CS270658B1 - Selective adsorbent for immunocomplexes binding - Google Patents

Description

Vynález se týká adsorbentu pro selektivní vázáni cirkulujících imunokomplexů obsažených v tělních tekutinách, prováděné pomocí Opakovaného a reprodukovatelného použití povlečeného nosiče. Postup je použitelný ve farmaceutickém průmyslu i v lékařství.

De prokázáno, že v tělních tekutinách, například v krvi, mají cirkulující imunokomplexy podstatný pathogenetický význam u řady onemocnění (mj. и antiimunitních onemocnění jako Lupus erythematodes viscaralis a rheumatoldní erthritida, u odvržení transplantátů, Infekčních onemocnění, případně и neoplasii). Cirkulující imunokomplexy se mohou usazovat stěnách cév a vyvolávat u orgánů, které jsou к tomu právě náchylné, zánětlivé reakce (mj. vasculitis, arthritis, nephritis, serositis, carditis, cerebritis, anaemii, leukopeniirombopenl1) projevující se odpovídajícími symptomy. Zvláště při autoimunitních onemocněních koreluje koncentrace imunokomplexů v séru (plazmě nebo jiných tělních tekutinách) se stupněm onemocněni. Proto je vhodné ovlivnit pathomechanismus těchto onemocnění odstraněním cirkulujících imunokomplexů z tělních tekutin. Tím se dosáhne zbrzdění postupu shora jmenovaných nemocí, sníží se aktivita onemocnění a potlačí se nebo odstraní s nimi spojená symptomy. Úspěchy plasmapheresy spočívají mj. v odstranění, případně v omezení pathogeneticky významných imunokomplexů /viz. E. Apostoloff aj ., Dt. Gesundheitsw. 34, 64 (1979); H. F. Parry aj., Ann. Rheum. Dis. 40, 224 až 228 (1981); T. Sharon aj., Plasma Ther. Transfus. Technol. 3^ 163 až 169 (1982); M. Valbonesi aj . , Int. D. Art. Organs. 4^, 234 až 236 (1981); □. V. Dones aj . , Arthritis Rheum. 24, 1113 až 1120 (1981)/.

Nevýhodou této metody je neselektivní odstranění všech složek plazmy, což vyvolává nutnost dodávání větších množství cizí plazmy nebo lidského albuminu. To může být z kapacitních nebo ekonomických důvodů limitujícím faktorem. Proto existuje již několik let snaha o vývoj adsorbsntů, které umožňují selektivní odstranění cirkulujících imunokomplexů z tělních tekutin. Přitom bylo v podstatě postupováno těmito způsoby:

-Stafylokokový protein A fixovaný na nerozpustný nosič (fixované stafylokoky, protein A-Sepharose) /srovnej O. S. Torman aj., D. Imunol. 124, 798 (1980); New England D. Med. 305, 1195; E. Behm a H. Klinkmann v Plasma Separation and Plasma Fractionation, str. 254 až 265 (Karger, Basel 1983)./

-porézní pryskyřice ne bázi esterů kyseliny akrylové /např. XAS-7, dodává firma Rohm a Hass Co., USA; srovnej T. Agiehi, Zinko Zoki, 9, 264 (1980)/

-iontoměniče jako karboxymetyl celulóza /srovnej L. D. Dohnson aj., Can. 3. Biochem. 42, 795 (1964)7 . -adsorbens, obsahující povrch, na nějž js vázán při nejmenšlm jeden hydrofobní člen 9 6 až 700 uhlíkovými atomy a člen, který vytváří přinejmenším jeden negativní náboj /t. Kuroda aj., japonský patent D. P. P 56-59199, P 58-59197/.

