CS269196B1 - Biocompatible collagenous material and method of its preparation - Google Patents

Description

CS 269 196 B1 1

Vynález se týká biokompatibilného kolagénového materiálu a epoeobu Jeho přípravy.Kolagén, doležitá bielkovina vaziva, kostí, chrupavky, kože a Silách, Je už dlho používaná núčnet ror.nyeli príprnvkov n pomocných materiálov aplikovaných v zdravotnict-vo. Využívajú sa viacerá užltočná vlastnosti, ako Je níska immunogenlta, pozvolné sa-movoťná odbúranie mstaboliokou cestou, znáíanliVosť v tkaniach a vhodná fyzikálno-ne-chanická vlastnosti, alebo dokonoa i priamy terapeutioký podporný účinok v niektorýchpatologických situáciach u vazivových Struktúr. Kolagánová hmota rázné tvarovaná a sroznym stupňoa pórovitosti, obsahu vlhkosti alebo 3al8ích thsrapsuticky účinných lé-tok sa používá na vytváranie drenáží, upohávok, podložiek, alebo výplní v chirurgii,alebo dokonca ako náhrada xenotransplatátov a rekonStrukčný materiál při úrazoch a hl-bokých patologických změnách. (Chvapil, M., Kronenthai B.L., Van Winkles Medical andsurgical applications of collagen. Jnt. Eev. Connective Tiseue Beecarch, 1973, 6, 1-61; Tanas I.V., Burke J.F., Deaigp oí an artiíicial skin. J.Biomed.Mater.Bee., 1980,14, 65-81; Oliver R.F., Barker H., Cooke A., Grante H.A., Dermal Collagen implants,Biomaterials, 1982, 3, 38-40; Doillpn C.J., Whyne C.F. , Berg R.A. , Olson B.M. , SilverF.H., Fibroblaet-collagen aponge interaotions in vitra an in vivo, Scanning El.Microe-copy, 1984, III, 1313-1320; Chvapil M., Colagen sponge: theory and practice of medicalapplications. J.Biomed. Materiál Bas., 1977, 11, 721-741; Begalakis N., Flink J., Sta-aikalis J.F., Burke J.F., lannas I.V., Dssign of an arfiticial skin, part II: J.Bio-med.Mater. Bes., 1980, 14, 511-528.

Napriek tomu, že mnoho rokov bol roznymi apásobmi vyčištěný kolagén považovaný zaneimmunogenný materiál a ani dnes nie Je považovaný za silný immunogén, predsa len boreuvedená literáma evidencia ukazuje, že výběru kolagánováho zdroja a spSsobu Jeho čis-tenia Je potřebné věnovat' pozornost' i z tohto hladiska. ĎalSie otázky, ktoré súvisias dosiať nedorieSenými problémami spojenými s regulováním rýchlosti odbúrania kolagé-nových implaritátov presnejíou kontrolou stupňa zasietovania pri výrobě kolagénovejsubetancie, a otázkou distribúcie kolagénových vlákien, nedoatatočnou odlnosťou vlhkýchkolagénových preparátov proti sekundárnej mikrobiologickéJ kontaminácii a v neposlednomradě tiež s vhodnou Struktúrou samontnej fibrilámej hmoty pre Speciálně aplikácie, sivyžadovali nové rieSenie.

