CS268700B2 - Means for beta-d-galacosidase determination - Google Patents

Means for beta-d-galacosidase determination Download PDF

Info

Publication number
CS268700B2
CS268700B2 CS885171A CS517188A CS268700B2 CS 268700 B2 CS268700 B2 CS 268700B2 CS 885171 A CS885171 A CS 885171A CS 517188 A CS517188 A CS 517188A CS 268700 B2 CS268700 B2 CS 268700B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
beta
galactosidase
enzyme
solution
mmol
Prior art date
Application number
CS885171A
Other languages
English (en)
Other versions
CS517188A2 (en
Inventor
Manfred Dr Kuhr
Rudolf Dr Machat
Wolfgang Dr Weckerle
Hans-Georg Dr Batz
Rupert Dr Herrmann
Wolfgang Dr Kleemann
Herbert Buschek
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19833345748 external-priority patent/DE3345748A1/de
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of CS517188A2 publication Critical patent/CS517188A2/cs
Publication of CS268700B2 publication Critical patent/CS268700B2/cs

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Vynález se týká prostředku pro stanoveni beta-D-galaktosidázy, který jako účinnou látku obsahuje fenolsulfonftaleinyl-beta-D-galaktosidy.
igosacharidy nebo polysacharidy, které obsahuji D-galaktosu s beta-glykos idickou vazbou, se vyskytuji prakticky ve všech organismech. Proto jsou také odpovídající beta-D-ga laktosidázy /ЕС 3.2.1.23/ velice rozšířené a mohou být prokázány u početných mikroorganismů^ zvířat i rostlin.
Beta-D-ga laktosidáza splňuje mnohé fyziologické funkce v okruhu savců: hraje důležitou roli při látkové přeměně uhlohydrátů, nebot jejím působením dochází к hydrolýze laktosy. Kromě toho představuje beta-D-galaktosidáza klíčový enzym při odbouráváni glykolipidů, mukopolysacharidů a glykoproteinů.
Vzhledem ke svému významnému fyziologickému postaveni získává beta-D-galaktosidáza v posledních letech stále na významu. Tak se například tento enzym používá ve stále vzrůstající míře jako indikační enzym pro enzymoimunologické testy /viz například Annals of Clinical Biochemistry 1$, 221 - 240 /1979//.
Stanoveni aktivity beta-D-galaktosidázy hraje proto stále vzrůstající roli. Při tom se zcela všeobecně smisi vzorek obsahující galaktosidázu s vhodným beta-D-galaktosidážovým substrátem. Tento substrát se působením enzymu rozštěpí, načež se jeden ze štěpných produktů vhodným způsobem stanoví. Může se stanovovat buď působením enzymu uvolněný glykon nebo aglykon. Zpravidla se stanovuje uvolněný aglykon. Jako substráty jsou vhodné přírodní substrát laktosa, jakož i obzvláště chromogenni galaktosidy.
Jako substrát beta-D-galaktosidázy je v Biochem. Z. , 209 /1960/ popsán feny l-be ta-D-ga l aktosid, jakož i jeho na aromatickém kruhu substituované deriváty /například o-nitrofenyl-beta-D-galaktos id nebo p-nitrofenyl-beta-D-galaktosid/. Hydrolýzou uvolněné fenoly se stanovuji fotometricky v ultrafialové oblasti, popřípadě nitrofenoly v krátkovlnné viditelné oblasti vlnových délek. Také se může jako indikační reakce připojit oxidativni kopulace s aminoantipyrinem /Analytical Biochem. 4Q, 281 11971//.
Pro h1stochemické pokusy se používají hlavně naftyl-beta-D-galaktosidy, například l-naftyl-sloučeniny /Histochemie 32/ 199/1973/, 6-brom-2-naftyl-derivát /J.Biol. Chem. 122/ 239 /1952// nebo naftol-AS-BI-beta-D-galaktosid /Histochemie 3Z/ 89/ /1973//. Pro vizuelnl pozorováni se při tom vznikající naftoly nechají reagovat s různými diazoniovými solemi na odpovídající azobarviva.
Dále je jako substrát beta-galaktosidázy známý 5-brom-4-chlor-Indoxyl-beta-D-galaktosid. Indikační reakci je zde oxidativni dimerisovánl vznikajícího indoxylu na Indigo /Histochemie £3/ 266 /1970// nebo kopulace s diazoniovými solem.i na indoxylazobarviva /Нistochemistry 5Z/ 323 /1978//.
