genetických manipulací se z manipulačního média nejméně na 2 minuty přenesou do ekvilibračního média, obsahujícího 5 až 30 % obj. glycerolu, z tohoto média se přenesou na 15 až 60 sekund do vitrifikačního média, potom se β 5 až 20 ^ul vitrifikačního média nasají do kalibrované kapiláry pro manipulaci s embryi, nakápnou do nádoby naplněné kapalným dusíkem a v transparentních kapkách vzniklých tímto způsobem jsou embrya a produkty mikromanipulací a genetických manipulací uchovávány v kapalném dusíku, ze kterého se před použitím kapky vyjmou a přenesou do vymývacího média obsahujícího 0,2 až 1,0 M roztok sacharózy, načež po roztátí kapek se embrya a produkty mikromanipulací a genetických manipulací přenesou na 3 až 10 minut do čerstvé kapky stejného média, potom se propláchnou v médiu bez sacharózy a připraví к dalšímu použití.
Produkty mikromanipulací a genetických manipulací (dále jen PMGM) jsou nakapány v mikrokapkách nejlépe 5 až 20 yul vitrifikačního média přímo do kapalného dusíku. Postup zmrazování je následující:
1) intaktní embrya a R4GM jsou z manipulačního média přenesena na 2 až 10 minut do kapky ekvilibraČního média s obsahem 5 až 30 nejlépe 10 % obj. glycerolu. Jako manipulační a ekvilibrační médium může být použito jakékoliv médium běžně používané pro práci se savčími embryi.
CS 271593 Bl
Doba pobytu v ekvilibračním médiu by neměla být kratší než 2 minuty t prodloužený pobyt v ekvilibračním médiu do 30 minut nemá vliv na výsledky zmrazování.
2) V minimálním množství ekvilibračního média jsou embrya a PMGM přenesena na 15 až 60 sekund do kapky vitrifikačního média připraveného z 15 až 35, nejlépa 30 % obj. glycerolu, 25 až 60 %, nejlépe 50 % obj. 2 M roztoku sacharozy v redestilované vodě a až do 40 %, nejlépe 20 % obj. krevního séra, s výhodou telecího či hovězího. Patnáctisekundový pobyt ve vitrifikačním médiu zajišťuje dostatečnou dehydrataci umožňující úspěšné zmrazení. Delší pobyt ve vitrifikačním médiu než 2 minuty tnůže negativně ovlivnit výsledek zmrazování.
3) Do kalibrované kapiláry je nataženo poloviční množství, tj. 5 až 20 ^ul vitrifikačního média a druhá polovina je natažena do kapiláry epolu ee zmrazovanýtni embryi. Médium z kapiláry je nakápnuto z výšky nejlépe 5 až 7 cm dc Petriho miaky o průměru 60 mm nebo jiné vhodné nádoby naplněné kapalným dusíkem. Manipulační kapiláry lze vytáhnout ze skleněných trubiček o průměru 1 mm a opatřit je tlačkumi z plastikových hadiček odpovídajících rozměrů. Kapiláry jsou kalibrovány tak, aby po vytlačení média z kapiláry došlo к oddělení kapky bez zbytku média v kapiláře a bez kóntaminace kapky vzduchovými bublinkami. Nejvýhodnější se ukázaly kapky o objemu 10 /Ul.
4) Takto vzniklé transparentní kapky obsahující embrya jsou pomocí pinzety zchlazené v kapalném dusíku přeneseny do označených nádob, ve kterých jsou uchovávány. Během uchovávání a jakékoliv manipulace jsou kapky udržovány v kapalném dusíku.
5) Kapky určené к rozmražení jsou zchlazenou pinzetou vyjmuty z kapalného dusíku a vloženy do vymývacího média s obsahem 0,2 až 1,0 nejlépe 0,5 M roztoku sacharozy. Po rozehřátí kapky jsou embrya přenesena do nové kapky média se stejnou koncentrací sacharozy a po 3 až 10 minutách jsou embrya nebo B4GM přenesena do média bez sacharozy, promyta a připravena к dalšímu použití, např. pro přenos do recipientu, kultivace in vitro atd. Příprava embryí a PMGM před zmrazováním a vymytí kryoprotektiv po rozmražení probíhalo při teplotě 20 °C.
Způsob kryokonzervace podle vynálezu je ze všech používaných způsobů kryokonzervace nejrychlejší, nejjednoduší a ekonomicky nejvýhodnější. Další zjednodušení uvedeného kryokonzervačního postupu mohou být pouze nevýznamného charakteru, bez většího praktického významu. Uvedený způsob kryokonzervace umožňuje opakovaně dosahovat 90 % a vyšší životaschopnosti embryí a TMGM po ukončení uchovávání v kapalném dusíku, což představuje maximální hranici v oblasti kryokonzervace. Použitelnost uvedeného kryokonzervačního způsobu pro embrya různých druhů bhvců, pro různá vývojová stadia, pro intaktní embrya i embrya zbavené ochranných obalů, tzv. zóny pellucidy, pro produkty různých typů mikrochirurgických a genetických manipulací a pro různé typy embryonálních buněk dokumentuje univerzálnost navrženého způsobu kry ок onzervac e.
