CS270671B1 - Způsob výroby prostředku pro stanovení proteolytické aktivity - Google Patents

Abstract

Prostředek pro stanovení proteolytické aktivity se vyrábí tak, že se k roztoku želatiny přidá roztok vhodného barviva nebo pigmentu (např. kongo červeň, ve vodě rozpustný nigrosin, černá tuš) a bifunkčním činidlem (např. glutaraldehydem) se provede zesítění želatiny za současného zabudování barviva nebo pigmentu.

Description

Vynález se týká způsobu výroby prostředku pro stanovení proteolytické aktivity.

Proteolytické enzymy jsou široce využívány v mnoha odvětvích průmyslu, v zemědělství, v medicíně, v biochemických laboratořích i jinde. Pro stanovení jejich aktivity lze použít celou řadu substrátů. Významné místo mezi nimi zaujímají nepropustné bílkovinné chromolytické substráty.

Dosud používané způsoby přípravy nerozpustných chromolytických substrátů spočívají v tom, že se a) na přirozenou nerozpustnou bílkovinu (např. kolagen, keratin, elastin, fibrin) kovalentně nebo absorbcí naváže vhodné reaktivní barvivo

b) běžné rozpustné bílkoviny v roztoku zesítí vhodným bifunkčním činidlem, přičemž se vytvoří nerozpustné síťované bílkoviny, na které se v druhém stupni kovalentně nebo absorbcí naváže vhodné reaktivní barvivo.

Způsob výroby prostředku pro stanovení proteolytické aktivity podle vynálezu spočívá v tom, že se k roztoku vhodné bílkoviny (např. želatina) přidá vhodné barvivo nebo pigment, načež se přidá vhodné bifunkční činidlo (s výhodou např. glutaraldehyd), aby došlo k zesítění a vytvoření nerozpustné, barevné síťované bílkoviny. Tato nerozpustná barevná síťovaná bílkovina je vytvořena v jediném kroku. Vzniklý produkt se důkladně promyje vodou a ponechá se buď ve formě gelu, nebo se rozdrobí na malé kousky, usuší za mírně zvýšené teploty a potom se rozetře na jemný prášek. Působením proteolytických enzymů se ze substrátu uvolňuje barvivo, jehož množství je úměrné aktivitě proteinasy a je možno ho stanovit např. spektrofotometricky, po odfiltrování nebo odstředění nerozloženého nerozpustného substrátu.

Vynález je dokumentován příklady.

Příklad 1

Želatina (10g) byla na vodní lázni rozvařena ve 100 ml vody. Po rozvaření bylo k roztoku želatiny přidáno 0,25g kongo červeně rozpuštěné v 10 ml vody. Ke vzniklému roztoku bylo potom za míchání přidáno 1 až 2 ml 50% glutaraldehydu, zředěného 10 ml vody. Došlo k rychlému zesítění želatiny a vytvořil se nerozpustný barevný gel. Vzniklý gel byl rozdroben na malé částice, promyt důkladně vodou, usušen při mírně zvýšené teplotě a rozetřen v třecí misce na jemné částice.

Příklad 2

Analogicky jako v příkladu 1 byl připraven nerozpustný barevný gel. Po rozdrobení a promytí vodou byly částice gelu homogenizovány v Elvehjem-Potterově homogenizátoru. Vytvořené jemné částice byly suspendovány v pufru a použity pro stanovení proteolytické aktivity.

Příklad 3

Analogicky jako v příkladu 1 byly připraveny substráty obsahující jako pigment nigrosin rozpustný ve vodě (0,25g na 10 g želatiny) nebo černou tuš (3 ml na 10 g želatiny, přidána po ochlazení roztoku želatiny na 35°C).

Příklad 4

Analogicky jako v příkladu 1 byl připraven roztok želatiny obsahující kongo červeň. Roztok byl rozlit na Petriho misky, aby se vytvořila vrstva asi 4 mm vysoká. Po zatuhnutí byla vrstva želatiny přelita 10 až 25 ml 2,5% roztoku glutaraldehydu a roztok byl ponechán působit 18 až 24 hodin. Potom byl roztok glutaraldehydu slit, zesítěná želatina byla důkladně promyta vodou a korkovrtem byly vykrojeny disky o vhodném průměru. Disky byly uchovávány ve vodě s přídavkem vhodného bakteriocidního prostředku.

Příklad 5

Analogicky jako v příkladu 4 byly připraveny disky, které byly za laboratorní teploty ponechány vyschnout. Byly uchovávány za laboratorní teploty.

CS 270671 Bl

Použití nerozpustných chromolytických substrátů je dokumentováno příklady 6 až 10.

Příklad 6

Oo zkumavek bylo naváženo po 20 mg substrátu (připraven podle příkladu 1), přidáno po 2 ml vhodného pufru a ponecháno 20 min bobtnat. Potom bylo do zkumavek přidáno po 1 ml roztoku obsahujícího proteinasy. Po vhodně dlouhé inkubaci (např. 30 min při 37 až 50° C) byl substrát odfiltrován a filtrát byl spektrofotometricky poměřen při 497 nm. Oo hodnoty absorbance 1 byla závislost mezi množstvím (aktivitou) proteinasy a absorbancí filtrátu lineární.

Příklad 7

Do zkumavek bylo pipetováno po 2 ml suspenze substrátu (připraven podle příkladu 2, suspenze obsahovala 10 mg substrátu na Iml) a potom bylo přidáno po 1 ml roztoku protei4 nas. Další postup byl analogický jako v příkladu 6.

Příklad Θ

Analogicky jako v příkladu 6 bylo provedeno stanovení proteolytické aktivity pomocí substrátů, které jako pigment obsahovaly nigrosin nebo Černou tuš (připravené podle příkladu 3). '

Příklad 9

Do 2 ml pufru ve zkumavkách byly vloženy disky substrátu (připraveně podle příkladu 4) a bylo přidáno po 1 ml roztoku proteinas. Po skončení inkubace byl zabarvený roztok odlit a proměřován.

Příklad 10

Analogicky jako v příkladu 9 bylo provedeno stanovení proteolytické aktivity pomocí vysušených disků substrátu (připravené podle příkladu 5) s tím rozdílem, že před přídavkem roztoku proteinasy po dobu 20 minut bobtnaly v pufru.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU .

   Způsob výroby prostředku pro stanovení proteolytické aktivity, vyznačující se tím, že se k roztoku želatiny přidá roztok barviva, např. kongo červeně nebo ve vodě rozpustného nigrosinu, nebo pigmentu, například černé tuše a bifunkčním činidlem, například glutaraldehydem, se provede zesítění želatiny za současného zabudování barviva nebo pigmentu .