CS268903B1 - Způsob testováni látek s eytostatickým účinkem - Google Patents

Abstract

Podstatou řešení je, že se testováni provádí na rostoucích pro toplastěch kvasinek rodu Saccharomyces a biologická účinky látek S cytostatickými účinky jsou analyzovány cyto log ickými metodami zahrnujícími hodnoceni velikosti protoplastú, počtu jader na protoplast a stupeň redukce mikrotubulárni soustavy. Z mikroskopického hodnoceni preparátů lze přimo zjistit jednotnou odpověď souboru kvasinkových buněk a zároveň určit vztah mezi chemickým složením testovaného cytostatika a molekulární úrovni jeho účinku na strukturu buňky. Způsob nahrazuje testováni látek s cytostatiským účinkem prováděný pomoci tkáňových kultur živočišných buněk a laboratorních zvířat.

Description

Vynález se týká způsobu testováni látek s cytostatickým účinkem.

Postup vychází z obecných nejnovějšich vědeckých poznatků, potvrzujících. že molekulární mechanismus děleni eukaryontni buňky je fylogeneticky velmi starý a principiálně shodný od kvasinek po člověka (3.L. Marx, Science 226, 527-528, 19854 P. Nurse, Nature 313, 631-632, 1985). Hlavni složkou tohoto mechanizmu jsou protoonkogeny, homo-ogy logy onkogenů - genů nádorových virů - které jsou přítomny jako geny regulující proli-era feraci v genomu všech obratlovců včetně člověka (R.A. Weinberg, 3.Cell Biology 97, 166-166 -1662, 1983). Porušeni souhry hlavních prollferač. genů je prvým krokem k spuštění ně-kterých typů nádorové přeměny(H.E. Varnus, Ann.Rev.Genet. 18. 553-612, 1984).

V průběhu dvou posledních let bylo v genomu kvasinek identifikováno již 8 protoonkogenů /A. E. Wheals. Bioessays 3. 108-112. 1985/. Tyto geny jsou vesměs zapojeny do regulace buněčného děleni, jejich funkce je relativně velmi dobře známa a jejich exprese je přimo spjata s mikrotubulárnim systémem, který je prvou složkou cytoskeletu identifikovanou u kvasinek /E. Streiblová a J. Hašek. Microbial Sciences 2. 139-143. 1985/. Inhibitory polymerizace mikrotubulárniho systému máji experimentálně a klinicky využitelný cytostatický účinek vzhledem k selektivní toxicitě k mikrotubulům, přítomným v jádrech rychle se dělících nádorových buněk /M. G. Fitzgerald. Biochem. Pharmac. 25, 1383. 1975/.

Užívané známé způsoby sériového testování látek s cytostatickým účinkem jsou prováděny na laboratornich zvířatech a ve tkáňových kulturách /De Brabander M. a kot.. Cancer Res. 36, 905-916 /1976//.

Dále jsou známy práce zabývající se špecifitou anti mikrotubutárních látek a testováni látek s cytostatickým účinkem na celé buňky kvasinek /Walker G. K., J. G. Microbio., 128, 61-71 /1982/; Quinlan R. A. a kol., J. Cell Sci. 46, 341-352 /1980//.

Uvedené používané techniky jsou časově, metodicky a ekonomicky náročné.

Tyto nevýhody odstraňuje způsob testováni látek s cytostatickým účinkem podle řešeni, jehož podstatou je, že ve sterilní živné půdě stabilizované osmoticky sorbitolem s osmolaritou 0,7 až 1 jsou submerzně inkubovány protoplysty Saccharomyces ce8 9 -1 revisiae nebo Saccharomyces uvarum v počáteční koncentraci 10 až 10 buněk . ml při teplotě 25 až 30 °C po dobu 20 až 30 minut a potom je přidán vzorek látky s cyto^statickým účinkem v koncentraci 10 až 100 ug/ml~¹ rozpuštěné v dimethylsulfoxidu a ponecháno 4 až 6 hod, potom je vzorek centrifugován, protoplast/ fixovány pro detekci jader a nepřímou imunofluorescenci mikrotubulárniho systému.

