CS269879B1

CS269879B1 - A preparation for the enzyme determination of alcohol concentration in biological fluids

Info

Publication number: CS269879B1
Application number: CS875032A
Authority: CS
Inventors: Ladislav Doc Rndr Csc Skursky; Vlastimil Ing Svoboda; Ruzena Novotna; Vladimir Pechmann; Jaroslav Rndr Rocek; Ctibor Rndr Andrys
Original assignee: Ladislav Doc Rndr Csc Skursky; Svoboda Vlastimil; Ruzena Novotna; Vladimir Pechmann; Jaroslav Rndr Rocek; Ctibor Rndr Andrys
Priority date: 1987-07-03
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1990-05-14
Also published as: CS503287A1

Abstract

Řešení se týká přípravku k enzymovému stanovení koncentrace alkoholu v biologických tekutinách obsahující alkoholdehydrogenasu, nikotinamidadenindinukleotid a tlumič o pH 4,5 až 10,5, který dále obsahuje chromogenní systém určitého složení se čtyřmi substituenty až osmi substituenty. Jako stabilizátor obsahuje přípravek monosacharid nebo oligosacharid a/nebo přirozenou nebo syntetickou polymerní látku. Tento přípravek lze provést jako soupravu činidel, tabletový nebo proužkový test k detekci alkoholu v dechu, slinách nebo krevním séru.The solution relates to a preparation for enzymatic determination of alcohol concentration in biological fluids containing alcohol dehydrogenase, nicotinamide adenine dinucleotide and a buffer with a pH of 4.5 to 10.5, which further contains a chromogenic system of a certain composition with four to eight substituents. As a stabilizer, the preparation contains a monosaccharide or oligosaccharide and/or a natural or synthetic polymeric substance. This preparation can be performed as a reagent kit, tablet or strip test for detecting alcohol in breath, saliva or blood serum.

Description

Stanovení relativně nízkých koncentrací alkoholu v biologických tekutinách, zejména v krvi, patří mezi velmi časté operace v biochemickézvláště forenzni analyze.Tradičně ee pro tento účel užívá takzvaná Wldmarkóva zkouška, založená na vydestilování těkavého alkoholu z vyšetřovaného vzorku do oxidační směsi a stanoveni úbytku oxidačního činidla,který je úměrný množství alkoholu (viz E.M.Widmark, Biochem. Ž. 131, 473-483/1922). I když tato metoda je prozatím v řadě zemí uznávána jako jediná platná pro forenzni účely, byly v průběhu let vypracovány a zvěděny do praxe modernější, jednodušší a mnohdy i specifičtější postupy. Nejjednodušší a zcela spolehlivé je například stanovení plynově chromatografické, které bylo také v některých zemích připuštěno pro soudní analyzy. Vedle toho se však v poslední době stále více prosazují metody enzymového stanovení alkoholu, jejichž nesporná výhoda tkví v prvé řadě v jednoduchosti, citlivosti a značné specifičnosti. Tyto metody jsou vesměs založeny na oxidaci alkoholu za přítomnosti enzymu alkoholdehydroge- ' nasy (E.C. 1.1.1.1.) za současné redukce koenzymu nikotinamidadenindinukleotidu (NAD) na jeho redukovanou formu (NAOH). Přírůstek NAOH, úměrný, obsahu alkoholu se při tom stanoví změřením charakteristické absorbapce při 340 nm (viz. T. Buchner, H. Redetzki, Kliň. 'Determination of relatively low concentrations of alcohol in biological fluids, especially in blood, is one of the most common operations in biochemical, especially forensic analysis. Traditionally, the so-called Widmark test is used for this purpose, based on distilling volatile alcohol from the examined sample into an oxidizing mixture and determining the loss of oxidizing agent, which is proportional to the amount of alcohol (see E.M. Widmark, Biochem. Ž. 131, 473-483/1922). Although this method is currently recognized in many countries as the only one valid for forensic purposes, more modern, simpler and often more specific procedures have been developed and put into practice over the years. The simplest and most reliable, for example, is gas chromatographic determination, which has also been accepted for forensic analysis in some countries. In addition, recently, enzyme methods for alcohol determination have become increasingly popular, the undisputed advantage of which lies primarily in simplicity, sensitivity and considerable specificity. These methods are generally based on the oxidation of alcohol in the presence of the enzyme alcohol dehydrogenase (E.C. 1.1.1.1.) with the simultaneous reduction of the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to its reduced form (NAOH). The increase in NAOH, proportional to the alcohol content, is determined by measuring the characteristic absorbance at 340 nm (see T. Buchner, H. Redetzki, Kliň. '