Uvedené nevýhody rieSi kolagénový materiál podl'a vynálezu, ktorého podstata spo-čívá v tom, že pozootáva z Jedného kolagénového typu (I) obsahujúceho dva odliSné po-lypeptidickó reťazce</l/I/2 a</2 priečne zasietovaná 1,5 až 8 vazbami na 1 mol kolagé-nu, pričom obsah nekolagénovýoh bielkovín Je najviac 0,5% hmot. vztiahnuté na kolagén,obsah vápnika neprevySuJe 1 mg/g kolagénu a obsah popola Je najviac 0,5 % hmot., pri-čom kovové ióny sú vo formě ohelátového komplexu. Takto připravený kolagén na rozdielod známých materiálov sa vyznačuje schopnosťou odolávat'rastu mikroorganizmov i za vlh-kých a nestsrilných podmienok, bez použitia SalSích bakteriostetických prípravkóv. Otáz-ku kontroly doby zotrvania implantátu v tkaniva příjemců možno do určitej miery rieSiťkontrolovaným atupňom zníženia priečneho zasieťovania kolagénu účinkom alkalickéhoprostredia počas určitej doby, pričom platí, že čím dlhSia Je doba alkalického posobe-nia, tým kratSia Je doba zotrvania implantátu, resp. rýohleJSie Je Jeho rozloženie fa-gocytosou a enzymatickými procesmi.

Podstata epoeobu přípravy uvedeného kolagénového materiálu spočívá v tom, že nakolagénové vazivo Sliaoh sa posobí z 50 % nasýtsným až nasýteným roztokom hydroxiduvápennatého najmenej třikrát za sebou, potom sa vazivo preperie vodou, neutralizujevodným roztokom obeahujúoim 1 až 12 %hmot. chloridu alebo síranu amonného alebo hydro-góneíranu sodného vztiahnuté na hmotnost’ vaziva, potom sa vazivo podrobí nekolagenoly-tickému účinku proteázy ako Je pronáza, trypsin, ohymotripsin, pepsín, panreatín ale-bo alkaláza pridanej v množstva odpovedajúcom 10 až 10 000 kazeinovým Jednotkám na 1 gkolagénu pri teplote 20 až 37°C počas najmenej 20 minút, znova sa preperie vodou a pře-prané vazivo sa vystaví účinku komplexotvomého činidla, vybraného zo skupiny látok CS 269 196 B1 nko je kyselina nitrilotrioctová, sodná sol tejto kyseliny, kyselina etyléndiamino—tetraootová alebo jnj sodná noť po dobu najmeliej JO minút a nnkonieo na kolngáno.vá' hmo-ta preperie vodou.

Kolagánová hmota ea po okyselelní na pH 2 až 4,5 nože rozomlieť a pře filtroval’cez tkaninový filter, připadne ea okyselená kolagánová hmota po filtrácii vyzráža^dovláknitej formy a znova premyje vodou. Vláknitá alebo gálovitá kolagánová hmota sa mo-že zmrazit’ pri teplote -90 až -60°C a potom vysuSiť lyofilizáciou a sterilizovať poso-bením teploty vyššej ako 80°C alebo gama žiarením, připadne sa před zmrazením alebo po-čas mrazenia može vystaviť pfisobsniu plynného alebo kvapalného oxidu uhličitého podpretlakom 0,02 až 0,6 MPa.

