CS270067B1 - N-[2-(2-Fosfonylethoxy)ethyl3 deriváty heterocyklických bází a způsoby jejich přípravy - Google Patents

Abstract

Předmětem řešení jsou N-C2-(2-fosfonylethoxy)ethyl!deriváty purinových a pyrimidinových heterocyklických bázi a způsoby jejich chemické syntézy. Tyto látky patří do oboru biochemikálií a látek s využitelným biologickým účinkem. Tato nová skupina látek ze skupiny acyklických analogů nukleotidů se připraví reakcí sodné soli příslušné heterocyklické báze s dialkylestery kyseliny 2-( 2-chlorethoxy)ethylfosfonové. Intermediárně vzniklé diethylestery se převedou na výsledné I produkty bud přimo reakci s halogentrimethylsllai nem nebo se nejprve parciálně hydrolysují alkaiicj kými hydroxidy na monoethylestery, poskytující 1 předmětené látky rovněž reakcí s halogentrimethyl— * silanem.

Description

Předmětem vynálezu jsou N-[2— ( 2-fcefonylethoxy)ethyl3 deriváty heterocyklických bází a způsoby jejich přípravy.

Mezi skupinou N-fosfonylalkoxyalkylderivátů heterocyklických bází jsou četné významné látky s možnostmi praktického použití. Tak např. N-(2-fosfonylmethoxyethyl)deriváty purinových bází (adeninu, 2,6-diaminopurinu a guaninu) jsou významná virostatika (čs. autorská osvědčení í

č. 263951, č. 263952 a 264222) se specifickým účinkem proti DNA virům. O-Fosfonylmethylethe- ^: ry 9-( 2,3-dihydroxypropy ) adeninu mají také chemosteriiizační účinek na některé druhy hmyzu (autorské osvědčení č. 23o341). Všechny dosud zmíněné látky obsahují charakteristickou fosfonylmethoxylovou funkční skupinu (—CHjP (θ) (θ·Ό 2 )·

Podstatou vynálezu jsou nové látky, N-[2-(2-fosfonylethoxy)-ethyl3derlváty heterocyklických bází obecného vzorce I b-ch₂ch₂och₂ch₂p(o)(oh)₂ (i), kde B je zbytek purin-9-ylový nebo purin-7-ylový, substituovaný v poloze 6 hydroxy-, amino-, methylthioskupinou nebo atomem chloru a v poloze 2 atomem vodíku nebo aminoskupinou, či zbytek uracil-l-ylový nebo cytosin-1—ylový, .

Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy látek vzorce I, spočívající v tom, že se sodná sůl připravená reakcí heterocyklické báze bučí samotné nebo chráněné acylací, s výhodou benzylací, aminoskupin nebo O-alkylací, s výhodou methylací, hydroxyskupin, s ekvlmolámím množstvím hydridu sodného v aprotickém rozpouštědle, s výhodou v dimethylformamidu, uvede v témže rozpouštědle při teplotách 2o °C až 14o °C do reakce s jedním až třemi molámími ekvivalenty diethylesteru kyseliny 2—(2-chlorethoxy)ethylfosfonové vzorce II

C1CH₂CH₂OCH₂CH₂P(O)(OC₂H₅)₂ (li), vzniklý meziprodukt obecného vzorce III b-ch₂ch₂och₂ch₂p(o)(oc₂h₅)₂ ( ΠΙ ) , kde B má stejný význam jako ve vzorci I, se izoluje krystalizací nebo s výhodou chromatografií na silikagelu, uvede do reakce s bromtrimethyl silanem v aprotickém rozpouštědle, s výhodou v dimethylformamidu, acetonltrilu nebo chlorovaných uhlovodících, a to při teplotě 2o °C až 4o °C, po odpaření rozpouštědla se směs rozloží vodou a produkt obecného vzorce I se izoluje s výhodou chromatografií na ionexu ne- « bo hydrofobizovaném silikagelu.

Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy látek obecného Vzorce I, spočívající v tom, že se látky obecného vzorce III uvedou do reakce s o,5 až 2 M roztokem hydroxidů alkalických ve vodě nebo jejich směsích s methanolem, ethanolem nebo dioxanem s obsahem nejméně 5o objemových procent vody , a to při teplotách 2o °C až loo °C, směs se neutralizuje minerální nebo organickou kyselinou, nebo s výhodou katexem v kyselé formě a monoestery obecného vzorce IV '

O

B-CH₂CH₂ ^OCH2^CH2P-^OC2^H ₅ OH ( IV ) .

kde B má stejný význam Jako ve vzorci I,

CS 27oo67 Bl izolované ionexovou chrom atografií se uvedou do reakce s bromtrimethylsilanem za výše uvedených podmínek a látky obecného vzorce I se izolují způsobem uvedeným výše.

Klíčovou sloučeninou pro postup přípravy látek obecného vzorce 1 podle vynálezu je diethylester fosfonové kyseliny vzorce II. Tato látka se s výhodou připraví reakcí triethyllosfitu s přebytečným bis(2-chlorethyl)etherem za teploty varu směsi a s oddestilováváním vznikajícího ethylchloridu. Tato látka byla také popsána v literatuře (L.Marier, M.M. Crutchfield, Phosphorus Sulfur 5f 45 (1978) ). Po skončení reakce se diester II izoluje frakční destilací ve vakuu. Je dostatečně stálý a může být uchováván při teplotě místnosti.

