CS271590B1 - Carrier for affine chromatography and method of its preparation - Google Patents

Description

Vynález ee týká nosiče pro afinitní chromatografli a způsobu jeho přípravy. Afinitu! chromatografie je rozdělovači proces, který využívá specifických vazebných míst látek imobilizováných na nosiči představujícím pevnou fázi к oddělení látky, která 8 vazebnými místy interaguje, od směsi jiných látek. Látka nebo složitější částice imobilizovaná na nosiči se nazývá ligand. Ligand určuje specifičnost a selektivitu rozdělovacího procesu. Nosič musí být chemicky i fyzikálně inertní.

Afinitní chromatografií se dosahuje rychlého a účinného čištění látek nejrůznějSí chemické povahy, hlavně látek rozpustných ve vodě, obsažených v komplexních materiálech původu rostlinného, živočišného nebo mikrobiálního, případně v surových produktech syntetických. Proces afinitní adsorpce se může uskutečnit buň umístěním nosiče 8 ligandem do sloupce, jímž dělená směs protéká, nebo způsobem vsádkovým.

Kromě účelů preparativních lze nosiče s navázanými ligandy používat též v metodách analytických. Afinitní adsorpce dodává analytické metodě vysokou selektivitu. Analytické metody založené na adsorpci některé z reagencií na pevný nosič se široce využívají zejména v imunoanalýze.

Základem pevné fáze pro proces afinitní chromatografie je nosič. Nosič může být granulovaný, v jiných případech mohou jako nosič posloužit materiály vláknité nebo stěny kapilární trubice. V analytických metodách Často slouží jako nosič stěny nádobky, v níž stanovení probíhá. Ligandy se na nosiče navazují převážně chemickými vazbami, někdy však dostačuje i vazba fyzikální. Ligandý se mohou na nosič navazovat bu5 přímo, nebo prostřednictvím oddělovacího členu. Oddělovací člen je látka, většinou ní zkomolekulární se dvěma nebo více funkčními skupinami, která umožňuje flexibilní připojení ligandu na nosič. Vazebná místa ligandu jsou v uspořádání s oddělovacím členem lépe stericky přístupná a kapacita nosiče s takto navázaným ligandem je zpravidla vyšší než kapacita nosiče s ligandem vázaným přímo.

Z přírodních materiálů se jako nosiče pro afinitní chromatografii používá celulóza, škrob, sírovaný dextran, agarosa, alginát nebo šíbované bílkoviny. Z organických syntetických polymerů se používají nosiče na bázi polyamidů, šíbovaného polyakrylamidu, polyesterů nebo fenolformaldehydové pryskyřice. Jako nosič anorganické povahy ee používají oxidy kovů nebo silikátové materiály, jako je sklo a podobně.

Pokud jsou nosiče gelové povahy, nevykazují dostatečnou pevnost při manipulaci, rozpadají se při intezívním míchání suspenze a uspávají filtry při filtraci. Syntetické polymery, nerozpustné přírodní pólysacharidy, např. celulóza, nebo anorganické materiály mají tu výhodu, že jsou mechanicky odolné a objemově stálé. Jejich nedostatkem je však schopnost vytvářet fyzikální vazby θ látkami v okolním roztoku. Vzhledem к této okolnosti je proces afinitní chromatografie rušen současně probíhající nespecifickou adsorpci mnohých látek, což má za důsledek, že afinitní proces je málo účinný. Další nevýhoda syntetických polymerních nosičů spočívá v tom, Že se obtížně smáčejí vodou.

Uvedené nedostatky odstraňuje nosič pro afinitní chromatografií podle vynálezu, který obsahuje porézní částice polymerů o středním průměru 0,01 až 5 mm, měrném povrchu 1 až 700 m²/g a porozitě 0,01 až 2,7 ml/g, na něž je navázána bílkovina v hmotnostním poměru 1 000 : 5 až 100. Nosič obsahuje porézní částice polymerů na bázi polyethylentereftalátu, póly/2,6-dimethy1/fenylenoxidu, poly-6-kaprolaktamu, blokového kopolymeru polykaprolaktamu a polyethylenoxidu nebo polykondenzátů formaldehydu s melaminem nebo močovinou a bílkovinu na bázi kaseinu, sérového· albuminu nebo imunoglobulinu G. .