Výše uvedené metody stanoveni vykazuji značné nevýhody. Za prvé jsou necitlivé a kromě toho jsou substráty používané ve stanoveních velmi Špatně rozpustné.
Podstatně citlivějších testů se dosáhne tehdy, když se jako substráty použiji galaktosidy, jejichž aglykon je možno stanovit fluorometricky. Jako takový substrát je např. popsán v Proč. Nat. Acad. Sci. U. S. $£ , 1981 /1961/ fluoresce1n-dibeta-D-galaktosid* Kromě toho se používá 2-naftyl-beta-D-galaktosid /Analytical Biochem. 42 , 275 /1971// nebo 4-methyl-umbelliferyl-beta-D-galaktosid /Biochem. J., 122/ 525 /1967/.
Nevýhoda f luorometrických stanoveni spočívá v tom, že se musí pracovat za značných nákladů na zařízeni. ,
Nadále tedy zůstává potřeba substrátů, pomocí nichž by bylo možno jednoduše, rychle a spolehlivě beta-D-galaktosidázu stanovit. Úkolem vynálezu je tedy tuto potřebu uspokojit.
CS 268700 В2
Nyni bylo zjiltěno, Že je možno beta-Ď-galaktosidázu velmi citlivě stanovit ve viditelné oblasti spektra vizuelně nebo pomoci jednoduchých spektrofotometrických přístrojů, když se jako substráty použiji sulfonftaleinyl-beta-O-galaktosIdy. Tyto sloučeniny máji kromě toho tu výhodu, že jsou ve vodě velmi snadno rozpustné.
Předmětem vynálezu je tedy prostředek ke stanoveni beta-O-galaktosidázy, který jako účinnou složku obsahuje sulfonftaleinyL-Ьеta-O-galaktos1dy obecného vzorce I
(I)>
ve kterém značí až R^ které mohou být stejné nebo rozdílné, vodíkový atom, atom halogenu, nitroskupinu nebo aminoskupinu, r5 až R12 které mohou být stejné nebo rozdílné vodíkový atom, atom halogenu, alkylovou skupinu s 1 až 5 uhlíkovými atomy, hydroxylovou skupinu, alkoxylovou skupinu s 1 až 5 uhlíkovými atomy, karboxylovou skupinu nebo nitroskuplnu a
M* značí proton, iont alkalického kovu, kovu alkalické zeminy nebo amonný.
Pod pojmem halogen při definováni substituentů R1 až R12 se rozumí fluor, chlor, brom a jod, výhodně fluor, chlor a brom. Pod pojmem alkylová skupina s 1 až 5 uhlíkovými atomy se rozumí výhodné alkyl s 1 až 5 uhlíkovými atomy, obzvláště výhodně methylová skupina a isopropylová skupina. Pod pojmem alkoxylová skupina s 1 až 5 uhlíkovými atomy se rozumí výhodně alkoxyl s 1 až 3 uhlíkovými atomy, přičemž obzvláště výhodná je methoxyskupina.
Pod pojmem iont alkalického kovu při definováni H* se rozumí lithný, sodný nebo draselný iont, přičemž jako výhodný lze uvést iont lithný a sodný. Jako iont alkalické zeminy lze uvést iont hořčíku, vápníku a barya, přičemž výhodný je lont vápníku.
se rozumí iont +
nebo rozdílné, značí vždy vodíkový atom, alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy, výhodně s 1 nebo 2 uhlíkovými atomy, nebo benzylovou skupinu.
Pod pojmem amonný při definováni M /NR14R,SR16R17/ přičemž R1^ až R17 , které mohou být stejné
Použiti sulfonftaleinyl-beta-D-galaktosidů jako substrátu pro beta-0-galaktosidázu vede к podstatně citlivějším testovacím systémům pro beta-o-galaktosidázu, než byly dosud známé. Uvedené nové substráty mohou být použity pro stanoveni aktivity beta-O-galaktosidázy výhodně jak v biochemické, tak také chemické oblasti. Jsou citlivější a z jejich použiti vyplývají následující výhody:
a/ Mohou se měřit nižší aktivity beta-o-galaktosidázy;
b/ mohou se používat menši množství vzorků;
с/ stanovení beta-O-galaktosidázové aktivity se může provádět v podstatně kratší době;
d/ menši používané množství vzorků a výhodnější vlnový rozsah při stanoveni snižuje kromě toho rušeni při stanoveni jinými součástmi vzorku.