Heterocyklická báze se pro reakci používá ve formě sodné soli, kterou lze připravit s výhodou přímo ze suspenze báze v příslušném rozpouštědle (nejlépe dimethylformamidu) přidáním jednoho molárního ekvivalentu hydridu sodného (lze použít přímo komerční 5o až 6o % disperzi hydridu sodného v parafinu). Ve většině případů se báze použije bez předchozí úpravy; ve zvláštních případech (např. pro zvýšení rozpustnosti nebo tehdy, může-li docházet při reakci ke vzniku více možných N-isomerů) se doporučuje použít heterocyklické báze vhodně substituované chránícími skupinami nebo báze jinak modifikované, která po provedení reakce může dal ší chemickou reakcí buď vzniklého meziproduktu nebo příslušné látky vzorce I poskytnout konečný produkt žádané struktury. Tak např. deriváty adeninu nebo 6-methylthiopurin poskytují v dimethylformamidu za těchto podmínek témě£ výhradně N(9)-isomery látek vzorce I a příslušné báze mohou být použity přímo; hypoxanthin však dává přednostně N(7)— isomer, takže jeho N(9)-substituovaný derivát vzorce I se nejsnáze připraví deaminací adeninového fosfonátu vzorce I kyselinou dusitou nebo jejím esterem. Cytosin a jeho 5—substituované deriváty mohou být sice pro reakci s látkou vzorce II použity přímo, ale výhodnější se Jeví např. předchozí benzoyl ace 4—aminoskupiny. U uracilu a thyminu, případně dalších 4—oxopyrimidinových bází dochází za výše uvedených podmínek ke vzniku směsi N(l)— a N(3)—isomerů látky I. pro přípravu N(l)-isomerů těchto bází je proto výhodné použít k reakci s látkou II sodných solí příslušných 4— methoxy—2—pyrimidonů, které jsou snadno dostupné a po izolaci příslušného produktu vzorce I lze odštěpit chránící 4-O-methylskupinu kyselou hydrolýzou. Rovněž u guaninu je použití samotné báze či jejího N —acetylderlvátu nevhodné nejen proto, že je výtěžek látky vzorce III (B-guanin-9-yl) celkově nízký, ale především proto, že při reakci vzniká směs N(9)- a N(7)-isomeru látek vzorce III. Mnohem účelnější je poižít místo guaninu sodné soli 2-amino-6-chlorpurinu; v tomto případě probíhá alkylace látkou vzorce II přednostně do polohy N(9) a vzniklý diester vzorce III (B-2—amino—6—chlorpurin-9—yi) lze snadno hydrolýzou zředěnou kyselinou (např. kyselinou chlorovodíkovou) a následující reakcí s bromtrimethylsilanem převést na guaninový derivát vzorce 1 (B-guanin-9-yl).

Po provedení kondenzace a odpaření dimethylformamidu ve vakuu lze surový produkt vzorce III snadno extrahovat např. chloroformem a v některých případech získat v čistém stavu přímou krystalizací, např. z methanolu. Ve všech případech se dá použít chromatografie na silikagelu. Meziprodukt vzorce III je obvyklé krystalický, dobře charakterizovatelný jak UV-spektrem, NMR-spektrem, tak i teplotou tání. Jeho výtěžky se pohybují kolem 5o %, v některých případech jsou vyšší. Zvýšení výtěžku lze někdy dosáhnout použitím přebytku činidla II, zvláště v těch případech, kdy reakce probíhá pomalu a může být doprovázena částečným rozkladem látky vzorce II (eliminací chlorovodíku).

Při použití di methyle steru obdobného látce vzorce II v postupu přípravy látek vzorce I u— vedeným způsobem může docházet ke vzniku N—methylderivátů příslušné heterocyklické báze. Proto je vždy výhodnější užívat pro tuto reakci diethylester vzorce II. Reakce není ovšem omezena pouze na tuto látku; stejně mohou být připraveny i Jiné dialkyl— nebo aralkylestery vzorce III z odpovídajících synthonň vzorce II.

štěpení ethylesterových vazeb v látkách vzorce III se nejvýhodněji provede reakcí s bromtrimethylsilanem (A. Holý, I. Rosenberg, Collect. Czech. Chern. Commun. 47, 3447 (1982) ). Tuto reakci je možné provádět v chloroformu, dichlor me lhánu nebo dalších chlorovaných uhlovodících nebo v dimethyiformamidu, ale jako prakticky nejvhodnější vzhledem k chemickému charakteru.

CS 27oo67 Bl rozpouštěcím vlastnostem a teplotě varu se jeví acetonitril. Pro reakci se používá slabého přebytku činidla (cca 2o %) a provádí se při teplotě místnosti. Po odpaření rozpouštědla ve vakuu a odstranění přebytku činidla kodestilací s acetonitrilem nebo jiným inertním rozpouštědlem se zbytek rozloží vodou (s výhodou v přítomnosti amoniaku nebo těkavého pufru, např. trlethylamoniumhydrogenkarbonátu). Získá se příelušná sůl látky obecného vzorce I, kontaminovaná bromidem. Odsolení a purifikace látky vzorce I se nejvhpdněji provede lonexovou chromatografií buď přímo na anexi nebo postupnou chromatpgratií na katexu a anexu (postup je určen vlastnostmi heterocyklické báze v látce vzorce 1). Provede-li .se konečná chromatografie např. na anexu v acetátové formě a látka vzorce I se eluuje kyselinou octovou, získá se po odpaření eluátu produkt ve formě kyseliny, který je možno v řadě případů čistit dodatečnou krystalizací z vody. V ostatních případech, kdy se po chromatografil získá látka vzorce I ve formě soli (např. amonné nebo triethylamonné), je ji vhodné převést na alkalickou (sodnou, lithnou) sůl nejlépe chromatografií na katexu v příslušném cyklu. Tyto soli se získají srážením koncentrovaných vodných roztoků acetonem nebo ethaholem a Jsou při uchovávání zcela stálé. Dostatečně stálé jsou i látky vzorce I ve formě volných krystalických kyselin (obvykle tvoří hydráty), pokud vlivem kyselosti nedochází k chemickým změnám na heterocyklické bázi látek vzorce I.

