CS271590B1

CS271590B1 - Carrier for affine chromatography and method of its preparation

Info

Publication number: CS271590B1
Application number: CS882319A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Rndr Drsc Franek; Galina Kandidat Chem Ve Cimova; Vladmir Prof Ing Csc Kubanek; Budimir Doc Ing Csc Veruovic
Original assignee: Frantisek Rndr Drsc Franek; Galina Kandidat Chem Ve Cimova; Vladmir Prof Ing Csc Kubanek; Veruovic Budimir
Priority date: 1988-04-06
Filing date: 1988-04-06
Publication date: 1990-10-12
Also published as: CS231988A1

Abstract

Support for affinity chromatography contains porous particles of organic polymers with mean diameter ranging from 0.01 to 5 mm, specific surface 1 to 700 m<2> and porosity 0.01 to 2.7 ml/g, to which a protein is attached in a weight ratio of 1,000:5 to 100. The preparation method consists of the fact that a powder porous polymer is activated by water solution of glutaraldehyde in a concentration of 1 to 20% weight and pH 3 to 10 and, after removal of redundant glutaraldehyde, it is left to react with a water solution of protein in a concentration of 0.2 to 20% weight and pH 3 to 10. The non-attached protein is removed and the support prepared in this manner is suspended in a water solution of glutaraldehyde in a concentration of 0.01 to 2% weight and pH 3 to 10. Then, the solution of glutaraldehyde is removed and the support is washed by a water solution of inorganic salts. The support can also be prepared in the following way: the activated powder porous polymer is left to react with a water solution of protein in a concentration of 0.2 to 20 % weight and pH 3 to 10 and simultaneously glutaraldehyde is added into the final concentration of 0.01 to 2% weight.

Description

Vynález ee týká nosiče pro afinitní chromatografli a způsobu jeho přípravy. Afinitu! chromatografie je rozdělovači proces, který využívá specifických vazebných míst látek imobilizováných na nosiči představujícím pevnou fázi к oddělení látky, která 8 vazebnými místy interaguje, od směsi jiných látek. Látka nebo složitější částice imobilizovaná na nosiči se nazývá ligand. Ligand určuje specifičnost a selektivitu rozdělovacího procesu. Nosič musí být chemicky i fyzikálně inertní.The invention relates to a carrier for affinity chromatography and to a process for its preparation. Affinity! chromatography is a partitioning process that utilizes specific binding sites of substances immobilized on a solid phase support to separate a substance that interacts with 8 binding sites from a mixture of other substances. A substance or a more complex particle immobilized on a carrier is called a ligand. The ligand determines the specificity and selectivity of the distribution process. The carrier must be chemically and physically inert.

Afinitní chromatografií se dosahuje rychlého a účinného čištění látek nejrůznějSí chemické povahy, hlavně látek rozpustných ve vodě, obsažených v komplexních materiálech původu rostlinného, živočišného nebo mikrobiálního, případně v surových produktech syntetických. Proces afinitní adsorpce se může uskutečnit buň umístěním nosiče 8 ligandem do sloupce, jímž dělená směs protéká, nebo způsobem vsádkovým.Affinity chromatography provides rapid and efficient purification of substances of various chemical nature, in particular water-soluble substances, contained in complex materials of plant, animal or microbial origin, or in crude synthetic products. The affinity adsorption process can be performed by the cell by placing the carrier 8 with the ligand in a column through which the split mixture flows, or in a batch manner.

Kromě účelů preparativních lze nosiče s navázanými ligandy používat též v metodách analytických. Afinitní adsorpce dodává analytické metodě vysokou selektivitu. Analytické metody založené na adsorpci některé z reagencií na pevný nosič se široce využívají zejména v imunoanalýze.In addition to preparative purposes, ligand-linked carriers can also be used in analytical methods. Affinity adsorption imparts high selectivity to the analytical method. Analytical methods based on adsorption of some of the reagents to a solid support are widely used, especially in immunoassays.