Wschr. 29, 615/1951). Tato metoda se také stala základem některých průmyslově vyráběných souprav pro stanovení alkoholu V krvi.Wschr. 29, 615/1951). This method also became the basis of some industrially produced kits for determining blood alcohol.

Významného zvýšení citlivosti uvedené enzymové metody bylo dosaženo spřažením tvorby NAOH s jeho reoxidací pomocí p-nitrosodimbthylanilinu, který se redukuje na produkt pravděpodobně chinondiiminový kation-, reagující s fenoly nebo naftoly za vzniku intenživně zbarvených indanilinových barviv. Intenzita vzniklého zbarvení je potom mírou alkoholu ve vyšetřovaném materiálu (viz. 0. Kovář, a kol. Anal. Biochem. 137. 74-79/1984).A significant increase in the sensitivity of the enzyme method was achieved by coupling the formation of NAOH with its reoxidation using p-nitrosodimethyleneaniline, which is reduced to a product, probably a quinonediimine cation, reacting with phenols or naphthols to form intensely colored indaniline dyes. The intensity of the resulting color is then a measure of the alcohol in the examined material (see 0. Kovář, et al. Anal. Biochem. 137. 74-79/1984).

Tato modifikace enzymového stanovení je oproti dříve vyvinutým postupům výhodnější tím, že k jejímu provedení je zapotřebí podstatně méně drahých preparátů, jako je enzym alkoholdehydrogenasa a NAD. Její nevýhodou je však opět skutečnost, že při aplikaci na stanovení alkoholu v biologických kapalinách a materiálech, jako je například krev, je nutné tyto materiály derpoteinovat, což ovšem celý postup značněškomplikuje a prodlužuje.This modification of the enzyme assay is more advantageous than previously developed procedures in that it requires significantly less expensive preparations, such as the enzyme alcohol dehydrogenase and NAD. However, its disadvantage is again the fact that when applied to the determination of alcohol in biological fluids and materials, such as blood, it is necessary to deproteinize these materials, which, however, significantly complicates and prolongs the entire procedure.

Tento problém řeší předložený vynález. Jeho podstata spočívá v tom, že přípravek dále obsahuje chromogenní systém sestávající ze substituovaného p-nltrosoanilinu jako například p-nitroso-N-alkyl- nebo p-nitrosQ-N.N-dialkylanilin v němž alkyl může obsahovat 1 až 4 atomy uhlíků nebo p-nitroso-N-aryl- nebonitroso-N,N-diarylanilin, ve kterém aryl znamená fenyl nebo tolyl a pasivní kopulačni komponenty,například substituovaný 1-naftol obecného vzorce I,This problem is solved by the present invention. Its essence lies in the fact that the preparation further comprises a chromogenic system consisting of a substituted p-nitrosoaniline such as, for example, a p-nitroso-N-alkyl- or p-nitroso-N,N-dialkylaniline in which the alkyl may contain 1 to 4 carbon atoms or a p-nitroso-N-aryl- or nitroso-N,N-diarylaniline in which aryl is phenyl or tolyl and passive coupling components, for example, a substituted 1-naphthol of the general formula I,

ve kterém R.^ je vodík nebo halogen nebo sulfoskupina nebo alkoxyl o počtu uhlíků 1 až 12 nebo popřípadědále substituovaná fenoxyskupina a R₂ je karboxyl nebo skupina -CONRjR^, ve které substituenty R^a R^jsou stejné nebo rozdílné atomy nebo skupiny jako vodík, alkyl o počtu atomů uhlíku 1 až 18 nebo karboxyalkyl o počtu uhlíku 1 až 5 nebo substituovaný 5-pyrazolon obecného vzorce IIin which R.^ is hydrogen or halogen or sulfo or alkoxy of 1 to 12 carbons or optionally substituted phenoxy and R ₂ is carboxyl or the group -CONRjR^, in which the substituents R^ and R^ are the same or different atoms or groups such as hydrogen, alkyl of 1 to 18 carbons or carboxyalkyl of 1 to 5 carbons or substituted 5-pyrazolone of general formula II