Zabezpečenie homogenity kolagénového typu zabezpečuje voíba kolagénu 31’achy, svýhodou achilovej, namiesto častéjšie používaných kožných materiálov. Je známe, že ko-lagén Je tvořený tyčinkovými polymárovými molekulami, zloženými z troch polypeptidic-kých retazcov, tzv. alfa reťazcov, ktoró sú navzájom navinuté do tvaru charakteristic-kej trojitej skrutkovice. Existenoia a stabilita takejto štruktúry Je podmienená prí-tomnoaťou glysinu v každej tretej polohe a ku stabilitě prispieva i relativné veíký ob-sah aminokyselinových zbj-tkov, prolinu a hydroxyprolínu. V roznych tkaninových štruk-túrach sa nachádzajú odlišné, geneticky určené typy kolagénov. Počet všetkých známýchtypov sa stále iv-ačáuje, v súčasnosti poznáme 8 typových skupin, z ktorých sa vačšinasáté ÍialeJ dělí na Jednotlivé členy typovej skupiny. Pokial Je vazivo v normálnej fy-ziologické J situácii, Je přítomný len Jeden z dvooh známých členov rodiny kolagénovéhotypu I, teda kolagén, ktorý obsahuje dva odlišné polypeptidické reťazce<Zl/I/2 acZ^.Druhý člen tejto typovej skupiny, tzv. trimer a organizáoiou (/</-l/I/)-j ea nachádza lenv patologických podmienkach, alebc pri kultivácii in vitro v buněčných kultúrách, v ná-doroch alebo nadmeme raetúcioh tkaniváeh. Samotná voíba zdroja kolagénu vSak nemozezabezpečit problém isnr.unologiokej aktivity kolagénových preparátov, len ju zjednodušuje.I ke 3 v mnohých prípadoch tvorba antigenov stimulovaná kolagánom nie je významná, vniektorých aituáoiach, pri celkove zníženej immunologickéj odolnosti příjemců kolagéno-vého implantátu, može byť i mieme immunogenná schopnoet’ oudzieho materiálu nepriazni-vý faktor. V týchto súvislostiach sa zvyčajne rozlišujú dve immunologické vlastnosti bielkovinových antigenov: antigónová speoifila/a immunogenicita. Antigenicita je ter-mín používaný pře popis schopnosti bislkoviny reagovat s vylučovanými protilátkami,kým pod pojmom immunogenicita rozumieme sohopnost hielkoviny stimulovať tvorbu protiló-tok. Immunochemické testy u kolagénov rózneho póvodu odkryli tri odlišné oblasti kola-génových molekúl, vyznačujúoich sa antigenioitou. NajdSležitejšia z týchto oblastí sanaohádxa v terminálnom, C-konoovom telopeptide. fralšia antigenická oblast! je v střed-ηβ j, helikálnej oblasti molekuly, ale této je aktívna obzvlášť při Strukturněj trans-formáoii vedúoej ku zníženiu usporiadanosti, teda pri premene kolagénu na želatínovúmodifikáciu. Aj v N-konoovom telopeptide a hlavně pře a pro -kolagénových peptidoch,odštěpovaných pri biosyntéze, sa vyskytujú antigenická oblasti. NajdSležitejšie antige-nickó oblasti sú tie, ktoré sa naohádzajú v koncových peptidooh. Pretože tieto oblastisú súčasne najcitlivejšie, íahko sa odštepujú proteinázami nekolagenolyticxej povahy,existuje teda možnosť zníženia antigenioity kolagénových preparátov enzymatickou ces-tou. Táto možnosť sa využívá v spSsobe přípravy kolagánového materiálu podía vynálezu.