Způsob přípravy nosiče spočívá v tom, že práškový porézní organický polymer se aktivuje vodným roztokem glutaraldehydu o koncentraci 1 až 20 % hmot, a pH 3 až 10 cs 271590 Bl a po odstranění nadbytečného glutaraldehydu se nechá reagovat s vodným roztokem bílkoviny o koncentraci 0,2 až 20 % hmot, a pH 3 až 10, za současného přidávání vodného roztoku glutaraldehydu až do výsledné koncentrace 0,01 až 2 % hmot., načež se nosič oddělí například filtrací a promyje se vodným roztokem anorganické soli, vodou, popřípadě acetonem. Nosič s navázanou bílkovinou lze dále vystavit působení borohydridu sodného ve vodném roztoku o koncentraci 0,05 až 0,5 % hojot. a pH 8 až 9.

Předkládaný vynález nosiče pro afinitní chromatografií odstraňuje uvedené nedostatky tím, že polymerní rigidní částice jsou potaženy vrstvou zesilované bílkoviny. Získají ee rigidní částice, jejichž povrch je tvořen bílkovinou a je tudíž zcela kompatibilní s vodným prostředím. Postranní řetězce aminokyselinových zbytků bílkoviny fungují jako oddělovací členy ligandů. Částice se snadno znovu smáčejí vodou po vyeuěení. Souvislá nerozpustná vrstva bílkoviny na povrchu polymerní částice se vytvoří fyzikální nebo chemickou vazbou molekul bílkoviny к povrchu Částice a zesilováním molekul bílkoviny pomocí vhodného bifunkčního činidla, s výhodou glutaraldehydu. Polymerní částice pro přípravu nosičů podle vynálezu jsou polymery v práškové porézní formě vyráběné na bázi polyamidů, polyesterů, pólyéterů nebo polykondenzátů formaldehydu s melaminem nebo močovinou. Tyto polymerní částice jsou ve vodě nerozpustné a mají střední průměr 0,01 až 5 ram. měrný povrch 1 až 700 m /g a porozit 0,01 až

2,7 ml/g. Polymerní částice pro přípravu nosičů pro afinitní chromatografií podle vynálezu se připravují podle čs· autorských osvědčení 171 917, 202 215 a 203 386. Jako bílkovinný materiál pro vytvoření vrstvy zesilované bílkoviny se používá s výhodou kasein, sérový albumin nebo imunoglobulin G.

Způsob přípravy nosičů podle vynálezu spočívá v tom, že se na polymerní částice adsorbuje dialdehyd, 8 výhodou glutaraldehyd, ve vodném roztoku. Dialdehyd se přidává v nadbytku, množství adsorbovaného dialdehydu je závislé na typu polymerní Částice, to je na její chemické struktuře a texturních vlastnostech, jakož i na podmínkách adsorpce. V případě, že polymerní částice má funkční skupiny schopné reagovat s aldehydem, probíhá kromě fyzikální adsorpce i chemisorpce. Po odstranění nenavázaného, resp. nenasorbovaného dialdehydu se polymerní Částice aktivované aldehydem uvedou do roztoku bílkoviny, např. kaseinu nebo sérového albuminu, a to s takovým množstvím a za takových podmínek, aby všechny volné aldehydické skupiny zreagovaly 8 aminoskupinami bílkovin· Částice polymeru в navázanou bílkovinou se suspendují v roztoku dialdehydu, čímž dojde к zesíťování molekul bílkoviny dialdehydem a tím к vytvoření souvislé vrstvy bílkoviny pokrývající celý povrch polymerní částice. V mnohých případech je možno navázáni a zesilování bílkoviny na povrchu polymerní částice provést v jedné operaci. Podmínky síťování bílkoviny vázané na polymerní částice, zejména množství dialdehydu, Je nutno volit tak, aby zreagoval jen minimální potřebný počet aminoskupin bílkoviny a zůstaly volné к reakci dostupné aminoskupiny pro následnou vazbu ligandů. Takto připravený nosič pro afinitní chromagografii se dobře smáčí ve vodě i po vysušení. Částice nosiče jsou mechanicky dostatečně pevné pro běžnou i náročnější manipulaci.

