CS269879B1 - Přípravek k enzymovému stanoveni koncentrace alkoholu v biologických tekutinách - Google Patents

Abstract

Řešení se týká přípravku k enzymovému stanovení koncentrace alkoholu v biologických tekutinách obsahující alkoholdehydrogenasu, nikotinamidadenindinukleotid a tlumič o pH 4,5 až 10,5, který dále obsahuje chromogenní systém určitého složení se čtyřmi substituenty až osmi substituenty. Jako stabilizátor obsahuje přípravek monosacharid nebo oligosacharid a/nebo přirozenou nebo syntetickou polymerní látku. Tento přípravek lze provést jako soupravu činidel, tabletový nebo proužkový test k detekci alkoholu v dechu, slinách nebo krevním séru.

Description

CS 269 879 B1 1

Stanovení relativně nízkých koncentrací alkoholu v biologických tekutinách, zejménav krvi, patří mezi velmi časté operace v biochemické* zvláště forenznl analyse.Tradičněee pro tento účel užívá takzvaná Wldraarkova zkouška, založená na vydestilování těkavého al-koholu z vyěetřovanáho vzorku do oxidační směsi a stanoveni úbytku oxldačn-lho činidla,který je úměrný množství alkoholu (viz E.M.Widmark, Biochem. Ž. 131, 473-483/1922). I když tato me-toda je prozatím v řadě zemí uznávána jako jediná platná pro forenzní účely, byly v prů-běhu let vypracovány a zvěděny do praxe modernější, jednodušší a mnohdy i specifičtějšípostupy. Nejjednodušší a zcela spolehlivé je například stanovení plynově chromatografic-ké, které bylo také v některých zemích připuštěno pro soudní analyzy. Vedle toho se všakv poslední době stále více prosazují metody enzymového stanovení alkoholu, jejichž ne-sporná výhoda tkví v prvé řadě v jednoduchosti, citlivosti a značné specifičnosti. Tytometody jsou vesměs založeny na oxidaci alkoholu za přítomnosti enzymu alkoholdehydroge-nasy (E.C. 1.1.1.1.) za současné redukce koenzymu nikotinamidadenindinukleotidu (NAD) najeho redukovanou formu (NAOH). Přírůstek NADH, úměrný, obsahu alkoholu se při tom stanovízměřením charakteristické absorbagce při 340 nm (viz. T. Buchner, H. Redetzki, Kliň.

Wschr. 29, 615/1951). Tato metoda se také stala základem některých průmyslově vyrábě-ných souprav pro stanovení alkoholu V krvi. Významného zvýšení citlivosti uvedené enzymové metody bylo dosaženo spřažením tvorbyNADH s jeho reoxidací pomocí p-nitrosodimethylanilinu, který se redukuje na produkt -pravděpodobně chinondiiminový kation-, reagující s fenoly nebo naftoly za vzniku inten-zivně zbarvených indanilinových barviv. Intenzita vzniklého zbarvení je potom míroualkoholu ve vyšetřovaném materiálu (viz. 0. Kovář, a kol. Anal. Biochem. 137. 74-79/1984).

Tato modifikace enzymového stanovení je oproti dříve vyvinutým postupům výhodnějšítím, že k jejímu provedení je zapotřebí podstatně méně drahých preparátů, jako je enzymalkoholdehydrogenasa a NAD. 3ejí nevýhodou je však opět skutečnost, že při aplikaci nastanovení alkoholu v biologických kapalinách a materiálech, jako je například krev, jenutné tyto materiály derpoteinovat, což ovšem celý postup značněškomplikuje a prodlužu-je.

Tento problém řeší předložený vynález, jeho podstata spočívá v tom, že přípravekdále obsahuje chromogenní systém sestávající ze substituovaného p-nitrosoanilinu jakonapříklad p-nitroso-N-alkyl- nebo p-nitrosa-N,N-dialkylanilin v němž alkyl může obsaho-vat 1 až 4 atomy uhlíků nebo p-nitroso-N-aryl- nebo nitroso-N,N-diarylanilin, ve kterémaryl znamená fenyl nebo tolyl a pasivní kopulačnl komponenty,například substituovaný 1-naftol obecného vzorce I,