Základem pevné fáze pro proces afinitní chromatografie je nosič. Nosič může být granulovaný, v jiných případech mohou jako nosič posloužit materiály vláknité nebo stěny kapilární trubice. V analytických metodách Často slouží jako nosič stěny nádobky, v níž stanovení probíhá. Ligandy se na nosiče navazují převážně chemickými vazbami, někdy však dostačuje i vazba fyzikální. Ligandý se mohou na nosič navazovat bu5 přímo, nebo prostřednictvím oddělovacího členu. Oddělovací člen je látka, většinou ní zkomolekulární se dvěma nebo více funkčními skupinami, která umožňuje flexibilní připojení ligandu na nosič. Vazebná místa ligandu jsou v uspořádání s oddělovacím členem lépe stericky přístupná a kapacita nosiče s takto navázaným ligandem je zpravidla vyšší než kapacita nosiče s ligandem vázaným přímo.The solid phase base for the affinity chromatography process is a carrier. The carrier may be granulated, in other cases fibrous or capillary tube walls may serve as the carrier. In analytical methods, it often serves as a support for the wall of the container in which the assay takes place. Ligands are bound to the carriers mainly by chemical bonds, but sometimes physical bonds are also sufficient. The ligands may be coupled to the carrier either directly or via a spacer. The spacer is a substance, usually a molecular one with two or more functional groups, that allows flexible attachment of the ligand to the support. The ligand binding sites are more sterically accessible in a spacer arrangement, and the capacity of the carrier with the ligand so bonded is generally higher than the capacity of the carrier with the ligand bound directly.

Z přírodních materiálů se jako nosiče pro afinitní chromatografii používá celulóza, škrob, sírovaný dextran, agarosa, alginát nebo šíbované bílkoviny. Z organických syntetických polymerů se používají nosiče na bázi polyamidů, šíbovaného polyakrylamidu, polyesterů nebo fenolformaldehydové pryskyřice. Jako nosič anorganické povahy ee používají oxidy kovů nebo silikátové materiály, jako je sklo a podobně.Of the natural materials, cellulose, starch, sulfur-containing dextran, agarose, alginate, or scattered proteins are used as carriers for affinity chromatography. Of the organic synthetic polymers, carriers based on polyamides, grafted polyacrylamide, polyesters or phenol-formaldehyde resin are used. As an inorganic carrier, metal oxides or silicate materials such as glass and the like are used.

Pokud jsou nosiče gelové povahy, nevykazují dostatečnou pevnost při manipulaci, rozpadají se při intezívním míchání suspenze a uspávají filtry při filtraci. Syntetické polymery, nerozpustné přírodní pólysacharidy, např. celulóza, nebo anorganické materiály mají tu výhodu, že jsou mechanicky odolné a objemově stálé. Jejich nedostatkem je však schopnost vytvářet fyzikální vazby θ látkami v okolním roztoku. Vzhledem к této okolnosti je proces afinitní chromatografie rušen současně probíhající nespecifickou adsorpci mnohých látek, což má za důsledek, že afinitní proces je málo účinný. Další nevýhoda syntetických polymerních nosičů spočívá v tom, Že se obtížně smáčejí vodou.If the carriers are gel-like, they do not exhibit sufficient handling strength, disintegrate upon intensive mixing of the suspension, and suspend the filters during filtration. Synthetic polymers, insoluble natural polysaccharides such as cellulose, or inorganic materials have the advantage of being mechanically resistant and volume stable. However, their drawback is the ability to form θ physical bonds by substances in the surrounding solution. Due to this circumstance, the affinity chromatography process is disturbed by the simultaneous non-specific adsorption of many substances, which results in the affinity process being poorly effective. Another disadvantage of synthetic polymeric carriers is that they are difficult to wet with water.

Uvedené nedostatky odstraňuje nosič pro afinitní chromatografií podle vynálezu, který obsahuje porézní částice polymerů o středním průměru 0,01 až 5 mm, měrném povrchu 1 až 700 m²/g a porozitě 0,01 až 2,7 ml/g, na něž je navázána bílkovina v hmotnostním poměru 1 000 : 5 až 100. Nosič obsahuje porézní částice polymerů na bázi polyethylentereftalátu, póly/2,6-dimethy1/fenylenoxidu, poly-6-kaprolaktamu, blokového kopolymeru polykaprolaktamu a polyethylenoxidu nebo polykondenzátů formaldehydu s melaminem nebo močovinou a bílkovinu na bázi kaseinu, sérového· albuminu nebo imunoglobulinu G. .These drawbacks are overcome by the affinity chromatography carrier according to the invention, which contains porous polymer particles having a mean diameter of 0.01 to 5 mm, a specific surface area of 1 to 700 m ² / g and a porosity of 0.01 to 2.7 ml / g to which it is bound. The protein comprises porous particles of polymers based on polyethylene terephthalate, poly (2,6-dimethyl) phenylene oxide, poly-6-caprolactam, polycaprolactam-polyethylene oxide block copolymer, or polycondensates of formaldehyde with melamine or urea and protein. based on casein, serum albumin or immunoglobulin G.