Ke stejnému účelu lze místo bromtrlmethylsilanu užít i jodtrimethylsilan za zcela analogických podmínek provedení reakce i zpracování. Z praktických důvodů (cena a dostupnost jodderivátu) však tato varianta není výhodná.

Hydrolýza jedné z esterových vazeb může být provedena i v alkalickém prostředí. Za těchto podmínek, tj. reakcí látek vzorce III ve vodném hydroxidu alkalickém nebo jeho směsích s ethanolem, methanolem, dioxanem apod. při teplotě místnosti nebo zvýšené teplotě se však odštěpuje pouze jedna z obou esterových funkcí, takže produktem reakce je látka obecného vzorce IV. ‘

Tato cesta má své opodstatnění v těch případech, kdy látka obecného vzorce III obsahuje acylové (např. benzoylové) chránící skupiny, které se touto reakcí současně odštěpí. Látky vzorce IV však již nelze dobře izolovat chromatografií na silikagelu a k jejich čištění je zapotřebí použít ionexové chromatografie za obdobných podmínek jako je uvedeno u čištění látek obecného vzorce I. Pro odštěpení zbývající esterově vázané skupiny je nutné provést reakci s bromtrimethylsilanem stejně, jak je popsáno výše. Před reakcí je třeba látku vzorce IV dobře vysušit, I v tomto případě je třeba použít nadbytek (2o až 25 %) činidla k dosažení úplné konverze.

Na rozdíl od N-(2-fosfonylmethoxyethyl)derivátů, z nichž mnohé mají protivirový účinek (čs. autorská osvědčení č. 263951 a č. 264222), neprojevují látky obecného vzorce I žádnou významnou účinnost proti virům. Mohou však najít uplatnění např. jako chemosterilanty hmyzu. Při perorálním podání zředěných vodných roztoků látek obecného vzorce I ad libitum např. né— kterým druhům ploštic (Pyrrhocoris apterus L·.), a to jak nymfám posledního instaru, tak i dospělcům, dojde v závislosti na koncentraci látky k výraznému snížení počtu vykladených vajíček, až k úplné zástavě kladení a současně k výraznému omezení až úplnému potlačení jejich líhnivosti. Tento účinek je závislý na struktuře látek vzorce I (charakteru heterocyklické báze) a je odlišitelný od prosté toxicity. Přehled tohoto účinku je uveden v tabulce 1. Chemosterilační účinek U tohoto druhu hmyzu byl nalezen rovněž u látek formálně obdobných sloučeninám obecného vzorce I, tj. fosfonylmethyletherům glycerolu a 9—(2,3—dihydroxypropyl)adeninu (čs. autorské osvědčení č. 233626). Uvedený účinek u látek obecného vzorce I však není v žádném o— hledu předvídatelný, protože látky vzorce 1 ee od výše uvedené skupiny zásadně liší jak přítomností charakteristické fosfonylethyletherové funkce, tak především tím, že neobsahují asymetrický uhlíkový atom, jehož přítomnost je nezbytná pro vyvolání biologických účinků u fosfonylme thylde riválů.

Významnou vlastností látek obecného vzorce I Je jejich stálost chemická i biologická. Vazba fosfonové kyseliny je neodštěpitelná běžnými enzymy, degradujícími např. monoestery kyseliny fosforečné, a je stálá vůči působení zředěných organických a minerálních kyselin, i proti amoniaku, aminům á zředěným vodným louhům.

CS 27oo67 Bl

V dalším je vynález osvětlen příklady způsobů provedení výroby a použití látek obecného vzorce I, aniž se tím jakkoli omezuje.

Příklad 1

Směs bis(2-chlorethyl)etheru (60 ml) a triethylfosfitu (18 ml) se zahřívá lo h při 16o °C v 25o ml baňce, rozpustí v loo ml benzenu a vnese na sloupec 5oo g silikagelu. Sloupec se eluuje směsí benzen-ethanol (99 : 1) a jednotlivé frakce (po 3o ml) se testují chromatografií na destičkách silikagelu v benzenu. Frakce obsahující produkt (detekce postřikem p-nitrobenzylpyridiniumbromidu a následujícím vystavením parám amoniaku) se spojí, odpaří ve vakuu a suší při 13 Pa nad oxidem fosforečným. Získá se 52 % diethylesteru kyseliny 2-(2-chlorethoxy)ethylfosfonové Jako bezbarvého oleje. Pro ΟθΗ₁₈Ο1Ο₄Ρ (244,7) vypočteno 14,49 % Cl, 12,66 % P; nalezeno 14,3o % Cl, 12,βο % P. Hmotnostní spektrum í 245 (M* + 1),

Suspenze 13,5 g adeninu a 3,4 g hydridu sodného v 7oo ml dimethylformamidu se míchá při 8o °C 1 h za vyloučení vlhkosti, poté se během 2 h přikape roztok 22,5 g diethylesteru kyseliny 2-(2-chlorethoxy)ethylfosfonové ve 2oo ml dimethylformamidu a směs se míchá 12 h při 8o °C za vyloučení přístupu vlhkosti. Poté se směs odpaří při 5o °C/2 kPa a zbytek odpaří za stejných podmínek dvakrát e 2oo ml toluenu. Odparek se extrahuje vroucím chloroformem (1 1), filtruje přes vrstvu křemeliny, promyje 2oo ml chloroformu a filtrát se zahustí ve vakuu při 3o °C na objem cca 2oo ml. Tento roztok se vnese na sloupec 5oo g silikagelu (3o až 4o ) a sloupec se promyje chloroformem (1 1). Elucí směsi chloroformu a melhanolu (9 i 1), odpařením spojených frakcí produktu (podle chromatografie na destičkách silikagelu ve směsi chloroíorm-methanol ,4:1; Rp o,55) a krystalizací odparku z etheru (petrolether do zákalu) se získá 9-[2-(2-diethoxyfosfonylethoxy)ethyl]adenin (lil, B-adenin-9—yl) ve výtěžku 19,5 g (62 %). T.t. 6o °C. Pro ^Cj3^H22^5°4^P (³⁴³·⁴) vypočteno 45,46 % C, 6,46 % Η, 2o,4o % N, 9,o4 % P; nalezeno 45,lo % C, 6,5ο % Η, 2o,25 % N, 8,93 % P.