Na rozdiel od ostatných metod čistenia kolagénovej suroviny pri výrobě zdravotnickyvyhovujúceho materiálu, používá sa v čistiaoej fáze krok založený na posobení pronázy,trypsinu, chymotrypsinu alebo pěšinu a dokladná extrakcia odštiepenýoh peptidov izostávajúoich enzýmov z vyčištěného materiálu. Pokial ide o immunogenicitu, schopnost’indukovat’ tvorbu protilátok, potom dovod tejto vlastnosti je dosiaí nejasný. Niektorípracovníci sa domnievajú, že příčina može byť v heterogenite kolagénových typov, pre-tože immunogenná reakoia sa zvýrazňuje so stúpajúcim počtom kolagénových typov nachád-zajúcich sa v testovanom lolagéne. Enzymatické štepenie terminélnych oblastí immunoge- CB 269 196 B1 3 nicitu neznižuje, rovnako ako pokles uspoříadanosti v helikálnych oblastiach napr. v«binledku tepelnaj <l»n* turáo i ·. V silvíelontl s přípravou bazpačnýoh kolagenových implnritátov Je důležité pozorovanie, i· ohemioké modifikácia kolegénu často vedle ku výraznému zvýéeniu immunogenloity. Tak napr. aoetyldoia, posobenie hydroxylaminu, sukcinyla-oia, metyláoia alebo iné modifikácie na vedlajéích reťaziach kyslých a bazických ami-nokyselin kolagénu premenla tento materiál na poměrně silný immunogén. To poukazuje nariziko, akém3že vyvolávať chemická modifikácia vedťajSích reťazcov kolagénu, používa-ná často v poatupoch přípravy kolagénovýoh materiálov uvedených v odbomej literatúre(Oliver B.P., Barker H., Cooke A., Grande B.A., Derme1 Collagen implants, Biomateriala1982, 3, 38-40). V sposobe podťa vynálezu Je respektovaná požladavka Co najnižSej mo-difikáoie nativnej kolagénovej molekuly za súČasného reSpektovania požiadavky čo naj-menSieho počtu kolagénových typov. Na druhej straně takýto přístup vylučuje chemickéúpravy, ktoré zabezpečuj·! inak nevyhnutná mikrobiálnu odolnost* kolagénových derivátovvo vlhkom prostředí a mořnoeťou sekundámej kontamináoie mikroorganizmami. Pri rieSe-ní problému bolo využité zistenie autorov, že dokladné zbavenie kolagénu minerálnychlátok, najma vápnika a iných solí viacmocnýoh katiónov, vyvolá výrazná mikrobiálnuodolností i v nepřítomnosti bakteriostatických látok, alebo aldehydickej modifikácie ba-zických skupin kolagénu, aké sú známe z doslal’ uvádzanýoh postupov přípravy. lnou výhodou rleSenia podťa vynálezu je možnost* reprodukovateťne j regulácie stup-ňa prirodzeného priečneho zasieťovania vyráběných kolagénových derivátov, pomocou al-kaliokého pomalého Siepenia zosiaťovania. Takto je možné presne definovat’ najdoleži-tejSiu' vlastnosť kolagénovýoh substrátov, ktorá určuje rýchlosť metabolickej výměny,alebo samovoíného odbúravania implantátov in vivo.