Látky s cytostatickým účinkem jsou testovány na pro toplastech kvasinek vzniklých enzymovým netrávením intaktních buněk kvasinek směsi enzymů z žaludku hlemýždě zahradního /Helix pomatia/; tento postup odstraňuje permeabilní bariéru na povrchu kvasinek, která by mohla bránit vstupu a transportu testovaných látek do buněk /Nečas 0., A. Svoboda, J. F. Peberdy a L. Fevenczy Zeds./ Fungal protoplasts, str. 115-133, Marcel Dekker, New York 1985/. K testování lze použit na přiklad kvasinek druhu Saccharomyces uvarum s velkými buňkami a vysokými růstovými rychlostmi. Mimoto tento druh je zdravotně nezávadný, má malé výživové nároky a je tradičně používaný v pivovarnictví.

Vzniklé protoplasty kvasinek, které pokračuji při kultivaci v osmoticky stabilizované půdě v růstu /syntéze proteinů a makromolekul/ a v jaderném děleni, představuji dynamický in vitro systém cytostaticky snadno dosažitelný.

Výhodou je, že rostoucí protoplasty jsou vystaveny vlivu studovaných cytostatických látek přimo v osmoticky stabilizovaném prostředí ve kterém rostou; biologické ú2

Činky testovaných látek jsou analyzovány po Čtyřech a Šesti hodinách, tj. přibližně po třech jaderných děleních, která proběhnou v kontrolnich protoplastech.

Znalosti kinetiky růstových procesů, jaderného děleni a chováni cytoskeletu v kvasinkových protoplastech lze použit k poznáváni způsobů, jimiž látky s cytosatickým úCinkem vstupuji do regulace buněCného chováni. Testováni umožňuje: a/ posoudit celkovou vnimavost buňky na studovanou látku, b/ přispět k objasněni citového místa pro působeni látky s cytostatickým účinkem c/ interpretovat mechanismus jeho ůřinku d/ vyjádřit utlum jaderného děleni ve stanoveném intervalu na buněčné úrovni.

K cytologické analýze inhibovaných protoplastú stačí optický mikroskop, vybavený zařízením pro fluorescenční mikroskopi v kombinaci s fázovým kontrastem. Mikrotubulárni systém je zobrazován nepřímou imunofluorescencí /Progress in Cell Cycle Controls, Mikrobiologický ústav ČSAV, 1983, str. 159 až 160/. Jaderná a mitochondriálni ONK a počet jader jsou zobrazovány přímou fluorescencí /H. Giloh a J. W. Sedat, Science 217, 1 252 až 1 255, 1 982/. Velikost protoplastú se posuzuje měřením jejich průměrů ve fázovém kontrastu pomocí okulárového mikrometru, který je pro tento účel vkládán do okuláru /Mikrobiologické metody, Praha, Academia 1981, str. 30 až 53/. Velikost protoplastú je vyjadřována jako střední velikost protoplastú /x /.

_ · ⁿi * ^xi

X = . , .10 ε · , 1· x průměrná střední velikost protoplastú v pm počet protoplastú v 1 pozorovaném poli střední velikost protoplastú v 1 pozorovaném poli v um ζη^ celkový počet změřených protoplastú

Pozorováni protoplastú je prováděno pomocí fluorescenčního mikroskopu Jenalumar /Zeiss Jena NOR/, který umožňuje alternativní střídáni fázového kontrastu s fluorescenčním pozorováním při různých vlnových délkách u jednoho preparátu. Použije se okuláru zvětšujícího 6 krát s vloženým mikrometrem a imersniho objektivu zvětšujícího 100 krát za použiti neftuoreskuj1c1 ho imersniho oleje. Velikost protoplastú se měří ve fázovém kontrastu, rozloženi DNA a počet jader se sleduje ve fluorescenčním obrazu za použiti filtru pro vlnovou délku 340 až 380 nm, stav mikrotubulárni soustavy se sleduje ve fluorescenčním obrazu za použiti filtru pro vlnovou délku 450 až 490 nm. Je porovnáváno průměrně 20 poli obsahujících 20 až 50 protoplastú se stejným počtem poU referenčních /kontrolních/ protoplastú.