Způsob přípravy nosiče spočívá v tom, že práškový porézní organický polymer se aktivuje vodným roztokem glutaraldehydu o koncentraci 1 až 20 % hmot, a pH 3 až 10 cs 271590 Bl a po odstranění nadbytečného glutaraldehydu se nechá reagovat s vodným roztokem bílkoviny o koncentraci 0,2 až 20 % hmot, a pH 3 až 10, za současného přidávání vodného roztoku glutaraldehydu až do výsledné koncentrace 0,01 až 2 % hmot., načež se nosič oddělí například filtrací a promyje se vodným roztokem anorganické soli, vodou, popřípadě acetonem. Nosič s navázanou bílkovinou lze dále vystavit působení borohydridu sodného ve vodném roztoku o koncentraci 0,05 až 0,5 % hojot. a pH 8 až 9.The method for preparing the carrier comprises activating the powdered porous organic polymer with an aqueous solution of glutaraldehyde at a concentration of 1 to 20% by weight, and a pH of 3 to 10 en 271590 B1 and reacting with an aqueous protein solution at a concentration of 0.2 up to 20% by weight, and a pH of 3 to 10, while adding an aqueous solution of glutaraldehyde up to a final concentration of 0.01 to 2% by weight, after which the support is separated, for example, by filtration and washed with an aqueous inorganic salt solution, water or acetone. The protein-coupled carrier may further be exposed to sodium borohydride in an aqueous solution at a concentration of 0.05 to 0.5% hoji. and pH 8 to 9.

Předkládaný vynález nosiče pro afinitní chromatografií odstraňuje uvedené nedostatky tím, že polymerní rigidní částice jsou potaženy vrstvou zesilované bílkoviny. Získají ee rigidní částice, jejichž povrch je tvořen bílkovinou a je tudíž zcela kompatibilní s vodným prostředím. Postranní řetězce aminokyselinových zbytků bílkoviny fungují jako oddělovací členy ligandů. Částice se snadno znovu smáčejí vodou po vyeuěení. Souvislá nerozpustná vrstva bílkoviny na povrchu polymerní částice se vytvoří fyzikální nebo chemickou vazbou molekul bílkoviny к povrchu Částice a zesilováním molekul bílkoviny pomocí vhodného bifunkčního činidla, s výhodou glutaraldehydu. Polymerní částice pro přípravu nosičů podle vynálezu jsou polymery v práškové porézní formě vyráběné na bázi polyamidů, polyesterů, pólyéterů nebo polykondenzátů formaldehydu s melaminem nebo močovinou. Tyto polymerní částice jsou ve vodě nerozpustné a mají střední průměr 0,01 až 5 ram. měrný povrch 1 až 700 m /g a porozit 0,01 ažThe present invention of the affinity chromatography support overcomes these drawbacks by coating polymeric rigid particles with a layer of crosslinked protein. They obtain ee rigid particles whose surface is made of protein and is therefore fully compatible with the aqueous environment. The side chains of the amino acid residues of the protein function as spacer members for the ligands. The particles are easily rewetted with water after drying. A continuous, insoluble protein layer on the surface of the polymer particle is formed by physically or chemically binding the protein molecules to the particle surface and crosslinking the protein molecules with a suitable bifunctional agent, preferably glutaraldehyde. The polymeric particles for the preparation of the carriers according to the invention are polymers in powder porous form made on the basis of polyamides, polyesters, polyethers or polycondensates of formaldehyde with melamine or urea. These polymer particles are water insoluble and have an average diameter of 0.01 to 5 µm. specific surface area 1 to 700 m / g and porosity 0.01 to

2,7 ml/g. Polymerní částice pro přípravu nosičů pro afinitní chromatografií podle vynálezu se připravují podle čs· autorských osvědčení 171 917, 202 215 a 203 386. Jako bílkovinný materiál pro vytvoření vrstvy zesilované bílkoviny se používá s výhodou kasein, sérový albumin nebo imunoglobulin G.2.7 ml / g. The polymeric particles for the preparation of the affinity chromatography carriers of the invention are prepared according to US Patent 171 917, 202 215 and 203 386. Casein, serum albumin or immunoglobulin G are preferably used as the proteinaceous material for forming the crosslinked protein layer.

