CS269492B1 - Argininové peptidy - Google Patents

Abstract

Řešení se týká argininových peptidů vzorce X-A-B-C- Arg - Arg - Y, kde značí: X atom vodíku, cv-karboxyalkanoyl s 3 až 5 atomy uhlíku nebo acyl s 2 až 5 atomy uhlíku, A zbytek glycinu, alaninu, leucinu nebo fenylalaninu, B totéž co A nebo jednoduchou vazbu, C zbytek alaninu, leucinu, prolinu nebo jednoduchou vazbu, Y fluorogenní zbytek 7-amino-4-methylkumarinu. Tyto sloučeniny jsou vysoce citlivé fluorogenní substráty pro proteolytické enzymy, které mohou být použitelné v klinické praxi, zejména k důkazu a/nebo stanovení kathepsinů řady B při diagnostice a/nebo therapii neoplasií.

Description

Vynález ee týká argininových peptidů obecného vzorce

X-A-B-C- Arg - Arg - Y, kde značí: X - atom vodíku,CJ-karboxyalkanoyl s 3 až 5 atemy uhlíku nebo acyl β 2 až 5 atomy uhlíku, A - zbytek glycinu, alaninu, leucinu nebo fenylalaninu,

B - totéž co A nebe jednoduchou vazbu, C - zbytek alaninu, leucinu, prelinu nebe jednoduchou vazbu, Y - fluorogenní zbytek 7-amino-4-methylkumarinu.

Tyto nové tri- až pentapeptidy představují skupinu vysoko citlivých fluorogenních substrárů pro proteolytická enzymy, použitelných v klinické praxi, zejména k důkazu a/nebe stanovení kathepeinů řady B při diagnostice a/nebo therapii neoplasií.

Je známo, že proteolytická enzymy zhoubných nádorů mají efektorové a regulační funkce v pochodech jejich růstu, diferenciace, invase a metastasování (Goldfarb R. H. a Liotta 1. A.: Seminars Thromb. Hemostas., 12, 294 (1986); Scher V.: Lab. Invest., 57, 607 (1987): Zucker S.: Cancer Invest., 6, 219 (1988); Duffy M. J.: Eur. J. Cancer. Clin. ' Cncol., 23, 583 (1987)). Kathepsin B (EC 3.4.22.1), cysteinová proteinasa, hraje významnou úlohu v prollferáci nádorových bunék (Sylvén B.et al., Virchows Arch B, 17, 97 (1974); Pietras R.J. et al., Histochem. Cytochem., 29, Suppl. A3, 440 (1981), v destrukci’komponent extracelulární matrix při invasi nádorových buněk (Sloane B. F. et al., In? Cysteine Proteinases and their Inhibitors, Turk V., ed., Gruyter, Berlin 1986, 729) a v agregaci krevních destiček nádorovými buňkami (Honn Κ. V. et al·, Science 217, 540 (1982); Cavanaugh P.G. et al., Clin. Expl. Metastas., 1, 297 (1983)). Aktivita kathepsinu B sdružená s plazmatickou membránou nádorových buněk koreluje s jejich metastatickým potenciálem (Sloane B. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, 2483 (1986); Rbzhin J. et al., Cancer Res., 47, 6620 (1987)). Aktivita kathepsinu B v krevní plazmě je zvýšena u nemocných s progradújícími a metastasujícími zhoubnými nádory (Assfalg-Machleidt I. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, Suppl., 263 (1988)). Proto argininové peptidy podle vynálezu představují specifické substráty pro kathepsin B, a tím vhodná diagnostika nádorů (tabulka 1).

Bližší podrobnosti přípravy argininových peptidů vyplývají z následujících příkladů provedení. Poznámka k příkladům: Veškeré odpařování roztoků bylo prováděno za sníženého tlaku. Sležení vyvíjecích soustav v chromatografii na tenké vrstvě: S^ = n-butanol - kyselina octová - voda (4:1: 1), S₂ = n-butanel - kyselina octová - pyridin- voda (15 : 3 s 10 : 6).