CS 269 879 BlCS 269 879 Bl

II.II.

ve kterém Rg je vodík nebo alkyl o počtu uhlíku 1 až 4 nebo oxbskupina a substituenty Rg až Rg představují nezávisle na sobě vodík nebo halogen nebo sulfoskupinu a který dále obsahuje tlumič o pH 4,5 až 10,5 a jako stabilizátor mono- nebo oligosacharid, jako například glukosu, fruktosu, rhamnosu nebo šacharosu a/nebo přirozeneu nebo syntetickou polymerní látku jako například želatinu, albumin, škrob, karboxymethylcelulosu, methylhydroxy-propylcelulosu, polyvinylpyrrolidon nebo polyvinylalkohol.in which Rg is hydrogen or alkyl of 1 to 4 carbons or an oxo group and the substituents Rg to Rg independently represent hydrogen or halogen or sulfo and which further contains a buffer with a pH of 4.5 to 10.5 and as a stabilizer a mono- or oligosaccharide, such as glucose, fructose, rhamnose or sucrose and/or a natural or synthetic polymeric substance such as gelatin, albumin, starch, carboxymethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone or polyvinyl alcohol.

Přípravek pro stanovení alkoholu podle tohoto vynálezu může být proveden bud ve formě soupravy činidel, sloužící k spektrofotometričkému určení koncentrace alkoholu v roztoku podle absorbance vzniklého chinoniminového barviva, nebo může být koncipován jako tabletový nebo proužkový test, to je v provedení, ve kterém všechna činidla potřebná k průběhu barevné analytické reakce jsou v prostředku obsažena v pevné fázi, popřípadě zakotvena na vhodném nasákavém nosiči. Stanovení alkoholu pomocí takovýchto přípravků se potom provede velmi jednoduše tak, že se kapka například krevního séra nebo slin nanese na proužek nebo tabletu a· po určité době se vzniklé zbarvení porovná se zkusmo zhotovenou barevnou stupnicí, jejíž jednotlivá barevná pole odpovídají určitým koncentracím alkoholu. Dalším možným způsobem aplikace tohoto vynálezu může být detekční trubička ke stanovení\obsahu par alkoholu v dechu. Reakční soustava je v tomto případě nanesena na vhodný nosič', kterým je naplněna skleněná trubička. Po průchodu vydechnutého vzduchu dojde k barevné změně náplně trubičky. Tato změna se vyhodnotí porovnáním se zkusmo zhotovenou barevnou stupnicí.The alcohol determination preparation according to the present invention can be made either in the form of a reagent kit, serving for spectrophotometric determination of alcohol concentration in solution according to the absorbance of the formed quinoneimine dye, or it can be designed as a tablet or strip test, that is, in a design in which all reagents required for the color analytical reaction are contained in the preparation in a solid phase, or anchored on a suitable absorbent carrier. Alcohol determination using such preparations is then carried out very simply by applying a drop of, for example, blood serum or saliva to a strip or tablet and after a certain time the resulting color is compared with a trial-made color scale, the individual color fields of which correspond to certain alcohol concentrations. Another possible way of applying the present invention can be a detection tube for determining the alcohol vapor content in breath. In this case, the reaction system is applied to a suitable carrier, which is filled with a glass tube. After the exhaled air passes through, the tube contents change color. This change is evaluated by comparing it with a pre-made color scale.

Tyto různé možnosti provedení přípravku k enzymovému stanovení koncentrace alkoholu podle vynálezu ilustrují blíže následující příklady.These various possible embodiments of the preparation for enzymatic determination of alcohol concentration according to the invention are illustrated in more detail by the following examples.