Vynález je dále podrobněji vysvětlen v následujících příkladech.

Příklad 1

К 1 g práškového polyamidu o velikosti částic 200 až 500 уит a měrném povrchu

3,6 m²/g bylo přidáno 10 ml 0,1 mol/1 fosfátového pufru o pH 7,0 a 2,5 ml 25 % vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla ponechána 20 h při teplotě 20 °C. Pak byl polymer oddělen filtrací a suspendován v 20 ml vodného roztoku obsahujícího 0,5 % hmot, kaseinu, 6 mol/1 močovinu a 0,1 mol/1 octanový pufr o pH 4,6. Za stálého míchání byly přidány 2 ml 1 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu a po 30 min. další 2 ml

CS 271590 Ы .

% vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla nepřetržitě míchána 2 hod. Polyamid s navázaným kaseinem byl oddělen filtrací. Ve filtrátu bylo stanoveno množství nenavázaného kaseinu a bylo zjištěno, že na 1 g práškového polyamidu se navázalo 35 mg kaseinu. Po promytí na filtru 0,1 mol/1 borátovým pufrem o pH 8,5 byl nosič suspendován v 25 ml 0,1 mol/1 borátového pufru o pH 8,5 obsahujícího 25 mg borohydridu sodného. Suspenze byla míchána 1 hod. při teplotě 4 °C. Polyamid s navázaným kaseinem byl na filtru promyt postupně vodou, 1 mol/1 roztokem chloridu sodného, vodou a acetonem. Práškový produkt byl sušen při teplotě 20 °C.

Připravený nosič byl použit к izolaci protilátek proti lidskému transferinu ze séra prasat imunizovaných lidských transferinem.

Nejprve byl proto na připravený nosič kovalentně navázán ligand, tj. v tomto případě lidský transferin. К 1 g nosiče bylo přidáno 8 ml vody a 2,5 ml 25 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Po promíchání byla suspenze ponechána po dobu 6 hod. při teplotě okolí. Nosič byl pak oddělen filtrací na Buchnerově nálevce a promyt 100 ml 0,1 mol/1 octanového pufru o pH 5,θ· К vlhkému nosiči bylo přidáno 50 mg lidfcého transferinu rozpuštěného v 10 ml 0,1 mol/1 octanového pufru o pH 5,0. Suspenze byla třepána 4 hod. Nosič s navázaným transferinem byl oddělen filtrací na Buchnerově nálevce. Ve filtrátu bylo stanoveno množství nenavázaného transferinu a bylo zjištěno, že na 1 g nosiče se navázalo 31 mg lidského transferinu. Aldehydické skupiny, které nereagovaly s aminoskupinami nosiČo ani ligandu, byly blokovány 20ti hodinovou inkubací v 20 ml 0,1 mol/1 fosfátového pufru o pH 7,0 obsahujícího 0,25 mol/1 glycin.

Takto připravený nosič 8 navázaným lidským transferinem byl použit к afinitní chromatografii ve sloupcovém uspořádání. V chromatografické koloně o průměru 2,5 cm byl nosič promyt 250 ml 0,15 mol/1 chloridem sodným. Pak bylo na kolonu naneseno 15 ml prasečího krevního séra, obsahujícího protilátky proti lidskému transferinu. Po protečení séra byla kolona promyta 250 ml 0,15 mol/1 chloridu sodného. Afinitně adsorbované protilátky byly desorbovány 50 ml 0,05 mol/1 glycinového pufru o pH 2,5. Roztok desorbovaných protilátek byl neutralizován a stanovena jejich koncentrace spektrofotometricky při 260 nm. Bylo zjištěno, že afinitní chromatografií na 1 g nosiče β navázaným transferinem bylo izolováno 42 mg prasečích protilátek. Protilátková aktivita získaného preparátu byla prověřena imunoelektroforézou.