V textové části jsou používány náslédující symboly aminokyselin, chránících a fluorogenních skupin:

Ala = alanin, Arg = arginin, Arg (K0₂) = N^-nitroarginin, Phe = fenylalanin, Gly = glycin, Leu = leucin, Pro = prolln, Git = 4-karboxybutanoyl, Ac * acetyl, Z = benzyloxykarbonyl, Boc = terc.-butyloxykarbonyl, MCU = 7-amino-4-methylkumarin.

Tabulka 1

Aktivita kathepsinu B v homogenátu nádorů plic a normální plicní tkáně u nemocných eperováných pro tumor plic

Aktivita kathepsinu B^b (nkat/g čerstvé tkání)

Nemocný Hietologická * diagnosa nádoru	Stadium onemocnění	tkáň nádoru ' ’	normální plicní zpx tkán ' 1	Poměr aktivit T/P
2 E	II	19,1		3,1
3 E	II	68,3	9,8	7,0
6 E	I	51,0	10,4	4,9

*

CS 269 492 Bl pokračování tabulky 1

7	E	III	119,5	6,0	19,9
8	E	I	14,8	5,0	3,0
12	E	III	112,0	19,0	5,9
15	E	I	45,0	14,8	3,·
18	E	II	64,7	9,3	7,0
20	E	I	31,5	5,6	5,6
25	E	I	262,2	30,2	8,7
26	E	I	86,6	15,8	5,5
27	E	III	45,8	18,2	2,5
13	A	I	117,3	46,8	2,5
17	A	III	261,8	34,4	7,6
24	A	II	89,0	16,2	5,5
29	A	I	114,8	41,8	2,7
14	E+A	III	151,0	62,2	2,4
23	B	I	37,3	10,0	3,7
28	S	I	30,3	8,0	3,8
*5	mGr	—	91,8	7,7	11,9
21	mCaVU	-	83,0	19,7	4,2

^aE = epidermoidní karcinom plic; A _B adenokarcinom plic; E+A = smíšený typ epidermoidního karcinomu plic a adenekaroinemu plic;,B = bronchioloalveolární karcinom plic; S = malobuněčný karcinom plic; mGr = solitérní plicní metastasa Grawitzova karcinomu ledviny; mCaVU = solitérní plicní metastasa karcinomu močového měchýře.

^Aktivita kathepsinu B stanovena kinetickou metodou s fluorogenním substrátem Ac-Leu-Arg-Arg-MCJ.

Příklad 1

Z-Arg(NO₂)-MCU

K roztoku MCU (17,6 g; lOO^mmolů) v pyridinu (600 ml), ochlazeného na -30 °C, byl přidán předchlazený roztok chloridu fosforitého. (4,5 ml) v pyridinu (50 ml). Reakční roztok byl ponechán 30 minut při -30 °C a potom 30 minut při teplotě místnosti. Potom byl k reakčnímu roztoku přidán Z-Arg(NOg) (35,3; 100 mmolů). Vzniklý reakční roztok byl ponechán 3 dny při teplotě místnosti, odpařen, nekrystalický odparek byl rozpuštěn v dimethylformamidu (70 ml) a produkt byl krystalován přídavkem 2-propanolu (720 ml). Bylo získáno 36,6 g (72 %) produktu o 139 až 142 °C. '

Arg(N0₂)-MCU

K roztoku Z-Arg(N0₂)-MCU (10,2 g; 20 mmolů) v ledové kyselinš octové (20 ml) byl přidán 36 % (v/o) bromovodíku v ledové kyselinš octové (20 ml). Po 1 hod. stání při teplotě místnosti byl k vzniklé suspenzi přidán ether (150 ml) a vyloučeny krystalický hydrobromid odfiltrován, promyt etherem a 12 h sušen ve vakuu nad hydroxyďem áodným a kysličníkem fosforečným. Potom byl hydrebromid rozpuštěn v 50% (o/o) vodném 2-propanolu (200 ml); po ochlazení cca na 50 °C byla base uvolněna přídavkem kono. amoniaku (7 ml) a produkt vyloučen přídavkem vody (50 ml). Po 12 h stání při +3 °C byl produkt odfiltrován, promyt vodou a sušen do konstantní váhy. Bylo získáno 6,3 g (89 %) e t. t. 221 až 224 *C.