Způsob přípravy nosičů podle vynálezu spočívá v tom, že se na polymerní částice adsorbuje dialdehyd, 8 výhodou glutaraldehyd, ve vodném roztoku. Dialdehyd se přidává v nadbytku, množství adsorbovaného dialdehydu je závislé na typu polymerní Částice, to je na její chemické struktuře a texturních vlastnostech, jakož i na podmínkách adsorpce. V případě, že polymerní částice má funkční skupiny schopné reagovat s aldehydem, probíhá kromě fyzikální adsorpce i chemisorpce. Po odstranění nenavázaného, resp. nenasorbovaného dialdehydu se polymerní Částice aktivované aldehydem uvedou do roztoku bílkoviny, např. kaseinu nebo sérového albuminu, a to s takovým množstvím a za takových podmínek, aby všechny volné aldehydické skupiny zreagovaly 8 aminoskupinami bílkovin· Částice polymeru в navázanou bílkovinou se suspendují v roztoku dialdehydu, čímž dojde к zesíťování molekul bílkoviny dialdehydem a tím к vytvoření souvislé vrstvy bílkoviny pokrývající celý povrch polymerní částice. V mnohých případech je možno navázáni a zesilování bílkoviny na povrchu polymerní částice provést v jedné operaci. Podmínky síťování bílkoviny vázané na polymerní částice, zejména množství dialdehydu, Je nutno volit tak, aby zreagoval jen minimální potřebný počet aminoskupin bílkoviny a zůstaly volné к reakci dostupné aminoskupiny pro následnou vazbu ligandů. Takto připravený nosič pro afinitní chromagografii se dobře smáčí ve vodě i po vysušení. Částice nosiče jsou mechanicky dostatečně pevné pro běžnou i náročnější manipulaci.The process for preparing carriers according to the invention consists in adsorbing dialdehyde, preferably glutaraldehyde, in an aqueous solution onto the polymer particles. The dialdehyde is added in excess, the amount of dialdehyde adsorbed is dependent on the type of polymer particle, i.e. its chemical structure and texture properties, as well as the adsorption conditions. When the polymer particle has functional groups capable of reacting with an aldehyde, chemisorption occurs in addition to physical adsorption. After removing unbound, resp. unabsorbed dialdehyde, the polymeric aldehyde-activated particles are brought into solution of a protein, such as casein or serum albumin, in an amount and under such conditions that all free aldehyde groups are reacted with 8 amino groups of proteins. thereby crosslinking the protein molecules with dialdehyde and thereby forming a continuous layer of protein covering the entire surface of the polymer particle. In many cases, the binding and crosslinking of the protein to the surface of the polymer particle can be performed in one operation. The cross-linking conditions of the protein bound to the polymer particles, in particular the amount of dialdehyde, must be chosen so that only the minimum number of amino groups required for the protein is reacted and the available amino groups remain free to react with subsequent ligands. The affinity chromatography carrier thus prepared is well wetted in water even after drying. The carrier particles are mechanically strong enough for normal and more demanding handling.

Vynález je dále podrobněji vysvětlen v následujících příkladech.The invention is explained in more detail in the following examples.

Příklad 1Example 1

К 1 g práškového polyamidu o velikosti částic 200 až 500 уит a měrném povrchu1 1 g of powdered polyamide with a particle size of 200 to 500 µm and a specific surface area

3,6 m²/g bylo přidáno 10 ml 0,1 mol/1 fosfátového pufru o pH 7,0 a 2,5 ml 25 % vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla ponechána 20 h při teplotě 20 °C. Pak byl polymer oddělen filtrací a suspendován v 20 ml vodného roztoku obsahujícího 0,5 % hmot, kaseinu, 6 mol/1 močovinu a 0,1 mol/1 octanový pufr o pH 4,6. Za stálého míchání byly přidány 2 ml 1 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu a po 30 min. další 2 ml3.6 ml ² / g was added with 10 ml 0.1 mol / l phosphate buffer pH 7.0 and 2.5 ml 25% aqueous glutaraldehyde solution. The suspension was left at 20 ° C for 20 h. The polymer was then separated by filtration and suspended in 20 ml of an aqueous solution containing 0.5% by weight of casein, 6 mol / l urea and 0.1 mol / l acetate buffer, pH 4.6. With stirring, 2 ml of 1 wt.% Aqueous glutaraldehyde solution were added and after 30 min. another 2 ml

CS 271590 Ы .CS 271590

% vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla nepřetržitě míchána 2 hod. Polyamid s navázaným kaseinem byl oddělen filtrací. Ve filtrátu bylo stanoveno množství nenavázaného kaseinu a bylo zjištěno, že na 1 g práškového polyamidu se navázalo 35 mg kaseinu. Po promytí na filtru 0,1 mol/1 borátovým pufrem o pH 8,5 byl nosič suspendován v 25 ml 0,1 mol/1 borátového pufru o pH 8,5 obsahujícího 25 mg borohydridu sodného. Suspenze byla míchána 1 hod. při teplotě 4 °C. Polyamid s navázaným kaseinem byl na filtru promyt postupně vodou, 1 mol/1 roztokem chloridu sodného, vodou a acetonem. Práškový produkt byl sušen při teplotě 20 °C.% aqueous glutaraldehyde solution. The suspension was stirred continuously for 2 hours. The casein-bound polyamide was collected by filtration. The amount of unbound casein was determined in the filtrate and it was found that 35 mg of casein was bound to 1 g of powdered polyamide. After washing on the filter with 0.1 mol / l borate buffer pH 8.5, the support was suspended in 25 ml of 0.1 mol / l borate buffer pH 8.5 containing 25 mg sodium borohydride. The suspension was stirred at 4 ° C for 1 h. Casein-bound polyamide was washed sequentially with water, 1 mol / L sodium chloride solution, water and acetone on the filter. The powdered product was dried at 20 ° C.