Tento produkt se rozpustí v 6oo ml acetonitrilu, přidá se 38 ml bromtrimethylsilanu a směs se ponechá stát v uzavřené baňce 24 h při teplotě místnosti. Odpaří se při 4o °C/2 kPa, přidá se 2oo ml acetonitrilu a znovu odpaří za týchž podmínek. K odparku se přidá 5oo ml o,4 M vodného roztoku triethylamoniumhydrogenkarbonátu (pH 7,5) a pH roztoku se udržuje přidáváním triethylaminu mezi 8 až 9 do konstantní hodnoty (cca 1 h). Poté se směs odpaří při 4o °C/ 2 kPa a zbytek za stejných podmínek odpaří s vodou (třikrát po loo ml). Tento odparek se rozpustí v 3oo ml vody a vnese na sloupec 5oo ml katexu (např. Dowexu 5o X 8) (n⁺ - forma). Sloupec se promývá vodou do poklesu kyselé reakce eluátu a ztráty UV—absorbce při 26o nm.

Pak se eluuje 2,5 % vodným amoniakem a jímá se eluát absorbující při 26o nm. Po odpaření ve vakuu ee zbytek rozpuštěný v loo ml vody vnese na sloupec 4oo ml středně bazického anexu (např. Sephadexu A-25 (HCO^^- -forma)). Sloupec se eluuje vodou do poklesu UV-absorbce eluátu při 26o nm a potom gradientem o až o,4 M triethylamoniumhydrogenkarbonátu (pH 7,5) (po 2 1). Průběh eluce se sleduje kontinuálním měřením UV-absorbce při 26o nm. Frakce produktu se odpaří ve vakuu, zbytek se odpaří s vodou (třikrát loo ml) a v loo ml vody vnese na sloupec 2oo ml katexu (např. Dowexu 5o X 8) (H⁺—forma). Sloupec se eluuje vodou, eluát absorbující při 26o nm se odpaří ve vakuu a ke zbytku rozpuštěnému v 2o ml vody se přidá 2oo ml acetonu a 2oo ml etheru. Vyloučený produkt se odsaje, promyje etherem (2oo ml) a suší při 13 Pa nad oxidem' fosforečným. Získá se 17 g (84 %) sodné soli 9-£2-(2-fosfonylethoxy) ethyl) adeninu —3 — fosfát) (i, B-adenin-9-yl). Elektroforetická pohyblivost E

Up o,75 (vztaženo na uridin— (pH 7,5). Pro C_gH N₅°₄PNa₂ (313,4) vypočteno 21,14 % N, 9,37 % P; nalezeno

2o,86 % N, 9,12 % P. UV-Spektrum (pH 2) :' max 257,7 nm (e _mnx - 114oo). R_p o,17 (2-propanoi-vodný amoniak-voda, 7:1: 2).

Příklad 2 A

K suspenzi 4.3 g N -benzoylcytosinu v 8o ml dimethylformamidu se přidá 46o mg hydridu sodného a směs se míchá 1 h při 2o °C. Přidá še roztok 6 g diethylesteru kyseliny 2-(2-chlorethoxy )ethylfosfonové (viz příklad 1) v 2o ml dimethylformamidu a směs se míchá 2o h při loo °C

CS 27oo67 Bl 5 pod chlorkalciovým uzávěrem. Výsledný roztok se odpaří při 4o °C/13 Pa dosucha a zbytek se extrahuje 5oo tni vroucího chloroformu. Tento extrakt ee odpaří dosucha ve vakuu a rozpustí v 2oo ml ο,ΙΜ methoxidu sodného v methanolu. Roztok se ponechá stát přes noc při 2o °C, neutrallsuje přidáním katexu (např. Dowexu 5o Χθ) v H⁺-formě, suspenze alkalizuje triethylaminem, odsaje a ionex se promyje 3oo ml methanolu. Filtrát se odpaří ve vakuu, odparek rozpustí v 2oo ml vody a extrahuje 3 x 5o ml etheru, vodná vrstva se zahustí ve vakuu na poloviční objem a roztok se vnese na sloupec 3oo ml katexu (např. Dowexu 5o X 8) (H⁺ -forma). Sloupec se eluuje vodou (5oo ml) a směsí methanol-voda (3:7) do poklesu UV-absorbce při 26o nm na původní hodnotu. Potom se eluuje 2,5% vodným amoniakem a jímá se eluát absorbující při 26o nm. Ten se odpaří ve vakuu, zbytek se odpaří s ethanolem (2x5o ml) a nakonec suší při 2o °C/13 Pa nad oxidem fosforečným 24 h. Získá se 4^2 g (66 %) monoesteru vzorce IV (B-cytosln—1-yl). Elektroforetická pohyblivost (viz příklad 1) o,lo, Rp, - o,34 (TLC, chloroform-methanol, 4:1).