Ukázalo se, že substráty podle předloženého vynálezu jsou vhodné ke stanovení aktivity beta-O-ga l aktosi dázy každého původu, které se mohou naprosto lišit ve svých optimálních hodnotách pH. Také v takovýchto případech reaguji prostředky se substráty obecného vzorce I podstatně citlivěji, než dosud známé testovací prostředky.
Su Ifonftaleinyl-beta-D-galaktosidy obecného vzorce I jsou také vhodné pro imunologické metody stanoveni/ při nichž se beta-O-galaktosidáza používá jako indikační enzym, jehož aktivita se musí po provedeni imunologické reakce zjištovat. Takovéto Imunologické metody stanovení s enzymatickými indikačními reakcemi jsou v odborném světě známé jako. enzymoímunologícké zkoušky /enzymimmunoassays/.
Tyto metody stanoveni slouží ke stanoveni koncentrací proteinu, po lyšach aridů, hormonů, léčivých látek a jiných níŽemolekulárních substanci v množství 10 $ 1012 mol/litr. Vždy podle potřeby stupňů oddělování fázi, rozlišuje se mezi homogenním a heterogenním vedením zkoušky. Další rozděleni může nastat v kompetitivním a nekompetit1vnim testovacím principu.
Pří všech testovacích principech se však pracuje s konjugáty enzym-anti gen, popřípadě enzym-prot1látka. Enzymatická indikační reakce je společná všem enzymoimunologickým zkouškám /enzymimmunoassays/. ;
Indikační enzym, vhodný pro uvedené účely je bet з-D-ga lafcros idáza. Stanovení beta-D-galaktosidázy v takovýchto enzymoimunologických zkouškách se běžně provádí tak, že se přidá vhodný substrát beta-D-galaktosidázy, enzymaticky se rozštěpí a běžným způsobem se fotometricky proměří.
Zlepšeni systému testu beta-D-galaktosidázy vede tedy rovněž ke značným výhodám při enzymoímunologických zkouškách:
a/ Vyšší citlivost důkazu umožňuje také zde sníženi hranice prokazatelné koncentrace, kratší reakčni dobu a nižší množství používaných vzorků a tím také snížení rušivých vlivů způsobovaných ostatními složkami vzorku;
b/ výhodnější rozsah vlnových délek při vyhodnocování snižuje možnost poruch při urči tém vedení reakce, kdy mohou nastávat poruchy vlivem nerozpustných součásti, například působením zákalů.
Prostředky podle předloženého vynálezu obsahují vedle jednoho nebo několika substrátů obecného vzorce I vhodný pufrovací systém, jakož i popřípadě další vhodné, běžné pro takovéto prostředky používané, přídavné látky, jako jsou například smáčedla, stabilizátory a podobně. Prostředky se mohou používat ve formě roztoků, jako Lyofilisáty nebo jako práškovité směsi, reagenční tablety nebo nanesené na savém nosiči.
Prostředek podle předloženého v.ynMezu ve formě roztoku obsahuje výhodně veškeré pro test potřebné reagencie. Jako rozpouštědlo přichází v úvahu voda nebo směsí vody a ve vodě rozpustnými organickými rozpouStědly, jako je například methylalkohol, ethylalkohol, aceton nebo dimethylformamid. Z hlediska trvanlivostí může být výhodné, rozdělit reagencie potřebné pro test do dvou nebo více roztoků, které se navzájem smísí teprve při vlastním stanoveni.
Pro výrobu prostředku ve formě lyofilisátu v celkové hmotnosti vždy asi 5 až 20 mg, výhodně asi 10 mg, se vysuší roztok,.který obsahuje vedle veškerých pro test potřebných reagencií běžné látky, jako je například polyvinyIpyrrolidon a eventuelně další plnídla, jako je například mannít, sorgit nebo xyllít.