Připravený nosič byl použit к izolaci protilátek proti lidskému transferinu ze séra prasat imunizovaných lidských transferinem.The prepared carrier was used to isolate anti-human transferrin antibodies from the serum of pigs immunized with human transferrin.

Nejprve byl proto na připravený nosič kovalentně navázán ligand, tj. v tomto případě lidský transferin. К 1 g nosiče bylo přidáno 8 ml vody a 2,5 ml 25 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Po promíchání byla suspenze ponechána po dobu 6 hod. při teplotě okolí. Nosič byl pak oddělen filtrací na Buchnerově nálevce a promyt 100 ml 0,1 mol/1 octanového pufru o pH 5,θ· К vlhkému nosiči bylo přidáno 50 mg lidfcého transferinu rozpuštěného v 10 ml 0,1 mol/1 octanového pufru o pH 5,0. Suspenze byla třepána 4 hod. Nosič s navázaným transferinem byl oddělen filtrací na Buchnerově nálevce. Ve filtrátu bylo stanoveno množství nenavázaného transferinu a bylo zjištěno, že na 1 g nosiče se navázalo 31 mg lidského transferinu. Aldehydické skupiny, které nereagovaly s aminoskupinami nosiČo ani ligandu, byly blokovány 20ti hodinovou inkubací v 20 ml 0,1 mol/1 fosfátového pufru o pH 7,0 obsahujícího 0,25 mol/1 glycin.First, a ligand, i.e. in this case human transferrin, was covalently bound to the prepared carrier. To 1 g of the carrier, 8 ml of water and 2.5 ml of a 25 wt.% Aqueous solution of glutaraldehyde were added. After stirring, the suspension was left for 6 hours at ambient temperature. The carrier was then separated by filtration on a Buchner funnel and washed with 100 ml of 0.1 mol / l acetate buffer, pH 5. 50 mg of human transferrin dissolved in 10 ml of 0.1 mol / l acetate buffer, pH 5 was added to the wet carrier. , 0. The suspension was shaken for 4 hours. The transferrin-bound support was separated by filtration on a Buchner funnel. The amount of unbound transferrin was determined in the filtrate and it was found that 31 mg of human transferrin was bound to 1 g of carrier. Aldehyde groups that did not react with the carrier or ligand amino groups were blocked by 20 hours incubation in 20 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 containing 0.25 mol / L glycine.

Takto připravený nosič 8 navázaným lidským transferinem byl použit к afinitní chromatografii ve sloupcovém uspořádání. V chromatografické koloně o průměru 2,5 cm byl nosič promyt 250 ml 0,15 mol/1 chloridem sodným. Pak bylo na kolonu naneseno 15 ml prasečího krevního séra, obsahujícího protilátky proti lidskému transferinu. Po protečení séra byla kolona promyta 250 ml 0,15 mol/1 chloridu sodného. Afinitně adsorbované protilátky byly desorbovány 50 ml 0,05 mol/1 glycinového pufru o pH 2,5. Roztok desorbovaných protilátek byl neutralizován a stanovena jejich koncentrace spektrofotometricky při 260 nm. Bylo zjištěno, že afinitní chromatografií na 1 g nosiče β navázaným transferinem bylo izolováno 42 mg prasečích protilátek. Protilátková aktivita získaného preparátu byla prověřena imunoelektroforézou.The thus prepared carrier 8 bound with human transferrin was used for column chromatography affinity chromatography. In a 2.5 cm diameter chromatography column, the support was washed with 250 ml of 0.15 mol / L sodium chloride. 15 ml of porcine blood serum containing antibodies to human transferrin was then applied to the column. After the serum was run off, the column was washed with 250 ml of 0.15 mol / L sodium chloride. Affinity-adsorbed antibodies were desorbed with 50 ml 0.05 M glycine buffer pH 2.5. The solution of desorbed antibodies was neutralized and their concentration was determined spectrophotometrically at 260 nm. It was found that 42 mg of porcine antibodies were isolated by affinity chromatography per 1 g of carrier β bound by transferrin. Antibody activity of the obtained preparation was verified by immunoelectrophoresis.