K tomuto odparku se přidá loo ml ácetonitrilu a lo ml bromtrimethylsilanu, směs se ponechá stát 48 h při 2o °C a odpaří ve vakuu. Zbytek se znovu odpaří se loo ml ácetonitrilu. rozpustí v 2oo ml o,4M triethylamonlumhydrogenkarbonátu a po 2 h se odpaří ve vakuu. Odparek se odpaří s methanolem (3xloo ml) a rozpustí v loo ml vody. Tento roztok se vnese na sloupec 2oo ml katexu (např. Dowexu 5o X 8) (H^T —forma), eluuje vodou do poklesu kyselé reakce eluátu a potom 2,5 % vodným amoniakem. Amoniakální eluát se odpaří dosucha ve vakuu, rozpustí v 5o ml vody, alkalisuje amoniakem a vnese na sloupec 2oo ml silně bázického anexu (např. Dowexu X 2) (acetát). Sloupec se eluuje vodou (5oo ml) a pak 1M kyselinou octovou. UV-absorbující kyselý eluát se odpaří dosucha, zbytek kodestiluje vodou ve vakuu (4 x 2o ml), rozpustí v malém množství horké vody, přidá se 5 objemových dílů ethanolu a ether do zákalu. Produkt, který vykrystaluje v .lednici, se odsaje, promyje etherem a vysuší při 13 Pa nad oxidem fosforečným. Získá se 2,o g l-C2-(2-fosfonylethoxy)ethyU cytosinu (i, B-cytosin-l-yl). R_ - o,17 (2-propanol-konc. amoniak-voda, 7:1:2) E_IT -o,85. T.t. 18o °C. Pro C_H,.N_O_P j? up o (263,3) vypočteno 36,49 % C,. 5,36 % H, 15,96 % N, 11,79 % Pj nalezeno 34,46 % C, 6,36 % H, 15,97 % N, lo,57 % P. UV-Spektrum (pH 2) :Λ__-28o nm (£ __- loooo).

m&x m&x

Příklad 3

Suspenze 3,o g 2,6-diaminopurinu a o,48 g hydrldu sodného ve loo ml dimethylformamidu se míchá 1 h při loo °C a poté se přidá 6,2 g diethylesteru kyseliny 2-(2-chlorethoxy)ethylfosfonové (viz příklad 1) v 2o ml dimethylformamidu. Směs se míchá 18 h při loo °C pod chlorkalciovým uzávěrem a odpaří při 6o °c/13 Pa. Odparek se kodestiluje dvakrát 5o ml toluenu za týchž podmínek a zbytek se extrahuje 2oo ml vroucího chloroformu. Suspenze se filtruje přes vrstvu křemeliny a filtrát se odpaří ve vakuu* Zbytek se nanese v 5o ml chloroformu na sloupec 4oo ml silikagelu a sloupec se eluuje směsí chloroformu s rostoucí koncentrací methanolu. Produkt III (B-2,6-diaminopurin-9-yl), který se eluuje směsí chloroform-methanol (92,5 : 7,5), se získá odpařením ve vakuu a vysušením ve formě amorfní pěny ve výtěžku 4.6 g (64 %). R_ - o,4o (TLC na silikagelu, chloroform-methanol, 4:1). i* ·

Tato látka se rozpustí v loo ml ácetonitrilu, přidá se lo ml bromtrimethylsilanu a směs se ponechá stát 48 h při teplotě místnosti. Odpaří se při 4o °C/2 kPa, kodestiluje s 5o ml acetonitrilu za stejných podmínek a zbytek se rozpustí v 2oo ml o,4M triethylamoniumhydrogenkarboná— tu pH 7.5. Po 3o min se odpaří ve vakuu dosucha a zbytek se odpaří ve vakuu s methanolem (3 x loo ml). Odparek se v 5o ml vody nanese na sloupec 2oo ml katexu (např. Dowexu 5o X a) (H⁺ -forma) a sloupec se vymyje vodou do ztráty kyselé reakce eluátu a UV-absorbce při 26o nm. Pak se sloupec eluuje 2,5 % vodným amoniakem a Jímá se UV-absorbující eluát. ’ Po odpaření ve vakuu se surový produkt v 25 ml vody alkalisované amoniakem na PpH 8,5 nanese na sloupec 2oo ml silně bázického anexu (např. Dowexu 1X2) (acetát) a sloupec se eluuje vodou do poklesu UV-absorbce při 26o nm na původní hodnotu. Ionex se suspenduje vil 2M kyseliny mravenči a suspenze se uvede za míchání do varu. Za horka se filtruje a ionex

CS 27oo67 Bl se promyje 1 1 vroucí 2M kyseliny mravenčí. Spojené filtráty se odpaří ve vakuu a zbytek se kodestiluje vodou (5 x loo ml) ve vakuu. Odparek se rozpustí ve vroucí vodě, přidá se 6 objemových dílů ethanolu a ether do vzniku stálého zákalu. V lednici vykrystaluje produkt, který se odsaje, promyje etherem a suší ve vakuu. Výtěžek 3,0 g 9-C2-(2—fosfonylethoxy)ethylj-2-aminoadeninu, netaje do 26o °C. Pro C_gH_lgN₆PO₄ (3o2,3) vypočteno 35,75 % C, 5,oo % H, 27,8o % N, 10,27 % P; nalezeno 35,46 % C, 4,8o % H, 27,75 % N, lo,34 % P. EyP (viz příklad 1) o,66, Rp o,o7 (PC, 2-propanol-konc. vodný amoniak-voda, 7:1: 2). UV-Spektrum (pH 2) :

Λ 256 nm, 287,6 nmjA , 267,6 nm.