Tyto adsorbenty mají však různé nevýhody: Protein A je schopen vázat imunokomplexy, avšak nikoliv dostatečně selektivně, protože váže rovněž IgG, který není vázán na imunokomplex. Mimoto je protein A cizí protein s tomu odpovídajícími nevýhodami v případech, kdy je používán ve styku s tělními tekutinami. Výrobní náklady proteinu A jsou velmi vysoké. Použití inaktivovaných stafylokoků jako přirozených nosičů proteinu A umožňuje použití proteinu A bez jeho dalšího čištění, přináší však dodatečné problémy při styku tělní tekutiny 6 inaktivovanýml bakteriemi (např. uvolňování pyrogenů). Údajně dochází rovněž к aktivlzaci komplementárního systému nosiči proteinu A. Porézní pryskyřice na bázi esterů kyseliny akrylové a karboxymethylcelulózy se vyznečují jen omezenou adsorpční kapacitou z tělní tekutiny. Adsorbens, který se skládá z hydrofobního členu a z členu, který obsahuje negativní náboj, není rovněž dostatečně specifický.

Předložený vynález odstraňuje tyto nedostatky. Vynález řeší úlohu odstranění cirkulujících imunokomplexů selektivně a Šetrně z tělních tekutin za použití sterillzovatel2

CS 270 658 B1 ných nosičů. Nosiče je možno jednoduše, rychle a reprodukpvatelně odstranit za účelem dalšího použití. Řešení tohoto úkolu, které je podstatou vynálezu, spočívá v tom, že protein Clq— podjednotka první komponenty komplementárního systému - je vázán spojovacími můstky na povlečené nosiče, například na makroporózní sférické kopolymery 2-hydro xyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem nebo na kopolymery stejné chemické struktury v plenární formě nebo na materiály obsahující celulózu, například perlovou celulózu nebo na celulózové nosiče v plenární formě, nebo je vázán pomocí silanového spojovacího činidla kovalentně na nosiče obsahující oxid křemíku, například na porézní sklo, skleněná vlákna nebo plenární filtry ze skleněných vláken, nebo je vázán na jiné nosiče, a takto na nosič vázaný protein Clq Jeppoužíván к vázání a odstraňováni cirkulujících imunokomplexů přičemž imunokomplexy vázané na protein Clq Jsou odstraňovány z tělních tekutin oddělením pevné fáze a pevná fáze je regenerována působením nedenaturujících mé dii. Podstata vynálezu spočívá dále v tom, že protein Clq, který se vyskytuje v lidské i zvířecí krvi a který Je zodpovědný za vázání imunokomplexŮ a jejich fyziologické vylučování, je vázán na shora jmenované noelČe, které mají dostatečně velký povrch a porozitu, a jejichž povrch Je podrobován chemické modifikaci známým způsobem epichlorhydrinem, estery kyseliny chlormravenčí, CNBr, kyanurchloridem, karbodiimldem (přehled: M. 0. Lilly:

Methoda in Enzymology 44, 1976, 46) nebo silanovýmí adháznímí činidly, nebo případně hetero- nebo homobifunkčními reagenciemi, a takto na nosič vázaný protein Clq Je použit pro in vivo a pro in vitro prováděné odstranění cirkulujících ImunokomplexŮ z krevních tekutin, načež takto vázané Imunokomplexy Jsou odštěpovány nedenaturujícími médii, takže použitý nosič - jehož povrch Je obsazen proteinem Clq může být znovu použit.

Nosič sloužící Jako pevná fáze má rozličné geometrické tvary, přičemž kulovitý, vláknitý nebo planárni zesítění nosiče Jsou zvláště vhodná. Myslitelné jsou však i filmy, laky a Jiné tenké vrstvy Jmenovaných kopolymerů na Jiných inertních biologicky snášenlivých materiálech.

Materiál obsahující póly(hydroxyethylmethakrylát) má v podstatě sférickou strukturu, přičemž Jeho velikost Částic, složení a porozita mohou být různé. Zvláště vhodné Jsou velikosti rů Je cca ci, a tím celulóza, né. Zvláště výhodné jsou velikosti částic mezi 100 až 400 50 nm. Maximální průměr pórů Je cca 100 ^um, plocha, která Je к dispozicí, a tím i kapacita nosiče, analogickým způsobem zmenšuje.