Příklad 2Example 2

К 1 g práškového polyethylentereftalátu o velikosti částic 30 až 40 _zum a měrném povrchu 80 m /g bylo přidáno 20 ml 5 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla ponechána 24 hod. při teplotě 20 °C. Polymer byl oddělen filtrací a ihned suspendován v 20 ml roztoku obsahujícího 0,5 hmotnostních % kaseinu, 6 mol/1 močoviny a 0,1 mol/1 octanový pufr o pH 4,7. Za stálého míchání byly přidány 2 ml И hmot, vodného roztoku glutaraldehydu a suspenze třepána 2 hod. Polyethylentereftalát s navázaným kaseinem byl oddělen filtrací. Ve filtrátu bylo stanoveno množství nenavázaného kaseinu a bylo zjištěno, že na 1 g práškového polyamidu se navázalo 60 mg kaseinu. Po promytí na filtru 0,1 mol/1 borátovým pufrem o pH 8,5 byl nosič suspendován v 20 ml 0,1 mol/1 borátového pufru o pH 8,5 obsahujícího 200 mg borohydridu sodného. Suspenze byla ponechána na třepačce 1 hod. při 4 °C. Pólyethylentereftalát s navázaným kaseinem byl promyt postupně vodou, ethanolem a acetonem. Práškový produkt byl sušen při teplotě 20 °C.К 1 g of powdered polyethylene terephthalate, having a particle size _of 30-40 microns and a specific surface of 80 m / g were added 20 ml of a 5% w aqueous solution of glutaraldehyde. The suspension was left at 20 ° C for 24 hours. The polymer was collected by filtration and immediately suspended in 20 ml of a solution containing 0.5 weight% casein, 6 mol / L urea and 0.1 mol / L acetate buffer, pH 4.7. While stirring, 2 ml of an aqueous solution of glutaraldehyde was added and the suspension was shaken for 2 hours. The casein-bound polyethylene terephthalate was collected by filtration. The amount of unbound casein was determined in the filtrate and it was found that 60 mg of casein was bound to 1 g of powdered polyamide. After washing with 0.1 M borate buffer pH 8.5 on the filter, the carrier was suspended in 20 ml of 0.1 M borate buffer pH 8.5 containing 200 mg sodium borohydride. The suspension was left on a shaker at 4 ° C for 1 hour. Casein-bound polyethylene terephthalate was washed successively with water, ethanol and acetone. The powdered product was dried at 20 ° C.

Připravený nosič byl použit к enzymoimunoanalytickému stanovení přítomnosti raonoklonálních protilátek proti beta-endorfinu ve vzorcích kultivačních médií odebraných z kultur hybridomových buněk.The prepared carrier was used for the enzymatic immunoassay for the presence of raonoclonal anti-beta-endorphin antibodies in culture medium samples taken from hybridoma cell cultures.

Nejprve byl proto na připravený nosič kovalentně navázán ligand, tj. v tomto případě beta-endorfin. К 50 mg nosiče bylo přidáno 0,5 ml vody a 0,125 ml 25 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Po promíchání byla suspenze ponechána 20 hod. při teplotě okolí. Potom byl nosič oddělen odstředěním a promyt při opakovaném odstředění 3 dávkami 0,1 mol/1 borátového pufru o pH 8,2. К vlhkému nosiči bylo přidáno 1,5 mg beta-endorfinu rozpuštěného v 0,5 ml 0,05 mol/1 borátového pufru o pH 8,2. Suspenze byla třepána 8 hod. Nosič s navázaným beta-endorfinem byl odstředěn. V supernatantu bylo stanoveno množství nenavázaného beta-endorfinu a bylo zjištěno, že na 50 mg nosiče se navázalo 1,1 mg beta-endorfinu. Aldehydické skupiny, které nereagovaly s arninoskupinami nosiče ani ligandů, byly blokovány 20ti hodinovou inkubací v 2 ml 0,1 mol/1 fosfátového pufru o pH 7,0 obsahujícího 1 mol/1 ethanolamin.First, a ligand, i.e. in this case beta-endorphin, was covalently bound to the prepared carrier. 0.5 ml of water and 0.125 ml of a 25% by weight aqueous solution of glutaraldehyde were added to 50 mg of the carrier. After stirring, the suspension was left at ambient temperature for 20 hours. Then, the support was separated by centrifugation and washed by repeated centrifugation with 3 portions of 0.1 mol / l borate buffer, pH 8.2. 1.5 mg of beta-endorphin dissolved in 0.5 ml of 0.05 M borate buffer, pH 8.2, was added to the wet carrier. The suspension was shaken for 8 hours. The beta-endorphin bound carrier was centrifuged. The amount of unbound beta-endorphin was determined in the supernatant and it was found that 1.1 mg of beta-endorphin was bound to 50 mg of carrier. Aldehyde groups that did not react with the amino or carrier groups of the ligands were blocked by incubating for 20 hours in 2 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 containing 1 M ethanolamine.