Poslednáz výhod přípravy kolagénových materiálov podťa prihléSky vynálezu sa tý-ká výroby kolagénových pien určených pre hemostatioké a iné účely. Doteraz připravova-né materiály tohto typu vychádzajú z kolagénovej hmoty nasiaknutej kyselinou alebo zá-sadou a jej mrazovej eublimácie za sníženého tlaku. Tieto hmoty májá štruktáru uzavře-te j pěny, tj. jednotlivé dutinky hubovitej Struktáry sú navzéjom oddělené tenkou stě-nou. Takáto átruktúra je vhodná vo vačSine prípadov, kedy materiál slúži pre účelyupchávky, ale v niektorých aplikáoiéoh je vyžadovaná sohopnosť rýohleho nasévania tě-lově j alebo fyziologické! kvapaliny alebo regulovatelná priepustnost pre kvapaliny. Pretakéto účely možno použití sposob podťa vynálezu, založený na použití plynu rozpustnéhovo vodnej fáze, a výhodou oxidu uhličitého, ktorý sa pod tlakom rozpustí vo vlhkom ko-lagénovom polotovare před jeho zmrazením. 7 priebehu mrazovej lyofilizéoie za snížené-ho tlaku, sa expandujúoim plynom perforujú steny dutiniek v pene, takže vzniknutý vý-robek má otvorenú Struk túru so schopno sťou nasávat’ a prepúsťať1 kvapaliny. Příklad 1 1 kg očistenej hovádsej aohillovej Sťaohy, zbavenej koncových časti a nakrájanejna kúsky přibližné 1 cnP sa premyje vodou a extrahuje třikrát vždy 5 1 roztoku obsahu-júceho 100 g/1 chloridu sodného za občasného mieSania, vždy po dobu 24 hodin pri teplo-to 10°C. Extrahované Sťachy sa premyjú destilovanou vodou dvakrát vždy po 5 1 vody zamieéania po dobu 4 hodin. Potom sa extrahujú třikrát po sebe s 50 % nasýteným roztokomhydroxidu vápenatého vždy po dobu 24 hodin pri teplote 10°C za občasného mieSania. Po-kiať je stupeň priečneho zasieťovania stanovený z denaturačnej teploty kolagénu v 6 Mroztoku močoviny vySSÍ, ako 4/mol, pokračuje sa v alkaliokom působení vo vymenenom roz-toku hydroxidu vápenatého tak dlho’, až sa stupeň kovalentného zasietovania zníži natáto hodnotu. Po alkalickej modifikácii sa vykoná neutralizácia posobením 2 1 roztokusíranu amonného o koncentrácii 25 g/1 po dobu 12 hodin. Po dekantécii sa šťachy premy-jú destilovanou vodou, dvakrát s 5 1 premieSavajá 4 hodiny a potom sa v 10 1 redesti-lovanej vody poneehajú 24 hodin pri 5°C. Kúsky 51’achy sa potom rozmixujú vo vodě po-mocou mixéru s nerezovými nožmi pri teplota neprevySujúcej 15°C. Zmes vlákien sa pre-myje třikrát destilovanou vodou a odvodní dekantáciou. Vláknina sa rozmieSa v 2 1 vody 4 CS 269 196 B1 o tnplotn ohnnhujdcnj 200 mg nnr.ýmu Pronéne (použitý výrobok Pronann P roinat, produkt preone Streptomyces grisouo, dodaný fy. Barva, Heidelberg, NBR) a mierne samieSa po dobu 12 hodin. Potom ea vláknina dekantuje a opakované paťkrát premýva redes-tilovanou vodou, vždy po dobu 5 hodin. Po poelednom praní voda ponechaná 24 hodin vstyku e vlákninou nezníži svoju vodivost’ o viac než 36 % a neobsahuje rozpustné biel-koviny detekovatel'né ninhydrinom. Kolagénová vláknina sa potom okyselí kyselinou oc-tovou na pH 3,6 a mixuje sa v napučanom stave při 5°C po dobu 5 minét, potom sa přidá20 mg ohjiatonuIII na g kolagénu a neutralizuje pomooou zriedeného hydroxidu sodného napH 7,0. Oddálené vlákna sa premyjú redestilovanou vodou, vždy 5 1 po dobu 5 hodin tři-krát a 5 1 po dobu 24 hodin třikrát. Vláknina sa potom čiastočne odvodní odstředěním apoužije sa na výrobu kolagénovýoh dieloov, ktoré sa sterilizujú gama Siarením. Příklad 2 1 kg telacej aohillovej Sťachy, očistenej a zbavenej koncových častí úponov sva-loviny sa premyje vodou, rozmixuje vo vodnom· prostředí pomocou mixéru s nerezovými nož-mi při teplotě nižáej ako 20°C a niekoikokrát premyje destilovanou vodou. Vláknina saextrahuje pomocou vodného roztoku chloridu sodného o koncentrácii 10 %hmot. pri oby-čajnej teplota, trikrét vždy 7 1 extrakčného kúpela za mieSania po dobu 24 hodin. Potomsa vláknina dekantuje v 10 1 vody, odvodní odstředěním a rozmieSava v 7 1 nasýtenéhoroztoku hydroxidu vápenatého. V tomto roztoku sa ponechá 48 hodin, potom sa odstředí aroztok hydroxidu sa vymění za nový. Za rovnakých podmienok sa alkalické pSsobenie eétedvakrát opakuje, čím sa dosiahne hodnota priečneho zasietovania, asi 5 vazieb na molkolagénu. Této hodnota závisí od druhu aplikácie pre ktoré Je kolagénová hmota určená.Vláknina sa potom opakované perle redestilovanou vodou až Je pracia voda len mierne al-kalická (pH Je menSle ako 9,0) a neutralizuje sa roztokou chloridu amonného a hydrogén-aíranu sodného 1:1 pri oelkovej konoentráeii 25 g/1 po dobu 24 hodin. Neutralizovanýkolagén sa potom odvodní odstředěním, premyje sa třikrát redestilovanou vodou a potomsa vloží do 3 1 roztoku, obeahujúceho 5 g pankreatínu. Pri teplote 35°C sa zmes mieSapo dobu 10 hodin, potom sa vláknina odstředí, trikrát premyje redestilovanou vodou aextrahuje 7 1 redeštilovaneJ vody, vždy po dobu 10 hodin, při teplote 5°C. Extrakciasa opakuje paťkrát, posledný extrakt už nedává pozitivnu reakoiu na dusíkaté látky nin-hydrinovou kolorimetrickou metodou. Vláknina sa potom rozptýlí v 3 1 roztoku obsahujé-ceho 1,5 g/1 kyseliny nitrilotrioctovej a 5,5 g/1 dvojsodnej soli kyseliny etylendia-mintetraoctovej. Po 24 hodinách sa roztok dekantuje, paťkrát premyje 7 1 redestilova-nej vody po dobu 10 hodin. Posledná pracia voda po 24 hodinovej ekvilibrácii s kolagé-novou vlákninou nezvýSi povodné hodnotu svojej vodivosti o viao než 35 %· Vláknina Jepoužiteíná na přípravu vláknitých kolagénových étvarov, alebo sa 3aleJ spraoováva pos-tupom vedúoim k přípravku tvoriaoemu pěnu s dodáním kyseliny hyaluronovej a 3alSíchtherapeuticky pdsobiaoich látok. Pre tento účel sa vláknina najskdr okyselí kyselinouoctovou na pH 3,8, ochladí na 5°0 a pri tejto teplote mixuje nerezovými nožmi. Vznik- nutá gelovitá hmota sa přefiltruje cez polyamidový sieťový filter o hustotě 3k 100/cm2,neutralizuje zriedeným roztokom uhličitanu sodného a vyléčená vláknina sa odstředí.Vláknina sa potom premyje redestilovanou vodou, rozmieSa v 7 1 redestilovanej vody a .ponechá při 10°C 12 hodin. Po dekantáoii sa pranie v 7 1 vody eSte dvakrát zopakuje,až sa vodivost? redestilovanej vody už nemeni o viao než 3 % z pftvodnej hodnoty. Taktopřipravené vlákninu možno použit’ pre vytváranie vláknitých étvarov, kapilárnych tru-bičiek, roznyoh dielcov a ploSnýoh étvarov určených pre zdravotnické účely. Před su-Sením, alebo lyofilizáciou do materiálu možno přidat’ potřebné množstvo hyaluronátu,antibiotik, immunodepresívne pásobiaóich látok a iných farmaceutických preparátov, pó-dia požiadaviek konkrétnej zdravotnej situácie. Tieto aktivně látky tiež možno přidat1až při zvlhčení suchého materiálu, alebo v případe, že Je požadovaná pěnová Struktéra,do kolagénového materiálu vo formě pěny. V tomto případe sa vláknina znovu okyselí ky-selinou mravčou alebo octovou na pS 3,2 a ku vzniknutému gelu sa přidá roztok hyaluro-

