CS269747B1 - Enzymová elektroda na stanovení oligosacharidů a glykosidů a způsob její přípravy - Google Patents

Abstract

Enzymová elektroda určená pro stanovení oligosacharidů a glykosidů obsahujících o-glukosidovou vazbu na povrchu elektrochemického čidla pro stanovení kyslíku obsahují fixovanou vrstvu koimobilizované -glukosidasy, glukosaoxidany a popřípadě mutarotasy spočívá v tom, že obsahují koimobilizovanou katalasu. Způsob její přípravy spočívá v tom, že se směs 1 až 10 ulo-glukosidasy o aktivitě 0,5 až 5 yukat/ml” , 1 až 10 yjl glukosaoxidasy o aktivitě 0,3 až až 5 ukat.ml-!, 0,5 až 10 ul_,katalasy o aktivitě 500 až 5000 yukat.ml” a popřípadě 1 až 15 ^il mutarotasy o aktivitě 1 až 10 ^ukat.ml-''' koimobilizuje reakcí s 1 až 10 ýul 1 až 5 % glutaraldehydu s 0,1 až 5 ^ul isokyanidu, například cyklohexylisokyanidu, při 4 °C po dobu 2 až 7 dnů na nylonovou sítku předem aktivovanou parciální hydrolýzou vodným roztokem s 10 až 25 Y hmot. kyselinou chlorovodíkovou po dobu Zb až 20 minut nebo na kolagenovou membránu předem aktivovanou působením 4 až 6 mol.dm·-’’ močoviny po dobu 1 až 5 dnů nebo na nativní kolagenovou membránu a potom se nylonová sítka nebo kolagenová membrána s kolmoblllzovanými enzymy fixuje na povrch elektrochemického čidla na stanovení kyslíku.

Description

Vynález se týká enzymové elektrody na stanovení oligosacharidů a glykosidů obsahujících Oů-glukosidovou vazbu a způsobu její přípravy.

Ke stanovení oligosacharidů a glykosidů se vedle různých typů chromatografií doposud v převážné míře používají chemické metody, založené na hydrolyze těchto látek pomocí minerálních kyselin a následující dehydratací uvolněných monosacharidů při zvýšené teplotě a převedením vzniklého derivátu furan-2-karbaldehydu reakcí s aromatickými aminy, fenoly nebo naftoly na barevné kondenzační produkty. Nevýhodou těchto kolorimetrických metod analyzy oligosacharidů a glykosidů je jejich malá specifičnost, to znamená že výsledky stanovení určitého sacharidu nebo glykosidů mohou být ovlivněny přítomností jiných cukrů nebo obdobně reagujících látek. Především z tohoto důvodu nalézají v analyze sacharidů čím dál větší uplatnění enzymové metody.

Veliká množství využití enzymů v analytické chemii jsou dána vysokou substrátovou specifitou enzymů a dále jejich schopností katalyzovat reakce při velmi nízkých koncentracích substrátů. Enzymové analytické metody umožňují stanovení určitého sacharidu v bohaté směsi ostatních látek bez jeho předchozí isolace nebo zdlouhavé úpravy vzorku před vlastní analýzou.

Pro analytické účely je ideální použití absolutně specifických enzymů, které přeměňují jen jednu jedinou látku sloučeninu. Typickým představitelem těchto enzymů je například glukosa-6-fosfátdehydrogenaaa. V analytické chemii.se běžně využívá i enzymů se skupinovou specifitou. Tyto enzymy poznají v různých sloučeninách jednu skupinu nebo uskupení atomů těmto sloučeninám společné, které je danými enzymy přeměňováno. Skupinová specifita enzymů nemusí být bezpodmínečně nevýhodou, protože velmi často pracujeme se spřaženými enzymovými reakcemi, kde v celém řetězci může být vysoce specifický jen jeden enzym. V mnoha případech je specifita stanovení i při použití skupinové specifických enzymů dána tím, že analyzovaný vzorek neobsahuje kromě stanovované sloučeniny jiné látky, které by mohly na základě přítomnosti shodné skupiny nebo uspořádání atomů interferovat. Například při stanovení laktosy se v mléčných výrobcích nevyskytují jiné látky s 0-0-galaktopyranosidovou vazbou, které by toto stanovení, založené na enzymové hydrolyze laktosy pomocí B-galakťosidasy, rušily.

Pomocí enzymové analyzy je možno získat snadno informace, které jsou jinými metodami dosažitelné jen s vysokou experimentální náročností opět v důsledku nedostatečné specifity. Jako příklad lze uvést stanovení jednotlivých sacharidů, například 0-glukosy, D-galaktosy, D-mannosy, D-fruktosy, laktosy, raffinosy a podobně ve vzorcích, které obsahují tyto sacharidy ve směsích s libovolným zastoupením jednotlivých cukrů .nebo cukerných derivátů. Ilustrativní jsou z tohoto hlediska rozdíly ve stanovení redukujících cukrů v hydrolyzátech škrobu nebo dřevní hmoty, obvykle vyjadřovaných v koncentraci D-glukosy, a v enzymovém stanovení skutečného obsahu D-glukosy.