ve kterém R.^ je vodík nebo halogen nebo sulfoskupina nebo alkoxyl o počtu uhlíků 1 až 12nebo popřípadědále substituovaná fenoxyskupina a R2 je karboxyl nebo skupina -CONRjR^,ve které substituenty R^a R^jsou stejné nebo rozdílné atomy nebo skupiny jako vodík,alkyl o počtu atomů uhlíku 1 až 18 nebo karboxyalkyl o počtu uhlíku 1 až 5 nebo substi-tuovaný 5-pyrazolon obecného vzorce II 2 CS 269 879 B1

ve kterém je vodík nebo alkyl o počtu uhlíku 1 až 4 nebo oxoskupina a substituentyRg až Rg představují nezávisle na sobě vodík nebo halogen nebo sulfoskupinu a který dáleobsahuje tlumič o pH 4,5 až 10,5 a jako stabilizátor mono- nebo oligosacharid, jako na-příklad glukosu, fruktosu, rhamnosu nebo šacharosu a/nebo přirozenou nebo syntetickoupolymerní látku jako například želatinu, albumin, Škrob, karboxymethylcelulosu, methyl-hydroxy-propylcelulosu, polyvinylpyrrolidon nebo polyvinylalkohol. Přípravek pro stanovení alkoholu podle tohoto vynálezu může být proveden buá ve for-mě soupravy činidel, sloužící k spektrofotometričkému určení koncentrace alkoholu v roz-toku podle absorbance vzniklého chinoniminového barviva, nebo může být koncipován jakotabletový nebo proužkový test, to je v provedení, ve kterém všechna činidla potřebnák průběhu barevné analytické reakce jsou v prostředku obsažena v pevné fázi, popřípadězakotvena na vhodném nasákavém nosiči. Stanovení alkoholu pomocí takovýchto přípravkůse potom provede velmi jednoduše tak, že se kapka například krevního séra nebo slin na-nese na proužek nebo tabletu a· po určité době se vzniklé zbarvení porovná se zkusmo zho-tovenou barevnou stupnicí, jejíž jednotlivá barevná pole odpovídají určitým koncentracímalkoholu. Dalším možným způsobem aplikace tohoto vynálezu může být detekční trubička kestanovení\obsahu par alkoholu v dechu. Reakční soustava je v tomto případě nanesena navhodný nosič', kterým je naplněna skleněná trubička. Po průchodu vydechnutého vzduchudojde k barevné změně náplně trubičky. Tato změna se vyhodnotí porovnáním se zkusmo zho-tovenou barevnou stupnicí.

Tyto různé možnosti provedení přípravku k enzymovému stanovení koncentrace alkoho-lu podle vynálezu ilustrují blíže následující příklady. Příklad 1

Souprava činidel pro spektrofotometrické stanovení alkoholuČinidlo č. 1

Alkohold.ehydrogenasa (z koňských jater)

Nikotinamidadenindinukleotid (NAD)

Polyvinylalkohol

Pyrofosfátový tlumič o pH 8,5, .0,1 M roztok Činidlo č. 2 p-Nitroso-N-fenylanilin l-(4-sulfofenyl)-3-methyl-5-pyrazolon

Pyrofosfátový tlumič o pH 8,5, 0,1 M roztok 2,0, yUkat 50,0 mg500,0 mg 50,0 ml 25 mg14,0 mg50,0 ml CS 269 879 81 3 Při stanovení alkoholu se smíchá 0,5 ml. činidla č. 1 a 0,5 ml činidla č. 2, přidá se5,0 yul vySetřovaného séra a po 5 minutách se změří absorbáncé při vlnové délce 530 nmproti slepému pokusu, ke kterému místo vzorku séra bylo přidáno 5,0 ^ul vody. Podle zjiš-těné absorbance se obsah alkoholu v séru odvodí například pomocí zkusmo zhotovené kalib-rační křivky. Touto metodou lze stanovit látkové množství alkoholu v rozmezí 0,01 až0,1 /umolu s 5¾ přesností. Při vyšší koncentraci je nutno analyzovaný vzorek ředit. Příklad 2

Diagnostické proužky ke stanovení alkoholu ve slinách

Impregnační roztok I

Alkoholdeydrogenasa (z koňských jeter) 200 í Nikotinamidadenosindinukleotid (NAD) 0,40 g Želatina 5,0 9 Polyvinylpyrolidon K 90 3,0 9 Polyvinylalkohol 5,0 9 Albumin (hovězí) ' 5>° 9 Sacharosa 10,0 9 Pyrofosfátový tlumič pH 8,5, 0,1 M 1 000,0 ml