Prostředek ve formě práškovité směsi nebo reagenčních tablet se dá vyrobit tak, že se potřebné součásti smísí s běžnými přísadami a granulují. Jako přídavné látky tohoto druhu je možno jmenovat například uhlohydráty, jako jsou monosacharldy, oUgosacharidy nebo po lysacharidy, popřípadě alkoholické cukry, jako je například mannitol sorbitol nebo xyllitol, nebp jiné rozpustné inertní sloučeniny, jako jsou například polyethylenglykoly nebo polyvinyIpyrrolidon. Práškovité směsi nebo reagenční tablety vykazují všeobecně konečnou hmotnost přibližně 30 až 200 mg, výhodně 50 až 80 mg. .
Pro výrobu prostředků ve formě testovacích proužků se impregnuje savý nosič,, výhodně filtrační papír, celulóza nebo rouno z umělých vláken, potřebnými reagence* mi, běžně používanými pro výrobu testovacích proužků, v lehce těkavém rozpouštědle, jako například voda, methylalkohol, ethylalkohol nebo aceton. Tato impregnace může probíhat v jednom pracovním stupni, často však bývá účelné provádět impregnaci ve více stupních, přičemž se napouští roztoky, které obsahují vždy jednu součást prostředku· Tak se může například v prvním stupni impregnovat vodným roztokem, který obsahuje pufr a ostatní ve vodě rozpustné součásti, a potom ve druhém stupni roztokem, který obsahuje beta-Ď-galaktosidázové substráty. Hotové testovací papírky se mohou použi t jako takové, nebo se známým způsobem nalepuji na držátka nebo se výhodně zasunují mezi podložku 2 plastu a jemnou sítku podle patentového spisu DE č. 21 18 45S.
V následujícím jsou uvedeny příklady, které slouží к bližšímu objasnění předmětu vynálezu, aniž by představovaly jeho omezeni.
V příkladech se používá následujících zkratek:
НЕ PES kyselina 2-/4-/2-hydroxyethyl/-1-pipera2inyl/-ethansulfonová;
BSA albumin z hovězího séra /albumin z bovinňího séra/;
Tween-20 polyoxyethylen/20/sorbitanmonolaurát;
/N-tris/hydroxyme thyl//methyl-glyci n.
Tri cin '’и
CŠ 268700 82
Přiklad 1
Stanoven! aktivity beta-Ď-galaktosidázy a/ Příprava používaných roztoků:
Baztek-eufcu hepes
100 mmol/1 chlorid sodný L-aspartát hořečnatý SSA
Tween-20 hodnota pH /nastaveno hydroxidem sodným/
154 mmol/1 mmol/1 g/1
0,5 g/1
7/3 /37°С/
BcaseQ&ol.CQZlQh.l
V roztoku pufru o výše uvedeném složeni se rozpustí 5 mmot/1 sodné soli fenolsulfonftaleinyl-beta-Ď-galaktosidu· Hodnota pH se nastaví pomoci hydroxidu sodného při teplotě 37° C na 8,5.
ŽSiaíQÍQÍ-ESIlSh.?
/
V roztoku pufru o výše uvedeném složeni se rozpustí 5 mmol/1 sodné soli 3,3 - di- fluorfenoLsulfonfta leinyl-beta-O-galaktosidu. Hodnota pH se nastaví pomoci hydroxidu sodného při teplotě 37° C na 7,5.
/
V roztoku pufru o výše uvedeném složeni se rozpustí 5 mmol/1 sodné soli 3,3 - di- chlorfenolsulfonftaleinyl-beta-D-gaLа кtosidu. Hodnota pH roztoku se ponechá na 7,3 /37° С/.
8eaaeoioi_C3Z131s-ů / /
V roztoku pufru výše uvedeného složeni se rozpustí 5 mmol/1 sodné soli 3,3 , 5,5 - tetrachlorfenol-3, 4”, 54’, 6” - tetrabromsu l fonftaleinyl-beta-o-galaktosidu. Hodnota pH roztoku se ponechá na 7,3 /37°С/.
Koncentrace substrátu a hodnoty pH je třeba mít pro každý použitý substrát op.timálni. Mohou se tedy, zcela vědomě vyskytovat různé hodnoty pro koncentraci substrátu, popřípadě různé hodnoty pH u jednotlivých reagenčních roztoků.
Bszlsis.cozxoy
Na trhu dostupní beta-O-galaktosidíza z Escherichia coll se rozpustí ve výše uvedeném roztoku pufru. Aktivita tohoto roztoku čini asi 0,08 U/ml /vztaženo na údaje výrobce/.
b/ Provedeni měření:
Měřeni se provádí fotometricky při niže uváděných vlnových délkách.