Průběh enzymových reakcí je možno aledovat buď následnými reakcemi, například vzniklých reakčních produktů, nebo s výhodou fyzikálními nebo fyzikálně chemickými metodami. Vedle velmi často používané fotometrie má velký význam spojení enzymových reakcí s elektrochemickými čidly detegujícíml substráty, produkty nebo jiné látky ovlivňující průběh enzymových reakcí. '

Použití volných enzymů naráží v některých případech na technické nebo ekonomické problémy jejich získávání, obtížnou regeneraci z reakční směsi, poměrně malou stabilitu něktérých volných enzymů atd. Tyto problémy jsou postupně řešeny náhradou rozpustných enzymů imobilizovanými enzymy použitelnými pro velký počet analýz. Ve spojení s elektrochemickou detekcí jsou získány biosenzory, se kterými je možno provádět analyzy bez spotřeby chemikálií v tzv. bezreagenční analyze. Velkou výhodou těchto biosenzorů je rychlost, přesnost a reprodukovatelnost stanovení a dále možnost analyzy roztoků barevných,

CS 269 7/47/ Bl kalných nebo fluoreskujících, kde jsou jiné způsoby detekce obtížné. Analytická využitelnost biosenzorů je podstatně ovlivněna jejich stabilitou. Tato je potom výrazně závislá na vlastní konstrukci biosenzorů a na druhu imobilizovaného biologického, enzymově aktivního materiálu. V některých případech může být stabilita biosenzoru snižována inhiblčním vlivem vedlejších produktů probíhajících enzymových reakcí. U enzymových elektrod na stanovení oligosacharidů založených na enzymové hydrolyze pomocí příslušných glykosidas s následující detekcí vzniklé D-glukosy pomocí glukosooxidasy může být posledně uvedený enzyn», v míře závislé na způsobu imobilizace, inhibován vznikajícím peroxidem vodíku.

Dalším důležitým faktorem ovlivňujícím stabilitu biosenzorů je způsob imobilizace * enzymů. Imobilizace se nejšastěji provádí zachycením ve struktuře gelu, například polyakrylamidového gelu, želatiny, alginátu a podobně, sorpcí bifunkčními činidly, popřípadě /přímou kovalentní vazbou realizovanou některou z imobilizačních technik na přírodní nebo syntetické membrány, které jsou v těsném styku s elektrochemickým čidlem.

. Stávající způsoby imobilizace αί-glukosidasy, glukosooxidasy u enzymové elektrody na stanovení oligosacharidů a glykosidů jsou použité enzymy zachyceny do nevytvrzeného žalatinového gelu, který je nutno při aplikaci na elektrochemické čidlo chránit acetátcelulozovou membránou ze strany roztoku, což vyžaduje složitější způsob přípravy vlastní elektrody.

Tyto nevýhody odstraňuje enzymová elektroda na stanovení oligosacharidů a glykosidů obsahujících oů-glukosidovou vazbu jako například maltosy, sacharosy nebo glukopyranosidů s různými aglykony obsahující koimobilizované enzymy o4-glukosidasu, glukosaoxidasu, popřípadě také mutarotasu, fixované na povrchu elektrochemického čidla pro stanovení kyslíku spočívá podle vynálezu v tom, že obsahuje koimobilizovanou katalasu. Způsobem podle vynálezu se enzymová elektroda na stanovení oligosacharidů a glykosidů obsahujících 0Č-glukosidovou vazbu připravuje .koimobilitací směsi 1 až 10 _zul OZ-giukosidasy -i -1 o aktivitě 0,5 až 5 yUkat.ml , 1 až 10 /U1 glukosaoxidasy o aktivitě 0,3 až 5 yukat.ml , 0,5 až 10 /U1 katalasy o aktivitě 500 áž 5 000 /Ukat.ml^-1 a popřípadě 1 až 15 yul mutarotasy o aktivitě 1 až 10 ^ukat.ml”¹ na nylonovou sítku předem aktivovanou parciální hydrolyzou vodným roztokem s 10 až 25 \ hmot, kyseliny chlorovodíkové po dobu 2 s až 20 minut nebo na kolagenovou membránu předem aktivovanou působením 4 až 6 mol.dm^-3 močoviny po dobu 1 až '5 dnů nebo na nativní kolagenovou membránu. Vlastní koimobilisace se podle vynálezu provádí reakcí s 1 až 10 ,ul 1 až 5 % glutaraldehydu a 0,1 až 5 ,ul isokyanidu, například cyklohexylisokyanidu, při 4 C po dobu 2 až 7 dnů. Po imobilizaci se nylonová sítka nebo kolagenová membrána s navázanými enzymy fixuje na povrchu elektrochemického čidla na stanovení kyslíku.

* Výhodou enzymové elektrody na stanovení oligosacharidů a glykosidů obsahujících

CŮ-glukosidovou vazbu podle vynálezu je jednoduchost provedení, vysoká stabilita získaného biosenzorů, dostatečně rychlá odezva a šíře lineární odezvy biosenzorů v závislosti na koncentraci oligosacharidů nebo OŮ-glukosidu v analyzovaném vzorku. Enzymová elektroda podle vynálezu rozkládá vznikající peroxid vodíku a zabraňuje inhibici ostatních přítomných enzymů.