Impregnační roztok II N-Methyl-N-karboxymethylsmid kyseliny l-hydroxy-2-naftooové 1,0 g p-Nitroso-N,N-dimethylanilin . 2,0 g

Toluen 1 000,0 ml

Impregnační roztoky se připraví postupným rozpouštěním jednotlivých komponent v uvedeném

O pořadí. Na filtrační papír o plošné hmotnosti 1B0 g/m se potom nanese impregnační roztokč. I do nasycení papíru a papír se vysuší proudem vzduchu zahřátého na 40° C, nebo ve va-kuové sušárně nebo lyofilizací. Potom se na tento papír nanese obdobným způsobem impreg-nační roztok II a opět se papír vysuší. Takto naimpregnovaný papír se potom rozřeže načtverečky 6x6 mm, které se nalepí například pomocí oboustranné samolepicí pásky na je-den konec podložky z bílé plastické hmoty o rozměrech 6 x 80 mm. Takto se získají testač-ní proužka nesoucí na svém konci indikační zónu, která se po namočení do kapaliny obsahu-jící alkohol, jako jsou například sliny nebo sérum barví zeleně až modře, přičemž odstína intenzita tohoto zbarvení jsou přímo úměrné koncentraci alkoholu ve vyšetřované kapali-ně. Tato koncentrace se určí porovnáním vzniklého zbarvení se zkusmo zhotovenou ba-revnou stupnicí, jejíž jednotlivá barevná pole odpovídají určitým koncentracím alkoholu.Touto metodou lze rychle, bez přístrojových nároků stanovit koncentraci 0,1 až 1,0 promilealkoholu s přesností 0,2 promile ve zkoumaném vzorku. Finanční náklady na jedno stanove-ní jsou nižší, než u jiných přípravků, přičemž citlivost jiných přípravků je až od 0,5 až0,6 promile a stanovení ruší například cigaretový kouř. Příklad 3

Detekční tablety ke stanovení alkoholu

Tabletovací směs č. I

Alkoholdehydrogenasa (z koňských jater) ' 37,0 yukat

Nikotinamidadenindinukleoid 1,0 g

Sacharosa 1,0 9 škrob bramborový 7,5 g

Talek 1,0 g 4 CS 269 879 B1

Pyrofosfátový tlumič □ pH 8,5, 0,2 M roztok 10,0 ml

Tabletovací směs č. II p-Nitroso-N,N-dimethylanilin 22,0 mg N-Oktadecylamid kyseliny l-hydroxy-4-sulfo-2-naftoové 20,0 mg

Talek 1,0 g Škrob bramborový . . 9,0 g

Tabletovací směs č. I se připraví tak, že se v pyrofosfátovém tlumiči rozpustí alkohol-debydrogenasa, nikotinamidadenindinukleotid a sacharosa a roztokem se stejnoměrně zkro- i pí zhomogenizovaná navážka škrobu a talku. Vzniklá pastovitá hmota se potom dokonale zhomogenizuje a potom se v tenké vrstvě dokonale vysuší ve vakuu při teplotě do 30° C.

Tabletovací směs č. II se připraví smícháním a důkladnou homogenizací všech tří komponent,předem jemně pomletých. Obě tabletovací směsi se potom smíchají a dokonale zhomogenizu-jí a vzniklá směs se ihned ztabletuje na tablety o hmotnosti 100 až 200 mg.

Stanovení alkoholu pomocí těchto tablet se provádí tak, že se vyšetřovaný vzorek, jakosliny nebo sérum nanese v množství 50 /Ul na povrch tablety a po 3 minutách se vizuálněvyhodnotí vzniklé zelené až modré zbarvení taBlfeťý sřdVriáriím éé zkusmo zhotovenou barev-nou srovnávací stupnicí.

Touto metodou lze rychle bez přístrojovýbh nároků stanovit koncentraci alkoholu v rozsa-hu 0,1 až 1,0 promile s přesností 0,25 promile ve zkoumaném vzorku. Příklad 4

Detekční trubička ke stanoveni alkoholu v dechuImpregnační roztok I

Alkoholdehydrogenasa (z koňských jater) -200 yukat

Nikotinamideadenindinukleotid 0,40 g

Polyvinylpyrolidon K 90 0,1 g

Polyvinylalkohol 1,0 g

Albumin hovězí 0,1 g

Pyrofosfátový tlumič pH 8,5, 0,1 Μ 1 000,0 ml

Impregnační roztok II N-Methyl-N-karboxymethylamid kyseliny l-hydroxy-2-naftoové 1.0 9 p-Nitroso-N,N-dimethylanilin 2,0 g

Toluen 1 000,0 ml

Impregnační roztoky se připraví postupným rozpouštěním jednotlivých komponent v uvede-ném pořadí.