částic mezi 100 až 400 /Um a průměry pórů větší než 50 nm. Maximální průměr po100 um, přičemž při zvětšujícím se průměru pórů se plocha, která Je к dispozi1 kapacita, stále zmenšuje. Materiál obsahující celulózu Je v podstatě perlová přičemž Její velikost částic, složení, struktura a porozita mohou být rozdílcům a průměr pórů větší než přičemž se stoupajícím průměrem pórů se

Protein Clq Je vázán na povrchy nosičů obsahujících celulózu, Jež byly modifikovány známým chemickým způsobem, například pomocí esterů kyseliny chlormravenčí, CNBr, kyanurchloridem, karbodiimldem nebo silanovými adhézními činidly.

Nosič obsahující oxid křemíku má rovněž rozličné geometrické formy, přičemž kulovité nebo vláknité nosiče s adítlvy nebo bez nich, které mohou být pomocí obsahu, sin trování, nebo použitím adhezlva uspořádány do nadřazených struktur (filtrů, frit apod.) s definovanou propustnosti, jsou zvláště výhodné. Materiály obsahující oxid křemíku jsou v podstatě porézní skla (viz F. 3ano>vski, W. Heyer: Poróse Glaser, Deutscher Verlag fur Grundstoffindustrie, Leipzig 1982), které Jak známo Je možno bez problému sterilizovat a udržovat sterilní a Jejichž velikost částic, struktura a porozita Jsou přesně definovány. Zvláště vhodné Jsou dokonale sférické částice (DO-WP C03B 259 554Θ, OD-WP B01 □ 269 4362, 00-WP B01 □ 26 94390) s velikoetmi částic mezi 1 a 1000 ^\зт a s průměry pórů 0,05 až 100 /Um, přičemž Jsou průměry pórů a plocha, které Je к dispozici a která rozhodujícím způsobem ovlivňuje kapacitu nosiče, navzájem nepřímo úměrné. Ideálně sférická forma matrice má rozhodující význam pro áetrné podmínky procesu, protože podstatně reduCS 270 65B B1 kuj© etříhové sily, které působí na proteiny, faavíc se vyznačují ideálně sférické skleněné částečky odolnosti proti otěru, výhodnými hydrodynamickými vlastnostmi, Širokým rozmezím textur, a tím i průtokových vlastností, jakož i nepřítomnosti toxickchh příměsí. Zvláště z hlediska technologických procesů jsou výhodné nosiče v planární formě nebo patrony 9Θ zrnitým materiálem, nebo membrány z porézního skla s nadřazenou strukturou, které jsou používány jako filtry v odpovídajících filtračních systémech. Zde se osvědčují zvláště dobře filtrační materiály obsahující 8kleněná vlákna vzhledem к jejich mechanické pevností.

Nedenaturující média pro odštěpeni vázaných lmunokomplexů jsou pufrované roztoky o vysoké iontové síle, přičemž jsou zvláště výhodné 0,5 až 3 M roztoky chloridu sodného, avšak rovněž chaotropické reagencie, kyseliny a louhy. Modifikace povrchů póly(hydroxyethylmethakrylétů) za účelem vytvořeni podmínek pro tvorbu kovalentni vazby s proteinem Clq probíhá známým způsobem, s výhodou působením epichlorhydrinu, může být však prováděna i jinými modifikačnimi poetupy, jako působením CNBr, karbodiimidů a jiných heteronebo homoblfunkčnich reagencií. Modifikace povrchu celulózy probíhá rovněž známým způsobem, výhodně působením esterů kyseliny chloromravenčí, může však probíhat i jinými modifikačními postupy, jako působením CNBr, kyanurchloridu, karbodiimidu nebo glutaraldehydu .

Modifikace povrchu nosičů obsahujících oxid křemíku probíhá působením tzv. eilanových adhezních činidel jako ,-OR x-(CH_) -S1 - ^Z OR

С П X

NDR kde R jsou alkyly a x jsou např. amino-, epoxy-, diazo-, sulfhydryl- nebo nitroskupiny a reakcí zbylých funkčních skupin známým způsobem s homo- nebo heterofunkčními reagenciemi nebo přímou reakcí s reaktivními skupinami proteinů.