Claims (6)

1. CS 269 196 B1 5 nótu v množstva 1,5 % na hmotnost' suoháho kolagénu. Do gélu možno pridať i 5alSie 7far-mncnutická preparáty podťa požiadaviak lekárn. Po zamioňAní n homogenizácii na gelzmrazí a lyofilizuje za zníženého tlaku. Vzniknutý produkt má tvar uzavretej pěny, zktorej sa farmakologicky účinné látky vylučuju pomaly behom celého hojivého procesu. Vytvořený gel s prídavkom hyaluronátu možno použit’ i pře přípravu otvorenej pěny tak, žepo ochladení na 5°C sa v uzavretej tlakovej nádobě nasýti plynným oxidom uhličitým apotom náhle zmrazí na teplotu nižěiu ako -40°C. Zmrazený materiál, připadne vytvarovanýdo požadovaného konečného stavu-tvaru sa podrobí mrazovej sublimácii za zníženého tla-ku. Sterilizuje sa po vysuéení v teplovzdušnom sterilizátore 30 minút při 115°C. Taktosa získajú kolagénové útvary tvořené otvorenou pěnou a obsahujúce připadne podporné far·maceutické preparáty, dodané bu2 před zmrazením, alebo spolu s vlhčiacim fyziologickýmroztokom, až před vlastnou aplikáciou. Kolagánový materiál pódia vynálezu može nájsť Široké uplatnenie hlavně v zdravot-nictva. Naeiaknutý prídavkom kyseliny a vody vytvára gelovitú hmotu vysokéj viskozity.Móže sa použiť ako nosič a sorbent farmakologicky účinných prípravkov a podporných lá-tok v hojivom procese a k přípravě umelej kože, xerotransplantátov a náhrad v očnej,cievnej a vnútomej chirurgii. PEEDMET VTNÁLEZU