max mln

Příklad 4

K roztoku 3,32 g 6—methylthlopurinu v 8o ml dimethylformamidu se přidá o,48 g hydridu sodného a směs se míchá 1 h při 5o °C. Přidá se 6,4 g diethylesteru 2-(2-chlorethoxy)ethylfosfonové kyseliny (viz příklad 1) a směs se zahřívá 18 h při loo °C za vyloučení vlhkosti. Odpaří se při 4o °C/13 Pa, extrahuje 4oo ml horkého chloroformu a extrakt se odpaří ve vakuu. Zbytek se nanese na sloupec 4oo ml silikagelu v chloroformu, sloupec se eluuje nejprve chloroformem (1 1) a potom směsí chloroform-methanol, 95 : 5). Frakce produktu (podle TLC ve směsi chloroform-methanol, 9 : 1, R_ - o,68 ) se spojí, odpaří ve vakuu a vysuší při 13 Pa nad oxidem fosfořečným. Výtěžek amorfní pěny látky III (B-6—methylthiopurin-9-yl) je 4,o g (53,5 %). Tento produkt se rozpustí v 8o ml acetonitrilu a po přidání bromtrimethylsilanu (8 ml) se směs ponechá stát 48 h při teplotě místnosti. Odpaří se při 4o °C/2 kPa, kodestiluje se za týchž podmínek s 5o ml acetonitrilu a zbytek se rozpustí v loo ml O,4M triethylamoniumhydrogenkarbonátu (pH 7,5). Po 3o min stání se odpaří ve vakuu, kodestiluje methanolem (4 x 5o ml) a odparek v 5o ml vody se vnese na sloupec 2oo ml katexu (např. Dowexu 5o X 8) (H⁺ -forma). Sloupec se eluuje vodou do poklesu kyselé reakce a UV-absorbce eluátu. Pak se sloupec promývá 2,5% vodným amoniakem a jímá se W—absorbující frakce při 26o nm. Odparek tohoto eluátu se rozpustí v 2o ml vody a vnese na sloupec loo ml katexu (např. Dowexu 5o X 8) (Na⁺ -forma). Sloupec se promývá vodou, UV-absorbující eluát se odpaří ve vakuu na objem cca lo ml, přidá se 2oo ml ethanolu a 2oo ml etheru, vyloučený produkt se odsaje, promyje etherem a vysuší při 13 Pa nad oxidem fosforečným. Získá se 2,8 g sodné soli 9-C2-(2—fosfonylethoxy)ethylJ-6-methylthiopurinu (i, B-6-methylthiopurin-9-yl). Netaje do 26o °C. ^up příklad 1) - o,73.

Pro C, H.A'PO.SNa. (362,4) vypočteno 33,14 % C, 3,61 % H, 15,47 % N, 8,57 % P, 8,85 % S; 1U 1«3 4 4 &

nalezeno 33,34 % C, 3,75 % H, 15,44 % N, 8,93 % P, 9,o? % S.

Příklad 5

Směs 2,52 g 4-methoxy-2-pyrimidonu a o,48 g hydridu sodného v 8o ml dimethylformamidu se míchá 1 h při 2o °C a přidá se roztok 6,2 g diethylesteru 2— (2—chlorethoxy)ethylfosfono— vé kyseliny v 2o ml dimethylformamidu. Směs se míchá pod chlorkalciovým uzávěrem 2o h při loo °C a poté se odpaří při 5o °C/13 Pa dosucha. Zbytek se kodestiluje toluenem (2 x 5o ml) za týchž podmínek a extrahuje vroucím chloroformem (5oo ml). Extrakt se odpaří ve vakuu a zbytek chromatografuje na sloupci 3oo g silikagelu chloroformem a poté směsí chloroform-methanol (98 : 2). Odpařením frakcí produktu ve vakuu a vysušením při 13 Pa nad oxidem fosforečným se získá 2,8 g látky III ,(B-4-methoxy-2—pyrimidon—1—yl) jako bezbarvého oleje, R_p - o,7o (TLC, chloroform-methanol, 9:1). Tento produkt se rozpustí v 6o ml acetonitrilu, přidá se 6 ml bromtrimethylsilanu a směs se ponechá stát 24 h při teplotě místnosti. Odpaří se při 4o °C/2 kPa, zbytek kodestiluje 5o ml acetonitrilu a rozpustí v loo ml o,4M triethylamoniumhydrogenkarbonátu pH 7,5. Po 1 h se tento roztok odpaří ve vakuu a kodestiluje methanolem (4 x 5o ml). Odparek se ve loo ml 8o% vodné kyseliny octové vaří pod zpětným chladičem 8 h, odpaří se při 4o °C/ /2 kPa a kodestiluje vodou (5 x 5o ml) za týchž podmínek. Zbytek se v 2o ml vody vnese na sloupec 15o ml katexu (např. Dowexu 5o X β) (l>i⁺ -forma) a sloupec se eluuje vodou. Jímá se frakce eluátu absorbující při 26o nm, odpaří se ve vakuu a zbytek se rozmíchá v 8o ml ethanolu. Přidá se 8o mi acetonu a míchá se 1 h. Produkt se odsaje, promyje etherem a vysuší při 13 Pa nad oxidem fosforečným. Získá se 1,6 g lithné soli l-[ 2—(2-fosfonylelhoxy )ethyl] uracilu

CS 27oo67 Bl (i, B-uracil-l-yl), R_p - o,21 (PC, 2-propanol-konc.vodný amoniak-voda, 7:1: 2), E o,96 (viz příklad 1). UV-Speklrum (pH 2) !A_max 26o nm (t_max “ loooo). Pro

Up ^8^11^2^6^^2 (276 1) 'VPO^teno 34,8o % C, 4,o2 % H, 10,15 % N, 11,24 % P; nalezeno 34,52 % C, 4,21 % Η,’ 1ο,ο6 % N, 11,2o % P.