Příklad 2

К 1 g práškového polyethylentereftalátu o velikosti částic 30 až 40 _zum a měrném povrchu 80 m /g bylo přidáno 20 ml 5 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla ponechána 24 hod. při teplotě 20 °C. Polymer byl oddělen filtrací a ihned suspendován v 20 ml roztoku obsahujícího 0,5 hmotnostních % kaseinu, 6 mol/1 močoviny a 0,1 mol/1 octanový pufr o pH 4,7. Za stálého míchání byly přidány 2 ml И hmot, vodného roztoku glutaraldehydu a suspenze třepána 2 hod. Polyethylentereftalát s navázaným kaseinem byl oddělen filtrací. Ve filtrátu bylo stanoveno množství nenavázaného kaseinu a bylo zjištěno, že na 1 g práškového polyamidu se navázalo 60 mg kaseinu. Po promytí na filtru 0,1 mol/1 borátovým pufrem o pH 8,5 byl nosič suspendován v 20 ml 0,1 mol/1 borátového pufru o pH 8,5 obsahujícího 200 mg borohydridu sodného. Suspenze byla ponechána na třepačce 1 hod. při 4 °C. Pólyethylentereftalát s navázaným kaseinem byl promyt postupně vodou, ethanolem a acetonem. Práškový produkt byl sušen při teplotě 20 °C.

Připravený nosič byl použit к enzymoimunoanalytickému stanovení přítomnosti raonoklonálních protilátek proti beta-endorfinu ve vzorcích kultivačních médií odebraných z kultur hybridomových buněk.

Nejprve byl proto na připravený nosič kovalentně navázán ligand, tj. v tomto případě beta-endorfin. К 50 mg nosiče bylo přidáno 0,5 ml vody a 0,125 ml 25 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Po promíchání byla suspenze ponechána 20 hod. při teplotě okolí. Potom byl nosič oddělen odstředěním a promyt při opakovaném odstředění 3 dávkami 0,1 mol/1 borátového pufru o pH 8,2. К vlhkému nosiči bylo přidáno 1,5 mg beta-endorfinu rozpuštěného v 0,5 ml 0,05 mol/1 borátového pufru o pH 8,2. Suspenze byla třepána 8 hod. Nosič s navázaným beta-endorfinem byl odstředěn. V supernatantu bylo stanoveno množství nenavázaného beta-endorfinu a bylo zjištěno, že na 50 mg nosiče se navázalo 1,1 mg beta-endorfinu. Aldehydické skupiny, které nereagovaly s arninoskupinami nosiče ani ligandů, byly blokovány 20ti hodinovou inkubací v 2 ml 0,1 mol/1 fosfátového pufru o pH 7,0 obsahujícího 1 mol/1 ethanolamin.

Takto připravený nosič s navázaným beta-endorfinem byl po promytí 0,1 tnol/1 fosfátovým pufrem o pH 7,0 použit к detekci monoklonálních protilátek proti beta-endorfinu ve vzorcích kultivačních médií odebraných z kultur hybridomových buněk. Specifická adsorpce monoklonálních protilátek na nosič a beta-endorfinem byla prokazována enzymaticky katalyzovaným rozkladem peroxidu vodíku pomocí prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu konjugované s křenovou peroxidasou. Při použití o-fenylendiaminu jako látky indikující množství kyslíku uvolněného enzymovou reakcí bylo po 20ti minutové inkubaci při 20 °C dosahováno optické absorbance při 490 nm v rozmezí od 0,05 do

1,20 podle koncentrace detegované monoklonální protilátky.

Příklad 3

К 10 g práškového poly/2,6-dimethyl/fenylenoxidu o velikosti částic 0,3 až 0,8 mm a měrném povrchu 560 m /g bylo přidáno 50 ml 0,05 mol/1 fosfátového pufru o pH

7,5 a 20 ml 25 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla ponechána 16 hod. při teplotě 20 °C. Polymer byl oddělen filtrací a suspendován v 40 ml 0,1 mol/1 fosfátového pufru o pH 7,5 obsahujícího 0,5 % hmotnostních hovězího imunoglobulinu G. Suspenze byla míchána 30 min. a pak bylo po dobu 10 min. po malých dávkách přidáváno celkem 25 ml 1 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Po dalších 30 min. byl polymer a navázaným imunoglobulinem G odděien filtrací. Ve filtrátu byl stanoven nenavázaný imunoglobulin G a bylo zjištěno, že na 10 g práškového poly/2,6-dimethyl/fenyloxidu se navázalo 130 mg hovězího imunoglobulinu G. Nosič byl na filtru postupně promyt 0,1 mol/1 chloridem sodným, 0,2 mol/1 uhličitanem sodným, vodou a acetonem. Práškový produkt byl sušen při teplotě 20 °C.