Příklad 1Example 1

Souprava činidel pro spektrofotometrické stanovení alkoholu :Reagent set for spectrophotometric determination of alcohol:

Činidlo δ. 1Reagent δ. 1

Alkohold.ehydrogenasa (z koňských jater) 2,0, /UkatAlcohol dehydrogenase (from horse liver) 2.0, /Ukat

Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) ' ., 50,0 mgNicotinamide adenine dinucleotide (NAD) ' ., 50.0 mg

Polyvinylalkohol 500,0 mgPolyvinyl alcohol 500.0 mg

Pyrofosfátový tlumič o pH 8,5, .0,1 M roztok ' 50,0 mlPyrophosphate buffer pH 8.5, 0.1 M solution ' 50.0 ml

Činidlo č. 2 ' p-Nitroso-N-fenylanilin ' 25 mg l-(4-sulfofenyl)-3-methyl-5-pyrazolon 14,0 mgReagent No. 2 'p-Nitroso-N-phenylaniline' 25 mg 1-(4-sulfophenyl)-3-methyl-5-pyrazolone 14.0 mg

Pyrofosfátový tlumič o pH 8,5, 0,1 M roztok 50,0 mlPyrophosphate buffer pH 8.5, 0.1 M solution 50.0 ml

CS 269 879 BlCS 269 879 Bl

Při stanovení alkoholu se smíchá 0,5 ml. činidla č. 1 a 0,5 ml činidla č. 2, přidá se 5,0 yul vyšetřovaného séra a po 5 minutách se změří absorbáncé při vlnové délce 530 nm proti slepému pokusu, ke kterému místo vzorku séra bylo přidáno 5,0 ^ul vody. Podle zjištěné absorbance se obsah alkoholu v séru odvodí například pomocí zkusmo zhotovené kalibrační křivky. Touto metodou lze stanovit látkové množství alkoholu v rozmezí 0,01 až 0,1 /umolu s 5¾ přesností. Při vyšší koncentraci je nutno analyzovaný vzorek ředit.When determining alcohol, 0.5 ml of reagent No. 1 and 0.5 ml of reagent No. 2 are mixed, 5.0 μl of the serum under examination are added and after 5 minutes the absorbance is measured at a wavelength of 530 nm against a blank experiment to which 5.0 μl of water was added instead of the serum sample. According to the determined absorbance, the alcohol content in the serum is deduced, for example, using a calibration curve prepared experimentally. This method can determine the substance amount of alcohol in the range of 0.01 to 0.1 μmol with 5¾ accuracy. At higher concentrations, the analyzed sample must be diluted.

Příklad 2’Example 2’

Diagnostické proužky ke stanovení alkoholu ve slináchDiagnostic strips for determining alcohol in saliva

Impregnační roztok IImpregnation solution I

Alkoholdeydrogenasa (z koňských jater) Alcohol dehydrogenase (from horse liver) 200 /Ukat 200 /Ukat Nikotinamidadenosindinukleotid (NAD) ’ Želatina Polyvinylpyrolidon K 90 Polyvinylalkohol Albumin (hovězí) . Sacharosa Pyrofosfátový tlumič pH 8,5, 0,1 M Nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD) ’ Gelatin Polyvinylpyrrolidone K 90 Polyvinyl alcohol Albumin (bovine) . Sucrose Pyrophosphate buffer pH 8.5, 0.1 M 0,40 g ' 5,0 g 3,0 g , 5,0 g ' 5,0 g 10,0 g ' 1 000,0 ml 0.40g' 5.0 g 3.0 g, 5.0 g ' 5.0 g 10.0 g ' 1000.0 ml

Impregnační roztok IIImpregnation solution II

N-Methyl-N-karboxymethylamld kyseliny l-hydroxy-2-naftooové . 1,0 g p-Nitroso-N,N-dimethylanilin .2,0 g1-Hydroxy-2-naphthoic acid N-Methyl-N-carboxymethylamide . 1.0 g p-Nitroso-N,N-dimethylaniline . 2.0 g