Clq-noslče, které jsou předmětem vynálezu, jsou chemicky staybilní, značně odolné působeni mikroorganismů, 9terilizovatelné a biokompatibilni. Tím je umožněna jejich regenerace . Nosič se zakotveným proteinem se potom používá к vázání a odstraňováni cirkulujících imunokomplexů, přičemž je možno jej použít obvyklým způsobem v průtokovém systému (hemoperfuze, plazmaperfuze) , jakož i vs vsádkovém procesu (při izolaci imunokomplexů pro výzkumy in vitro). Po proběhnutí reakce a oddělení no9Íče od tělních tekutin, 9Θ kterými byl ve 9tyku, sa imunokomplexy odštěpí pů9obením nedenaturujícich činidel, např. 2M roztokem NaCl, takže kovalentně vázaný protein Clq je к diepozici к novému použiti. Postup, který je předmětem vynálezu, používá fyziologickou funkci proteinu Clq pro selektivní a šetrné vázáni imunokomplexů a jejich následovně odstranění z tělních tekutin.

Níže uvedené příklady slouží к bližšímu osvětlení vynálezu:

Příklad 1 g makroporéznlho sférického kopolymeru 2-hydroxyethylmethakrylátu 9 ethylendi-

2 methakrylátem a vylučovací mezi 2x10 D a povrchem cca 70 m /g a reaktivními ехроэкиpinami (1,020 m mol/g no9iče) (Separon Herna 1000 E ) 9Θ smísí s proteinem Clq (1 mg/ml) v PBS-pufru obsahujícím 10 mM EDTA o pH 7,4 a po dobu 48 hodin inkubuje při 4 °C za mírného třepání. Určeni vázaného proteinu Clq probíhá diferenční analýzou roztoku po 280 provedení reakce, reap. stanovením zbylého proteinu při 280 nm (Ej % « 0,6) nebo pomocí jednoduché radiální imunodifúze za užití specifického antisera. Potom se smísí nosič s 1M roztokem etanolaminu v PBS-pufru o pH 7,4, aby byly ještě případně volné re akční skupiny zablokovány. Oále se nosič vymyje 0,01 M fosfátovým pufrem o pH 7,4, kte4

CS 270 658 B1 rý obsahuje 0,05 m NaCl. Protein Clq zakotvený na nosiči se nyní použije к navázání Imunokomplexů. К tomu se nosič na bázi Separonu se zakotveným proteinem Clq 9mísí 8 heparinízovanou plazmou, která obsahuje zvýšenou koncentraci cirkulujících imunokomplexů (pacient s lupus erythematodee vlsceralis) a inkubuje se 2 h při normální teplotě. Po odstraněni nosiče dekantací nebo centrifugaci se nosič promyje nejdříve 0,01 mM fosfátovým pufrem 1 pH 7,4, obsahujícím 0,05 M NaCl, a potom regeneruje 2 M NaCl v P8S-pufru o pH 7,4. Stanovení imunokomplexů se provede pomocí imunoeseje s použitím proteinu Clq na pevné fázi. К určení nespecifické vazby na nosič byla stanovena koncentrace bílkovin ve specifickém sluétu podle Lowryho při 280 nm, byla též provedena ímunoelektroforéza, dvojitá radiální imunodifúze se specifickými antiséry a elektroforéza na polyakrylamidovém gelu. V eluátu bylo možno specificky stanovit cirkulující imunokomplexy. Kontaminující průvodní proteiny nebyly přítomny. Aktivace komplementárního systému nebyla prokázána .

Příklad 2 p

Na aktivovaný Separon Herna E se naváže lidský protein Clq, jak je popsáno v příkladu 1. Tato matrice se naplní do chromátografického sloupce (0 4 mm) a promyje se 0,01 M fosfátovým pufrem, pH 7,4, 0,05 M NaCl. Nato se dávkuje 2 ml heparinizovaná plazmy pacienta se zvýšenou hladinou imunokomplexů a eluuje shora uvedeným pufrem (průtok 10 ml/h). Odštěpeni specificky vázaných imunokomplexů a s tím spojená regenerace matrice ее provádí jak je popsáno v příkladu 1, tj . působením 2M roztoku NaCl v P8S pufru, pH 7,4. Koncentrace bílkovin byla stanovována kontinuálně pomocí průtokového UV-spektrofotometru. Výsledky odpovídají údajům uvedeným v příkladu 1«