950/u1 reagenčního roztoku se umístí v jednocentimetrově kyvetě při teplotě 37° С a
50/ul roztoku enžymu. Jako míra reakce se 2 jištuje vzestup extinkce za jednotku času /mext/ min/. Byl zjištěn ze změřených extinkci dělením reakční dobou. V následující tabulce jsou uvedeny zjištěné hodnoty:
Tabulka
reagenčni roztok ‘ vlnová délka /nm/ mi ra reakce / m e x t / m i n /
1 560 9
2 578 71 ,
3 578 123
4 578 121
Přiklad 2
Stanoveni aktivity beta-D-galaktosidázy a/ Příprava používaných roztoků
Roztok-guf ry
HEPES 50 mmol/1
kyselina citrónová 50 mmol/1
t r1cín 50 mmol/1
chlorid sodný 154 mmol/1
L-aspartát hořečnatý . 1 mmol/1
BSA 10 g/1
hodnota pH /upraveno
hydroxidem sodným/ 6,0 /37
&easfiD&DÍ.£QZtQK..-l
V roztoku pufru výše uvedeného složeni se rozpustí 5 mmol/1 3,3 -dimethyl-fenolsulfonftaleinyl-beta-D-galaktosidu.
Eei2ínČDÍ_COííSh_-2 /
V roztoku pufru výše uvedeného složeni se rozpustí 5 mmol/1 3,3 -dihydroxy-fenolsulfonftalei nyl-be ta-D-galaktosidu.
Na trhu dostupná beta-D-galaktosidá za z Escherichia coli se rozpustí v roztoku pufru výše uvedeného složeni. Aktivita tohoto roztoku činí asi 0,08 U/ml /vztaženo na údaje výrobce/ .
b/ Prováděni měřeni:
950 /ul reagenčniho roztoku se v jednoceníimetrové kyvetě smísí při teplotě 37° C a 50 /ul enzymového roztoku. Po 10 minutách reakční doby se nastaví pH na hodnotu 10 a měří se extinkce. Při slepém pokusu se postupuje stejně, pouze namísto enzymového roztoku se použije stejné množství roztoku pufru. Teplota během reakce a měřeni se udržuje na 37° C. Ze zjištěných extlnkčnich vzorků s enzymem a bez enzymu se vypočítává extinkčnl diference. Dělením této extinkčnl diference reakční dobou se získá jako míra reakce vzestup extinkce za časovou jednotku /mext/min/. V následující tabulce jsou uvedeny zjištěné hodnoty pro uvedené substráty.
''H
8 T a b u l к a CS 268700 82
reagenčnl roztok vlnová délka /hm/ míra reakce /техt/mi n/
1 578 98
2 593 6
ad 3
Stanoveni aktivity beta-b-galaktosidázy různého původu
Použijí se na trhu dostupné běžné beta-D-galaktosidázové preparáty ко charakteristický znak svoji maximální aktivitu při různých hodnotách
Tyto pH.
vyvíjejí jaÚdaje výrobců:
ga Laktos1 dá za galaktosidáza Oalaktosidáza ga l aktos1 dá za bobů /Jack Beans/ Aspergillus nlger Escherichis coli hovězích jater pH pH pH pH a/ Příprava používaných roztoků
3,5
4/0
6,9
7,3
SSžXQh.QUÍCU
HEPES kyselina citrónová tri c in chlorid sodný L-aspartát hořečnatý BSA
154 mmol/1 mmol/1 mmol/1 nunol/1 nunol/l
9/1
Připraví se roztoky pufru o výše uvedeném složeni optima používaných beta-galaktosidáz /3,5;
a kyselinou chlorovodíkovou dle provede hydroxidem sodným
4,0;
, přičemž
6,9; 7,3/.