   1. Biokompatibilný kolagénový materiál vyznačujúci sa tým, že pozostáva z jednéhokolagénového typu (I) obsahujúceho dva"odliSné polypeptidické retezce^l/I/g 2,priečne sieťované 1,5 až 8 vazbami na 1 mol kolagénu, pričom obsah nekolagénových biel-kovín je najviac 0,5 %hmot. vztiahnuté na kolagén, obsah vápnika neprevyáuje 1 mg/g ko-lagénu, obsah popola je najviao 0,5 %hmot. a kovové ióny sú vo formě chelátového kom-plexu.
2. 2. SpSsob přípravy kolagénového materiálu pódia bodu 1 vyuhádzajúci z vyčištěnýcha rozomletých zvieracích Sliach vyznačujúci sa tým, že na kolagénové vazivo Sliach sapBsobí z 50 % nasýteným až nasýteným roztokom hydroxidu vápenatého najmenej třikrát za sebou, potom sa vazivo properie vodou, neutralizuje vodným roztokom obsahujúcim 1 až12 %hmot. chloridu alebo síranu amonného alebo hydrogénsíranu sodného vztiahnuté nahmotnost' vaziva, potom sa vazivo podrobí nekolagénolytickému účinku proteázy ako Je pro-náza, trypsin, chymotripsin, pepsín,.-pankreatidín alebo alkaléza pridanej v množstveodpovedajúcom 10 až 10 000 kazeinovým jednotkám na 1 g kolagénu při teplote 20 až 37°Cpočas najmenej 20 minút, znova sa preperie vodou, přeprané vazivo sa vystaví účinku kom-plexotvorného činidla vybraného zo skupiny látok ako je kyselina nitriolotrioctová, sod-ná sol’ tejto kyseliny, kyselina etylóndiaaminotetraoctová alebo jej sodná sol1 po dobunajmenej 30 minút a nakoniec sa kolagénové hmota preperie vodou.
3. 3. Sposob přípravy kolagénového materiálu podťa bodu 1 a 2 vyznačujúci sa tým, žekolagénové hmota sa po okyslení na pH 2 až 4,5 rozomelie a přefiltruje cez tkaninovýfilter.
4. 4. Sposob přípravy kolegénováho materiálu podťa bodu 1 až 3 vyznačujúci sa tým, žeokyslená kolagénové hmota sa po filtrécii neutralizáciou alebo posobením chloridu sodné-ho vyzréža do vláknitej formy a znova sa premyje vodou.
5. 5. Sposob přípravy kolagénového materiálu podťa bodu 1 až 4 vyznačujúci sa tým, ževláknitá alebo gelovitá kolagénové hmota sa zmrazí při teplote -10 až -60°C, vysuéí lyo-filizáciou a sterilizuje posobením teploty vyššej ako 80°C a/alebo gama žiarením.
6. 6. Sposob přípravy kolagénového materiálu podlá bodu 1 až 5 vyznačujúci sa tým, žeha kolagénovú hmotu sa před zmrazením alebo počas mrazenia páeobí plynným alebo kvapal-ným oxidom uhličitým pod pretlakom 0,02 až 0,6 MPa.