ToluenToluene

000,0 ml000.0 ml

Impregnační roztoky se připraví postupným rozpouštěním jednotlivých komponent v uvedeném *2 pořadí. Na filtrační papír o plošné hmotnosti 1B0 g/m se potom nanese impregnační roztok č. I do nasycení papíru a papír se vysuší proudem vzduchu zahřátého na 40° C, nebo ve vakuové sušárně nebo lyofilizací. Potom se na tento papír nanese obdobným způsobem impregnační roztok II a opět se papír vysuší. Takto naimpregnovaný papír se potom rozřeže na čtverečky 6x6 mm, které se nalepí například pomocí oboustranné samolepicí pásky na jeden konec podložky z bílé plastické hmoty o rozměrech 6 x 80 mm. Takto se získají testační proužka nesoucí na svém konci indikační zónu, která se po namočení do kapaliny obsahující alkohol, jako jsou například sliny nebo sérum barví zeleně až modře, přičemž odstín a intenzita tohoto zbarvení jsou přímo úměrné koncentraci alkoholu ve vyšetřované kapalině. Tato koncentrace se určí porovnáním vzniklého zbarvení se zkusmo zhotovenou barevnou stupnicí, jejíž jednotlivá barevná pole odpovídají určitým koncentracím alkoholu. Touto metodou lze rychle, bez přístrojových nároků stanovit koncentraci 0,1 až 1,0 promile alkoholu s přesností 0,2 promile ve zkoumaném vzorku. Finanční náklady na jedno stanovení jsou nižší, než u jiných přípravků, přičemž citlivost jiných přípravků je až od 0,5 až 0,6 promile a stanovení ruší například cigaretový kouř.The impregnation solutions are prepared by gradually dissolving the individual components in the order given *2. Impregnation solution No. I is then applied to filter paper with a surface weight of 1B0 g/m2 until the paper is saturated and the paper is dried with a stream of air heated to 40° C, or in a vacuum dryer or by lyophilization. Impregnation solution II is then applied to this paper in a similar manner and the paper is dried again. The impregnated paper is then cut into 6x6 mm squares, which are glued, for example, using double-sided self-adhesive tape to one end of a white plastic substrate measuring 6 x 80 mm. In this way, test strips are obtained carrying an indicator zone at their end, which, after being soaked in a liquid containing alcohol, such as saliva or serum, turns green to blue, the shade and intensity of this coloration being directly proportional to the alcohol concentration in the examined liquid. This concentration is determined by comparing the resulting color with a pre-made color scale, the individual color fields of which correspond to certain alcohol concentrations. This method can be used to quickly determine the concentration of 0.1 to 1.0 per mille of alcohol with an accuracy of 0.2 per mille in the sample under examination, without any instrumentation requirements. The financial costs for one determination are lower than for other preparations, while the sensitivity of other preparations is up to 0.5 to 0.6 per mille and the determination is interfered with, for example, by cigarette smoke.

Příklad 3Example 3

Detekční tablety ke stanovení alkoholuDetection tablets for alcohol determination

Tabletovací směs č. ITabletting mixture No. I

Alkoholdehydrogenasa (z koňských jater) ' 37,0 yukatAlcohol dehydrogenase (from horse liver) ' 37.0 yukat

Nikotinamldadenindinukleoid 1,0gNicotinamide adenine dinucleoid 1.0g

Sacharosa 1,09 škrob bramborový 7,5gSucrose 1.09 potato starch 7.5g

Talek 1,0gTalc 1.0g

CS 269 879 BlCS 269 879 Bl

Pyrofosfátový tlumič o pH 8,5, 0,2 M roztok 10,0 mlPyrophosphate buffer pH 8.5, 0.2 M solution 10.0 ml

Tabletovací směs č. II p-Nitroso-N,N-dimethylanilin 22,0mgTabletting mixture No. II p-Nitroso-N,N-dimethylaniline 22.0mg

N-Oktadecylamid kyseliny l-hydroxy-4-sulfo-2-naftoové 20,0mgN-Octadecylamide of l-hydroxy-4-sulfo-2-naphthoic acid 20.0mg

Talek 1,0gTalc 1.0g

Škrob bramborový . .9,0 gPotato starch . .9.0 g

Tabletovací směs č. I se připraví tak, že se v pyrofosfátovém tlumiči rozpustí alkoholdehydrogenasa, nikotinamidadenindinukleotid a sacharosa a roztokem se stejnoměrně zkroi pí zhomogenizovaná navážka škrobu a talku. Vzniklá pastovitá hmota se potom dokonale zhomogenizuje a potom se v tenké vrstvě dokonale vysuší ve vakuu při teplotě do 30° C.Tabletting mixture No. I is prepared by dissolving alcohol dehydrogenase, nicotinamide adenine dinucleotide and sucrose in pyrophosphate buffer and evenly mixing the solution with a homogenized portion of starch and talc. The resulting pasty mass is then thoroughly homogenized and then dried in a thin layer in vacuum at a temperature of up to 30° C.