při teplotě 37° C hodnoty Nastaveni hodnoty pH pH se nastaví po se
Reagenčnl roztoky
V roztoku pufru výše $e rozpustí vždy 5 mmoL/1 uvedeného složeni s různými /
.sodné soli 3,3 hodnotami pH /3,5, 4,0, 6,9, diehlorfenolsulfonftaleinyl-beta-D-galaktosidu
7/3/
Enzymové roztoky
Rozpustí galaktos idá za galaktosidáza galaktosidáxa galaktosldáza se beta-0-galaktos1 dázy v roztoku pufru o optimální hodnotě pH:
z bobů /Jack Aspergillus Escherichia hovězích jater
Beans/ ni ger col i
Aktivita takto připravených roztoků činí asi 0,08 U/ml /vztaženo na údaje výrobce/ b/
Prováděni měřeni:
Enzymatická reakce probíhá během definované reakční doby při hodnotě pH vždy opt130/ul en15 minut
3,5
4,0
6,9
7,3 pH pH pH pH z
mální pro používaný enzym. Pro měřeni se smisi 1000/ul reagenčniho roztoku se zymového roztoku při teplotě 37° C v jednoceníimetrové kyvetě. Po reakční době se hodnota pH nastaví na 8,5 pomoci hydroxidu sodného a zjisti se extinkce při 578 nm.
Teplota s^ při reakci 1 měření udržuje konstantní 37° C. Stejným způsobem se provede pro
CS 268700 02 každé měření slepý pokus, kdy se namísto enzymového roztoku přidává 30/ul pufru· с/ Vyhodnoceni
Nejdříve se zjisti diference mezi naměřenou hodnotou pro enzym a hodnotou pro slepý pokus. Vydělením této diference reakční dobou se jako míra reakce zjisti vzestup extinkce za Časovou jednotku /mext/min/.
naměř.hodn. s enzymem - naměř, hodn. bez enzymu - Λ naměř, hodnot
Д naměř, hodnot
-----------—-—-------- = míra reakce /mext/min/ reakční doba
Zjištěné naměřené hodnoty pro reakci jednotlivých enzymů jsou uvedeny v následující tabulce: ·
Tabulka
Enzym z hodnota pH míra reakce /mext/min/
boby /'Jack Beans/ 3,5 71
Aspergillus niger AzO 112
Escherichia coli 6/9 74
hovězí játra 7/3 32
Výše popsané výsledky pokusů ukazují, že sulfonftaleinyl-beta-D-galaktosidy jsou vhodné jako substráty pro beta-galaktosi dázu každého původu.
Přiklad 4
Stanoveni aktivity volné a konjugované beta-D-galaktosidázy a/ Příprava používaných roztoků
HEPES 100 mmol/1
chlorid sodný 154 mmo1/1
L-aspartát hořečnatý 2 mmol/1
BSA . 10 9/1
T ween-20 0 ,5 g/1
hodnota pH /nastaveno
hydroxidem sodným/ 7 ,3 /3?
8ίϊ9ίθίθ1.Ε0112!' /
Ve výše uvedeném roztoku pufru se rozpustí 5 mmol/1 sodné soli 3,3 - dichlor-fenolsulfonftaleinyl-beta-D-galaktosidu. Hodnota pH roztoku pufru 7,3 /37° С/ zůstane zachována ·
Еошшух.гггШ
Na trhu dostupná beta-D-galaktosidáza z Escherichia coli se rozpustí ve výše uvedeném roztoku pufru. Aktivita tohoto roztoku činí así 0,08 U/ml /vztaženo na údaje výrobce/.
Použije se preparát beta-D-galaktosidáza-proti látka. Příprava takovéhoto konjugátu enzym - protilátka je známá, například je popsána v Bíochem. Biophys. Acta 612/ 40-49/1980/.
CS 268700 02
Preparát se ve výše uvedeném pufru zředí tak, aby se dosáhlo srovnatelné aktivity s výše popsaným roztokem enzymu.
b/ Provedená měření
Měřeni se provádí fotometrícky při 578 nm 950/ul reagenčniho roztoku se smísí v jednocení i met rové kyvetě při teplotě 37°C s 50/uL roztoku enzymu, popřípadě s 50/ul roztoku enzymového konjugátu. Jako míra reakce se zjištuje vzestup extinkce za jednotku Času /mext/ min/.
Při reakci s volnou beta-t>-galaktosidázou se naměřilo 124 mext/min; při reakci s konjugátem beta-Ď-galaktosidáza-proti látka se naměřilo 120 mext/min.
Obě naměřené hodnoty ukazuji, že jak za použiti volné, tak také konjugované beta-D-galaktosidázy byl zjištěn velmi dobře měřitelný extinkČní rozdíl. Z toho vyplývá, že sulfonftaleinyl-beta-O-galaktosidy jsou jako substráty vhodné ve stejné míre jak pro volnou betaD-galaktosídázu, tak také pro konjugáty beta-D-galaktosidázy.