Použití tohoto způsobu je doloženo následujícími příklady.
Příklad 1
Z 200 osmibuněčných embryí získaných od hybridních myší a kryokonzervováných přímým nakapáním do kapalného duaíku po 2 až 3 minutách v ekvilibračním médiu ve skupinách po 3 až 5, ve vitrifikačním médiu o složení 30 % obj. glycerolu, 50 % obj. 2 M roztoku sacharozy v redestilované vodě a 20 % obj. hovězího krevního séra, bylo po rozmražení získáno 194 (97 %) životaschopných embryí. Dosažené výsledky charakterizované vysokou opakovatelností a úrovní přežívání představují maximum dosažitelné při konzervaci embrií dokumentují vhodnost použitého kryokonzervačního způsobu a délky pobytu v ekvilibračním médiu.
CS 271593 Bl
Příklad 2
Z 300 osmi až šestináctibuněčných embryí získaných od šesti vybraných inbredních myších kmenů a kryokonzervovaných po 10 minutách v ekvilibračním médiu přímým nakapáním do kapalného dusíku ve skupinách po 3 až 5> ve vitrifikačním médiu uvedeném v příkladu 1, bylo po rozmražení získáno 282 (94 %) životaschopných embryí. Dosažené vysoká opakovatelnost a maximální úroveň přežívání embryí dokumentují použitelnost způsobu kryokonzervace podle vynálezu, používajícího prodloužený pobyt v ekvilibračním médiu pro geneticky různorodá embrya.
Příklad 3
Ze 100 osmibuněčných embryí zbavených nebuněčných obalů a kryokonzervovaných přímým nakapáním do kapalného dusíku po 30 sekundách ve vitrifikačním médiu, uvedeném v příkladu 1, bylo po rozmražení získáno 93 (93 %) intaktních a životaschopných embryí. Výsledky dokumentují možnost kryokonzervace embryí a produktů manipulací zbavených nebuněčných obalů způsobem podle vynálezu při využití zkráceného pobytu ve vitrifikačním médiu, přičemž viabilita vysoko přesahuje všechny dosud dosahované výsledky kryokonzervace embryí bez nebuněčných obalů.
Příklad 4
Viabilita myších čtyř a SeetináctibunČčných embryí, morul a blastocyst kryokonzervovaných přímým nakapáním do kapalného dusíku, ve vitrifikačním médiu obsahujícím 20. % obj. glycerolu, 76 % obj. 2 M roztoku sacharozy v redestilované vodě a 4 % obj. telecího krevního séra, dosahovala po rozmražení a vymytí v médiu s 1,0 M roztokem sacharozy 90 až 94 Výsledky dokumentují účinnost kryokonzervačního způsobu podle vynálezu, včetně možnosti využití vyšší koncentrace sacharozy při vymývání kryoprotektivní látky pro kryokonzervaci různých vývojových stádií.
Příklad 5
Embrya myší vystavená různým typům manipulací - mikrochirurgické enukleaci, elektrofuzi blastomer embryí, mikroinjekcím do cytoplasty nebo játra, reagregaci na blastomer při konstrukci chimér a pertenogenetické aktivaci a kryokonzervována přímým nakapáním v 10 ^ul kapkách do kapalného dusíku po 2 až 3 minutách v ekvilibračním médiu a po 60 sekundách ve vitrifikačním médiu, uvedeném v příkladu 1, byla po rozmražení životaschopná a viabilita takto ošetřených a kryokonzervovaných embryí se pohybovala mezi 70 až 90 %. Výsledky dokumentují použitelnost způsobu kryokonzervace podle vynálezu pro různé typy mikrochirurgicky a geneticky manipulovaných embryí.
Příklad 6
Embrya krys ve stadiu Čtyř a šestnáctibuněk a blastocysty a embrya skotu ve stádiu moruly a blastocysty kryokonzervovaná přímým ponořením do kapalného dusíku po 10 minutách v ekvilibračním médiu, uvedeném v příkladu 1 ve skupinách 1 až 2, byla po rozmražení životaschopná. Viabilita embryí krys dosahovala 70 až 90 % a embryí skotu 75 až 85 %. Výsledky dokumentují možnost použití způsobu kryokonzervace podle vynálezu pro různá vývojová stadia embryí různých druhů savců.