Tabletovací směs č. II se připraví smícháním a důkladnou homogenizací všech tří komponent, předem jemně pomletých. Obě tabletovací směsi se potom smíchají a dokonale zhomogenizují a vzniklá směs se ihned ztabletuje na tablety o hmotnosti 100 až 200 mg.Tabletting mixture No. II is prepared by mixing and thoroughly homogenizing all three components, previously finely ground. Both tabletting mixtures are then mixed and perfectly homogenized and the resulting mixture is immediately tabletted into tablets weighing 100 to 200 mg.

Stanovení alkoholu pomocí těchto tablet se provádí tak, že se vyšetřovaný vzorek, jako sliny nebo sérum nanese v množství 50 /U1 na povrch tablety a po 3 minutách se vizuálně vyhodnotí vzniklé zelené až modré zbarvení tablbtý sřdVriáriím dé zkusmo zhotovenou barevnou srovnávací stupnicí.The determination of alcohol using these tablets is carried out by applying the examined sample, such as saliva or serum, in an amount of 50 µl to the surface of the tablet and after 3 minutes the resulting green to blue coloration of the tablet is visually evaluated using a specially prepared color comparison scale.

Touto metodou lze rychle bez přístrojovýbh nároků stanovit koncentraci alkoholu v rozsahu 0,1 až 1,0 promile s přesností 0,25 promile ve zkoumaném vzorku.This method can be used to quickly determine the alcohol concentration in the range of 0.1 to 1.0 per mille with an accuracy of 0.25 per mille in the sample under examination, without any instrumentation requirements.

Příklad 4·Example 4·

Detekční trubička ke stanovehi alkoholu v dechu.Detection tube for determining alcohol in the breath.

Impregnační roztok IImpregnation solution I

Alkoholdehydrogenasa (z koňských jater) -200 yukatAlcohol dehydrogenase (from horse liver) -200 yukat

Nikotinamideadenindinukleotid 0,40 gNicotinamide adenine dinucleotide 0.40 g

Polyvinylpyrolidon K 90 0,1gPolyvinylpyrrolidone K 90 0.1g

Polyvinylalkohol 1,0gPolyvinyl alcohol 1.0g

Albumin hovězí 0,1gBovine albumin 0.1g

Pyrofosfátový tlumič pH 8,5, 0,1 M . 1 000,0 mlPyrophosphate buffer pH 8.5, 0.1 M. 1,000.0 ml

Impregnační roztok IIImpregnation solution II

N-Methyl-N-karboxymethylamid kyseliny l-hydroxy-2-naftoové1,0 g p-Nitroso-N,N-dimethylanilin2,0 gl-Hydroxy-2-naphthoic acid N-Methyl-N-carboxymethylamide 1.0 g p-Nitroso-N,N-dimethylaniline 2.0 g

Toluen 1 000,0 mlToluene 1,000.0 ml

Impregnační roztoky se připraví postupným rozpouštěním jednotlivých komponent v uvedeném pořadí.'Impregnation solutions are prepared by gradually dissolving the individual components in the order listed.

Na nosič Chromaton N zrnění 0,40 až 0,63 mm se roynoměrně nanese impregnační roztok I, čímž se získá hustá kašovitá hmota. Po důkladné homogenisaci se tato hmota v tenké vrstvě vysuší ve vakuu při teplotě do 30° C. 'The impregnation solution I is evenly applied to the Chromaton N carrier with a grain size of 0.40 to 0.63 mm, thereby obtaining a thick slurry. After thorough homogenization, this mass is dried in a thin layer in vacuum at a temperature of up to 30° C. '

Po’ usúšení se produkt rozmělní na výchozí zrnění a stejným způsobem jako impregnační roztok I se nanese a vysuší na tomto produktu i impregnační roztok II.After drying, the product is ground to the initial grain size and, in the same way as impregnation solution I, impregnation solution II is applied and dried on this product.