Navrhovaným testem se sledováni účinků cytostatických látek mnohonásobně ekonomizuje, protože náklady na udržováni kmene, na živné půdy, Lytické enzymy a protilátky jsou ve srovnáni s chovem a testováním na laboratorních zvířatech téměř zanedbatelné.

Předmětný způsob využití umožňuje sériové testováni látek s cytostatickým účinkem podle vynálezu.

V příkladech provedení je dokumentována dostatečná univerzalita způsobu využiti kvasinek pro testováni látek s cytostatickým účinkem, a to použitím nokodazolu /methyl-/-2-thienyIkarbonyl/-1 H~benzimidazol-2-yl karbamátu/, karbendaz i mu /MBC; methylbenzimidazol-2-yl karbamátu/ a použitím původního československého cytostatika Benfluronu /5- 2-/N-N-dimethylamino/etoxy -?-oxo-7H-benzo c fluoren hydrochloridů/, kte

CS 268903 81 3 rý je předměte· čs. autorského osvědčeni č. 212 669 a jehož vlastnosti jsou dále uvedeny v čs. autorských osvědčeních č. 235 429 a č. 242 292. Různý účinek cytostatik na mikrotubulárni systém a jaderné děleni protoplastů kvasinky Saccharomyces uvarua lze dokumentovat snímky z fluorescenčního mikroskopu. Z těchto snímků je možno zjistit i vztah mezi chemickým složením daného cytostatika a molekulární úrovni jeho účinku na funkční organizaci buňky.

Bližší podrobnosti vyplývají z příkladů provedeni, které způsob podle vynálezu blíže objasňují, ale nijak neomezuji.

Příklady provedení

Přiklad 1

V testování se použije druh Saccharomyces uvarum kmen P 96, který je průběžně udržován na pevné sterilní půdě, obsahující 2 X glukózy, 2 X baktopeptonu, 1 X kvasničného extraktu a 2 X agaru. Kmen vyrostlý při teplotě 25 °C po dobu 48 hodin je uchováván /skladován/ při teplotě 4 až 8 °c po dobu 3 měsíců. Po této době se kultura přeočkuje na tekutou půdu stejného složeni na 48 hodin a potom znovu přenese na pevný šikmý agar, nechá vyrůst pří 25 °C po dobu 48 hodin a dále se skladuje pří teplotě 4 až 8 °C po dobu 3 měsíců.

K přípravě protoplastů se buňky kultivují submersně v tekuté sterilní živné půdě stejného složení v baňkách na rotačním třepacia stroji při teplotě 28 °C po dobu 6 hodin. Buňky, které jsou v logaritmické fází růstu, j sou z kultivační půdy získány vakuovou filtraci přes membránový filtr /Synpor - Synthesis, Pardubice, velikost pórů 0,4/pm/ a přeneseny do trávicí směsi tak, aby jejich konečná koncentrace v této směsi byla 10$ buněk . ml \ .

Trávicí směs obsahuje 3 mL štávy ze zažívacího ústroji Helix pomatia, 1,5 ml 0,1 M roztoku ΚΗ^ΡΟ^ o pH 6,5, 1 mM fenylsulfonylfluor1d /dále PMSF/ a 1,1 M roztok sorbitolu. Jsou uvedeny aktuální koncentrace v trávicí směsi. Po 30ti minutách pomalého třepáni při teplotě 25 °C je suspenze protoplastů během 10 minut opatrně vyředěna 0,1 M roztokem KH^PO^ na konečnou osmolaritu 0,7 sorbitolu. Takto získané protoplasty jsou odstředěny do tekutě živné půdy, jejíž složeni bylo popsáno v prvním odstavci; živná půda je stabilizována osmoticky 0,7 M sorbitolem. Oo této půdy jsou protoplasty inokulovány v počáteční koncentraci 10 protoplastů . mL a jejich další kultivace probíhá při teplotě 25 °C za pomalého třepáni na reciprokém třepacim stroji o počtu kyvů 100 . min \ '

Cytostatikum nokodazol je připravováno jako zásobní roztok v di me thylsulfoxidu /dále DMSO/ a aplikováno do živné půdy v konečné koncentraci 10 ^jg . mL^-1; koncentrace DMSO použitá při aplikaci na protoplasty nepřekračuje 0,4 X /obj/obj/. Protoplasty jsou nejprve pěstovány 30 minut v živné půdě jak uvedeno v předchozím odstavci, potom je k rostoucím protoplastům přidán nokodazol a ponechán působit 4 hodiny. Zároveň jsou pěstovány protoplasty bez cytostatika za stejných podmínek ve stejném časovém intervalu. Po čtyřech hodinách jsou oba vzorky protoplastů nahromaděny centrifugaci a fixovány při teplotě 25 °C následujícím způsobem.