Příklad 3

Perlová celulóza aktivovaná estery kyseliny chloromravenčí (aktivační stupeň 63 /Umol/ml) se nejdříve převede postupně do vodného prostředí, protože Je smísena s nem. To se provádí vypíráním nosiče za míchání dostatečně velkým přebytkem (50 ml dioxavypíracího roztoku/ml nosiče) směsí dioxan-voda o tomto složení: 90/10; 70/30; 10/90; 0/100.

Celková doba vypíracího procesu nemá být delší než 10 až 15 minut, eby sežzabránilo ztrátám aktivních skupin v důsledku hydrolýzy. Nato se nosič smísí s proteinem Clq (1 mg/ml) v PBS-pufru, pH 7,4, který obsahuje 10 mM EOŤA a inkubuje se 4 h při pokojové teplotě za mírného třepání. Stanovení vázaného proteinu se provádí diferenčním měřením získané2B0 ho roztoku, případně zbytku, po předchozí dialýze při 280 nm (E^ « 6,8) nebo pomoci jednoduché radiální imunodifúze. Dále se nosič smísí s 1 m roztokem ethanolaminu v PBS-pufru, pH 7,0, aby se zablokovaly ještě případně volná reaktivní skupiny. Nato se nosič vypírá 0,01 a fosfátovým pufrem, pH 7,4, který obdahuje 0,05 M NaCl. Tento na nosiči zakotvený protein Clq se nyní použije pro vázání imunokomplexů. To se provede tak, že perlová celulóza θθ zakotveným pro einem Clq se smísí se sérem pacienta, které obsahuje zvýšenou koncentraci imunokomplexů (pacient s lupus erythematodes visceralls) a inkubuje po dobu 2 h při normální teplotě. Nosič se oddělí dekantací nebo centrifugaci a vymývá 0,01 mM fosfátovým pufrem, pH 7,4, 0,05 M NaCl a nato se regeneruje 2M NaCl v PBS-pufru, pH 7,4. Stanovení imunokomplexů se provede jako v příkladu 1 a 2 pomocí imunoeseje s proteinem Clq zakotveným na pevné fázi. Pro určení nespecifického navázán, na nosič se stanovuje koncentrace bílkovin ve specifickém eluátu podle Lowryho a provádí se imunoelektrof oréza. Případná aktivizace komplementárního systému 96 sleduje kvantitativním určením komplementárních komponent proteinů Clq а C3.

Tabulka 1 ukazuje charakteristický výsledek takové procedury.

CS 270 658 B1

Tabulka 1 cirkulující imunokomplexy ( <ug/ml ekvivalenty agrog. IgG) %

Sérum pacienta před procedurou 90 100 po proceduře 62 69

Aktivizace komplementárního systému nebyla prokázána.

Přiklad 4

Na aktivovanou perlovou celulózu se jako v přikladu 3 naváže protein Clq. Tato matrice se náplni do chromátografické kolony a vymývá se 0,01 M fosfátovým pufrem, pH 7,4, 0,05 M NaCl. Nato se nanese na kolonu 1 ml sera pacienta se zvýšenou hladinou imunokomplexů a eluuje výše uvedeným pufrem (průtok 10 ml/h). Odštěpeni specificky vázaných imunokomplexů a s tím spojená regenerace matrice probíhá, jak je popsáno v příkladu 1, 2M roztokem NaCl v PBS-pufru, pH 7,4. Koncentrace bílkovin byle sledována kontinuálně pomocí průtokového UV fotometru. Výsledky byly obdobné výsledkům uvedeným v přikladu 3.