Takto připravenou sypkou hmotou plníme skleněné trubičky, na jednom konci zatavené, o vnitřním průměru 5 mm sloupcem hmoty v délce 30 mm. Polohu sloupce v trubičce fixujeme porézními vložkami a potom se trubička ve vzdálenosti 50 mm od okraje sloupce hmoty zataví. Takto se získá detekční trubička v délce asi 10 cm.The loose material thus prepared is filled into glass tubes, sealed at one end, with an internal diameter of 5 mm and a column of material 30 mm long. The position of the column in the tube is fixed with porous inserts and then the tube is sealed at a distance of 50 mm from the edge of the column of material. This results in a detection tube about 10 cm long.

Detekce alkoholu v dechu se provádí po odlomení obou konců detekční trubičky profouknutím známého objemu výdechu obsahujícího páry alkoholu. Tím dojde ke změně zbarvení náplně trubičky z intenzivně žluté barvy přes zelenou až na sytě modé zbarvení, podle koncentrace par alkoholu v dechu. Vyhodnocení koncentrace alkoholu se provede poCS 269 879 Bl rovnáním dosaženého zbarvení se zkusmo zhotovenou stupnicí barevných políček.Detection of alcohol in the breath is carried out after breaking off both ends of the detection tube by blowing through a known volume of exhaled breath containing alcohol vapors. This causes the color of the tube filling to change from intense yellow to green to deep blue, depending on the concentration of alcohol vapors in the breath. The alcohol concentration is evaluated according to CS 269 879 Bl by comparing the achieved color with a scale of color fields that has been experimentally made.

Touto metodou lze rychle bez nároků na měřící přístroje detekovat alkohol v dechu, přičemž lze stanovit již koncentraci odpovídající 0,1 promile alkoholu v krvi vyšetřovaného. Tuto citlivost a rozsah detekce lze korigovat změnami v průměru trubičky, délkou sloupce náplně a zrnitostí nosiče.This method can be used to quickly detect alcohol in the breath without the need for measuring devices, and can determine a concentration corresponding to 0.1 per mille of alcohol in the blood of the subject. This sensitivity and detection range can be corrected by changes in the diameter of the tube, the length of the filling column and the granularity of the carrier.

Claims

P R E P O R T I O N OF THE FINDING

1. A preparation for enzymatic determination of alcohol concentration in biological fluids, comprising alcohol dehydrogenase, nicotinamide adenine dinucleotide and a buffer with a pH of 4.5 to 10.5, characterized in that it further comprises a chromogenic system consisting of a substituted p-nitrosoaniline such as, for example, p-nitroso-N-alkyl- or p-nitroso-N,N-dialkylaniline, in which alkyl may contain 1 to 4 carbon atoms or p-nitroso-N-aryl- or p-nitroso-N,N-diarylaniline, in which aryl means phenyl or tolyl and passive coupling components, for example, substituted 1-naphthol of the general formula I

OH

in which R^ is hydrogen or halogen or sulfo or alkoxy of 1 to 12 carbons or optionally further substituted phenoxy and R? is carboxyl or a group -CONRjR^, in which the substituents Rj and R^ are the same or different atoms or groups such as hydrogen, alkyl of 1 to 18 carbons or carboxyalkyl of 1 to 5 carbons or a substituted 5-pyrazolone of general formula II

II in which R 1 is hydrogen or alkyl of 1 to 4 carbon atoms or an oxo group and the substituents R 8 to R ₁₁ independently represent hydrogen or halogen or a sulfo group.

2. The preparation according to item 1, characterized in that it contains as a stabilizer a monosaccharide or oligosaccharide, such as glucose, fructose, rhamnose or sucrose and/or a natural or synthetic polymeric substance, such as gelatin, albumin, starch, dextran, carboxymethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone or polyvinyl alcohol. ,