Protoplasty jsou fixovány celkem 90 minut ve dvou stupních. Prvý stupeň zahrnuje 80 minutovou fixaci 4 X /obj/obj/ formaIdehydem ve stabilizačním pufru obsahujícím 0,1 M roztok KH^PO^ o pH 6,5, 20 mM ethyI englykol-bis^#-aminoethyleter/-N,N,n)n-tetraoctovou kyselinu /dále EGTK/ a 1 mM roztok MgCl₂· Uvedeny jsou aktuální koncentrace ve fixační směsi. Ve druhém stupni jsou protoplasty dále fixovány 10 minut 1 X /obj/obj/ glutaraIdehydem. Potom jsou fixované protoplasty z živné půdy odstředěny, promyty pufrovaným fyziologickým roztokem o pH 7,3 /dále jen PFR/ a inkubovány 20 minut v chladném roztoku NaBH^ o koncentraci 0,5 mg . mL^-1 v PFR. Nakonec jsou protoCS 268903 81 plasty třikrát promyty roztok·· PFR a naneseny v husté suspenzi do tenké vrstvy na čisté OMytá Mikroskopické skla /krycí/. Po zaschnuti jsou protoplasty peraeabl11zovány ponořením sklíček do Methanolu po dobu 10 Minut a následné do acetonu na 30 sekund při teplotě -20 °C. ’

Pro nepřlMou inunofluorescenčni detekci nikrotubulárniho systému v protoplastech se použije myši nonoklonálni protilátka TU 01 proti tubulinu prasečího nožku /V. Viklický a kol. Cell Blol. Internát. Reports 6, 725-730, 1982/. Kryci skla s perMeabilizovanými protoplasty jsou nejprve preinkubována s 1 Z /obj/obj/ roztokem hovězího seruMalbůminu /dále jen HSA/ v PRF a potom inkubována s protilátkou Tu 01 získanou podle čs. autorského osvědčeni č. 223 535. Protilátka se ředí 1 : 99 s 1 X /obj/ /obj/ HSA v PFR a inkubuje s preparáty po dobu 60 ainut. Potom jsou vzorky na sklíčkách promyty třikrát teplým 1 X roztokem HSA v PFR. V druhém stupni jsou protoplasty postinkubovány s prasečím antimyším fglobulinem konjugovanýM s fluorescein isothlocyanáten /SwAM/FITC - Ústav sér a očkovacích látek Praha nebo na přiklad Niles Laboratories, lne., Research Products, Div. Elkhard. Ind. England/. Postinkubaee probíhá ve SwAM/FITC značené protilátce ředěné desetkrát v 1 X /obj/obj/ PFR po dobu 60 ainut. všechny uvedené postupy jsou prováděny při teplotě 37 °C. Potom se sklíčka třikrát promyji roztokem PFR a přiklepl se na podložní mikroskopická skla do 0,1 X propylgalátu, který zabraňuje slábnuti fluorescence.

Při fluorescenční detekci jader v protoplastech se postupuje způsobe· uvedený· v předcházejícím odstavci a nakonec se přidá 50 X /obj/obj/ vodný roztok glycerolu obsahujícího 10 ug . mL~¹ 4,6-diamino-2-fenylindolu /OAPI/, který se specificky váže na jadernou a m1tochondrlálni DNK /Williamson 0. H. a kol. Methods in Cell Biology 1_2, 335-351 /1975//. '

Srovnáním biologických účinků látky s cytostatickým účinkem na protoplasty s kontrolním vzorkem protoplastů vyrostlých v jeho nepřítomnosti se provádí pomoci cytologických metod zmíněných v popisu předmětného vynálezu.