Z-Arg(N0₂)_Arg(N0₂)-MCU

K roztoku Z-Arg(NO₂)-MCU (3,9 g; 11 mmolů) v dimethylformamidu (25 ml) a N-ethylpiperi dinu (1,55 ml; 11 mmolů), ochlazenému na -20 °C, byl přidán chlormravenčan ekhylnatý (1,1 ml; 11 mmolů). Po 10 minutovém míchání a shlazení (-5 °C) byl k reakčnímu roztoku

CS 269 492 Bl 3 přidán roztok Arg(N0₂)-MCU (3,8 g; 10 mmolů) v dimethylformamidu (50 ml). Po 12 h stání při teplotě místnosti byl reakění roztok odpařen, k nekrystalickému odparku byla přidána 1M HC1 a vyloučený krystalický produkt byl postupně (3krát) rozetírán 5^ hydrogen-uhličitanem sodným, nakonec s vodou a krystalován ze směsi dimethylformamidu (30 ml) a 2-propanolu (250 ml). Bylo získáno 3,95 g (56 JÍ) o.t. t. 152 až 155 °C.

Pro ^C3O^H37^N11°11 (711,7) bylo vypočteno: 50,63 % C, 5,24 % H, 21,65 % N; nalezeno: 49,96 % C,’ 5,45 % ň a 21,14 % N.

Arg(N0₂)-Arg(N0₂)-MCU

K roztoku Z-Arg(N0₂)-arg(N0₂)-MCU (10,7 g; 15 mmolů) v ledové kyailinS octové (100 ml) byl přidán 36% bromovodík v ledové kyselině octové (30 ml). Po 3 hodinovém míchání při teplotě místnosti byl vyloučený krystalický hydrobromid^!.odfiltrován, promyt etherem a sušen v exsikátoru nad kysličníkem fosforečným a hydroxydem sodným. Bylo získáno 5,4 g (62 %) o t. t. 183 až 186 °C. R_f = 0,46^ ; 0,64/S₂. .

K roztoku hydrobromidu (3,3 gj 5 mmolů) v dimethylformamidu (10 ml) byl přidán 5% hydrogen-uhličitan sodný (30 ml), vyloučená base byla odfiltrována a promyta vodou. Krystalizací z dimethylformamidu a octanu ehtylnatého bylo získáno 1,9 g (68 %) produktu o t. t. 178 až 181 °C.

Boc-Arg(NO₂)_Arg( N0₂)-MCU

K roztoků Boc-Arg(N0₂) (4,15 gj 13 mmolů) v dimethylformamidu (30 ml) byl přidán N-hydroxysukcinimid(l,5 g) a N,N-dicyklohexylkarbodiimid (4,9 g) při teplotě 0 ®C. Po 1 hodinovém míchání při teplotě místnosti byl k reakční suspenzi přidán Arg(NO₂)-MCU (4,9 gj 13 mmolů) v roztoku dimethylformamidu (100 ml). Druhý den byla vyloučená N,NÚdicyklohexylmočovina odfiltrována, filtrát byl odpařen a nekrystalický odparek byl vysrážan vodou, postupně rozetírán s 1% kyselinou citrónovou, vodou, 5% hydrogen-uhličitanem sodným, vodou a vysušen do konstantní váhy při teplotě místnosti. Bylo získáno 8,6 g (97 %) o t. t. 171 až 174 °C; natává 165 °C,

Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-MCU

K Boc-Arg(N0₂)-Arg(N0₂)-MCU (3,75 gj 5 mmolů) byla přidána kyselina trifluoroctová (5 ml)j vzniklá suspenze po 30 minutovém míchání při teplotě místnosti se rozpustila a vzniklý roztok byl dále míchán 2,5 hodiny. Přídavkem etheru (30 ml) vyloučený trifluoracetát byl odfiltrován, promyt etherem a 12 hodin sušen nad kysličníkem fosforečným a hydroxydem sodným. Uvolnění base bylo provedeno obdobným způsobem jako u odpovídajícího hydrobromidu. Bylo získáno 2,1 g (72 %) produktu o t. t. 129 až 182 °C.