Nové substráty tedy mohou být použity nejen jako prostředky pro stanoveni volné beta-Ď-galaktosidázy. Jsou vhodné a použitelné také při enzymoimunologických zkouškách, při nichž se beta-D-galaktosidáza využívá jako indikační enzym.

Claims (2)

  1. PfiEDMfiT VYNALEZU
    1. Prostředek ke stanoveni beta-D-galaktosidázy, obsahující jeden nebo více chromogennich substrátu a vhodný pufr, vyznačující se tim, že jako chromogenni substrát obsahuje fenolsulfonftaleinyl-beta-D-galaktos id obecného vzorcel
    1 4 ve kterém R až R , které mohou být stejné nebo rozdilně, 2nači vždy vodíkový atom,, atom halogenu, nitroskupinu nebo aminoskupinu,
    5 12
    R až R , které mohou být stejné nebo rozdílné, značí vždy vodíkový atom, atom halogenu, elkylovou skupinu s 1 až 5 uhlíkovými atomy, hydroxyskupinu, alkoxylovou skupinu s 1 až 5 uhlíkovými atomy, karboxylovou skupinu nebo nitroskupinu a
    M* značí proton, iont alkalického kovu, kovu alkalické zeminy nebo iont amonný.
  2. 2. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako pomocné látky obsahuje smáčedla, oxidační prostředky, galenické přísady a/nebo plnidla.
CS885171A 1983-12-17 1988-07-19 Means for beta-d-galacosidase determination CS268700B2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19833345748 DE3345748A1 (de) 1983-12-17 1983-12-17 Phenolsulfonphthaleinyl-ss-d-galactoside, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der ss-d-galactosidase
CS849877A CS268664B2 (en) 1983-12-17 1984-12-17 Process for the preparation of phenolsulphonephthaleinyl-beta -d-galactosides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS517188A2 CS517188A2 (en) 1989-07-12
CS268700B2 true CS268700B2 (en) 1990-04-11

Family

ID=25746658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS885171A CS268700B2 (en) 1983-12-17 1988-07-19 Means for beta-d-galacosidase determination

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS268700B2 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS517188A2 (en) 1989-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3814630B2 (ja) 体液中の白血球の濃度を比色法により測定するための改良法
US4321397A (en) 4-Aminoantipyrine dye for the analytic determination of hydrogen peroxide
US4247631A (en) Reagent and method for the analytic determination of hydrogen peroxide
US4394512A (en) 1-(Substituted phenyl) aminoantipyrin compounds
EP0496793B1 (en) Enhanced chemiluminescent assay
US4251629A (en) Determination of hydrogen peroxide
US4613569A (en) Stabilized composition of tetrazolium salts
FI81359C (fi) Glykosider av resorufin-derivat, foerfarande foer framstaellning daerav samt deras anvaendning foer bestaemning av aktiviteten av glykosidaser.
US4668622A (en) Phenolsulphonphthaleinyl-β-D-galactosides and diagnostic agents containing them
CS236765B2 (en) Agent for determining of alpha amylase
US4754025A (en) Glucosamine derivatives and reagent for assaying N-acetyl-β-D-glucosaminidase using the same as substrate
JPS6054699A (ja) 尿素の酵素測定用組成物
US4716110A (en) Composition for assaying hydrogen peroxide
CS268700B2 (en) Means for beta-d-galacosidase determination
EP0415471B1 (en) Stabilized Trinder reagent
Mizoguchi et al. Water-soluble chromogenic reagent for colorimetric detection of hydrogen peroxide—an alternative to 4-aminoantipyrine working at a long wavelength
US5350678A (en) Method of differential assay for α-amylase isozymes and a kit for the same
US5206006A (en) Stabilized trinder reagent
US5260428A (en) Agent for the detection of substances with hydrolase activity
US5792619A (en) Assay using oxidative chromogenic reagent
JPH0236181B2 (cs)
EP0761821A1 (en) Assay method avoiding interference by hemoglobin with light detection
US6387646B1 (en) Reagent compositions for measuring electrolyte
JP3690754B2 (ja) 試料中の成分の定量法
JP2001008698A (ja) 酸化発色試薬