Na nosič Chromaton N zrnění 0,4Ů až 0,63 mm se rovnoměrně nanese impregnační roztok I,čímž se získá hustá kašovitá hmota. Po důkladné homogenisaci se tato hmota v tenkévrstvě vysuší ve vakuu při teplotě do 30° C.

Po’ usúšení se produkt rozmělní na výchozí zrnění a stejným způsobem jako impregnačníroztok I se nanese a vysuší na tomto produktu i impregnační roztok II.

Takto připravenou sypkou hmotou plníme skleněné trubičky, na jednom konci zatavené,o vnitřním průměru 5 mm sloupcem hmoty v 'délce 30 mm. Polohu sloupce v trubičce fi-xujeme porézními vložkami a potom se trubička ve vzdálenosti 50 mm od okraje sloupcehmoty zataví. Takto se získá detekční trubička v délce asi 10 cm.

Detekce alkoholu v dechu se provádí po odlomení obou konců detekční trubičky profouk- nutím známého objemu výdechu obsahujícího páry alkoholu. Tím dojde ke změně zbarvení náplně trubičky z intenzivně žluté barvy přes zelenou až na sytě modé zbarvení, po- dle koncentrace par alkoholu v dechu. Vyhodnocení koncentrace alkoholu se provede po-

Claims (2)

1. CS 269 879 81 5 rovnáním dosaženého zbarvení se zkusmo zhotovenou stupnicí barevných políček. Touto metodou lze rychle bez nároků na měřící přístroje detekovat alkohol v dechu, přičemžlze stanovit již koncentraci odpovídající 0,1 promile alkoholu v krvi vyšetřovaného. Tutocitlivost a rozsah detekce lze korigovat změnami v průměru trubičky, délkou sloupce náplněa zrnitostí nosiče. P R E.P M Ě T V.Y NÁLEZU

   1. Přípravek k enzymovému stanovení koncentrace alkoholu v biologických tekutinách, obsa-hující alkoholdehydrogenasu, nikotinamidadenindinukleotid a tlumič o pH 4,5 až 10,5, vy-značující se tím, že obsahuje dále chromogenní systém, sestávající ze substituovanéhop-nitrosoanilinu jako například p-nitroso-N-alkyl- nebo p-nitroso-N,N-dialkylanilin, vekterém alkyl může obsahovat 1 až 4 atomy uhlíku nebo p-nitroso-N-aryl - nebo p-nitroso- I -Ν,Ν-diarylanilin, ve kterém aryl znamená fenyl nebo tolyl a pasivní kopulační komponen-ty, například substituovaný 1-naítol obecného vzorce I

   ve kterém Rj je vodík nebo halogen nebo sulfoskupina nebo alkoxyl o počtu uhlíků 1 až 12nebo popřípadě dálé Substituovaná fenoxyskupina a Rj je karboxyl nebo skupina - CONRjR^,ve které substituenty Rj a R^ jsou stejné nebo rozdílné atomy nebo skupiny jako vodík,alkyl o počtu atomů uhlíku 1 až 18 nebo karboxyalkyl o počtu atomů uhlíku 1 až 5 nebosubstituovaný 5-pyrazolon obecného vzorce II

   ve kterém R^je vodík nebo alkyl o počtu atomů uhlíku 1 až 4 nebo oxoskupina a substituen-ty Rg až Rfl představují nezávisle na sobě vodík nebo halogen nebo sulfoskupinu.
2. 2. Přípravek podle bodu 1, vyznačující se tím, že obsahuje jako stabilizátor monosacharid nebo oligosachárid, jako například glukosu, fruktosu, rhamnosu nebo sacharosu a/nebo při- rozenou nebo syntetickou polymernl látku, jako například želatinu, albumin, škrob, dex- tran, karboxymethylcelulosu, methyl-hydroxypropylcelulosu, polyvinylpyrolidon nebo poly- vinylalkohol.