Příklad 6

Směs 3,4 g 2—amino—6-chlorpurinu, 5,6 g uhličitanu draselného, 6 g diethylesteru 2—(2—chlorethoxy)ethylíosfonové kyseliny a loo ml dimethylformamidu se míchá 3o h při loo °C a za horka zfiltruje. Sraženina se promyje 5o ml dimethylformamidu a filtrát odpaří při 5o °C/ 2 kPa, Zbytek se extrahuje vroucím chloroformem (3 x 2oo ml) , filtrát odpaří při 4o °c/2 kPa a zbytek v 5o ml chloroformu se vnese na sloupec 2oo ml silikagelu v chloroformu. Sloupec se promývá chloroformem a průběh eluce se sleduje tenkovrstvou chromatografií na destičkách silikagelu v soustavě chloroform—methanol (9 : 1). Získá se frakce 9-[ 2-( 2-diethoxyfosíonylethoxy) ethylj -2-amino-6-chlorpurlnu (R_ - o,4o), která se odpaří a vysuší při 13 Pa nad oxidem fosfoť řečným. Výtěžek 3,2 g (42 %) bezbarvé pěny. Další elucí kolony chloroformem se obdobně získá l.o g (13 %) 7-C2-(2-diethoxyfosfonylethoxy)ethyU-2-amino-6-chlorpurinu (Rp “ o,28).

Odparek 9-isomeru (3,2 g) se rozpustí v 3o ml dioxanu, přidá se 3o ml 1M hydroxidu sodného a směs se ponechá stát 24 h při teplotě místnosti. Neutralizuje se přidáním katexu (např. Dowexu 5o X 8) (H⁺ -forma), alkalisuje se trlethylaminem, zfiltruje, promyje 5o ml vody a odpaří ve vakuu dosucha. Zbytek se zahřívá v refluxu s 8o ml 1M chlorovodíkové kyseliny, neutralizuje vodným amoniakem a odpaří ve vakuu dosucha. Tento odparek v 2o ml vody se vnese na sloupec 2oo ml katexu (např. Dowexu 5o X 8) (H⁺-forma) a eluuje se vodou do ztráty kyselé reakce a absorbce eluátu při 26o nm. Pak se sloupec eluuje 2,5% vodným amoniakem a jímá se eluát absorbující při 26o nm. Po odpaření ve vakuu se zbytek vysuší při 13 Pa nad oxidem fosforečným, suspenduje v 6o ml acetonitrUu, přidá se 6 ml bromtrimethylsilanu a směs se ponechá stát 24 h při teplotě místnosti v uzavřené baňce. Směs se odpaří ve vakuu, zbytek se rozpustí ve loo ml o,4M triethylamoniumhydrogenkarbonátu, odpaří se ve vakuu a kodestUuje methanolem (4 x 5o ml). Tento zbytek se v 25 ml vody nanese na sloupec 2oo ml slabě bázického anexu (např. Sephadexu A-25) (HCO~ - forma) a eluuje se vodou do poklesu UV-absorbce eluátu při 26o nm, Pak se sloupec eluuje lineárním gradientem triethylamoniumhydrogenkarbonátu, pH 7,5 (o až o,3M po 1 1), a Jímá se hlavní frakce eluátu, absorbující při 26o nm (eluuje se při o,15 až o,25M). Po odpaření ve vakuu se zbytek kodestUuje methanolem (5 x 5o ml), rozpustí ve vodě a vnese na sloupec 5o ml katexu (např. Dowexů 5o X 8) (Na⁺ —forma). Eluuje se vodou, jímá se eluát absorbující při 26o nm a odpaří se ve vakuu. Zbytek se kodestUuje ethanolem (2 x 5o ml) a sráží z methanolu (lo ml) etherem (2oo ml). Odsaje se, pro— myje etherem a suší ve vakuu. Získá se 1,4 g sodné soli 9-[2-(2-fosfonylethoxy)ethylJguaninu (I, B-guanin—9-yl), - o,86, Rp - o,o9 (papír.chromatografie v soustavě 2-propanol-konc.

amoniak—voda, 7:1:2$. Pro C„H N O PNa„ (347,3) vypočteno 31,12 % C, 3,48 % H, y i» o o λ .

2o,17 % N, 8,94 % P{ nalezeno 31,3o % C, 3,76 % H, 19,82 % N, 8,79 % P.

Stejným způsobem byl z l,o g 7-isomeru (viz výše) připraven ve formě sodné soli 7-£2— (2-fosfonylethoxy)ethyl]guanin (i, B- guanin-7-yl). Výtěžek o,36 g, a Rp hodnoty jsou stejné jako u 9-isomeru. Pro CgH₁₂N₅O₅Na₂ (347,3) vypočteno 31,12 % C, 3,48 % 14, 2o,17 % N, 8,94 % P; nalezeno 3o,85 % C, 3,61 % Η, 2o,o6 % N, 8,82 % P.

P říklad 7

K roztoku l,o g sodné soli 9— 2-(2-fosťonylethoxy)ethyl -adeninu v 5o ml 8o% vodné kyseliny octové se přidá 4 ml 3—me thylbutylnitritu a směs se míchá přes noc v uzavřené bance při teplotě místnosti. Odpaří se ve vakuu a zbytek kodestUuje vodou (5 x- 25 ml). Zbytek se v 2o ml vody vnese na sloupec 15o ml katexu (např. Dowexu 5o X 8) (H .-forma) a sloupec se eluuje vodou. Jímá se frakce produktu absorbující při 26o nm, odpaří se ve vakuu a za horka se rozpustí v právě potřebném množství vody. Přidá se desetinásobný objem ethanolu a ether (stejný objem jako ethanol). V lednici vykryslaluje produkt, který se odsoj®, promyje směsí ethanolu a o

CS 27oo67 B1 etheru (1 : 1), etherem λ vysuší ve vakuu. Získá se o,56 g 9- 2-(2-fosfonylethoxy)ethyl hypoxanthinu, nol—konc.

o,96 (viz příklad 1), R r

- 0,16 (papírová chromatografie v soustavě 2—propa— amoniak—voda, 7:1:2). Pro (288,3) vypočteno 37,5o % C, 4,54 % H,

19,44 % N, 10,77 % P; nalezeno 37,87 % C, 4,85 % H, 19,41 % N, 11,ο7 % P.