Ac-Leu-Arg(Νϋ₂)-Arg(N0₂) -MCU

K roztoku Ac-Leu (257 mg; 1,49 mmolů) v dimethylformamidu (15 ml) a N-hydroxysukcinimidu (170 mg), ochlazenému ma 0 °C byl přidán N,NÍdicyklohexylkarbodiimid, (327 mg) a po 1 hodinovém míchání při teplotě místnosti byl k vzniklé suspenzi přidán roztok Arg(N0₂)-Arg(N0₂)-MCU (780 mgj 1,35 mmolů) v dimethylformamidu (15 ml). Po 12 hodinovém stání při teplotě mísinosti byla vyloučená Ν,Ν-dicyklohexylmočovina odfiltrována, filtrát byl odpařen a produkt byl vysrážen vodou. Postupným roztíráním s 1% kyselinou citrónovou, vodou, 5% hydrogen-uhličitanem sodným, vodou a krystalizací z kyseliny octové (10 ml) a etheru (100 ml) bylo získáno 650 mg (66 %) produktu o t. t. 165 až 168 °C,

Ac-Deu-Arg-Arg—MCU.2AcOH

Suspenze Ac-Leu-Arg(N0₂)-Arg(N0₂)-MCU (2,3 g*3,l mmolů) v ledové kyselině octové (100 ml) byla tlakově (5 MPa) hydrogenolyzována v přítomnosti 5% Pd/C /FLUKA/ (1,8 g). Po 5 hodinách byl katalyzátor odfiltrován, filtrát byl odpařen a nekrystalický odparek byl čištěn gelovou filtrací na Sephadexu G15 v 0,2 M kysálině octové; bylo získáno 620 mg lyofili•“’V

CS 269 492 Bl zoraného produktu, elektroforeticky homogenního (pufr pyridin-kyselina octová pH 5,7), při potenciálním epádň 8 V/cm. *

Pro C₃₄H₅₄W₁₀0₁₀.2Ac0H.2H₂0 (798,9) bylo vypočteno: 51,12 1 C, 7,32 1 H, 17,53 1 Nj nalezeno: 50,90 1 C, 7,16 % H a*17,99 % N^<jt)²⁰ -47,8 ⁰ (o « 0,2; methanol).’ • · · .

Příklad 2 ·

Z-Ala-Ala-Arg(N0₂)-Arg(N0₂)-MCU

K roztoku Z-Ala-Ala (294 mg; 1 mmol) v dimethylformamidu (15 ml) a N-hydroxyeukcinimidu (115 mg), eohlazenému na 0 *C, byl přidán N.NÍdicyklohexylkarbodiimid (220 mg) a po 1 hodinovém mícháni při teplotě místnosti byl k vzniklé suspenzi přidán roztok Arg(N0₂)-Arg(NO₂)-MCU (577 mg; 1 mmol) v dimethylformamidu (10 ml). Další zpracování obdobné, jako je uvedeno v'příkladu 1. Bylo získáno 560 mg (66 % produktu o t. t. 165 až 168 °C. Pro ^c36^47^13^12*^2° (®71,9) bylo vypočteno: 49,59 % C, 5,66 % H,,2O,88 £ N; nalezeno: 49,83 % C,· 5,79 % H a 21,12 % N.

Ala-Ala-Arg-Arg-KCU-3AcOH.2H₂0

Suepenze Z-Ala-Ala-Arg(NO₂)-ArgfNO₂)-MCU (435 mg; 0,5 mmolu) v kyseliné octové byla tlakové hydrogenolyzována (5 MPa) a zpracována, jak je uvedeno v příkladu 1. u analogu Ac-I>eu-Arg-Arg-MCU. Bylo získáno 220 mg produktu.

R_f = 0,05/S₁; O,4O/S₂.