Takto připravený nosič s navázaným beta-endorfinem byl po promytí 0,1 tnol/1 fosfátovým pufrem o pH 7,0 použit к detekci monoklonálních protilátek proti beta-endorfinu ve vzorcích kultivačních médií odebraných z kultur hybridomových buněk. Specifická adsorpce monoklonálních protilátek na nosič a beta-endorfinem byla prokazována enzymaticky katalyzovaným rozkladem peroxidu vodíku pomocí prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu konjugované s křenovou peroxidasou. Při použití o-fenylendiaminu jako látky indikující množství kyslíku uvolněného enzymovou reakcí bylo po 20ti minutové inkubaci při 20 °C dosahováno optické absorbance při 490 nm v rozmezí od 0,05 doThe beta-endorphin-bound carrier thus prepared was used to detect monoclonal anti-beta-endorphin antibodies in culture medium samples taken from hybridoma cell cultures after washing with 0.1 mM phosphate buffer pH 7.0. Specific adsorption of monoclonal antibodies to the carrier and beta-endorphin was demonstrated by enzymatically catalyzed decomposition of hydrogen peroxide with a horseradish peroxidase-conjugated porcine anti-mouse immunoglobulin antibody. Using o-phenylenediamine as an indicator of the amount of oxygen released by the enzyme reaction, after 20 minutes incubation at 20 ° C, the optical absorbance at 490 nm was achieved in the range of 0.05 to

1,20 podle koncentrace detegované monoklonální protilátky.1.20 according to the concentration of monoclonal antibody detected.

Příklad 3Example 3

К 10 g práškového poly/2,6-dimethyl/fenylenoxidu o velikosti částic 0,3 až 0,8 mm a měrném povrchu 560 m /g bylo přidáno 50 ml 0,05 mol/1 fosfátového pufru o pHTo 10 g of powdered poly (2,6-dimethyl) phenylene oxide having a particle size of 0.3 to 0.8 mm and a specific surface area of 560 m / g was added 50 ml of 0.05 mol / l phosphate buffer at pH

7,5 a 20 ml 25 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla ponechána 16 hod. při teplotě 20 °C. Polymer byl oddělen filtrací a suspendován v 40 ml 0,1 mol/1 fosfátového pufru o pH 7,5 obsahujícího 0,5 % hmotnostních hovězího imunoglobulinu G. Suspenze byla míchána 30 min. a pak bylo po dobu 10 min. po malých dávkách přidáváno celkem 25 ml 1 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Po dalších 30 min. byl polymer a navázaným imunoglobulinem G odděien filtrací. Ve filtrátu byl stanoven nenavázaný imunoglobulin G a bylo zjištěno, že na 10 g práškového poly/2,6-dimethyl/fenyloxidu se navázalo 130 mg hovězího imunoglobulinu G. Nosič byl na filtru postupně promyt 0,1 mol/1 chloridem sodným, 0,2 mol/1 uhličitanem sodným, vodou a acetonem. Práškový produkt byl sušen při teplotě 20 °C.7.5 and 20 ml of a 25 wt.% Aqueous solution of glutaraldehyde. The suspension was left at 20 ° C for 16 hours. The polymer was collected by filtration and suspended in 40 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.5 containing 0.5% bovine immunoglobulin G. The suspension was stirred for 30 min. and then for 10 min. a total of 25 ml of a 1% by weight aqueous glutaraldehyde solution was added in small portions. After another 30 min. the polymer and bound immunoglobulin G were separated by filtration. Unbound immunoglobulin G was determined in the filtrate and it was found that 10 g of powdered poly (2,6-dimethyl) phenyloxide was bound with 130 mg of bovine immunoglobulin G. The carrier was washed successively on the filter with 0.1 mol / l sodium chloride 0, 2 mol / l sodium carbonate, water and acetone. The powdered product was dried at 20 ° C.

Připravený nosič byl použit ke stejnému účelu jako nosič v příkladu 1.The prepared carrier was used for the same purpose as the carrier in Example 1.