Vynález je dokumentován příklady použití, aniž by se jimi omezoval.

Příklad 1

Nylonová sítka byla ponořena na 2 s do vodného roztoku s 25 % hmot, kyseliny chlorovodíkové a potom byla ihned promyta vodou a 0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0. Na takto aktivovanou sícku bylo aplikováno 5 /U1 oí-glukosidasy o aktivitě 2,5 /ukat.ml , 5 /U1 gluCS 269 747 Bl kosaoxidasy o aktivitě 3 yukat.ml“¹, 5 ^ul katalasy o aktivitě 2 yukat.ml^-1, 5 ^ul

2,5 % glutaraldehydu a 1 yul cyklohexylisokyanidu. Po 4 dnech stání při 4 °C byla sítka promyta 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,0 a potom byla fixována na povrchu kyslíkového čidla.

Příklad 2

Na nylonovou sítku aktivovanou 20 minutovým působením 10 % hmot, kyseliny chlorovodíkové bylo po jejím promytí vodou a 0,1 M fosfátovým pufrem o-pH 7,0 aplikováno 10 oí-glukosidasy o aktivitě 0,5 yukat.ml^-1, 1 /U1 glukosaoxidasy o aktivitě 5 /Ukat.ml^-1 0,5 yul katalasy o aktivitě 5 mkat.ml^-1, 10 ^ul mutarotasy o aktivitě 5 /Ukat.ml\ 1 yul 5 1: glutaraldehydu a 0,1 /U1 cyklohexylisokyanidu. Po 5 dnech reakce při 4 °C byla sítka s koimobilisovanými enzymy promyta 0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 a poté /^U1 byla fixována na povrchu kyslíkového čidla.

Příklad 3

Kolagenová membrána byla podrobena 24 h působení 6 M močoviny. Potom byla promyta vodou a .0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0. Na Částečně vysušený, povrch membrány bylo aplikováno 10 yulού-glukosidasy o aktivitě 5 /ukat.ml~\ 1 yul glukosaoxidasy o aktivitě 1 /Ukat.ml\ 10 yul katalasy o aktivitě 500 /Ukat.ml\ 10 ^ul 1 * glutaraldehydu a 5 /U1 cyklohexylisokyanidu. Po 48 h působení při 4 °C byla membrána důkladně promyta 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,0 a potom byla fixována na povrchu kyslíkového čidla. .

Příklad 4

Na nativní kolagenovou membránu byl aplikován 1 ,ul -glukosidasy o aktivitě -1 -1 /Ukat.ml , 2 /U1 glukosaoxidasy o aktivitě 5 /Ukat.ml , 0,5 /U1 katalasy o aktivitě /Ukat.ml!, 1 /U1 mutarotasy o aktivitě 10 yukat.ml^-^, 1 /U1 5 H glutaraldehydu a 5 /U1 20 1t hmot, roztoku /^-dimethylaminopropylisokyanidu. Po 7 denním působení při 4 °C byla membrána s koimobillzovanýml enzymy promyta 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,0 a potom byla fixována na povrchu kyslíkového čidla.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Enzymová elektroda na stanovení oligosacharidů a glykosidů, obsahujících <Z-glukosidovou vazbu jako například jsou maltosy, sacharosy nebo glukopyranosidy s různými, aglykóny, která na povrchu elektrochemického čidla pro stanovení kyslíku obsahují fixovanou vrstvq koimobilizované úó-glukosidasy, glukosaoxidasy a popřípadě mutarotasy, vyznačují- ⁵ । cí se tím, že obsahují koimobilizovanou katalasu. *
2. 2. Způsob přípravy enzymové elektrody podle bodu 1, vyznačující se tím, že se směs 1 až i

   10 /ul oC-glukosidasy o aktivitě 0,5 až 5 /Ukat.ml^-1, 1 až 10 /U1 glukosaoxidasy o aktivitě 0,3 až 5 yUkat.ml^-1, 0,5 až 10 ^ul katalasy o aktivitě 500 až 5 OOO.yukat. .ml^-1 a popřípadě 1 až 15 yul mutarotasy o aktivitě 1 až 10 ^ukat.ml^-1 koimobilizuje reakcí s 1 až 10 ^ul 1 až 5 % glutaraldehydu a 0,1 až 5 ^ul isokyanidu, například cyklohexylisokyanidu, při 4 °C po dobu 2 až 7 dnů na nylonovou sítku předem aktivovanou parciální hydrolýzou vodným roztokem 10 až 25 % hmot, kyselinou chlorovodíkovou po dobu 2 s až 20 minut nebo na kolagenovou membránu předem aktivovanou působením 4 až 6 mol. . dm^-3 močoviny po dobu 1 až 5 dnů nebo na nativní kolagenovou membránu a potom se nylonová sítka nebo kolagenová membrána s koimobillzovanýml enzymy fixuje na povrch elektrochemického čidla na stanovení kyslíku. '