Příklad 5

Porézní skleněné kuličky s průměrem pórů 135 nm byly aktivovány varem v 30% kyselině dusičná a vypíráním neutrálním roztokem silanováho spojovacího činidla NB 114 (Aminopropyltriethoxysilan, VEB Chemiewer Nunchritz) ve směsi etanol/voda (1 : 1), pH 3,5, po dobu 4 h při 60 °C a 6 h při 120 °C. Po vypráni směsí etanol/voda a po několikanásobném vyprání PBS-pufrem, pH 7,4, se takto funkcionalizované sklo inkubuje 2% glutardialdehydem v 0,1 M fosnalizované sklo inkubuje 2% glutardialdehydem v 0,1 M fosfátovém pufru, pH 6,8 po dobu 2 h při 37 °C. Po dalším vymytí PBS-pufrem se smísí aktivované sklo s proteinem Clq (500 /Ug/ml) v PBS-pufru, pH 7,4, který obsahuje 10 mM EOTA a inkubuje při 37 °C po dobu 4 h. Po dalších vymývacich procesech se ještě volné aldehydické skupiny blokují pomoci 1M roztoku ethanolaminu. Po opakovaném vypíráni 0,01 M fosfátovým pufrem, pH 7,4, který obsahuje 0,05 M NaCl, se tato matrice se zakotveným proteinem Clq použije к navázání cirkulujících imunokomplexů. To se provede smísením séra odebraného pacientovi s lupus erythematodes visceralis), obsahujícího zvýšenou koncentraci cirkulujících imunokomplexů se skleněnými kuličkami, na nichž byl zakotven protein Clq a inkubací po dobu 2 hod. při pokojové teplotě. Nosič se oddělí centrifugací nebo dekantací a vymývá 0,01 M fosfátovým pufrem, pH 7,3, 0,05 M NaCl, načež se regeneruje 2M NaCl v PBS-pufru, pH 7,4. Stanovení imunokomplexů bylo provedeno znovu pomocí imunoeseje s proteinem Clq na pevné fázi. Pro urěení nespedifického navázáni na nosič se stanovuje koncentrace bílkovin ve speicfickém eluátu podle Lowryho a provádí se imunoelektroforéza. Tabulka 2 ukazuje charakteristický výsledek této procedury.

Tabulka 2 cirkulující imunokomplexy ( /jg/ml ekvivalenty agrag. IgG)

Sérum pacienta před procedurou 90 po proceduře 68

100

Claims (6)

1. P 8. E 0 M ě T VYNÁLEZU

   1« Selektivní ad9orbens pro vázání imunokomplexů z tělních tekutin na základě biospecifických interakcí na pevných fázích, vyznačené tím, ie jako pevnou fázi obsahují nosiče, například kopolymery 2-hydroxyethylmethakrylátu a ethylenmethakrylátu něco materiály obsahující celulózu nebo oxid křemíku, které obsahuji protein Clq kovalentně vázaný pomocí spojovacích můstků.
2. 2. Selektivní adsorbens podle bodu 1, vyznačené tím, že pevné fáze tvořící nosiče sestávají ze sférických, plenárních nebo vláknitých tvarových tělísek nebo jsou nanese ny jako vrstvy, filmy nebo laky.
3. 3. Selektivní adsorbens podle bodu 2, vyznačené tím, že tvarová tělíska tvořící no siče jsou uspořádána sintrovánim, tkaním, slepením nebo uložením v obalu, například do planární formy, nebo tvoří náplně kolon.
4. 4. Selektivní adsorbens podle bodů 1 až 3, vyznačené ti·, že materiál nosiče tvoří sférické kopolymery poly(hydroxyethylmethakrylátu), jejichž velikost Částic činí 10 až 1 000 ^um a jejíchž průměr pórů je v rozmezí 10 až 1 000 no.
5. 5. Selektivní adsorbens podle bodů 1, 2, 3 vyznačené tím, že materiál na bázi celulózy je perlová celulóza s velikosti částic 10 až 600 yum a průměrem pórů 10 až 1 000 nm.
6. 6. Selektivní adsorbens podle bodů 1 až 3, vyznačené tía, že materiály nosičů obsahující oxid křemíku mají kulovitou formu částic, jejichž velikost činí 1 až 1 000 yum, průměr pórů 0,05 až 100 /Um, nebo jsou utvořeny ve tvaru vláken.