Připravený nosič byl použit ke stejnému účelu jako nosič v příkladu 1.

Na připravený nosič byl kovalentně navázán ligand, tj. v tomto případě lidský transferin. К 10 g nosiče bylo přidáno 40 ml vody a 10 ml 25 % hmot, vodného roztoku glutaraldehydu. Suspenze byla míchána 5 hod. Nosič byl pak oddělen filtrací na Buchnerově nálevce a promyt 600 ml 0,1 mol/1 octanového pufru o pH 5,0. Suspenze byla míchána 5 hod. Nosič 8 navázaným transferinem byl oddělen filtrací na Búchnerově nálevce. Ve filtrátu bylo stanoveno množství nenavázaného transferinu a bylo zjištěno, Že na 10 g nosiče se navázalo 405 mg lidského transferinu. Aldehydové skupiny, které nereagovaly 8 aminoskupinami nosiče ani ligandů byly blokovány 24hodinovou inkubací v 160 ml 0,5 mol/1 ethanolaminu.

Takto připravený nosič 8 navázaným lidským transferinem byl použit к afinitní chromatografií ve vsádkovém uspořádání, přičemž byl po jednotlivých krocích nosič oddělován od kapalné fáze filtrací. Nosič s navázaným transferinem byl nejprve promyt 0,15 mol/1 chloridem sodným a pak inkubován za stálého třepání po dobu 2 hod. s 250 ml prasečího séra obsahujícího protilátky proti lidskému transferinu. Nosič byl na filtru promyt 0,5 1 0,15 mol/1 chloridu sodného. Afinitně adsorbované protilátky byly

CS 271590 Bl desorbovány 100 ml 0,05 mol/1 diethylaminu po dobu 5 min. za stálého třepání. Roztok desorbovaných protilátek byl po oddálení filtrací ihned neutralizován a stanovena koncentrace protilátek spektrofotometricky při 260 nm· Bylo zjištěno, že vsádkovou afinitní chromátografií na 10. g nosiče в navázaným transferinem bylo izolováno 535 mg prasečích protilátek. Protilátková aktivita získaného preparátu byla prověřena imunoelektroforé zou.

Claims (5)

1. Nosič pro afinitní chromatografii, vyznačující se tím, že obsahuje porézní částice organických polymerů o středním průměru 0,01 až 5 mm, měrném povrchu 1 až 700 m²/g a porositě 0,01 až 2,7 ml/g, na němž je navázána bílkovina v hmotovém poměru 1 000 : 5 až 100.

2. Nosič podle bodu 1, vyznačující se tím, že organický polymer je na bázi pólyethylentereftalátu, poly/2,6-dimethy1/fenylenoxidu, póly-6-kaprolaktamu, blokového kopolymerů polykaprolaktamu a pólyethylenoxidu nebo polykondenzátů formaldehydu A s melaminem nebo močovinou.

I

3. Nosič podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že na organický polymer je navázána bílkovina na bázi kaseinu, sérového albuminu nebo imunoglobulinu G.

4· Způsob přípravy nosiče podle bodu 1 až 3, vyznačující se tím, že práěkový porézní polymer se aktivuje vodným roztokem glutaraldehydu o koncentraci 1 až 20 % hmot· a pH 3 až 10 a po odstranění nadbytečného glutaraldehydu, například odstředěním, se nechá reagovat s vodným roztokem bílkoviny o koncentraci 0,2 až 20 % hmot, a pH 3 až 10, za současného přidávání glutaraldehydu až do výsledné koncentrace 0,01 až 2 % hmot·, načež se nosič oddělí například filtrací a promyje se vodným roztokem anorganické soli a vodou, popřípadě acetonem·

5· Způsob podle bodu 4, vyznačující ee tím, že nosič s navázanou bílkovinou se dále vystaví působení borohydridu sodného ve vodném roztoku o koncentraci 0,05 až 0,5 % hmot· a pH 8 až 9·