Na připravený nosič byl kovalentně navázán ligand, tj. v tomto případě lidský transferin. К 10 g nosiče bylo přidáno 40 ml vody a 10 ml 25 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla míchána 5 hod. Nosič byl pak oddělen filtrací na Buchnerově nálevce a promyt 600 ml 0,1 mol/1 octanového pufru o pH 5,0. Suspenze byla míchána 5 hod. Nosič 8 navázaným transferinem byl oddělen filtrací na Búchnerově nálevce. Ve filtrátu bylo stanoveno množství nenavázaného transferinu a bylo zjištěno, Že na 10 g nosiče se navázalo 405 mg lidského transferinu. Aldehydové skupiny, které nereagovaly 8 aminoskupinami nosiče ani ligandů byly blokovány 24hodinovou inkubací v 160 ml 0,5 mol/1 ethanolaminu.A ligand, i.e. human transferrin, was covalently bound to the prepared carrier. 40 ml of water and 10 ml of a 25% by weight aqueous solution of glutaraldehyde were added to 10 g of carrier. The suspension was stirred for 5 hours. The support was then separated by filtration on a Buchner funnel and washed with 600 ml of 0.1 M acetate buffer pH 5.0. The suspension was stirred for 5 hours. Transferin-bound support 8 was separated by filtration on a Buchner funnel. The amount of unbound transferrin was determined in the filtrate and it was found that 405 mg of human transferrin was bound to 10 g of carrier. Aldehyde groups that did not react with the 8 amino groups of the carrier or ligand were blocked by incubating for 24 hours in 160 ml of 0.5 mol / L ethanolamine.

Takto připravený nosič 8 navázaným lidským transferinem byl použit к afinitní chromatografií ve vsádkovém uspořádání, přičemž byl po jednotlivých krocích nosič oddělován od kapalné fáze filtrací. Nosič s navázaným transferinem byl nejprve promyt 0,15 mol/1 chloridem sodným a pak inkubován za stálého třepání po dobu 2 hod. s 250 ml prasečího séra obsahujícího protilátky proti lidskému transferinu. Nosič byl na filtru promyt 0,5 1 0,15 mol/1 chloridu sodného. Afinitně adsorbované protilátky bylyThe thus prepared carrier 8 bound with human transferrin was used for batch affinity chromatography, separating the carrier from the liquid phase by filtration step by step. The transferrin-bound carrier was first washed with 0.15 mol / L sodium chloride and then incubated with shaking for 2 hours with 250 ml of swine serum containing anti-human transferrin antibodies. The support was washed on the filter with 0.5 L of 0.15 mol / L sodium chloride. Affinity adsorbed antibodies were

CS 271590 Bl desorbovány 100 ml 0,05 mol/1 diethylaminu po dobu 5 min. za stálého třepání. Roztok desorbovaných protilátek byl po oddálení filtrací ihned neutralizován a stanovena koncentrace protilátek spektrofotometricky při 260 nm· Bylo zjištěno, že vsádkovou afinitní chromátografií na 10. g nosiče в navázaným transferinem bylo izolováno 535 mg prasečích protilátek. Protilátková aktivita získaného preparátu byla prověřena imunoelektroforé zou.CS 271590 B1 desorbed with 100 ml 0.05 mol / L diethylamine for 5 min. while shaking. The desorbed antibody solution was immediately neutralized after filtering off and the antibody concentration was determined spectrophotometrically at 260 nm. It was found that 535 mg of porcine antibodies were isolated by batch affinity chromatography per 10 g of carrier in transferrin bound. The antibody activity of the obtained preparation was verified by immunoelectrophoresis.

Claims

CLAIMS 1. A carrier for affinity chromatography comprising porous organic polymer particles having a mean diameter of 0.01 to 5 mm, a specific surface area of 1 to 700 m @ ² / g and a porosity of 0.01 to 2.7 ml / g on which the protein is bound in a weight ratio of 1000: 5 to 100.

2. A carrier according to claim 1, wherein the organic polymer is based on poly (ethylene terephthalate), poly (2,6-dimethyl) phenylene oxide, poly-6-caprolactam, polycaprolactam and poly (ethylene oxide) block copolymers or polycondensates of formaldehyde A with melamine or urea.

AND

3. A carrier as claimed in claim 1 or claim 2, wherein the casein, serum albumin or immunoglobulin G protein is coupled to the organic polymer.

4. A process according to claim 1, wherein the porous polymer powder is activated with an aqueous solution of glutaraldehyde at a concentration of 1-20% by weight and a pH of 3-10, and after removal of excess glutaraldehyde, e.g. an aqueous protein solution at a concentration of 0.2 to 20% by weight, and a pH of 3 to 10, while adding glutaraldehyde to a final concentration of 0.01 to 2% by weight, then separating the carrier, for example, by filtration and washing with an aqueous solution of inorganic salt; water or acetone ·

5. The method of claim 4, further comprising subjecting the protein-bound support to sodium borohydride in an aqueous solution having a concentration of 0.05 to 0.5% by weight and a pH of 8 to 9.