Průměrná velikost protoplastů inhíbovaných působením přidaného nokodazolu činila 10,2 um, průměrný počet jader vztažený na jeden protoplast činil 1,3. Mikrotubulární systém inhíbovaných protoplastů byl zcela depolymerízován, což jednoznačně dokazuje primární účinek cytostatika na tuto buněčnou složku.

V kontrolním .vzorku rostoucích protoplastů vyrostlých bez přítomnosti cytostatika činila průměrná velikost protoplastů 15,4 um, průměrný počet jader vztažený na jeden protoplast byl 1,8. Mikrotubulárni systém nevykazoval žádnou redukci - byly zjištěny normální mi krotubulárni konfigurace v jádrech a zřetelné cytoplastické mikrotubuly v cytoplasmě dosahující až k cytoplastické membráně ve fyziologickém stavu .

Příklad 2

Místo druhu Saccharomyces uvarum bylo pro přípravu protoplastů použito druhu Saccharomyces cerevislae. Protoplasty uvedeného druhu kvasinky byly připraveny za podmínek a způsobem, které jsou uvedeny v přikladu 1. Místo nokodazolu bylo použito jiné sloučeniny karbamátové řady - karbendazimu - v koncentraci 100 ug . mL~\ Dále bylo postupováno jak uvedeno v příkladu 1 včetně detekce biologických účinků na základě zvolených parametrů.

Průměrná velikost protoplastů inhíbovaných přítomností karbendazimu se shodovala s velikostí protplastů inhíbovaných nokodazolem, včetně průměrného počtu jader, jak uvedeno v příkladu 1. Mikrotubulárni systém v inhíbovaných protoplastech byl však redukován pouze částečné. Jaderné mikrotubuly byly zcela depolymerízovány, zatímco

CS 268903 B1 5 cytoplasrnatické mikrotubuly zůstaly zachovány v redukované formě. Z výsledků vyplývá, že cílovou buněčnou strukturou pro působeni karbendazimu je mikrotubulárni systém. Jeho účinek na jaderné a cytoplasmatické mikrotubuly je však diferencovaný.

Přiklad 3

Kultivace kmene Saccharomyces uvarum a příprava protoplastů byla provedena podle přikladu 1. jako látky s cytostatíckým účinkem bylo použito Benfluronu v základní koncentraci 10 ^ug . mL \ Pří hodnoceni velikosti protoplastů, počtu jader a stavu změn mikrotubulárni soustavy bylo postupováno jako v přikladu 1 za pomocí popsaných metod hodnoceni.

Zjištěná průměrná velikost protoplastů inhibovaných Benfluronem se nelišila od protoplastů kontrolních /15,4 ^jm/. Byly zjištěny defekty na úrovni jaderné a mitochondriálni ONK odpovídající okamžité zástavě replikace ONK v jádrech i mitochondriich. Jaderné a cytoplasmatické mikrotubuly byly desorganizovány bez depolymerizace. Cílovou strukturou tohoto cytostatika je jaderná a mitochondriálni ONK.

Způsob testováni látek s cytostatíckým účinkem podle vynálezu může nahradit testováni těchto látek, které se dosud provádí pomoci tkáňových kultur živočišných buněk a pomoci laboratorních zvířat, což je ekonomicky značně výhodné.

Claims (1)

1. Způsob testováni látek s cytostatíckým účinkem, vyznačující se tím, že ve sterilní živné půdě stabilizované osmoticky sorbitoíem s osmolaritou 0,7 až 1 jsou sub merzně ínkubovány protoplasty Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces uvarum v počáteční koncentraci 10⁸ až 10⁹ buněk . mL~¹ při teplotě 25 až 30 °C po dobu 20 až

   30 minut a potom je přidán vzorek látky s cytostatíckým účinkem v koncentraci 10 až -1

   100/Ug/mL rozpuštěné v dimethyIsulfoxidu a ponecháno 4 až 6 hod, potom je vzorek centrifugován, protoplasty fixovány pro detekcí jader a nepřímou 1munofluorescenci mikrotubulárniho systému.