Claims (2)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU1· Způsob kryokonzervace embryí savců, vyznačující se tím, že embrya a produkty mikromanipulaoí a genetických manipulací se z manipulačního média nejméně na 2 minuty přenesou do ekvilibračního média obsahujícího 5 až 3 % obj· glycerolu, z tohoto média se přenesou na 15 až 60 sekund do vitrifikačního média, potom se в 5 až 20 /U1 vitrifikačního média nasají do kalibrované kapiláry pro manipulaci s embryi, nakápnou do nádoby naplněné kapalným dusíkem a v transparentních kapkách vzniklých tímto způsobem jsou embrya a produkty mikromanipulací a genetických manipulací uchovávány v kapalném dusíku, ze kterého se před použitím kapky vyjmou a přenesou do vymývacího média, obsahujícího 0,2 až 1,0 M roztok saoharózy, načež po roztátí kapek se embrya a produkty mikromanipulací a genetických manipulací přenesou na 3 až 10 minut do čerstvé kapky stejného média, načež se propláchnou v médiu bez saoharózy a připraví se к dalšímu použití·
- 2» Způsob kryokonzervace podle bodu 1, vyznačující se tím, že vitrifikační médium obsahuje 15 až 35 % obj· glycerolu, 25 až 80 % obj· 2 M roztoku sacharózy v redestilované vodě a až do 40 4 obj· krevního séra, např· telecího či hovězího·
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS885758A CS271593B1 (en) | 1988-08-24 | 1988-08-24 | Method of mammals' embryos cryopreservation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS885758A CS271593B1 (en) | 1988-08-24 | 1988-08-24 | Method of mammals' embryos cryopreservation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS575888A1 CS575888A1 (en) | 1989-11-14 |
| CS271593B1 true CS271593B1 (en) | 1990-10-12 |
Family
ID=5403088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS885758A CS271593B1 (en) | 1988-08-24 | 1988-08-24 | Method of mammals' embryos cryopreservation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS271593B1 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ308176B6 (cs) * | 2014-04-04 | 2020-02-05 | VÝZKUMNÝ ÚSTAV VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ, v.v.i. | Malokapacitní systém pro kryokonzervaci semene v parách tekutého dusíku |
-
1988
- 1988-08-24 CS CS885758A patent/CS271593B1/cs unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ308176B6 (cs) * | 2014-04-04 | 2020-02-05 | VÝZKUMNÝ ÚSTAV VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ, v.v.i. | Malokapacitní systém pro kryokonzervaci semene v parách tekutého dusíku |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS575888A1 (en) | 1989-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Otoi et al. | Cryopreservation of mature bovine oocytes by vitrification in straws | |
| US20240397936A1 (en) | High subzero cryopreservation | |
| Orief et al. | Vitrification: will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques? | |
| US6982172B2 (en) | Oocyte vitrification technique | |
| Maehara et al. | Hollow fiber vitrification provides a novel method for cryopreserving in vitro maturation/fertilization-derived porcine embryos | |
| CA2808101C (en) | Method of liquid nitrogen surface vitrification | |
| JP2013528435A (ja) | 凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作する装置およびこうした装置の使用 | |
| AU750589B2 (en) | Method and apparatus for cryopreservation | |
| US20150313211A1 (en) | A Method of Vitrification | |
| Im et al. | Effects of cumulus cells, different cryoprotectants, various maturation stages and preincubation before insemination on developmental capacity of frozen-thawed bovine oocytes | |
| Bhat et al. | Open pulled straw vitrification and slow freezing of sheep IVF embryos using different cryoprotectants | |
| Cho et al. | Improvement in post-thaw viability of in vitro-produced bovine blastocysts vitrified by glass micropipette (GMP) | |
| Yang et al. | Development of vitrified–thawed bovine oocytes after in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer | |
| CS271593B1 (en) | Method of mammals' embryos cryopreservation | |
| Fuller et al. | Cryopreservation of mammalian embryos | |
| RU141452U1 (ru) | Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих | |
| JP2001226201A (ja) | 哺乳動物の凍結前胞状卵胞及び哺乳動物前胞状卵胞の凍結保存法 | |
| RU2707252C1 (ru) | Способ заморозки ооцитов крупного рогатого скота | |
| Vanderzwalmen et al. | 10A. One decade of experience with vitrification of human embryos in straws, hemi-straws, and high security vitrification straws | |
| Arav et al. | Preservation of gametes and embryos | |
| Kim et al. | Comparative study on the viability of frozen-thawed primordial germ cells using vitrification in chicken breed | |
| Liebermann et al. | 37 Post-compaction Embryos for IVF | |
| Bentov | History of Cryopreservation | |
| JPH03232441A (ja) | 受胎率を上げた凍結受精卵およびその調製法 | |
| JP3598368B2 (ja) | 胚のガラス化保存用液体組成物及びそれを用いた胚の超低温保存方法 |