Příklad 3

Z-Ala-Ala-Ala-Arg(NOg)-Arg(NO₂)-MCU

K roztoku Z-Ala-Ala-Ala (365 mg; 1 mmol) v dimethylformamidu (15 ml) a N-hydroxysukcinimidu (115 mg), ochlazenému na O °C byl přidán N,N-dicyklohexylkarbodiimid (220 mg) a po 1 hodiné byl přidán roztok ArgCNOgj-ArgíIK^-NCU (577 mg; 1 mmol) a další zpracování bylo obdobné, jak je uvedeno v příkladu 1. Bylo získáno 640 mg (69 %). T. t. 158 až 161 °C.

Pro ^39^52^14°13*“^2° (961,0) bylo vypočteno: 48,75 % C, 5,87 H, 20,41 1 N; nalezeno: 48,68 Jí C, 5,51 1 H a 21,07 % N. ''

Ala-Ala-Ala-Arg-Arg-MCU«3Ac0H

Suspenze Z-Ala-Ala-Ala-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-MCU(48O mg; 0,5 mmolu) v kyselině octevé byla tlakově hydrogenolyzována (5 MPa), jak je uvedeno v příkladu 1. Bylo získáno 245 mg produktu. ',

R_f = 0,05/Sp 0,38/S₂

Příklad 4

Boc-Phe-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-MCU.

Byl připraven karbediimidovou methodon z Boc-Phe a Arg(N0₂)-Arg(N0₂)-MCU obdobným způsobem jako Boc-derivát uvedený v příkladu 2 ve výtěžku 72 % a t. t. 161 až 164 °C. Vzorek k analýze byl krystalován z dimethylformamidu a £-propanolu; t. t. byla nezměněna. Pro ^C36®48^N22°11*2^H2° (^S24>⁸⁷) Bylo vypočteno: 50,23 í 0, 6,09 i H, 19,52 % K; nalezeno: 50,39 % C, 6,17 % H a 19,52 % N.

Phe-Arg(N0₂)-Arg(N0₂)-MCU

Roztok Boc-Phe-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-MCU (990 mg; l,2mmolů) v kyselině trifluoroctevé (2 ml) byl ponechán při teplotě místnosti 1 hodinu a vzniklý trifluoracetát byl vysrážen přídavkem etheru, potom byl odfiltrován a suěen ve vakuu nad kysličníkem fosforečným a hyCS 269 492 Bl droxydem sodným. Base produktu byla získána rozpuštěním trifluoracetátu v dimethylfermamidu (5 ml) a vysrážením přídavkem 5% hydrogen-uhličitanu sodného (10 ml). Potom byla base odfiltrována, promyta vodou a přesrážena z dimethylformamidu a 2-prepanolu! bylo získáno 520 mg.

R_f = O,66/S₁; O,82/S₂

GlT-Phe-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-MCU

Roztok Phe-Arg(N0₂)-Arg(N0₂)-MCU (435 mg{ 0,6 mmolfi) a anhydridu kyseliny glutarové (103 mg) v dimethylformamidu (3 ml) byl -zahříván 2 hodiny při teplotě 80 °C. Petom byl reakční roztok odpařen, produkt byl vysrážen vodou, odfiltrován a krystalizací z dimethylformamidu a 2-propanolu bylo získáno 510 mg; t. t. 179 až 182 °C.

Glt-Phe-Arg-Arg-MCU.AcOH

Suspenze Glt-Phe-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-MCU (420 mg; 0,5 mmolu) v kyselině octové byla tlakově hydrogenolysována (5 MPa) stejným způsobem, jak je uvedeno v příkladu 1 a 2.

Bylo získáno 380 mg produktu elektroforeticky a chromatograficky homogenního.

R_f = 0,16/S₁ ; 0,64/S₂. ·

Claims (1)

1. PŘEDMĚT V Ϊ B Á 1 E Z U

   Argininové peptidy obecného vzorce

   X _ A - B - C - Arg - Arg - Y , .

   kde značí: X - atom vodíku,Aj-karboxyalkanoyl s 3 až 5 atomy uhlíku nebo acyl s 2 až 5 atomy uhlíku, A - zbytek glycinu, alaninu, leucinu nebo fenylalaninu,

   B - totéž co A nebo jednoduchou vazbu, C - zbytek alaninu, leucinu, prolinu nebo jednoduchou vazbu,

   Y - fluorogenní zbytek 7-amino-4-methylkumarinu.