Příklad 8

Stanovení chemosterilačního účinku látek.

Ploštice Pyrrhocoris apterus L. byla chována v konstantních podmínkách při teplotě 26 1 °C ve fotoperiodě 18 h světla + 6 h tmy a při relativní vlhkosti 75 + lo %. Jako potrava byla použita lipová semínka a pitná voda. Základní chovy v o,5 1 zavařovacích sklenicích. Pro testy byly odebírány nymfy posledního instaru ve stáří o až 6 h. Roztoky testovaných látek obecného vzorce I (sodných solí) byly připravovány v pitné vodě a byly podávány v průběhu testu místo pitné vody. .

Vlastní test probíhal na Petriho miskách o průměru 12 až 15 cm s pěti páry zvířat nebo na miskách o průměru 6 až lo cm s jednotlivými páry. Dna misek byla pokryta filtračním papírem, misky obsahovaly pitítko se zkoumaným roztokem látek obecného vzorce I a lipová semínka. U pokusu byla hodnocena toxicita, délka posledního instaru, průběh imaginární ekdyse, zahájení oviposice a množství vykladených vajíček v jednotlivých snůškách. Vykladená vajíčka byla odebírána a umístěna na Petriho misky k inkubaci za výše uvedených podmínek. Líhnivost byla sledována v době líhnutí u kontrolních pokusů, druhý odečet byl prováděn o 5 dnů později (k vyloučení případného prodloužení embryogenese).

Za uvedených podmínek byla délka posledního instaru kontrolních jedinců průměrně 8 dnů; tato délka nebyla ovlivněna žádnou ze sledovaných látek. Průběh svlékání do dospělce nebyl ovlivněn. Snížení plodnosti a líhnivosti pro jednotlivé látky obecného vzorce I Je uvedeno v tabulce 1. '

Tabulka 1

Působení látek obecného vzorce I (sodné soli) na plodnost ploštice Pyrrhocoris apterus L. po kontinuální orální aplikaci na nymfy posledního instaru

č.	B (koncentrace, %)	Průměrný počet vykladených vajíček na samici	Průměrný počet vylíhlých vajíček na samici	Líhnivost (%)
	Kontrola	166,1 + 14,4	143,9 + 16,1	86,6
1	Adenin—9-yl
	lo-5	O	O	O
	lo6	92,3 + 10,8	42,7 + 7,7	46,3
2	2,6-Diaminopurin—9—yl
	lo8	O	O	O
3	Gúanin—9-yl
	lo’6 -	O	o	O
	ίο7.	139,3 + 17,8	121,1 + 15,4	86,9
4	6-Methylthiopurin-9~yl
	lo“7	O	O	O
	lo“8	112,8 + 16,4	86,1 + 12,1	76,3
5	Uracil-l-yl
	lo4	O	O	O
	lo’5	93,C + 15,3	31,5 4- lo,5	33,7

CS 27oo67 Bl

Cytosin-l-yl lo^-4 lo^-5

O

112,1 + 11,8

O

79,7 + 14,8

O 71.1

Claims (3)

PŘEDMĚT vynálezu .

1. N-[ 2-(2—Fosfonylethoxy)ethyl]deriváty heterocyklických bází obecného vzorce I b-ch₂ch₂och₂ch₂p(o)(oh)₂ (I), kde B je zbytek purin-9-ylový nebo purin-7-ylový, substituovaný v poloze 6 hydroxy-, amino-, methylthioskupinou nebo atomem chloru a v poloze 2 atomem vodíku nebo aminoskupinou, či zbytek uracil-l-ylový nebo cytosin-l-ylový.

2. Způsob přípravy látek obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačený tím, že se sodná sůl připravená reakcí heterocyklické báze buď samotné nebo chráněné acylací, s výhodou benzoylací, aminoskupin nebo O-alkylací, s výhodou methylací, hydroxyskupin, s ekvimolárním množstvím hydridu sodného v aprotickém rozpouštědle, s výhodou v dimethylformamidu, uvede v tém— že rozpouštědle při teplotách 2o °C až 14o °C do reakce s jedním až třemi molárními ekvivalenty diethylesteru kyseliny 2-(2-chlorethoxy)ethylfosfonové vzorce II cich₂ch₂och₂ch₂p(o) (oc₂h₅)₂ ( II ) vzniklý meziprodukt obecného vzorce III . . B-CH₂CH₂OCH₂CH₂P(O)(OC₂H_g)_{2 ( m χ} kde B má stejný význam jako ve vzorci I, se izoluje krystalizací nebo s výhodou chromatografií na silikagelu, uvede při teplotě 2o až 4o °C do reakce s bromtrimethylsilanem v aprotickém rozpouštědle, s výhodou v dimethylformamidu, a— cetonitrilu nebo chlorovaných uhlovodících, po odpaření rozpouštědla se směs rozloží vodou a látka obecného vzorce I se izoluje, s výhodou chromatografií na ionexu nebo hydrofobizovaném sillkagelu.

3. Způsob příprav látek obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačený tím, že se látky obecného vzorce III podle bodu 2 uvedou do reakce s o,5 až 2,oM roztokem hydroxidů alkalických ve vodě nebo jejích směsích s methanolem, ethanolem nebo dioxanem s obsahem nejméně 5o objemových procent vody, a to při teplotách 2o °C až loo °C, směs se neutralizuje minerální nebo organickou kyselinou, nebo s výhodou katexem v kyselé formě, a monoestery obecného vzorce IV $

' B-CH,CH,OCH CH P-OCH-H ( IV )

A & 4 ě | 4L O . . OH kde Li má stejný význam jako ve vzorci I, ' izolované ionexovou chromatografií, se uvedou do reakce s bromtrimethylsilanem, a látky obecného vzcKe I se dále izolují způsobem podle bodu 2.